本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及rock2抑制劑在制備炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,bd)包括克羅恩病(crohn’sdisease,cd)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,uc)，是一種慢性非特異性炎癥性胃腸道疾病。ibd的發(fā)病原因和機(jī)制仍不清楚，可能與持續(xù)的腸道感染、腸黏膜屏障受損、黏膜組織內(nèi)免疫調(diào)節(jié)紊亂、基因易感和環(huán)境等因素有關(guān)。該病病程長(zhǎng)、容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至致殘，造成沉重的社會(huì)醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來(lái)我國(guó)ibd患病人數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)，因東西方生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、基因遺傳等因素差異，使我們對(duì)國(guó)人ibd患者發(fā)病機(jī)制和臨床防治研究面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前ibd的診斷主要是內(nèi)鏡及組織病理學(xué)檢查，創(chuàng)傷性較大且缺乏診斷ibd的特異性指標(biāo)及治療ibd的特異性靶點(diǎn)。因此，一種新的對(duì)ibd的診斷及治療的方法對(duì)臨床上的診療過(guò)程來(lái)說(shuō)是極其重要的。rho相關(guān)激酶(rhoassociatedkinases,rock)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，其分子量約為160kd。rock有兩個(gè)亞型，即rock1和rock2，可通過(guò)與rho-gtp結(jié)合激活，進(jìn)而磷酸化其下游分子，從而發(fā)揮各種生物活動(dòng)功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種rock蛋白底物，包括肌球蛋白輕鏈(mlc)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(mlcp)、肌球蛋白磷酸酶(mypt-1)、肌鈣蛋白等。很多研究已經(jīng)表明：rock可通過(guò)磷酸化其下游的多個(gè)靶蛋白，從而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)，比如說(shuō)收縮、遷移、凋亡以及增值。因此，rock參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如心血管疾病、癌癥等。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，rock活性水平在一些自身免疫性疾病患者中顯著上調(diào)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,sle)及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)。此外，在cd患者炎性腸粘膜中發(fā)現(xiàn)gtp-rhoa的水平顯著升高。最近有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)rock2可調(diào)節(jié)小鼠及正常人cd4+t細(xì)胞分泌的il-21及il-17的水平。然而，其在ibd組織中的表達(dá)情況及在腸黏膜炎癥發(fā)生過(guò)程的免疫應(yīng)答效應(yīng)作用仍不清楚。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種rock2活性選擇性抑制劑slx-2119在制備炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種rock2抑制劑在制備炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述rock2抑制劑為選擇性rock2抑制劑。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述選擇性rock2抑制劑為選擇性rock2抑制劑slx-2119。如無(wú)特殊說(shuō)明，本發(fā)明涉及的試劑均為市售產(chǎn)品。在本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)rock2活性水平在腸道炎癥中的作用，因此，抑制rock2活性水平的化合物均落入本發(fā)明范圍內(nèi)。這些化合物包括但不限于rock2活性選擇性抑制劑。因此，本family那個(gè)提出了一種rock2活性選擇性抑制劑slx-2119在制備炎癥性腸病藥物中的應(yīng)用，從而為炎癥性腸病的研究開(kāi)辟了一條新的途徑，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。附圖說(shuō)明圖1：rock2活性水平在活動(dòng)期ibd患者腸粘膜中顯著升高?；顒?dòng)期cd(a-cd)和uc(a-uc)患者腸粘膜組織中rock2活性水平較健康對(duì)照者(hc)顯著上調(diào)(**p<0.01,***p<0.001),而緩解期cd(r-cd)與uc(r-uc)患者腸粘膜組織中rock2活性水平較健康對(duì)照者(hc)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；圖2：rock2活性水平可調(diào)節(jié)ibd患者cd4+t細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。用rock2高選擇性抑制劑slx-2119(5μm，10μm)刺激新鮮提純的未激活cd4+t細(xì)胞1h，anti-cd3/cd28體外激活。72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，運(yùn)用elisa檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子蛋白水平。slx-2119抑制rock2活化水平,可降低tnf-α、ifn-γ、il-17a以及il-21的蛋白水平,且提高il-10的蛋白水平(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；以及，圖3：抑制rock2活性水平可有效緩解tnbs誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥。具體實(shí)施方式以下，結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)知道的是，以下具體實(shí)施方式僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1.rock2活性的測(cè)定1.1組織總蛋白的提取1)將腸粘膜組織放入一ep管，并在管中加入適量的ip裂解液，并用研磨棒于冰上進(jìn)行研磨，直至不能看見(jiàn)成形的組織后，置于冰上靜置2h。2)充分裂解后，離心，離心條件：12000rpm，4℃，5min。待離心結(jié)束后，小心取出ep管，用移液槍小心將上層澄清液體移至另一ep管內(nèi)。1.2蛋白濃度測(cè)定1)按bca試劑盒說(shuō)明書(shū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制定表如下：孔號(hào)01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(μl)01248121620去離子水(μl)2019181612840對(duì)應(yīng)蛋白含量(μg)00.51.02.04.06.08.010.02)稀釋待測(cè)樣本至合適濃度，使樣本稀釋總體積達(dá)20μl。3)根據(jù)樣本數(shù)量，取適量bca試劑(試劑a與b的體積比為50:1)，混勻后配成bca工作液。在各孔中加入200μlbca工作液，充分混勻，于37℃靜置30min。以空白孔進(jìn)行調(diào)零對(duì)照，在波長(zhǎng)為562nm條件下檢測(cè)樣品光吸收值。4)計(jì)算待測(cè)樣品濃度。根據(jù)所測(cè)樣品吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量(μg)。再根據(jù)稀釋濃度，計(jì)算樣本實(shí)際濃度(μg/μl)。1.3免疫沉淀1)將50μg細(xì)胞裂解加入1μgrock2抗體(anti-rock2)在4℃緩慢搖晃孵育1h，然后加入20μl預(yù)先清洗過(guò)的proteina/gplus-agarose，4℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜。2)免疫沉淀反應(yīng)后，清洗proteina/gplus-agarose4遍，離心，離心條件：3,000rpm，4℃，5min。沉淀的proteina/gplus-agarose即為提純的rock2蛋白。1.4rock活性的檢測(cè)1)根據(jù)96孔rock活性檢測(cè)試劑盒(96-wellrockactivityassaykit)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行rock2活性的檢測(cè)。2)將定量的細(xì)胞蛋白裂解液或者純化的rock2蛋白吸至包被有mypt-1的孔中，在30℃內(nèi)孵育1h。清洗5遍。3)孔內(nèi)加入pmypt-1(thr696)抗體(anti-pmypt-1(thr696)antibody)，在30℃內(nèi)孵育1h。清洗5遍。4)加入hpr標(biāo)記的第二抗體(hrp-conjugatedsecondaryantibody)孵育1h。清洗5遍。5)在孔內(nèi)加入底物溶液(substratesolution)，20min后加入終止液(stopsolution)。6)最后，在多功能酶標(biāo)儀上讀數(shù)(od450)，即為rock2活性的相對(duì)值。實(shí)施例2.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)(1)用包被液(coatingbuffer)在加樣槽中將200×captureantibody(包被抗體)稀釋至1×。用移液器吸取50μl的1×captureantibody轉(zhuǎn)移至96孔板中，緩慢搖晃96孔板，保證液面覆蓋孔底。置于4℃冰箱過(guò)夜。(2)第2天，移除孔內(nèi)液體，并用緩沖液清洗孔3次，每次緩沖液停留孔內(nèi)3min。(3)用移液器吸取100μl封閉液(blockingbuffer)移至96孔板，并在室溫下于搖床中搖勻1h。(4)參照步驟(2)清洗孔后，按照以下濃度梯度用封閉液稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：1000ng、500ng、250ng、125ng、64ng、32ng和16ng。將50μl稀釋好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用移液器轉(zhuǎn)移至孵有包被抗體(captureantibody)的96孔板中。并將只加入封閉液的孔作為陰性對(duì)照孔。(5)用封閉液將待檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用移液器將其轉(zhuǎn)移至孵有包被抗體的96孔板中。并在室溫下于置于搖床中搖勻2h。(6)再次洗滌后，用封閉液在加樣槽中將200×detectionantibody(檢測(cè)抗體)稀釋至1×。用移液器吸取50μl的1×detectionantibody至96孔板中，緩慢搖晃96孔板，保證液面覆蓋孔底。并在室溫下于置于搖床中搖勻2h。(7)再次洗滌后，用封閉液在加樣槽中將1000×streptavidin-hrp稀釋至1×。用移液器吸取50μl的1×streptavidin-hrp轉(zhuǎn)移至96孔板。并在室溫下于置于搖床中搖勻1h。(8)再次洗滌后，用移液器加入預(yù)熱至室溫的tmb底物溶液(tmbsubstratesolution)，并于室溫下反應(yīng)15min。(9)加入50μl終止液終止反應(yīng)。將96孔板置于多功能酶標(biāo)儀中，讀取od值，根據(jù)待測(cè)樣品稀釋倍數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)樣品中細(xì)胞因子濃度。實(shí)施例3.tnbs誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型與slx-2119的體內(nèi)治療(1)將待實(shí)驗(yàn)的balb/c小鼠禁食24h，分為四組：a、b、c、d組；其中，所述balb/c小鼠是一種市售常規(guī)商品。(2)將5％tnbs與100％乙醇按照1:1的比例配置成適量tnbs混合液，置于4℃冰箱內(nèi)避光暫存。(3)配制1.25％戊巴比妥鈉，麻醉待實(shí)驗(yàn)的小鼠。(2)抓住麻醉后的小鼠尾巴，將連接有針筒的灌腸管緩慢從小鼠肛門(mén)插入，直至4cm處，并將150μltnbs混合液緩慢打入其中a、b兩組小鼠，而另兩組則打入150μl50％乙醇。(4)倒提小鼠30s后將小鼠放回籠中，恢復(fù)正常實(shí)物與水的供應(yīng)。(5)待清醒后，給予灌胃處理，即b、d組小鼠給予2mg并溶于0.4％甲基纖維素的slx-2119，而a、c組小鼠給予0.4％甲基纖維素灌胃。灌胃7天。(6)于第8天將四組小鼠處死。實(shí)施例4.小鼠組織he染色步驟(1)組織包埋：將處死后的小鼠浸泡于75％酒精進(jìn)行消毒5min。將用眼科剪剪取的小鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)移至4％多聚甲醛溶液浸泡，并于4℃冰箱中固定24h。然后，將組織依次經(jīng)過(guò)各濃度乙醇脫水，并在二甲苯透明后于65℃浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋。將標(biāo)本切成7um左右厚的石蠟切片，貼于免疫組化專(zhuān)用載玻片上，于45℃烘烤2h。將片子存放于室溫下，可長(zhǎng)時(shí)間保存。(2)將切片置于切片架上，于烤箱內(nèi)60℃烘烤1h，取出后迅速轉(zhuǎn)移至二甲苯中緩慢上下涮洗3min，后再將片子轉(zhuǎn)移至另一盛有二甲苯的玻璃缸中浸泡3min。將片子取出后，依次放入不同濃度的乙醇中制水。然后，將切片轉(zhuǎn)移至盛有pbs溶液的玻璃缸中浸泡清洗3次，每次5min。(3)將切片置于蘇木精水溶液中染色約10min，然后將切片轉(zhuǎn)移至酸水及氨水中分色。接著在流水下將切片沖洗1h，注意水流應(yīng)需沿著切片邊沿沖洗，注意水流需小，且避免水流直接沖洗切片，之后將切片置于蒸餾水中清洗片刻。緊接著將切片放入70％和90％酒精中脫水各10min。最后將切片置于酒精伊紅染色液染色2min。(5)將染色后的切片經(jīng)無(wú)水乙醇脫水?dāng)?shù)分鐘后，置于二甲苯浸泡數(shù)分鐘使該切片透明。(6)在切片上滴上中性樹(shù)膠，小心覆上蓋玻片封固。(7)待樹(shù)膠晾干后，將切片置于顯微鏡下觀察結(jié)腸各結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1.rock2活性水平在活動(dòng)期ibd患者腸粘膜顯著升高申請(qǐng)人將收集的ibd患者和健康對(duì)照者的腸粘膜標(biāo)本進(jìn)行裂解、定量、免疫沉淀后，運(yùn)用96-wellrockactivityassaykit檢測(cè)rock1/rock2活性水平，獲得如圖1所示的檢測(cè)結(jié)果。如圖1所示的，活動(dòng)期cd(a-cd)和uc(a-uc)患者腸粘膜rock2活性水平均較健康對(duì)照者(hc)顯著升高(**p<0.01,***p<0.001)，而緩解期cd(r-cd)與uc(r-uc)患者腸粘膜及pbmcs中rock2活性水平較健康對(duì)照者(hc)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.rock2活性水平可調(diào)節(jié)ibd患者cd4+t細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌申請(qǐng)人從健康對(duì)照者(hc)及ibd患者的外周血中分離提純未激活的cd4+t細(xì)胞，然后運(yùn)用rock2高選擇性抑制劑slx-2119刺激細(xì)胞1小時(shí)，繼而使用anti-cd3/cd28體外激活，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，運(yùn)用elisa檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子蛋白水平。同時(shí)，收集細(xì)胞，通過(guò)rna提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子mrna表達(dá)水平，獲得圖2檢測(cè)結(jié)果。如圖2所示的，實(shí)驗(yàn)表明：抑制rock2活化水平可降低tnf-α、ifn-γ、il-17a以及il-21的蛋白水平，但提高了il-10的蛋白水平(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。3.抑制rock2活性水平可有效緩解tnbs誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥為了進(jìn)一步深入研究rock2活性水平在腸道炎癥中的作用，申請(qǐng)人建立了小鼠結(jié)腸炎模型。tnbs誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型是ibd研究領(lǐng)域中廣泛運(yùn)用的經(jīng)典模型之一。在構(gòu)建tnbs小鼠結(jié)腸炎模型時(shí)，我們進(jìn)行了slx-2119灌胃處理；在小鼠結(jié)腸炎造模過(guò)程中，我們密切觀察了小鼠的體重變化，并獲得了圖3所示的檢測(cè)結(jié)果。如圖3(a)所示的，與甲基纖維素灌胃處理的小鼠相比，slx-2119灌胃治療的小鼠體重降低顯著緩解(*p<0.05,**p<0.01)。小鼠于第8天處死。如圖3(b-c)所示的，與甲基纖維素灌胃處理的小鼠相比，slx-2119灌胃治療的小鼠結(jié)腸縮短程度顯著緩解(*p<0.05,**p<0.01)。此外，我們還收集了小鼠結(jié)腸組織，通過(guò)制作石蠟切片后，進(jìn)行h-e染色。如圖3(d-e)所示的，抑制了rock2活性水平后可明顯降低了tnbs誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織的病理評(píng)分及結(jié)腸組織破壞(*p<0.05)。如圖3中e所示的，控制組的病理學(xué)評(píng)分沒(méi)有輸出顯示，這代表控制組的病理學(xué)評(píng)分為零，表示控制組無(wú)炎癥。因此，這些數(shù)據(jù)有力地表明使用選擇性rock2抑制劑slx-2119以體內(nèi)抑制rock2活性水平能夠有效地緩解結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明已由上述相關(guān)實(shí)施例加以描述，然而上述實(shí)施例僅為實(shí)施本發(fā)明的范例。必需指出的是，已公開(kāi)的實(shí)施例并未限制本發(fā)明的范圍。相反地，包含于權(quán)利要求書(shū)的精神及范圍的修改及均等設(shè)置均包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12