本發(fā)明涉及胸腺五肽緩釋微球及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

蛋白多肽類藥物具有療效高、劑量小的優(yōu)勢，現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展使大規(guī)模生產(chǎn)高效的生物活性蛋白多肽類藥物成為可能，使其在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。但是，蛋白多肽類藥物存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)易降解、半衰期很短的缺點(diǎn)，導(dǎo)致臨床應(yīng)用時，給藥形式有限，給藥途徑單一，目前的臨床劑型多數(shù)為注射溶液劑和凍干粉針劑，使用時需長期頻繁注射，患者順應(yīng)性較差。以生物可降解藥用高分子材料為載體制備該類藥物的緩釋微球，可使藥物緩慢釋放，降低毒/副作用，緩釋期可達(dá)數(shù)天或數(shù)月，明顯減少服藥次數(shù)，優(yōu)化整體治療費(fèi)用，有利于臨床治療。

微球是指藥物溶解或者分散在高分子材料基質(zhì)中形成的球狀實(shí)體微粒，粒徑一般在1～250μm之間(理想直徑應(yīng)小于125μm)。以生物可降解藥用高分子材料為載體的微球，能夠?qū)⒌鞍锥嚯念愃幬锇谖⑶蛑羞M(jìn)行保護(hù)，借助高分子材料的降解來釋放藥物，根據(jù)所選載體材料的規(guī)格和降解速率，緩釋周期可達(dá)數(shù)天或數(shù)月。

胸腺五肽(thymopentin，tp-5)是胸腺生成素的活性片段，具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能的作用。臨床應(yīng)用范圍廣泛，主要用于治療慢性乙型肝炎、各種原發(fā)性或繼發(fā)性t細(xì)胞缺陷疾病、某些自身免疫性疾病、各種細(xì)胞免疫功能低下的疾病以及腫瘤的輔助治療。

目前已有將胸腺五肽制成緩釋微球的研究。但現(xiàn)有胸腺五肽緩釋微球存在孔隙率高、載藥量低等問題。例如，李洪報道的胸腺五肽緩釋微球，根據(jù)其包封率的結(jié)果，可以計(jì)算其載藥量僅有1.76％(參見中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009年7月，第26卷，第7期，第582-584頁)。cn1714861a中公開的胸腺五肽緩釋微球中載藥量較低，孔隙率較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上情況，本發(fā)明提供一種胸腺五肽緩釋微球，其具有低孔隙率，高載藥量。并且，發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，載藥量的提高、孔隙率的降低，改變了胸腺五肽緩釋微球的釋放周期和體內(nèi)釋藥特征。

為此，本發(fā)明一方面提供一種胸腺五肽緩釋微球，包含胸腺五肽和生物可降解藥用高分子材料，其特征在于，所述緩釋微球的載藥量為5％以上；優(yōu)選為8％以上；更優(yōu)選為10％以上；進(jìn)一步優(yōu)選為12％以上；最優(yōu)選為15％以上。孔隙率為30％以下；優(yōu)選為25％以下；更優(yōu)選為20％以下；進(jìn)一步優(yōu)選為15％以下；進(jìn)一步優(yōu)選為10％以下；最優(yōu)選為6％以下。

優(yōu)選地，上述的胸腺五肽緩釋微球中，生物可降解藥用高分子材料占所述緩釋微球的重量百分比為60％-95％。

優(yōu)選地，上述的胸腺五肽緩釋微球中，所述生物可降解藥用高分子材料為選自天然生物可降解藥用高分子材料和合成生物可降解藥用高分子材料中的至少一種；其中，天然生物可降解藥用高分子材料包含膠原、明膠、透明質(zhì)酸類、海藻酸鹽、絲素蛋白、白蛋白、玉米醇溶蛋白、淀粉、纖維素、聚糖(如甲殼素)、以及它們的衍生物；合成生物可降解藥用高分子材料包含聚酯類、聚酸酐類、聚原酸酯類、聚磷酸酯類、聚氨酯類。

優(yōu)選地，上述生物可降解藥用高分子材料為聚酯類。

更優(yōu)選地，上述聚酯類包括聚丙交酯乙交酯(plga)、聚丙交酯(pla)、聚乙交酯(pga)、聚氰基丙烯酸烷酯(paca)、聚己內(nèi)酯(pcl)、聚羥基丁酸酯(phb)、聚羥基丁酸戊酸共聚酯(phbv)、聚羥戊酸(pva)、聚癸酸(pda)、聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯、聚乳酸-羥甲基乙醇酸(plhmga)、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(pla-peg)、聚乳酸羥基乙酸-多聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物(plga-pll-peg)、乳酸-聚乙二醇(聚丙二醇)共聚物(pela)中的至少一種。

進(jìn)一步優(yōu)選地，上述聚酯類為聚丙交酯乙交酯(plga)。

優(yōu)選地，上述胸腺五肽緩釋微球中，所述生物可降解藥用高分子材料為聚丙交酯乙交酯(plga)，所述聚丙交酯乙交酯(plga)中乳酸與羥基乙酸聚合摩爾比例為50:50～90:10，粘度為0.1～2.0dl/g。

優(yōu)選地，上述胸腺五肽緩釋微球的孔隙率為3～6％或12.7％；所述聚丙交酯乙交酯(plga)中乳酸與羥基乙酸的聚合摩爾比例為50:50，所述聚丙交酯乙交酯(plga)的粘度為0.59dl/g或0.38dl/g。

優(yōu)選地，上述的胸腺五肽緩釋微球中，還包括乳化穩(wěn)定劑。

更優(yōu)選地，所述乳化穩(wěn)定劑為選自聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚甲基丙烯酸鈉、聚丙烯酸鈉和羧甲基纖維素鈉中的至少一種。

更優(yōu)選地，所述乳化穩(wěn)定劑為聚乙烯醇(pva)和聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的至少一種。

優(yōu)選地，上述胸腺五肽緩釋微球中，所述生物可降解藥用高分子材料占所述緩釋微球的重量百分比為60.0％-94.75％，優(yōu)選為60.0％-91.75％，更優(yōu)選60.0％-89.75％，更優(yōu)選60.0％-87.75％，更優(yōu)選60.0％-84.75％。

優(yōu)選地，所述乳化穩(wěn)定劑占所述緩釋微球的重量百分比為0.25％-20％。

本發(fā)明第二個方面提供上述胸腺五肽緩釋微球的制備方法，包括w/o/w法、s/o/w法、w/o/o法、s/o/o法。

優(yōu)選地，上述制備方法為w/o/w法。

更優(yōu)選地，上述w/o/w法為w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法。

優(yōu)選地，上述的制備方法采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，包括如下步驟：將生物可降解藥用高分子材料溶解在有機(jī)溶劑中，優(yōu)選為選自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、甲苯、甲醇、苯甲醇、乙醚、丙酮、四氫呋喃中的至少一種有機(jī)溶劑中，作為油相，將胸腺五肽溶解于水中作為內(nèi)水相，滲透壓調(diào)節(jié)劑和任選的乳化穩(wěn)定劑溶于水中作為外水相，將內(nèi)水相加入油相中制成初乳(w/o)，再轉(zhuǎn)入外水相制成復(fù)乳(w/o/w)，將復(fù)乳轉(zhuǎn)移至水溶液中，攪拌，收集所得微球，洗滌，冷凍干燥，即得緩釋微球。

更優(yōu)選地，上述滲透壓調(diào)節(jié)劑為選自氯化鈉、磷酸鹽、葡萄糖、羥丙基-β-環(huán)糊精和聚乙烯亞胺中的至少一種。

本發(fā)明的第三個方面是提供上述的胸腺五肽緩釋微球在制備注射給藥、口服給藥、眼部給藥的藥物制劑中的用途。

胸腺五肽緩釋微球在體內(nèi)的分析方法為：將熒光素與胸腺五肽通過化學(xué)鍵連接，通過上述胸腺五肽緩釋微球的制備方法制備成制劑給藥，測定血漿熒光強(qiáng)度。

在本發(fā)明中，載藥量是指緩釋微球中所含藥物占微球總重的比例，它決定了緩釋微球制劑單次給藥尤其是注射給藥的劑量。

如果沒有特別地指出，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語以及名稱都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同的意思。

本發(fā)明的胸腺五肽緩釋微球具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明的胸腺五肽緩釋微球載藥量高，單次注射微球總量小，即可實(shí)現(xiàn)長周期治療有效量的藥物釋放。

2)通過使胸腺五肽緩釋微球的孔隙率控制在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)緩釋微球的體內(nèi)釋藥曲線符合higuchi動力學(xué)模型或零級模型。從而可根據(jù)胸腺五肽日需求量等要求選擇具有合適體內(nèi)釋放特征的微球，或聯(lián)合使用兩種或多種釋放特征的微球。

3)生物可降解藥用高分子材料通常具有特定的降解速率，從而具有特定的釋藥周期。而本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，通過使孔隙率和載藥量控制在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以延長生物可降解藥用高分子材料原本的釋放周期，制得滿足各種臨床應(yīng)用需求的胸腺五肽緩釋微球。

附圖說明

圖1：本發(fā)明實(shí)施例所制得的各孔隙率水平的胸腺五肽/plga微球掃描電鏡(sem)照片。

圖2：本發(fā)明實(shí)施例所制得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽/plga微球熒光顯微鏡照片。

圖3：本發(fā)明實(shí)施例所制得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽/plga微球肌肉注射給藥后大鼠體內(nèi)的釋藥曲線圖。其中，橫坐標(biāo)為時間(d)，縱坐標(biāo)為體內(nèi)累積釋藥百分率(％)。

圖4：本發(fā)明實(shí)施例所制得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽/plga微球肌肉注射給藥后大鼠體內(nèi)的日均釋藥百分率柱形圖。其中，橫坐標(biāo)為時間(d)，縱坐標(biāo)為體內(nèi)日均釋藥百分率(％/d)。其中各柱形從左到右依次代表t1-1、t1-2、t2-1、t2-2、t2-3的體內(nèi)日均釋藥百分率。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行示例性說明，但本發(fā)明的范圍并不局限于實(shí)施例。

實(shí)施例1

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，將外水相滲透壓調(diào)節(jié)劑氯化鈉按10、20、40、60、80mg/ml投料，生物可降解藥用高分子材料plga的單體聚合摩爾比為50:50，粘度為0.59dl/g。按如下方法制備微球樣品：

稱取2.0gplga(聚合摩爾比例50:50，粘度0.59dl/g)溶解于8.0ml二氯甲烷中，制成復(fù)乳中油相；將600mgtp-5溶于1.2ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的二氯甲烷有機(jī)相中，置于高剪切乳化分散機(jī)中，以17,000rpm處理2.0min，形成w/o型初乳；以含0.5％聚乙烯醇(pva)為乳化劑、預(yù)定量的氯化鈉(nacl)為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，以8,000rpm處理5.0min，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳；將復(fù)乳轉(zhuǎn)移入300ml含0.5％pva的固化液中，冰浴條件下以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌1.5h，再移至25℃的水浴中，以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌2.5h；離心，收集所得微球，蒸餾水洗滌多次后，再離心收集，冷凍干燥即得。

所得tp-5/plga微球呈白色粉末狀，流動性良好，對應(yīng)于外水相氯化鈉濃度10、20、40、60、80mg/ml，分別標(biāo)記為微球h1、h2、h3、h4、h5。

實(shí)施例2

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽(fitc-tp5，多肽固相合成法制得，純度≥95％，避光保存)和胸腺五肽(tp-5)按照1:5重量比投料混合，外水相氯化鈉濃度為40mg/ml，生物可降解藥用高分子材料plga的單體聚合摩爾比為50:50，粘度為0.59dl/g。按如下方法避光條件下制備微球樣品：

稱取2.0gplga(聚合摩爾比例50:50，粘度0.59dl/g)溶解于8.0ml二氯甲烷中，制成復(fù)乳中油相；將100mgfitc-tp5和500mgtp-5共同溶于1.2ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的二氯甲烷有機(jī)相中，置于高剪切乳化分散機(jī)中，以17,000rpm處理2.0min，形成w/o型初乳；以含0.5％聚乙烯醇(pva)為乳化劑、含40mg/ml氯化鈉(nacl)為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，以8,000rpm處理5.0min，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳；將復(fù)乳轉(zhuǎn)移入300ml含0.5％pva的固化液中，冰浴條件下以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌1.5h，再移至25℃的水浴中，以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌2.5h；離心，收集所得微球，蒸餾水洗滌多次后，再離心收集，冷凍干燥即得。

所得混合熒光微球呈橙色粉末狀，流動性良好，標(biāo)記為m3。

實(shí)施例3

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，將外水相滲透壓調(diào)節(jié)劑氯化鈉按70、100mg/ml投料，生物可降解藥用高分子材料plga的單體聚合摩爾比為50:50，粘度為0.38dl/g。按如下方法避光條件下制備微球樣品：

稱取2.0gplga(聚合摩爾比例50:50，粘度0.38dl/g)溶解于6.5ml二氯甲烷和1.5ml乙酸乙酯的混合溶劑中，制成復(fù)乳中油相；將600mg異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽(fitc-tp5，多肽固相合成法制得，純度≥95％，避光保存)溶于1.2ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的混合溶劑有機(jī)相中，置于高剪切乳化分散機(jī)中，以17,000rpm處理2.0min，形成w/o型初乳；以含0.5％聚乙烯醇(pva)為乳化劑、預(yù)定濃度的氯化鈉(nacl)為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，以8,000rpm處理5.0min，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳；將復(fù)乳轉(zhuǎn)移入300ml含0.5％pva的固化液中，冰浴條件下以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌1.5h，再移至25℃的水浴中，以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌2.5h；離心，收集所得微球，蒸餾水洗滌多次后，再離心收集，冷凍干燥即得。

所得微球呈橙色粉末狀，流動性良好，對應(yīng)于外水相氯化鈉濃度70、100mg/ml，分別標(biāo)記為t1-1，t1-2。

實(shí)施例4

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，將外水相氯化鈉按40、60、80mg/ml投料，生物可降解藥用高分子材料plga的單體聚合摩爾比為50:50，粘度為0.59dl/g。按如下方法避光條件下制備微球樣品：

稱取2.0gplga(聚合摩爾比例50:50，粘度0.59dl/g)溶解于8.0ml二氯甲烷中，制成復(fù)乳中油相；將600mg異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽(fitc-tp5，多肽固相合成法制得，純度≥95％，避光保存)溶于1.2ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的二氯甲烷有機(jī)相中，置于高剪切乳化分散機(jī)中，以17,000rpm處理2.0min，形成w/o型初乳；以含0.5％聚乙烯醇(pva)為乳化劑、預(yù)定濃度的氯化鈉(nacl)為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，以8,000rpm處理5.0min，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳；將復(fù)乳轉(zhuǎn)移入300ml含0.5％pva的固化液中，冰浴條件下以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌1.5h，再移至25℃的水浴中，以350rpm轉(zhuǎn)速機(jī)械攪拌2.5h；離心，收集所得微球，蒸餾水洗滌多次后，再離心收集，冷凍干燥即得。

所得微球呈橙色粉末狀，流動性良好，對應(yīng)于外水相氯化鈉濃度40、60、80mg/ml，分別標(biāo)記為t2-1，t2-2，t2-3。

實(shí)施例5

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，生物可降解藥用高分子材料plga的單體聚合摩爾比為75:25，粘度為0.55dl/g。按如下方法制備微球樣品：

稱取2.0gplga溶解于8.0ml二氯甲烷中，制成復(fù)乳中油相；將600mgtp-5溶于1.2ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的二氯甲烷有機(jī)相中，置于高剪切乳化分散機(jī)中，以17,000rpm處理2.0min，形成w/o型初乳；以含2％聚乙烯醇(pva)為乳化劑、30mg/ml的氯化鈉為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，以8,000rpm處理5.0min，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳，固化，冰浴機(jī)械攪拌1.5h，再移至25℃的水浴中機(jī)械攪拌2.5h，洗滌，離心，收集，冷凍干燥即得。

所得tp-5/plga微球粉末流動性良好，載藥量18.98％，孔隙率為17.41％。

實(shí)施例6

采用w/o/w復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，生物可降解藥用高分子材料pla，粘度為0.26dl/g。按如下方法制備微球樣品：

稱取1.0gpla溶解于5.0ml乙酸乙酯中，制成復(fù)乳中油相；將300mgtp-5溶于1ml注射用水中制成內(nèi)水相；將內(nèi)水相加入至作為中油相的乙酸乙酯有機(jī)相中，剪切形成w/o型初乳；以含5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)為乳化劑、50mg/ml的氯化鈉(nacl)為滲透壓調(diào)節(jié)劑的80ml水溶液做為外水相，將初乳倒入該溶液中，高速乳化形成w/o/w型復(fù)乳；固化，于25℃機(jī)械攪拌5h，洗滌，離心，收集，冷凍干燥即得。

所得tp-5/pla微球粉末流動性良好，載藥量19.57％，孔隙率為8.01％。

試驗(yàn)例

試驗(yàn)例1：各微球粒徑、載藥量、孔隙率的測定

①微球粒徑測定

采用激光散射粒徑測定儀測定微球的平均粒徑。

②微球的載藥量測定

取微球適量(約相當(dāng)于2mg活性藥物)，置于25ml容量瓶中，加入2ml乙腈-水(9:1)，超聲分散2min，加入含0.02％吐溫-20的ph7.0磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液作為供試液；另取對照品適量，同法制成濃度為80μg/ml的對照溶液；量取供試液和對照液各20μl，照hplc外標(biāo)法計(jì)算微球中活性藥物的含量。

胸腺五肽(tp-5)的色譜條件：色譜柱為agilenteclipsexdb-c18,5μm,4.6×250mm；流動相為ph7.0磷酸鹽緩沖液:甲醇(88:12v/v)；流速lml/min；檢測波長230nm；

異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽(fitc-tp5)的色譜條件：色譜柱：agilenteclipsexdb-c18,5μm,4.6×250mm；流動相為ph7.0磷酸鹽緩沖液:甲醇(60:40v/v)；流速lml/min；檢測波長230nm；

微球的載藥量計(jì)算公式如下：載藥量＝(微球中所含藥物重量/微球總重)×100％。

③微球的孔隙率測定

采用poremastergt-60全自動壓汞儀通過壓汞法測定微球的孔隙率。

表1：胸腺五肽/plga微球h1、h2、h3、h4、h5的粒徑、載藥量、孔隙率測定結(jié)果。

注：滲透壓差的計(jì)算公式：δπ＝(π內(nèi)-π外)；滲透壓以毫滲透量濃度來表示，毫滲透量濃度(mosm/l)＝(每升溶劑中溶解的溶質(zhì)克數(shù)/分子量)×n×1000，因此內(nèi)水相滲透壓為1000×c/679.8(c為內(nèi)水相藥物濃度，mg/ml)，外水相滲透壓為1000×2×c/58.5(c為外水相氯化鈉濃度，mg/ml)，而pva分子量在3萬～7萬，其產(chǎn)生的滲透壓可忽略不計(jì)。

結(jié)果表明，在不同的內(nèi)外水相滲透壓差條件下，即通過外水相添加不同濃度的氯化鈉，能夠制備不同孔隙率和載藥量水平的微球。

表2：異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽與胸腺五肽按重量比1:5混合制備的混合熒光微球m3的粒徑、載藥量、孔隙率測定結(jié)果。

結(jié)果表明，混合熒光標(biāo)記微球m3的載藥量結(jié)果與fitc-tp5:tp-5＝1:5(重量比)的投料比例一致。通過與同等條件下制備的無熒光標(biāo)記微球h3的粒徑、載藥量、孔隙率的比較，表明兩種微球基本無差別，同時證明異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽/plga微球可代表胸腺五肽/plga微球用于體內(nèi)釋放研究。

表3：異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽制備的fitc-tp5/plga微球t1-1、t1-2、t2-1、t2-2、t2-3的孔隙率、粒徑、載藥量的測定結(jié)果。

試驗(yàn)例2：微球的體內(nèi)釋放試驗(yàn)

①實(shí)驗(yàn)樣品

參比制劑：異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽，溶于生理鹽水配制濃度為0.2mg/ml(以胸腺五肽計(jì))溶液(fitc-tp5solution)。

受試制劑：如下異硫氰酸熒光素標(biāo)記的胸腺五肽/plga微球，溶于0.5％cmc-na中，制成40mg/ml微球混懸液(以胸腺五肽計(jì))。

t1-1：粒徑24μm，孔隙率3.0％。

t1-2：粒徑28μm，孔隙率5.8％。

t2-1：粒徑47μm，孔隙率12.7％。

t2-2：粒徑45μm，孔隙率3.9％。

t2-3：粒徑50μm，孔隙率4.5％。

②給藥方案

雄性健康sd大鼠30只，體重190～210g，禁食(不禁水)12h以上，隨機(jī)分為6組，每組5只，分別為普通注射液參比組，微球受試制劑t1-1、t1-2、t2-1、t2-2、t2-3組，均采用單次肌肉注射，以tp-5計(jì)，給藥劑量如下：

參比組：1mg/kg，

t1-1、t1-2組：均為20mg/kg，

t2-1、t2-2、t2-3組：均為40mg/kg。

注：試驗(yàn)時考慮到t1-1、t1-2組微球采用的plga材料粘度低，預(yù)計(jì)釋放周期可能較短，故將其劑量減半，劑量本身不會影響體內(nèi)釋藥特征的研究。

③樣品測定

普通注射液參比組于給藥后0,5,10,15,30min,1,2,4,6,10,24h,微球受試組于給藥后0,0.5,1,2,4,10,24h,4,7,14,21,28,35,42,49,56,63d，于眼眶靜脈叢采血約0.3ml，于肝素化具塞離心管中，4500rpm離心10min分離血漿，取100μl于96孔板中采用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度，扣除空白后根據(jù)建立的體內(nèi)分析方法按照體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線：a＝25112c+6.1962，計(jì)算體內(nèi)fitc-tp5的濃度。

④數(shù)據(jù)處理

根據(jù)參比組、各受試微球組不同時間點(diǎn)的血藥濃度數(shù)據(jù)，采用das2.0藥動學(xué)處理軟件，計(jì)算主要參數(shù)auc。

通過微球組與注射液組auc(0-∞)計(jì)算微球相對生物利用度fr＝auc(0-∞)(ms)/auc(0-∞)(injection)×1.0/dosage(ms)×100％。結(jié)果表明，微球的相對生物利用度均＞100％。

微球受試組采用auc％法計(jì)算不同時間的累積釋藥百分率，公式auc％＝auc(0-t)/auc(0-∞)×100％，以累積釋藥百分率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)分別繪制五組受試微球的體內(nèi)累積釋藥曲線，如圖4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，孔隙率不僅會影響體內(nèi)釋藥周期，還明顯地影響微球的體內(nèi)釋放特征。

分別運(yùn)用higuchi、零級和一級數(shù)學(xué)模型，對受試微球的體內(nèi)釋藥模型進(jìn)行動力學(xué)方程擬合，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，孔隙率在12.7％時體內(nèi)釋藥符合higuchi模型，孔隙率在3～6％范圍時，體內(nèi)釋藥均符合零級模型。結(jié)果提示，孔隙率在本發(fā)明范圍內(nèi)時，微球的體內(nèi)釋藥曲線可呈現(xiàn)higuchi動力學(xué)模型或零級模型。

以微球體內(nèi)累積釋放曲線為基礎(chǔ)，計(jì)算不同時間段的日均釋放百分率，分別繪制受試微球日均釋放百分率柱形圖，如圖4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同孔隙率微球具有不同的體內(nèi)釋藥速率。

表4：胸腺五肽/plga微球的體內(nèi)累積釋藥曲線的動力學(xué)模型擬合