專利名稱：一種載多烯紫杉醇plga緩釋微球的制備方法及其在超聲介導下腫瘤間質化療中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于腫瘤間質化療的緩釋制劑，具體而言，本發(fā)明是制備一種多
烯紫杉醇的緩釋制劑，通過超聲影像學技術引導注射到腫瘤組織內，建立一種可較徹底滅活腫瘤，操作簡便，全身毒副作用低的腫瘤間質化療新方法。
背景技術：
多烯紫杉醇是一種新型抗腫瘤藥物，主要通過抑制細胞微管解聚，使紡錘體失去正常功能，導致細胞死亡。此外，多烯紫杉醇還可以抑制細胞DNA、 RNA或蛋白質的合成，對肝癌、卵巢癌、乳腺癌、周圍型肺癌、胰腺癌、頭頸部等腫瘤等有效。由于多烯紫杉醇難溶于水，現行制劑通常使用表面活性劑Tween 80和乙醇增溶，容易導致病人過敏反應。多烯紫杉醇全身給藥后可迅速分布于除中樞神經之外的幾乎所有組織中，常造成骨髓抑制，中性粒細胞減少，外周神經毒性，血液系統毒性、體液儲留等毒副作用。因此，改進多烯紫杉醇劑型與給藥方式，提高腫瘤局部藥物濃度，減輕全身毒副作用具有重要意義。
傳統化療全身給藥后腫瘤局部藥物濃度低，且全身不良反應明顯，對部分實體瘤如肝癌等的療效較差。近年來隨著高分子材料在醫(yī)藥學領域的應用，脂質體、微球、凝膠等藥物控緩釋新制劑不斷涌現，腫瘤間質化療逐漸成為腫瘤治療研究的熱點之一。將抗癌藥物制備成具有緩釋作用的給藥系統，經不同方式，如超聲影像學技術介導下植入腫瘤組織、瘤周組織的間質或腫瘤切除后的瘤床，使藥物在腫瘤局部緩慢、持續(xù)釋放，維持局部較高的藥物濃度，同時降低全身毒副作用。本發(fā)明采用聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)包載抗腫瘤作用強、抗瘤譜廣的多烯紫杉醇，制備一種緩釋制劑，可在超聲影像學技術引導下注射到腫瘤局部進行間質化療，達到高效安全的效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤間質化療的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球，該微球以PLGA包載多烯紫杉醇，可通過超聲影像學技術介導注射到腫瘤組織內，提高腫瘤局部藥物濃度，減輕全身給藥的毒副作用，達到安全高效的目的。 本發(fā)明采用的技術方案是，所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球是將PLGA與多烯紫杉醇通過單乳化法制成的載藥微球。具體說是將PLGA與多烯紫杉醇通過單乳化法制成的載藥微球，所述的載藥微球中的PLGA分子量為5000-50000dal ，乳酸/羥基乙酸摩爾比為75 : 25 50 : 50， PLGA與多烯紫杉醇的投料比為100/1 100/10，在有機溶劑中乳化制備而成，其中水相分散介質采用濃度為1 6%的聚乙烯醇。載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球在下文中簡稱(載藥微球)。 本發(fā)明的載多烯紫杉醇PLGA緩釋微球以PLGA為基質材料，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為100/1到100/10，即100/1 100/10，通過通用的單乳化法制備。所述的載多烯紫杉醇PLGA微球，其PLGA分子量為5000 50000dal，乳酸(lactic acid， LA) /羥基乙酸(glycolic acid，GA)摩爾比為75 : 25 50 : 50，有機溶劑采用二氯甲烷，乳化可采用電動勻漿、超聲乳化或電動攪拌等方法。水相分散介質采用聚乙烯醇，型號可為PVA1788，濃度為1 6%。我們優(yōu)選PLGA的分子量為10000dal， LA/GA = 50/50 (以摩爾比計)的PLGA為基質材料，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為50/3，二氯甲烷為有機相，3X PVA為水相，800轉/分鐘電動攪拌2min，然后加入蒸餾水磁力攪拌4hr進行固化，洗滌3次后冷凍干燥。結果制備的微球平均粒徑為23. 8 ii m，大小較均勻一致，表面光滑、無粘連，包封率達98. 6% ，載藥率達5. 59%，可持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物達6周，緩釋最佳，且實驗表明在超聲引導下載藥微球局部注射抗實驗性裸鼠荷人肝癌作用最佳，能在制備治療肝癌、乳腺癌、卵巢癌、周圍型肺癌、胰腺癌、頭頸部等腫瘤的載藥緩釋微球藥物中的應用。 本發(fā)明的載多烯紫杉醇PLGA緩釋微球具有降低多烯紫杉醇降解的保護作用。多烯紫杉醇在水溶液中穩(wěn)定性差，隨著時間延長，多烯紫杉醇逐漸發(fā)生降解。采用PLGA微球包載多烯紫杉醇，可顯著降低藥物水解。反相疏水高效液相法檢測結果顯示，體外釋放于水溶液的多烯紫杉醇出現了明顯的降解片段吸收峰，而包載在微球內的多烯紫杉醇結構較完整，無明顯降解片段出現。 本發(fā)明的載多烯紫杉醇緩釋微球制劑適用于機體絕大部分實體瘤的超聲介導下間質化療，包括肝、腎、胰腺、脾、前列腺、子宮、卵巢、腹膜后、甲狀腺、乳腺以及頸部和淺表軟組織腫瘤，包括良性和惡性腫瘤。 本發(fā)明的載多烯紫杉醇緩釋微球制劑尤其在注射到荷人肝癌、乳腺癌、卵巢癌的裸鼠腫瘤組織內，通過病理組織學檢查腫瘤壞死情況，結果表明載多烯紫杉醇的緩釋微球可徹底的消融滅活腫瘤，并且顯著減少藥物的全身毒副作用，是一種極具臨床應用前景的超聲介入腫瘤間質化療的新方法。


圖1A為本發(fā)明的多烯紫杉醇-聚乳酸羥基乙酸微球的掃描電鏡X500圖。
圖1B為本發(fā)明的多烯紫杉醇-聚乳酸羥基乙酸微球的掃描電鏡X2000圖。
圖2為本發(fā)明的多烯紫杉醇-聚乳酸羥基乙酸微球體外釋放曲線圖。
圖3A為本發(fā)明的多烯紫杉醇_聚乳酸羥基乙酸微球體外釋放前檢測的HPLC圖，在保留時間約為7. 6min時出現了多烯紫杉醇的吸收峰。 圖3B圖為本發(fā)明的多烯紫杉醇-聚乳酸羥基乙酸微球體外釋放7天的上清液的HPLC圖，在9. 3min時出現了新的吸收峰，峰面積為多烯紫杉醇的28. 1%。
圖3C為本發(fā)明從體外釋放7天的多烯紫杉醇微球抽提多烯紫杉醇的HPLC圖，在9. 3min時也出現了新的吸收峰，但峰面積僅為多烯紫杉醇的5. 2%。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發(fā)明進行詳細說明
實施例 1.載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備載多烯紫杉醇的PLGA微球。精密稱取PLGA 50mg，溶于lml二氯甲烷，加入多烯紫杉醇3mg，渦旋振蕩充分溶解，為有機相。用lml注射器吸取有機相，緩緩注入50ml 3XPVA水溶液中，800rpm電動攪拌2分鐘，繼續(xù)磁力攪拌3小時。固化好的載藥微球經0. 22 i！ m微孔濾膜抽濾，用500ml蒸餾水反復洗滌，收集載藥微球，真空冷凍干燥即得載多烯紫杉醇的PLGA微球。 實驗證明當PLGA與多烯紫杉醇的投料比為50mg/3mg時，所獲得的載多烯紫杉醇
的PLGA緩釋微球具有最佳的包封率和載藥率，分別為98. 6%與5. 59% 。 上述的PLGA基質材料的分子量為10000dal， LA/GA = 50/50 (以摩爾比計)，此材
料可以是市售產品或采用通用的開環(huán)聚合法合成制成。 2.載藥微球表面形態(tài)觀察及粒徑測定 取適量載藥微球凍干粉，置雙面膠帶上，均勻涂布，離子鍍膜儀濺金后，掃描電鏡觀察，微球大小較均勻，表面光滑，分散良好，無粘連，見圖1A和圖1B。測量300個載藥微球的粒徑，平均粒徑為23. 8 ii m。
3.載藥微球包封率和載藥率的測定 采用高效液相色譜法(HPLC)檢領U。色譜條件如下流動相為甲醇/水=70/30，流速為1. 0ml/min，柱溫3(TC，檢測波長227nm。精密稱取多烯紫杉醇適量，加入甲醇溶解成濃度為lmg/ml的標準貯備液。精密量取多烯紫杉醇儲備液0. 05、0. 1、0. 25、0. 5和1. Oml置10ml量瓶中，甲醇定容得系列濃度的對照溶液。20 iU進樣，以峰面積(Y)對對照溶液濃度(X mg/L)進行直線回歸。 精密稱取載藥微球10mg于5ml離心管中，加入0. 5ml 二氯甲烷，超聲使微球溶解，再加入2. 5ml甲醇，渦旋10min，5000Xg離心10min，取上清液進樣20 yl 。測定峰面積，代入標準曲線計算多烯紫杉醇濃度。結果，當PLGA與多烯紫杉醇的投料比為50mg/3mg時可獲得最佳的包封率和載藥率，分別為98. 6%與5. 59%。
4.載藥微球的體外釋放 精密稱取載藥微球10mg置于青霉素瓶中，加入5ml pH為7. 2的磷酸鹽緩沖液(含3 % PEG 6000)，渦旋lmin后在37 °C 、 (75 ± 5) rpm振蕩，分別于第1 、 7 、 14、 21 、 28 、 35 、 42天，5000Xg離心10min，取出所有上清液，同時補充等量釋放液，繼續(xù)振蕩。HPLC法測定釋放液中多烯紫杉醇濃度。結果，載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球釋放較平穩(wěn)，第1天釋放了 4. 2% ，無明顯"突釋"行為，到第42天累積釋放了 65. 3%，見圖2的載多烯紫杉醇PLGA微球的體外釋放曲線圖。 5.體外釋放多烯紫杉醇的結構穩(wěn)定性檢測 精密稱取載藥微球50mg置于青霉素瓶中，加入10ml釋放液，37°C 、 (75±5) rpm振蕩，在第7天，5000 X g離心10min分離上清液，沉淀的載藥微球殘渣真空干燥后，用二氯甲烷溶解，甲醇萃取多烯紫杉醇，HPLC法測定釋放液和沉淀微球的多烯紫杉醇，比較吸收峰的差異。用于參照的圖3A為載藥微球體外釋放前檢測的HPLC圖，在保留時間約為7. 6min時出現了多烯紫杉醇的吸收峰。載藥微球體外釋放上清液在保留時間約為9. 3min時出現一新的吸收峰，峰面積約為多烯紫杉醇峰面積的28. 1X，見3B，說明體外釋放的多烯紫杉醇出現了降解。體外釋放后的載藥微球在保留時間約為9. 3min亦可見該吸收峰峰，但峰面積極小，僅為多烯紫杉醇峰面積的5. 2%，見圖3C。這表明包載在PLGA微球的多烯紫杉醇比釋放在緩沖液中的藥物更穩(wěn)定，PLGA載體具有保護多烯紫杉醇藥物，減少其發(fā)生降解的作用。
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6.超聲引導下載藥微球局部注射抗實驗性裸鼠荷人肝癌作用
人肝癌Bel-7404細胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，細胞融合生長至90%后，收集細胞制備5 X 107cells/ml的單細胞懸液。取雄性BALB/c-皿裸小鼠，右腋下接種0. 2ml細胞懸液，14天后選取腫瘤直徑1. 5-2. Ocm的50只，隨機分成5組，為模型對照組、空白微球組、多烯紫杉醇靜脈給藥組、多烯紫杉醇微球瘤內注射給藥高、低劑量組，每組10只。微球給藥組裸鼠在超聲引導下，將微球注射到腫瘤局部，使藥物均勻分布到整個腫瘤。結果，模型組與空白微球裸鼠的腫瘤持續(xù)生長，而各給藥組都表現出一定的抗腫瘤作用，其中多烯紫杉醇微球瘤體內注射高劑量組抗腫瘤作用最顯著，抑瘤率高達72. 67%。注射后14天每組取3只裸鼠腫瘤進行病理檢查，可見腫瘤組織大片壞死，微血管密度減低。取腫瘤組織進行熒光定量PCR檢測腫瘤血管生成相關基因VEGF、Ang2、bFGF表達的變化，結果見載藥微球組基因表達明顯下調(表l)。余下裸鼠觀察42天，剝離腫瘤稱質量，各組裸鼠的抑瘤率見表2。 表1各組裸鼠腫瘤組織VEGF、 Ang2、 bFGF基因表達的A Ct值比較
組另ljVEGFAng2bFGF
模型對照組0. 68±0. 293. 34±0. 772. 44±0. 63
空白微球對照組0. 77±0. 422.97±0. 832. 81土0. 96
多烯紫杉醉靜脈組1. 76±0. 574. ll土l. 093. 33±0. 88
多烯紫杉醇微球高劑量組3. 17±1.055. 08±1. 544. 02 ±1. 12
多烯紫杉醇微球低劑量組2. 76±0. 974. 59土1.663. 47±0. 79 表2多烯紫杉醇微球對荷人肝癌裸鼠抗腫瘤作用
組另!J 瘤質量(g) 抑瘤率(％)
模型對照組4. 61 ±0. 93一
空白微球對照組4. 83 ±1.02一
多烯紫杉醇靜脈組3. 68±0. 7720. 17
多烯紫杉醇微球高劑量組1.26±0. 2572.67
多烯紫杉醇微球低劑量組2. 33±0. 4649. 46 7.載藥微球局部注射抗實驗性裸鼠荷人乳腺癌作用 人乳腺癌MDA-MB-231細胞體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液，細胞融合生長至90%后，收集細胞制備5X 107cells/mL的單細胞懸液。取雌性BALB/c-皿裸小鼠，于右腋下接種0. 2ml， 14天后隨機分為模型組、空白微球對照組、多烯紫杉醇靜脈注射組、多烯紫杉醇微球注射組，每組6只。給藥后42天剝離腫瘤稱質量，結果多烯紫杉醇微球組抑瘤率達83. 5%，明顯高于靜脈注射組的33. 8% 。
8.載藥微球局部注射抗實驗性裸鼠荷人卵巢癌作用 人卵巢癌細胞SK0V3體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，細胞融合生長至90%后，收集細胞制備5X 107cells/mL的單細胞懸液。取雌性BALB/c-皿裸小鼠，于右腋下接種0. 2ml， 14天后隨機分為模型組、空白微球對照組、多烯紫杉醇靜脈注射組、多烯紫杉醇微球瘤內注射組，每組6只。給藥后42天剝離腫瘤稱質量，結果多烯紫杉醇微球組抑瘤率達79. 2%，明顯高于靜脈注射組的29. 4%。
權利要求
一種載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球，其特征在于是將PLGA與多烯紫杉醇通過單乳化法制成的載藥微球，所述的載藥微球中的PLGA分子量為5000-50000dal，乳酸/羥基乙酸摩爾比為75∶25～50∶50，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為100/1～100/10，在有機溶劑中乳化制備而成，其中水相分散介質采用濃度為1～6％的聚乙烯醇。
2. 根據權利要求1所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球，其特征在于所述的PLGA的分子量為10000dal，乳酸/羥基乙酸摩爾比為50/50，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為50/3，二氯甲烷為有機相，3% PVA為水相，乳化制備成平均粒徑為23.8ym，包封率為98.6%，載藥率為5. 59%的載藥微球。
3. 權利要求1所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球制備方法，包括如下步驟稱取配比量的PLGA溶于二氯甲烷，加入配比量的多烯紫杉醇，渦旋振蕩充分溶解，為有機相；用注射器吸取有機相，緩緩注入適宜量及適宜濃度的PVA水溶液中，電動攪拌后繼續(xù)磁力攪拌，固化好的載藥微球經0. 22陽微孔濾膜抽濾，用適量蒸餾水反復洗滌，收集載藥微球，真空冷凍干燥即得載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球。
4. 根據權利要求3所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球制備方法，其特征在于所述的PLGA分子量為5000-50000dal，乳酸/羥基乙酸摩爾比為75 : 25 50 : 50，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為100/1 100/10，聚乙烯醇濃度為1 6%。
5. 根據權利要求4所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球制備方法，其特征在于所述的PLGA的分子量為10000dal，乳酸/羥基乙酸摩爾比為50/50，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為50/3， 二氯甲烷為有機相，3 % PVA為水相，乳化制備成平均粒徑為23. 8 y m，包封率為98. 6 % ，載藥率為5. 59 %的載藥微球。
6. 權利要求1所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球，在制備治療肝癌、乳腺癌、卵巢癌、周圍型肺癌、胰腺癌、頭頸部等腫瘤的載藥緩釋微球藥物中的應用。
7. 權利要求1所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球，在超聲介導下腫瘤間質化療中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種載多烯紫杉醇PLGA緩釋微球的制備方法及其在超聲介導下腫瘤間質化療中的應用，所述的載多烯紫杉醇的PLGA緩釋微球是將PLGA與多烯紫杉醇通過單乳化法制成的載藥微球，所述的載藥微球中的PLGA分子量為5000-50000dal，乳酸/羥基乙酸摩爾比為75∶25～50∶50，PLGA與多烯紫杉醇的投料比為100/1～100/10，在有機溶劑中乳化制備而成。本發(fā)明的載多烯紫杉醇緩釋微球制劑在注射到荷人肝癌、乳腺癌、卵巢癌的裸鼠腫瘤組織內，通過病理組織學檢查腫瘤壞死情況，結果表明載多烯紫杉醇的緩釋微球可徹底的消融滅活腫瘤，并且顯著減少藥物的全身毒副作用，是一種極具臨床應用前景的超聲介入腫瘤間質化療的新方法。
文檔編號A61K9/16GK101697963SQ20091011271
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月29日
發(fā)明者林禮務, 蔡敏嫻, 薛恩生, 陳志奎 申請人:福建醫(yī)科大學附屬協和醫(yī)院