相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求2014年10月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/072,031和2015年3月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/134,955的權(quán)益；為了所有目的，這兩者都通過引用并入本文。

本發(fā)明涉及使用非巖藻糖基化抗cd40抗體治療癌癥和慢性感染性疾病的方法。

發(fā)明背景

cd40是腫瘤壞死因子(tnf)受體超家族的成員。它是具有表面50kda分子量的單鏈i型跨膜蛋白。cd40由一些癌細(xì)胞例如淋巴瘤細(xì)胞和幾種類型的實(shí)體瘤細(xì)胞表達(dá)。cd40還通過促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞和t細(xì)胞之間的接觸依賴性相互作用來激活免疫系統(tǒng)。盡管已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中測(cè)試了許多抗cd40抗體，但至今沒有一個(gè)表現(xiàn)出足夠的活性。本發(fā)明解決了這個(gè)和其他問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開提供治療癌癥的方法，通過向需要這種治療的患者給予抗cd40抗體?？筩d40抗體包含seqidno：1的重鏈可變區(qū)和seqidno：2的輕鏈可變區(qū)，以及人恒定區(qū)。恒定區(qū)在根據(jù)kabat所述的eu指數(shù)的殘基n297處具有n-糖苷連接的糖鏈，并且小于5％的n-糖苷連接的糖鏈包括巖藻糖殘基，即通過與n-乙酰葡糖胺(“glcnac”)的α1，6鍵結(jié)合至糖鏈的還原末端的巖藻糖?？筩d40抗體的給予的劑量水平為0.1-300μg/kg(μg抗體/千克患者體重)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為0.6-150μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為1.0-100μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為5-25μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為8-12μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為約10μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體劑量水平為10μg/kg。

在另一方面，本公開提供治療癌癥的方法，通過向需要這種治療的患者給予抗cd40抗體?？筩d40抗體包含seqidno：1的重鏈可變區(qū)和seqidno：2的輕鏈可變區(qū)，以及人恒定區(qū)。恒定區(qū)在根據(jù)kabat所述的eu指數(shù)的殘基n297處具有n-糖苷連接的糖鏈，并且小于5％的n-糖苷連接的糖鏈包括巖藻糖殘基，即通過與n-乙酰葡糖胺(“glcnac”)的α1，6鍵結(jié)合至糖鏈的還原末端的巖藻糖?？筩d40抗體的給予的劑量水平為0.1-2000μg/kg(μg抗體/千克患者體重)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該劑量水平為10-1000μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該劑量水平為50-800μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該劑量水平為75-600μg/kg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該劑量水平為100-500μg/kg。在其他實(shí)施方式中，劑量水平是選自下述的范圍：100-300μg/kg，300-500μg/kg，500-700μg/kg，700-900μg/kg，和900-1100μg/kg。在其他實(shí)施方式中，劑量水平是選自下述的范圍：100-150μg/kg，150-200μg/kg，200-250μg/kg，250-300μg/kg，300-350μg/kg，350-400μg/kg，400-450μg/kg，450-500μg/kg，500-550μg/kg，550-600μg/kg，600-650μg/kg，650-700μg/kg，700-750μg/kg，750-800μg/kg，800-850μg/kg，850-900μg/kg，900-950μg/kg，950-1000μg/kg，1000-1050μg/kg，和1050-1100μg/kg。在其他實(shí)施方式中，劑量水平選自：約60μg/kg、約100μg/kg、約150μg/kg、約200μg/kg，aabout250μg/kg、約300μg/kg、約350μg/kg、約400μg/kg、約450μg/kg、約500μg/kg、約550μg/kg、約600μg/kg、約650μg/kg、約700μg/kg、約750μg/kg、約800μg/kg、約850μg/kg、約900μg/kg、約950μg/kg、約1000-1050μg/kg、約1050μg/kg和1110μg/kg。

在一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每三周給予。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每六周給予。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每十周給予。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每12周給予。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每15周給予。在另一個(gè)實(shí)施方式中，抗cd40抗體每18周給予。

在另一實(shí)施方式中，所述患者患有cd40陽性癌癥。在另一實(shí)施方式中，所述患者患有cd40陰性癌癥。在其他實(shí)施方式中，患者具有的癌癥為實(shí)體瘤。在另一實(shí)施方式中，患者具有的癌癥為血液癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是黑素瘤，乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌，肺癌，包括非小細(xì)胞肺癌或胰腺癌。

在另一方面，本公開提供了通過向患者給予阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體和抗cd40抗體的組合來治療癌癥的方法。阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體的一個(gè)示例是抗細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla4)抗體?？筩tla4抗體的示例包括例如自伊匹單抗(ipilimumab)或特姆單抗(tremelimumab)。阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體的另一個(gè)示例是抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd1)抗體?？筽d1抗體的實(shí)例包括，例如，尼莫單抗(nivolumab)、多替珠單抗(pidilizumab)或彭美羅珠單抗(pembrolizumab)。阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體的另一個(gè)示例是抗程序性死亡配體(pd-l1)抗體?？筽d-l1抗體的示例包括例如medi4736和mpdl3280a。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者具有cd40陽性癌癥，并且用抗-cd40抗體和阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體(例如抗ctla4抗體，抗pd1抗體或抗pd-l1抗體)的組合進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者具有cd40陰性癌癥，并且用抗-cd40抗體和阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體(例如抗ctla4抗體，抗pd1抗體或抗pd-l1抗體)的組合進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者具有的癌癥是實(shí)體瘤，并且用抗-cd40抗體和阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體(例如抗ctla4抗體，抗pd1抗體或抗pd-l1抗體)的組合進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者具有的癌癥是血清癌癥，并且用抗-cd40抗體和阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體(例如抗ctla4抗體，抗pd1抗體或抗pd-l1抗體)的組合進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是黑素瘤，乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌，肺癌，包括非小細(xì)胞肺癌或胰腺癌，并且用抗-cd40抗體和阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體(例如抗ctla4抗體，抗pd1抗體或抗pd-l1抗體)的組合進(jìn)行治療。

定義

“多肽”或“多肽鏈”是氨基酸殘基通過肽鍵連接而成的聚合物，可為天然或合成產(chǎn)生。少于約10個(gè)氨基酸殘基的多肽通常稱作“肽”。

“蛋白質(zhì)”是包含一條或多條多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)還可包含非肽組分，如碳水化合物基團(tuán)。碳水化合物和其它非肽取代基可由產(chǎn)生蛋白的細(xì)胞加入到蛋白中，其會(huì)隨細(xì)胞類型而變化。本文在其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)方面限定蛋白；取代基(例如碳水化合物基團(tuán))通常未指定，但是可以存在。

本文使用的術(shù)語“氨基末端”和“羧基末端”指多肽中的位置。上下文允許時(shí)，這些術(shù)語根據(jù)多肽特定序列或部分使用以表示附近或相對(duì)位置。例如，多肽中相對(duì)參照序列位于羧基末端的某些序列位于參照序列的羧基末端附近，但并不必需在完整多肽的羧基末端。

本文所用術(shù)語“抗體”指因抗原存在產(chǎn)生響應(yīng)而由身體生產(chǎn)且結(jié)合該抗原的免疫球蛋白，以及其抗原結(jié)合片段和經(jīng)工程改造的變體。因此，術(shù)語“抗體”包括例如包含全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈和輕鏈的完整單克隆抗體(如使用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體)和結(jié)合抗原的抗體片段(如f(ab′)2和fab片段)。還包括遺傳工程改造的完整抗體和片段，如嵌合抗體、人源化抗體、單鏈fv片段、單鏈抗體、雙抗體、小抗體、線性抗體、多價(jià)或多特異性(如雙特異性)雜交抗體等。因此，術(shù)語“抗體”廣義地用于包括含有抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)且能夠特異性結(jié)合其抗原的任何蛋白。

“抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)”是足以結(jié)合其抗原的抗體的一部分。最小的這類區(qū)域通常是可變結(jié)構(gòu)域或其遺傳改造的變體。單結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)可來自駝科動(dòng)物抗體(參見muyldermans和lauwereys，j.mol.recog.12：131-140，1999；nguyen等，emboj.19：921-930，2000)或來自其他物種的vh結(jié)構(gòu)域以生成單結(jié)構(gòu)域抗體(“dab”；參見ward等，nature341：544-546，1989；winter等的美國(guó)專利號(hào)6,248,516)。在某些變化形式中，抗原結(jié)合位點(diǎn)是具有天然或非天然(如誘變)產(chǎn)生的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或其組合的僅2個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的多肽區(qū)域(參見例如pessi等，nature362：367-369，1993；qiu等，naturebiotechnol.25：921-929，2007)。更常見的，抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含與共同表位結(jié)合的重鏈可變(vh)結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變(vl)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，抗體除抗原結(jié)合位點(diǎn)外還可包含一種或多種組分，例如抗體的第二抗原結(jié)合位點(diǎn)(其可結(jié)合相同或不同的表位或者相同或不同的抗原)、肽接頭、免疫球蛋白恒定區(qū)、免疫球蛋白鉸鏈、兩親螺旋(參見pack和pluckthun，biochem.31：1579-1584，1992)、非肽接頭、寡核苷酸(參見chaudri等，febsletters450：23-26，1999)、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性藥物或細(xì)胞毒性藥物等，且可以是單亞基或多亞基蛋白。包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子的示例是本領(lǐng)域已知的且包括例如fv、單鏈fv(scfv)、fab、fab′、f(ab′)2、f(ab)c、雙抗體、dab、小抗體、納米抗體、fab-scfv融合體、雙特異性(scfv)4-igg和雙特異性(scfv)2-fab(參見例如hu等，cancerres.56：3055-3061，1996；atwell等，molecularimmunology33：1301-1312，1996；carter和merchant，curr.opin.biotechnol.8：449-454，1997；zuo等，proteinengineering13：361-367，2000；以及l(fā)u等，j.immunol.methods267：213-226，2002)。

本文所用術(shù)語“免疫球蛋白”指由一種或多種多肽組成的蛋白，所述一種或多種多肽基本由免疫球蛋白基因編碼。免疫球蛋白的一種形式構(gòu)成了脊椎動(dòng)物中天然(即自然)抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。該形式是四聚體且由兩個(gè)相同的免疫球蛋白鏈的對(duì)組成，各對(duì)具有一條輕鏈和一條重鏈。在各對(duì)中，輕鏈和重鏈可變區(qū)(vl和vh)共同主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，且恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)功能。在較高等的脊椎動(dòng)物中已鑒定到了五種類別的免疫球蛋白(igg、iga、igm、igd和ige)。igg是主要類別；其通常以血漿中發(fā)現(xiàn)的第二豐富蛋白的形式存在。人中，igg由四個(gè)稱為igg1、igg2、igg3和igg4的亞類組成。igg類的重鏈恒定區(qū)被確定為希臘字母γ。例如，igg1亞類的免疫球蛋白含有γ1重鏈恒定區(qū)。各免疫球蛋白重鏈都具有由恒定區(qū)蛋白結(jié)構(gòu)域(ch1、鉸鏈、ch2和ch3；igg3還含有ch4結(jié)構(gòu)域)組成的恒定區(qū)，所述恒定區(qū)蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)τ谀澄锓N中給定的亞類而言基本不變。編碼人和非人免疫球蛋白鏈的dna序列為本領(lǐng)域熟知。(參見例如ellison等，dna1：11-18，1981；ellison等，nucleicacidsres.10：4071-4079，1982；kenten等，proc.natl.acad.sci.usa79：6661-6665，1982；seno等，nuc.acidsres.11：719-726，1983；riechmann等，nature332：323-327，1988；amster等，nuc.acidsres.8：2055-2065，1980；rusconi和kohler，nature314：330-334，1985；boss等，nuc.acidsres.12：3791-3806，1984；bothwell等，nature298：380-382，1982；vanderloo等，immunogenetics42：333-341，1995；karlin等，j.mol.evol.22：195-208，1985；kindsvogel等，dna1：335-343，1982；breiner等，gene18：165-174，1982；kondo等，eur.j.immunol.23：245-249，1993；以及genbank登錄號(hào)j00228)。對(duì)于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的綜述，參見putnam，theplasmaproteins(《血漿蛋白質(zhì)》)，卷v，學(xué)術(shù)出版社公司(academicpress，inc.)，49-140，1987；以及padlan，mol.immunol.31：169-217，1994。術(shù)語“免疫球蛋白”在本文中以其常用含義使用，指完整的抗體、其組成鏈或鏈的片段(取決于上下文)。

全長(zhǎng)免疫球蛋白“輕鏈”(約25kda或214個(gè)氨基酸)在氨基末端處由可變區(qū)基因編碼(編碼約110個(gè)氨基酸)且在羧基末端處由κ或λ恒定區(qū)基因編碼。全長(zhǎng)免疫球蛋白“重鏈”(約50kd或446個(gè)氨基酸)由可變區(qū)基因(編碼約116個(gè)氨基酸)和γ、μ、α、δ或ε恒定區(qū)基因(編碼約330個(gè)氨基酸)編碼，后者分別將抗體的同種型限定為igg、igm、iga、igd或ige。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過約12個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈也包括約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“d”區(qū)。(一般參見，fundamentalimmunology(《基礎(chǔ)免疫學(xué)》)(paul編，紐約拉文出版社，第2版，1989)第7章)。

免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)(在本文中也分別稱為“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域”(“vl結(jié)構(gòu)域”)或“重鏈可變結(jié)構(gòu)域”(“vh結(jié)構(gòu)域”))由被三個(gè)高變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”)間斷的“框架”區(qū)組成?？蚣軈^(qū)的功能是將用于特異性結(jié)合的cdr與抗原的表位對(duì)齊。因此，術(shù)語“高變區(qū)”或“cdr”指主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。從氨基末端至羧基末端，vl和vh結(jié)構(gòu)域都包含以下框架區(qū)(fr)和cdr區(qū)：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。各結(jié)構(gòu)域氨基酸的分配與kabat，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(《免疫學(xué)感興趣蛋白的序列》)(馬里蘭州貝塞斯達(dá)的國(guó)立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)(1987和1991))或chothia和lesk，j.mol.biol.196：901-917(1987)；chothia等，nature342：878-883(1989)的定義一致。kabat還提供了廣泛使用的編號(hào)慣例(kabat編號(hào))，其中為不同重鏈之間或不同輕鏈之間相應(yīng)的殘基分配了相同的編號(hào)。vl結(jié)構(gòu)域的cdr1、2和3在本文中還分別稱作cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3；vh結(jié)構(gòu)域的cdr1、2和3在本文中還分別稱作cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。

除非上下文另有說明，否則本文所用術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指衍生自單個(gè)克隆，包括真核、原核或噬菌體克隆的抗體，而非其產(chǎn)生方法。

術(shù)語“嵌合抗體”是指具有衍生自第一物種的可變結(jié)構(gòu)域和衍生自第二物種的恒定區(qū)的抗體。例如，可通過遺傳工程由屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建嵌合免疫球蛋白或抗體。下文定義的術(shù)語“人源化抗體”并不旨在包括嵌合抗體。如本文所述，雖然人源化抗體在其構(gòu)建中是嵌合的(即，包含來自超過一種蛋白質(zhì)的區(qū)域)，但是它們包括其他未在嵌合免疫球蛋白或抗體中發(fā)現(xiàn)的特征(即，包括供體cdr殘基和受體框架殘基的可變區(qū))。

術(shù)語“人源化vh結(jié)構(gòu)域”或“人源化vl結(jié)構(gòu)域”指包含完全或基本來自非人供體免疫球蛋白(如小鼠或大鼠)的一些或全部cdr和完全或基本來自人免疫球蛋白序列的可變區(qū)框架序列的免疫球蛋白vh或vl結(jié)構(gòu)域。提供cdr的非人免疫球蛋白稱作“供體”且提供框架區(qū)的人免疫球蛋白稱作“受體”。在一些情況下，人源化抗體會(huì)保留人可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)內(nèi)的一些非人殘基以增強(qiáng)適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性(例如，當(dāng)抗體是人源化的時(shí)候，需要框架區(qū)中的突變以保留結(jié)合親和力)。

“人源化抗體”是包含人源化vh結(jié)構(gòu)域和人源化vl結(jié)構(gòu)域之一或全部?jī)蓚€(gè)的抗體。無需存在免疫球蛋白恒定區(qū)，但如果存在，其完全或基本來自于人免疫球蛋白恒定區(qū)。

抗體與其靶標(biāo)抗原的特異性結(jié)合指親和力為至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰m^-1。特異性結(jié)合在幅度上可檢測(cè)地高于與至少一個(gè)不相關(guān)靶標(biāo)之間的非特異性結(jié)合并可與之區(qū)分。特異性結(jié)合可以是特定空間擬合(如鎖和鑰匙類型)或特定官能團(tuán)之間鍵形成的結(jié)果，而非特異性結(jié)合通常是范德華力的結(jié)果。然而，特異性結(jié)合并不必然表示單克隆抗體結(jié)合一個(gè)且僅結(jié)合一個(gè)靶標(biāo)。

關(guān)于本文所述的蛋白，與seqidno所指定氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基包括這類殘基的翻譯后修飾。

本文使用的術(shù)語“稀釋劑”是指適用于改變或達(dá)到本文所述的示例性或合適濃度的溶液。

術(shù)語“容器”是指其中可放置或包含物體或液體例如用于儲(chǔ)存的東西(例如，盛放器、容器、器皿等)。

術(shù)語“給藥途徑”包括用于遞送治療性蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域公認(rèn)的給藥途徑，例如，胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。對(duì)于用于治療癌癥的抗體的給藥，可能需要通過靜脈內(nèi)或皮下給藥來向全身循環(huán)中給藥。對(duì)于由實(shí)體瘤表征的癌癥的治療，如果需要，還可直接對(duì)腫瘤進(jìn)行局部給藥。

術(shù)語“治療”是指向患病的患者給予治療劑，目的在于治愈、愈合、緩解、延緩、釋放、改變、補(bǔ)救、減輕、改善或影響疾病。

術(shù)語“患者”包括接受預(yù)防性或治療性治療的人和其他哺乳動(dòng)物對(duì)象。

術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指足以實(shí)現(xiàn)或至少部分實(shí)現(xiàn)所需效果的量，即足以抑制疾病或病癥的一種或多種癥狀的出現(xiàn)或使其緩解的量。以“有效方案”給予有效量的藥物組合物。術(shù)語“有效方案”指適于實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病或病癥的預(yù)防性或治療性治療的劑量頻率和給予的組合物量的組合。

本文所用術(shù)語“約”表示具體值加減10％的大致范圍。例如，表述“約20μg/kg”涵蓋18-22μg/kg的范圍。本文所用的約也包括準(zhǔn)確量。因此，“約20μg/kg”表示“約20μg/kg”以及“20μg/kg”。

附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1提供了sea-cd40(實(shí)線)和達(dá)西珠單抗(虛線)對(duì)存在于pbmc表面上的人cd40蛋白的結(jié)合。

圖2a和2b提供了sea-cd40(空心和實(shí)心方塊)和達(dá)西珠單抗(空心和實(shí)心圓圈)對(duì)人fcγiiia受體變體的結(jié)合親和力。圖2a提供了圖形表示，圖2b提供了kd值。sea-cd40值顯示在左列；達(dá)西珠單抗值列于右欄。

圖3提供了sea-cd40處理的結(jié)果，來自人外周血單核細(xì)胞(pbmc)的b細(xì)胞消耗的劑量關(guān)系和時(shí)程。

圖4a和4b顯示了用sea-cd40或同種型對(duì)照(sea-h00)處理24小時(shí)后人全血的代表性細(xì)胞因子的產(chǎn)生?？贵w以μg/ml為單位給予。圖4a顯示腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生，圖4b顯示了mip-1β的產(chǎn)生。

圖5a和5b顯示了用sea-cd40或同種型對(duì)照(sea-h00)處理24小時(shí)后人pbmc的代表性細(xì)胞因子的產(chǎn)生?？贵w以μg/ml為單位給予。圖5a顯示腫瘤壞死因子-α(tnf-α)的產(chǎn)生，圖5b顯示了mip-1β的產(chǎn)生。

圖6提供了sea-cd40(實(shí)心方塊)、達(dá)西珠單抗(灰色圓圈)或sea-cd40f(ab’)2(灰色方塊)處理的結(jié)果：來自人pbmc的b細(xì)胞消耗的時(shí)程。

圖7提供了sea-cd40(實(shí)心方塊)、達(dá)西珠單抗(灰色圓圈)或sea-cd40f(ab’)2(灰色方塊)處理的結(jié)果：pbmc的干擾素γ(ifnγ)的產(chǎn)生。

圖8顯示sea-cd40(實(shí)心方塊)、達(dá)西珠單抗(灰色圓圈)或sea-cd40f(ab’)2(灰色方塊)處理的結(jié)果：pbmc對(duì)抗原呈遞細(xì)胞成熟標(biāo)志物hla-dr/dq/dp的誘導(dǎo)。

圖9提供了用不同濃度的sea-cd40處理的pbmc中免疫激活標(biāo)志物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)曲線。

圖10a和10b比較了通過用sea-cd40或達(dá)西珠單抗孵育pbmc產(chǎn)生的m1流感肽的免疫響應(yīng)。圖10a顯示抗原特異性t細(xì)胞的水平百分比；圖10b顯示ifn-γ生產(chǎn)的水平。

圖11顯示了用sea-cd40和抗ctla-4抗體或抗pd-1抗體的組合孵育的pbmc對(duì)m1流感肽的免疫響應(yīng)的增強(qiáng)。ifnγ水平如圖11所示。

圖12顯示了用sea-cd40和抗ctla-4抗體或抗pd-1抗體的組合孵育的pbmc對(duì)m1流感肽的免疫響應(yīng)的增強(qiáng)?？乖禺愋詔細(xì)胞的水平如圖12所示。

圖13提供了來自具有癌癥的供體的pbmc對(duì)常見腫瘤抗原肽(magea1/mage3/ny-eso)的免疫響應(yīng)(ifnγ產(chǎn)生)。在存在或不存在增加濃度的sea-cd40或sgn-40的情況下將pbmc孵育5天。

圖14提供了來自具有癌癥的供體的pbmc對(duì)常見腫瘤抗原肽(magea1/mage3/ny-eso)的免疫響應(yīng)(ifnγ產(chǎn)生)。在存在或不存在增加濃度的sea-cd40和/或恒定濃度的抗ctla4或抗pd1阻斷抗體的情況下孵育pbmc。

圖15a和15b顯示巖藻糖基化和非巖藻糖基化抗小鼠cd40抗體與鼠fcγ受體的結(jié)合。fcγ受體是fcγri(圖15a)或fcγriv(圖15b)。

圖16顯示小鼠b16黑素瘤模型中巖藻糖基化和非巖藻糖基化抗cd40抗體替代物的體內(nèi)活性。

圖17顯示sea-cd40、抗體21.4.1和cd40六聚體配體的b細(xì)胞活化活性。使用純化的b細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖18顯示sea-cd40、抗體21.4.1和cd40六聚體配體的b細(xì)胞活化活性。使用pbmc培養(yǎng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖19顯示sea-cd40，抗體21.4.1，達(dá)西珠單抗和sea同種型對(duì)照的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化活性。

圖20顯示sea-cd40，抗體21.4.1，達(dá)西珠單抗或sea同種型對(duì)照對(duì)干擾素-γ(ifn-γ)水平的誘導(dǎo)。

圖21顯示sea-cd40，抗體21.4.1，達(dá)西珠單抗或sea同種型對(duì)照對(duì)白介素10(il10)水平的誘導(dǎo)。

圖22顯示sea-cd40，抗體21.4.1或達(dá)西珠單抗對(duì)干擾素-γ(ifn-γ)水平的誘導(dǎo)。在流感肽存在下進(jìn)行孵育。

圖23顯示了sea-cd40，抗體21.4.1或達(dá)西珠單抗對(duì)流感抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)的誘導(dǎo)。

圖24顯示了pbmc與流感肽和sea-cd40，抗體21.4.1或達(dá)西珠單抗孵育后il10水平的變化。

發(fā)明詳述

本公開提供非巖藻糖基化抗cd40抗體sea-cd40的活性的描述。sea-cd40是一種激動(dòng)性抗體，并具有與fcγ受體iii的增強(qiáng)結(jié)合，令人驚奇地表現(xiàn)出cd40信號(hào)通路的增強(qiáng)活化。由于其cd40途徑的增強(qiáng)活化，sea-cd40是免疫系統(tǒng)的有效激活劑，可用于治療癌癥或治療感染性疾病，特別是慢性病毒性疾病，如丙型肝炎，人類免疫缺陷病毒，eb病毒，巨細(xì)胞病毒，約翰坎寧安病毒和人乳頭狀瘤病毒。其他感染性疾病包括例如結(jié)核病。與巖藻糖基化的親本抗體相比，免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)活化允許sea-cd40以低水平給藥。

cd40的描述和功能。

cd40是腫瘤壞死因子(tnf)受體超家族的成員。它是具有表面50kda分子量的單鏈i型跨膜蛋白。其成熟多肽核心由237個(gè)氨基酸組成，其中173個(gè)氨基酸包含組織成4個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)，這是tnf受體家族成員的特征。兩個(gè)潛在的n-連接的糖基化位點(diǎn)存在于ecd的膜近端區(qū)域，而潛在的o-連接的糖基化位點(diǎn)不存在。22個(gè)氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)cd與cd40的42個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾部連接。參與cd40介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的序列基序已經(jīng)在cd40細(xì)胞質(zhì)尾部中被鑒定。這些基序與稱為tnf-r相關(guān)因子(traf)的細(xì)胞質(zhì)因子相互作用以觸發(fā)多個(gè)下游事件，包括map激酶和nfκb的激活，其繼而調(diào)節(jié)各種炎癥、存活和生長(zhǎng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。參見例如vankooten和banchereau，j.leukoc.biol.67：2-17(2000)；elgueta等，immunol.rev.229：152-172(2009)。

在造血系統(tǒng)中，可以在分化的多個(gè)階段的b細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、濾泡樹突狀細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dc)、嗜酸性粒細(xì)胞和活化的t細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)cd40。在正常的非造血組織中，已經(jīng)在腎上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞和皮膚源以及激活的內(nèi)皮上檢測(cè)到cd40。cd40的可溶性形式從cd40表達(dá)細(xì)胞釋放，可能通過初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的差異剪接或金屬蛋白酶tnfα轉(zhuǎn)化酶的有限蛋白水解來釋放。shedcd40可以通過干擾cd40/cd40l相互作用來潛在地修飾免疫響應(yīng)。參見例如vankooten和banchereau，j.leukoc.biol.67：2-17(2000)；elgueta等，immunol.rev.229：152-172(2009)。

cd40(cd40l)的內(nèi)源性配體是39kda的ii型膜糖蛋白，也稱為cd154。cd40l是tnf超家族的成員，在細(xì)胞表面表達(dá)為三聚體。cd40l在活化的cd4+、cd8+和γδt細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)。cd40l也在純化的單核細(xì)胞、活化的b細(xì)胞、上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和dc上以可變水平檢測(cè)到，但是這些細(xì)胞類型上cd40l表達(dá)的功能相關(guān)性尚未明確定義(vankooten2000；elgueta2009)。然而，cd40l在活化的血小板上的表達(dá)已經(jīng)涉及血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制。參見例如ferroni等，curr.med.chem.14：2170-2180(2007)。

cd40/cd40l相互作用的最佳表征功能是其在抗原呈遞細(xì)胞和t細(xì)胞之間的接觸依賴性相互作用中的作用。參見例如vankooten和banchereau，j.leukoc.biol.67：2-17(2000)；elgueta等，immunol.rev.229：152-172(2009)。激活的t細(xì)胞上的cd40l與抗原激活的b細(xì)胞上的cd40的結(jié)合不僅可以促進(jìn)b細(xì)胞的快速擴(kuò)增，而且還為b細(xì)胞分化為記憶b細(xì)胞或漿細(xì)胞提供必要的信號(hào)。cd40信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)責(zé)形成生發(fā)中心，其中b細(xì)胞經(jīng)歷親和力成熟和同種型轉(zhuǎn)換以獲得產(chǎn)生igg，iga和ige同種型的高親和力抗體的能力。參見例如kehry，j.immunol.156：2345-2348(1996)。因此，具有阻止功能性cd40/cd40l相互作用的cd40l基因座突變的個(gè)體患有原發(fā)性免疫缺陷型x連鎖超igm綜合征，其特征在于過度表達(dá)循環(huán)igm和不能產(chǎn)生igg，iga和ige。這些患者表現(xiàn)出抑制的繼發(fā)性體液免疫響應(yīng)，增加的對(duì)復(fù)發(fā)性致熱感染的易感性，以及更高頻率的癌和淋巴瘤。在小鼠中進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)以使cd40或cd40l基因座失活重現(xiàn)了x連鎖超igm患者中觀察到的主要缺陷。這些ko小鼠也顯示受損的抗原特異性t細(xì)胞啟動(dòng)，表明cd40l/cd40相互作用也是開展細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)的關(guān)鍵因素。參見例如elgueta等，immunol.rev.229：152-172(2009)。

抗cd40或cd40l的cd40連接的體內(nèi)免疫刺激作用與針對(duì)同基因腫瘤的免疫反應(yīng)有關(guān)。參見例如french等nat.med.5：548-553(1999)。針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫響應(yīng)的缺陷可能來自下述因素的組合：源于諸如pd-1或ctla-4的免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)，mhc抗原表達(dá)降低，腫瘤相關(guān)抗原差表達(dá)，適當(dāng)粘附或共刺激分子，以及由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制蛋白如tgfβ?？乖蔬f和轉(zhuǎn)化細(xì)胞上的cd40連接導(dǎo)致粘附蛋白(例如cd54)、共刺激分子(例如cd86)和mhc抗原以及炎性細(xì)胞因子分泌的上調(diào)，從而潛在地誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)抗腫瘤免疫響應(yīng)，以及腫瘤細(xì)胞的免疫原性。參見例如gaiewski等nat.immunol.14：1014-1022(2013)。

cd40交聯(lián)的主要后果是dc激活(通常稱為許可)，并且增強(qiáng)骨髓和b細(xì)胞處理和向t細(xì)胞呈遞腫瘤相關(guān)抗原的能力。除了具有激活先天免疫響應(yīng)的直接能力之外，cd40信號(hào)傳導(dǎo)的獨(dú)特后果是在稱為“交叉引發(fā)”的過程中將腫瘤衍生的抗原apc呈遞至cd8+細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)前體。成熟dc對(duì)cd40依賴性激活和ctl前體分化為腫瘤特異性效應(yīng)子ctl可能增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫響應(yīng)。參見例如kurts等nat.rev.immunol.10：403-414(2010)。

包括達(dá)西珠單抗、sea-cd40親本分子在內(nèi)的激動(dòng)性cd40mab已經(jīng)顯示出在單一藥物和聯(lián)合化療方案中令人鼓舞的臨床活性。達(dá)西珠單抗在nhl的1期研究和彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤(dlbcl)中的2期研究中表現(xiàn)出一些臨床活性。參見例如advani等j.clin.oncol.27：4371-4377(2009)和devos等j.hematol.oncol.7：1-9(2014)。此外，cd40的人源化igg2激動(dòng)劑抗體cp-870,893，當(dāng)與紫杉醇或卡鉑或吉西他濱組合時(shí)，其在實(shí)體腫瘤適應(yīng)癥中表現(xiàn)出令人鼓舞的活性。在這些研究中，觀察到抗原呈遞細(xì)胞的激活，細(xì)胞因子產(chǎn)生和抗原特異性t細(xì)胞的產(chǎn)生。參見例如beatty等clin.cancerres.19：6286-6295(2013)和vonderheide等oncoimmunology2：e23033(2013)。

抗-cd40抗體

由于其在免疫功能中的作用，已經(jīng)針對(duì)cd40抗原產(chǎn)生了抗體。這樣的抗體可以分為三組：抑制cd40活性的拮抗性抗體；部分誘導(dǎo)cd40活性的部分激動(dòng)性抗體；和完全刺激cd40活性的完全激動(dòng)性抗體。每個(gè)組的成員已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試；迄今為止沒有一個(gè)被批準(zhǔn)。

sea-cd40

本公開提供非巖藻糖基化的hs2c6抗體sea-cd40。s2c6最初被分離為針對(duì)本文稱為ms2c6的人膀胱癌產(chǎn)生的鼠單克隆抗體。參見例如paulie等cancerimmunol.immunother.17：165-179(1984)。s2c6抗體是cd40信號(hào)通路的部分激動(dòng)劑，因此具有以下活性：與人cd40蛋白結(jié)合，與食蟹猴cd40蛋白結(jié)合，激活cd40信號(hào)通路，增強(qiáng)cd40與其配體cd40l的相互作用。參見例如，美國(guó)專利號(hào)6,946,129。

作為開發(fā)的下一步驟，將s2c6人源化，本文中將該人源化抗體稱為人源化的s2c6，作為達(dá)西珠單抗或巖藻糖基化的人源化s2c6(fhs2c6)或sgn-40。參見例如wo2006/128103。sgn-40在人類臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其活性不足以保證進(jìn)一步發(fā)展。

sea-cd40是非巖藻糖化的人源化s2c6抗體。sea-cd40的重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別公開為seqidno：1和2。重鏈的可變區(qū)來自seqidno：1的氨基酸1-113；輕鏈的可變區(qū)來自seqidno：2的氨基酸1-113。在wo2006/128103中公開了sea-cd40的抗體骨架的產(chǎn)生，其通過引用并入本文。

本公開提供非巖藻糖化的人源化s2c6抗體，本文稱為nfhs2c6或sea-cd40。與親本抗體達(dá)西珠單抗相比，除了增強(qiáng)與fc受體的結(jié)合之外，sea-cd40還增強(qiáng)cd40途徑的活性。因此，將sea-cd40抗體以較低劑量給予于患者，并使用不同的給予計(jì)劃。

非巖藻糖基化抗體

sea-cd40是一種非巖藻糖基化抗體，顯示出增強(qiáng)的fcγiii受體結(jié)合，并且出人意料地提高了免疫細(xì)胞中激活cd40信號(hào)通路的能力。

制造非巖藻糖基化抗體的方法

本公開提供了制備具有核心巖藻糖基化降低的人源化s2c6抗體的組合物和方法。如本文所用，“核心巖藻糖基化”是指在n-連接的聚糖的還原末端向n-乙酰葡糖胺(“glcnac”)添加巖藻糖(“巖藻糖基化”)。

與sea-cd40抗體骨架的fc區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)結(jié)合的復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈的巖藻糖基化被還原。如本文所用，“復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈”通常與天冬酰胺297結(jié)合(根據(jù)kabat所示的eu索引，《熱門免疫學(xué)序列》，第5版，出版號(hào)91-3242，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部，nih，馬里蘭州貝塞斯達(dá)，1991)。如本文所用，復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈具有雙天線復(fù)合糖鏈，主要具有以下結(jié)構(gòu)：

其中±表示糖分子可以存在或不存在，數(shù)字表示糖分子之間的連接位置。在上述結(jié)構(gòu)中，與天冬酰胺結(jié)合的糖鏈末端稱為還原末端(右側(cè))，對(duì)側(cè)稱為非還原末端。巖藻糖通常與還原末端的n-乙酰葡糖胺(“glcnac”)結(jié)合，通常通過α1，6鍵(glcnac的6位與巖藻糖的1位相連)?！癵al”是指半乳糖，“man”是指甘露糖。

“復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈”包括1)復(fù)合型，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)具有一個(gè)或多個(gè)半乳糖-n-乙酰葡糖胺的分支(也稱為“gal-glcnac”)，并且gal-glcnac的非還原末端側(cè)任選具有唾液酸，二等分n-乙酰葡糖胺等；或2)雜交型，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)具有高甘露糖n-糖苷連接的糖鏈和復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈的兩個(gè)分支。

在一些實(shí)施方式中，“復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈”包括這樣的復(fù)合體，其中核心結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)具有半乳糖-n-乙酰葡糖胺(也稱為“gal-glcnac“)的零、一個(gè)或多個(gè)分支，并且gal-glcnac的非還原末端側(cè)任選進(jìn)一步具有唾液酸，二等分n-乙酰葡糖胺等結(jié)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的方法，通常只有少量的巖藻糖納入到sea-cd40分子的復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈中。例如，在各種實(shí)施方式中，小于約60％，小于約50％，小于約40％，小于約30％，小于約20％，小于約15％，小于約10％，小于約5％或小于約3％的抗體具有巖藻糖的核心巖藻糖基化。在一些實(shí)施方式中，約2％的抗體具有巖藻糖的核心巖藻糖基化。

在某些實(shí)施方式中，僅將少量巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的代謝物或產(chǎn)物)納入復(fù)合n-糖苷連接的糖鏈中。例如，在各種實(shí)施方式中，小于約40％，小于約30％，小于約20％，小于約15％，小于約10％，小于約5％，或小于約3％sea-cd40抗體具有由巖藻糖類似物或巖藻糖類似物的代謝物或產(chǎn)物的核心巖藻糖基化。在一些實(shí)施方式中，約2％的sea-cd40抗體具有由巖藻糖類似物或巖藻糖類似物的代謝物或產(chǎn)物的核心巖藻糖基化。

例如在wo/2009/135181中描述了通過用巖藻糖類似物孵育抗體產(chǎn)生細(xì)胞來制備非巖藻糖基化抗體的方法。簡(jiǎn)言之，已經(jīng)工程改造以表達(dá)人源化的s2c6抗體的細(xì)胞在巖藻糖類似物或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝物或產(chǎn)物的存在下孵育。如本文所用，細(xì)胞內(nèi)代謝物可以是例如gdp改性的類似物或完全或部分去酯化的類似物。產(chǎn)物可以是例如完全或部分去酯化的類似物。在一些實(shí)施方式中，巖藻糖類似物可以抑制巖藻糖補(bǔ)救途徑中的酶。例如，巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物或產(chǎn)物)可以抑制巖藻糖磷酸酶或gdp-巖藻糖-焦磷酸化酶的活性。在一些實(shí)施方式中，巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物或產(chǎn)物)抑制巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(優(yōu)選1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，例如fut8蛋白)。在一些實(shí)施方式中，巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物或產(chǎn)物)可以抑制巖藻糖從頭合成途徑中酶的活性。例如，巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物或產(chǎn)物)可以抑制gdp-甘露糖4，6-脫水酶或/或gdp-巖藻糖合成酶的活性。在一些實(shí)施方式中，巖藻糖類似物(或巖藻糖類似物的細(xì)胞內(nèi)代謝物或產(chǎn)物)可以抑制巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如gdp-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，巖藻糖類似物是2-氟巖藻糖。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基使用巖藻糖類似物的方法和其他巖藻糖類似物公開于，例如，wo/2009/135181，其通過引用并入本文。

用于工程化細(xì)胞系以減少核心巖藻糖基化的其他方法包括基因敲除，基因敲入和rna干擾(rnai)。在基因敲除中，編碼fut8(α1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的基因被滅活。fut8催化巖藻糖基殘基從gdp-巖藻糖轉(zhuǎn)移到n-聚糖的asn連接(n-連接)glcnac的位置6。據(jù)報(bào)道，fut8是唯一負(fù)責(zé)將巖藻糖加入到n-連接的雙天線碳水化合物中asn297處的酶?；蚯萌胩砑泳幋a酶，如gntiii或高爾基體α甘露糖苷酶ii的基因。細(xì)胞中這些酶的水平的增加使來自巖藻糖基化途徑的單克隆抗體轉(zhuǎn)移(導(dǎo)致核心巖藻糖基化降低)并且具有二等分n-乙酰葡糖胺的量增加。rnai通常還靶向fut8基因表達(dá)，導(dǎo)致mrna轉(zhuǎn)錄水平降低或完全敲除基因表達(dá)。這些方法中的任何一種可用于產(chǎn)生能夠生產(chǎn)非巖藻糖基化抗體(例如sea-cd40抗體)的細(xì)胞系。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多方法可用于確定抗體上巖藻糖基化的量。方法包括例如通過plrp-s層析和電噴霧電離四極tofms的lc-ms。

在給予于患者時(shí)，非巖藻糖基化抗體sea-cd40誘導(dǎo)單核細(xì)胞成熟活化成巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括例如干擾素-γ(ifn-γ)和趨化因子，其引起針對(duì)免疫系統(tǒng)挑戰(zhàn)的強(qiáng)烈t細(xì)胞響應(yīng)。不同于完全激動(dòng)的抗體，如抗體24.4.1，sea-cd40不誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子，如白介素-10(il-10)。il-10繼而誘導(dǎo)t調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性，抑制免疫反應(yīng)。因此，sea-cd40可用于誘導(dǎo)強(qiáng)烈的t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)而不促進(jìn)t調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性。

sea-cd40的劑量和給藥

用于胃腸道外給藥的藥物組合物優(yōu)選為無菌且基本等滲且在gmp條件下制造?？梢詥挝粍┬?即單次給藥的劑量)提供藥物組合物?？墒褂靡环N或多種生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體、稀釋劑、賦形劑或助劑制備藥物組合物。制劑取決于所選擇的給藥途徑。為了注射，抗體可配制在水性溶液中，優(yōu)選生理相容性緩沖液以減少注射位點(diǎn)的不舒適性。該溶液可包含配制劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸贵w可以是使用前用合適的載劑(如無菌無熱原的水)進(jìn)行重建的凍干形式。

sea-cd40靜脈內(nèi)給藥。在其它實(shí)施方式中，sea-cd40皮下給藥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在皮下腫瘤部位給予sea-cd40。

與其親本抗體達(dá)西珠單抗相比，非巖藻糖基化的sea-cd40抗體驚人地增強(qiáng)了免疫活化活性。因此，與達(dá)西珠單抗相比，sea-cd40可以以較低劑量和以不同的計(jì)劃給予患者。

例如，sea-cd40可以以0.1-2000μg/kg(μg/千克患者體重)的水平給予患者。其他可能的劑量范圍為10-1000μg/kg、50-800μg/kg、75-600μg/kg、100-500μg/kg。其他可能的劑量范圍如下：100-300μg/kg、300-500μg/kg、500-700μg/kg、700-900μg/kg、和900-1100μg/kg。更多的劑量范圍如下：100-150μag/kg、150-200μg/kg、200-250μg/kg、250-300μag/kg、300-350μg/kg、350-400μg/kg、400-450μg/kg、450-500μg/kg、500-550μg/kg、550-600μg/kg、600-650μg/kg、650-700μg/kg、700-750μg/kg、750-800μg/kg、800-850μag/kg、850-900μg/kg、900-950μg/kg、950-1000μg/kg、1000-1050μg/kg、和1050-1100μg/kg。其他可能的劑量范圍是0.3-200μg/kg、0.6-150μg/kg、1.0-100μg/kg、2-50μg/kg、5-25μg/kg、7.5-15μg/kg和8-12μg/kg。

在其他實(shí)施方式中、以0.6μg/kg、1.0μg/kg、2.5μg/kg、5.0μg/kg、7.5μg/kg、10μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg或200μg/kg將sea-cd40給予患者。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，以10μg/kg將sea-cd40給予患者。

在另外的實(shí)施方式中，以約60μg/kg、約100μg/kg、約150μg/kg、約200μg/kg、250μg/kg、約300μg/kg、約350μg/約400μg/kg、約450μg/kg、約500μg/kg、約500μg/kg、約500μg/kg、約600μg/約800μg/kg、約850μg/kg、約900μg/kg、約950μg/kg、約1000-1050μg/kg、約1050μg/kg和1110μg/kg將sea-cd40給予患者。

在一些實(shí)施方式中，以降低免疫耗盡可能性的方式給予sea-cd40。例如，sea-cd40可以以三周的間隔，六周的間隔，八周的間隔，十周的間隔，十二周的間隔或十四周的間隔給予。間隔時(shí)間也可以為月計(jì)劃，例如一個(gè)月的間隔，兩個(gè)月的間隔或三個(gè)月的間隔。

因?yàn)閟ea-cd40激活免疫系統(tǒng)以針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原響應(yīng)，其用途不限于表達(dá)cd40的癌癥。因此，sea-cd40可用于治療cd40陽性和cd40陰性癌。

sea-cd40優(yōu)選用于治療已知具有免疫響應(yīng)性的腫瘤，特別是如果癌癥表達(dá)低水平的cd40或不可檢測(cè)地表達(dá)cd40。免疫響應(yīng)性癌癥包括例如黑素瘤；膀胱癌；肺癌，例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌；卵巢癌；腎癌；胰腺癌；乳腺癌；宮頸癌；頭頸癌，前列腺癌；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；慢性淋巴細(xì)胞白血病；肝細(xì)胞癌；或多發(fā)性骨髓瘤。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，sea-cd40用于治療實(shí)體瘤。在另一個(gè)實(shí)施方式中，sea-cd40用于治療血液癌，例如淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤；慢性淋巴細(xì)胞白血?。换蚨喟l(fā)性骨髓瘤。

sea-cd40聯(lián)合治療

由于其免疫刺激功能，sea-cd40可以與激活免疫系統(tǒng)的其他治療劑組合使用。具有免疫刺激功能的藥物包括例如t細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑；免疫激活劑和誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的化療劑。作為一個(gè)例子，某些抗體通過阻斷在t細(xì)胞上作為免疫檢查點(diǎn)的分子的活性起作用。因此，sea-cd40可以與靶向免疫檢查點(diǎn)蛋白的抗體組合使用。

t細(xì)胞調(diào)節(jié)劑

t細(xì)胞在免疫系統(tǒng)識(shí)別和消除體內(nèi)癌癥的能力中發(fā)揮作用。t細(xì)胞調(diào)節(jié)劑包括阻斷免疫檢查點(diǎn)功能的抗體。參見例如pardoll，naturerev.cancer，12：252-264(2012)。阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗體包括例如抗pd-1抗體，抗-pd-l1抗體和抗ctla4抗體。其他檢查點(diǎn)抑制劑/激活劑包括lag3和tim3?？梢允褂冕槍?duì)一些蛋白質(zhì)的抗體來調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性或優(yōu)選活化t細(xì)胞活性，例如針對(duì)4ibb，cd27，icos和ox40的抗體。其他t細(xì)胞調(diào)節(jié)劑包括酶吲哚胺2，3-雙加氧酶(ido)的抑制劑。

抗ctla4抗體識(shí)別蛋白質(zhì)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞4(ctla-4)，也稱為分化簇152或cd152。ctla-4蛋白在t細(xì)胞上表達(dá)，其識(shí)別適合于免疫系統(tǒng)攻擊的抗原。ctla-4的活化可抑制免疫反應(yīng)。參見例如nirschi和drake，clin.cancerres.，19：4917-4924(2013)。對(duì)ctla-4特異并阻斷其活性的抗體已被用于通過上調(diào)對(duì)癌癥的免疫響應(yīng)來治療癌癥。ctla-4抗體的示例包括伊匹單抗或特姆單抗。sea-cd40可以與伊匹單抗或特姆單抗聯(lián)合給予以治療癌癥。

抗pd1抗體識(shí)別蛋白程序性死亡-1(pd-1)。類似ctla-4，pd-1在t細(xì)胞上表達(dá)，并且抑制免疫響應(yīng)。參見例如nirschi和drake，clin.cancerres.，19：4917-4924(2013)。對(duì)pd-1特異并阻斷其活性的抗體已被用于通過上調(diào)對(duì)癌癥的免疫響應(yīng)來治療癌癥。pd-1抗體的示例包括med10680、amp-224、尼莫單抗、多替珠單抗和彭美羅珠單抗。作為檢查點(diǎn)抑制劑并可與sea-cd40組合使用的其它pd-1結(jié)合蛋白包括例如b7-dc-fc。sea-cd40可與medi0680、amp-224、尼莫單抗、多替珠單抗或彭美羅珠單抗組合給予以治療癌癥。

pd-l1是pd-1蛋白的配體。pd-l1在癌細(xì)胞上表達(dá)，其與pd-1的相互作用允許表達(dá)pd-l1的癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)。已經(jīng)產(chǎn)生抗pd-l1抗體并用于治療癌癥。pd-l1抗體的示例包括例如medi4736、bms-936559/mdx-1105、msb0010718c和mpdl3280a。sea-cd40可以與medi4736、bms-936559/mdx-1105、msb0010718c或mpdl3280a組合給予以治療癌癥。

阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白質(zhì)功能的其他抗體包括針對(duì)例如lag3和tim3的抗體，并且可以與sea-cd40組合使用。

使用針對(duì)41bb、cd27、icos和ox40的抗體來激活t細(xì)胞活性，并可與sea-cd40組合使用。ox40抗體包括例如medi6469和medi6383。激動(dòng)性抗cd27抗體的示例是cdx-1127，其可以與sea-cd40組合使用。

酶吲哚胺2，3-雙加氧酶(ido)催化氨基酸色氨酸的降解。ido的抑制劑可以是小分子，如迷迭香酸，cox-2抑制劑和α-甲基-色氨酸。

誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡的化療劑

在大多數(shù)人類中，數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡死去并被去除而不產(chǎn)生免疫響應(yīng)。然而，在用一些化療劑處理后，觀察到免疫細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤。因此，化療劑殺死的一些腫瘤細(xì)胞作為疫苗，引發(fā)了腫瘤特異性免疫響應(yīng)。這種現(xiàn)象被稱為免疫原性細(xì)胞死亡(icd)。參見例如kroemer等，annu.rev.immunol.，31：51-72(2013)?？梢詫?shí)驗(yàn)測(cè)定化療藥物誘導(dǎo)icd的能力。必須滿足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。首先，在沒有佐劑的情況下，用經(jīng)化療劑體外處理的癌細(xì)胞注射免疫活性小鼠必須引發(fā)對(duì)腫瘤抗原特異的保護(hù)性免疫響應(yīng)。第二，體內(nèi)發(fā)生的icd，例如使用潛在的icd誘導(dǎo)化療劑治療的小鼠同基因模型必須在腫瘤中驅(qū)動(dòng)依賴于免疫系統(tǒng)的免疫響應(yīng)。

誘導(dǎo)icd的化療劑包括例如蒽環(huán)類抗生素抗體、抗egfr抗體、硼替佐米、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、腫瘤照射和奧沙利鉑。sea-cd40可與任何這些試劑組合使用以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫響應(yīng)并在患者中治療癌癥。

免疫活化

也可以通過給予直接刺激免疫系統(tǒng)的藥物治療癌癥。這些試劑包括例如gm-csf，ifn-γ，白介素-2，gvax和tlr9激動(dòng)劑。其他免疫激活劑包括例如癌癥疫苗，卡介苗(bcg)，非特異性免疫刺激劑(例如咪喹莫特)和諸如car-t細(xì)胞的細(xì)胞療法。sea-cd40可與任何這些試劑組合使用以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫響應(yīng)并在患者中治療癌癥。

其他組合

與sea-cd40的其他組合可用于治療癌癥。示例包括例如與抗-pd1抗體例如尼莫單抗、彭美羅珠單抗和多替珠單抗、medi0680或amp-224組合的sea-cd40；與吉西他濱組合sea-cd40，含或不含紫杉醇或順鉑或奧沙利鉑；與braf抑制劑如維莫拉本或達(dá)布他濱組合的sea-cd-40；或與環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、和潑尼松(chop)或利妥昔單抗、異環(huán)磷酰胺、卡鉑、和依托泊苷(rice)或利妥昔單抗、吉西他濱、地塞米松和順鉑(rgdp)組合的sea-cd40。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例用于說明而非限制本發(fā)明所要求的權(quán)利。

實(shí)施例1：非巖藻糖基化hs2c6抗體的合成

在cho細(xì)胞中表達(dá)具有seqidno：1和2的重鏈和輕鏈的人源化抗cd40抗體s2c6。在抗體生產(chǎn)期間，細(xì)胞培養(yǎng)基中包含巖藻糖基化抑制劑2-氟巖藻糖，產(chǎn)生非巖藻糖基化抗體sea-cd40。參見例如okeley等proc.nat’lacad.sci.110：5404-55409(2013)。用于細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含巖藻糖，并將2-氟巖藻糖加入到培養(yǎng)基中以抑制蛋白質(zhì)巖藻糖基化。同上。通過lc-ms，通過plrp-s層析和電噴霧電離四極tofms測(cè)量巖藻糖向抗體的摻入。同上。數(shù)據(jù)未顯示。

實(shí)施例2：非巖藻糖基化hs2c6抗體的表征

sea-cd40的cd40結(jié)合親和力測(cè)定：為了分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)，人全血由astarte生物公司(astartebiologics)提供。簡(jiǎn)言之，將血液收集到肝素管中，并在抽出的四小時(shí)內(nèi)送入西雅圖遺傳學(xué)公司(seattlegenetics)。一旦到達(dá)，血液等分到50ml錐形管(falcon)中，并在eppendorf5810r(a-4-62轉(zhuǎn)子)中以200g的速度在25℃下不間斷旋轉(zhuǎn)20分鐘，以分離富含血小板的部分。離心后，形成三層不同層：底層紅細(xì)胞(占總體積的50-80％)；中間層，非常薄的白細(xì)胞帶；頂層，草黃色富血小板血漿(prp)。

用1ml移液管除去血小板中富集的上層草黃色層。一旦血小板富集血漿被移出，血液用等體積的無菌pbs稀釋(吉布可(gibco)公司，lot1618435，ept2016-07)。將溫?zé)嶂潦覝氐?5mlhistopaque-1077(sigma，批號(hào)rnbd2965，expt.5/2017)的置于血液下方。histopaque樣品在25℃下以1500rpm不間斷旋轉(zhuǎn)25分鐘。離心后，再次形成三層：底層，紅細(xì)胞(占總體積的50-80％)；中層，白血細(xì)胞的厚帶(也稱為“血沉棕黃層”)；頂層，pbs和剩余的血小板。

用1ml移液管取出上層pbs/血小板層，棄去。將白血細(xì)胞的厚帶輕輕取出并置于干凈的50ml無菌錐形管中。將管填充至50ml，將細(xì)胞以800g旋轉(zhuǎn)10分鐘。除去洗滌溶液，將沉淀重懸在10mlack紅血液裂解緩沖液(吉布可公司，批號(hào)1618488)中10分鐘。然后用35ml無菌pbs將50ml錐形管充滿，細(xì)胞以800g旋轉(zhuǎn)10分鐘。除去洗液，將沉淀重新懸浮于50mlpbs中。取出500μl的樣品，用vi-細(xì)胞-xr(克曼庫爾特(beckmancoulter)公司)計(jì)數(shù)pbmc。將細(xì)胞800g再次旋轉(zhuǎn)10分鐘。除去洗滌溶液，并在fac染色溶液(bd)中以1×10⁶/ml重新懸浮沉淀。將100μl重懸的pbmc置于96孔u(yù)底板(康寧(corning)公司)中并置于冰上。為了阻止非特異性fcγriiia結(jié)合，用100μg/ml的人fc片段(卡巴開(calbiochem)公司)預(yù)處理pbmc30分鐘。制備生物素化sea-h00(非巖藻糖基化對(duì)照抗體)，sea-cd40或sgn-40的10倍系列稀釋液以產(chǎn)生稀釋系列(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/ml)。

將樣品在冰冷的fac緩沖液中洗滌兩次，并與飽和濃度的pe-鏈霉親和素(bd)在冰上孵育30分鐘。將樣品在冰冷的fac緩沖液中洗滌兩次并重懸于200μl的fac緩沖液中。使用bdlsrii和diva軟件評(píng)估結(jié)合。fcs在flowjo和geomean中進(jìn)行了分析，確定了陽性染色細(xì)胞的熒光，并繪制在prismgraphpad中。數(shù)據(jù)擬合為非線性回歸，假設(shè)prism中的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和通過μg/ml計(jì)算除以sea-cd40的分子量計(jì)算得到的結(jié)合kd值。

結(jié)果：通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定sea-cd40和親本抗體達(dá)西珠單抗對(duì)人外周血單核細(xì)胞(pbmc)上cd40的結(jié)合親和力?？鄢m當(dāng)同種型對(duì)照的背景結(jié)合，并將平均熒光強(qiáng)度(mfi)針對(duì)抗體濃度作圖。結(jié)果示于圖1。sea-cd40和親本抗體達(dá)西珠單抗給出了幾乎重疊的結(jié)合曲線，以及約為1.17nm的兩個(gè)飽和pbmc的濃度。這些數(shù)據(jù)表明巖藻糖基化的變化不影響seacd40對(duì)cd40的親和力。

sea-cd40的fcγriiia結(jié)合親和力測(cè)定：產(chǎn)生表達(dá)高(158v)或低(158f)版本的人fcγriiia的cho細(xì)胞。將20x10⁶個(gè)細(xì)胞離心，在20ml1xpbs中洗滌一次，并重懸于8mlbd染色緩沖液中。細(xì)胞以以下密度等分：在100ul體積中2.0x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。0.20×10⁶個(gè)細(xì)胞等分到每個(gè)孔中。將細(xì)胞在室溫下以1250rpm離心5分鐘。

將抗體稀釋至0.14ug/ml(sgn)或0.04ug/ml(sea)。稀釋示于表1。

表1

將上清液從旋轉(zhuǎn)的細(xì)胞中吸出，并用多通道移液管加入60ul相應(yīng)的抗體稀釋液。相應(yīng)的濃度分別為100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、0.14mcg/ml。將樣品在4℃下孵育1小時(shí)。離心樣品，每孔用200μlbd染色緩沖液洗滌兩次。將1毫升的鏈霉親和素-pe加入到20mlbd染色緩沖液(超過2°)中以制備鏈霉親和素緩沖液。將100μl的鏈霉親和素緩沖液加入到每個(gè)樣品中，并在4℃下在黑暗中孵育30分鐘。然后離心樣品，每孔用200ulbd染色緩沖液洗滌兩次。在lsrii上，樣品通過流式細(xì)胞儀在hts模式下進(jìn)行分析，并通過圖形mfi計(jì)算prizm中的kd。

結(jié)果：評(píng)估sea-cd40和親本抗體達(dá)西珠單抗與表達(dá)低(158f)或高(158v)親和形式的fcγriiia的中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果如圖2a和2b所示。sea-cd40以相似親和力(分別為kd27.5nm和5.2nm)與低(158f)和高(158v)形式的fcγriiia結(jié)合。結(jié)合低親和力(158f)形式的sea-cd40明顯優(yōu)于巖藻糖基化親本抗體達(dá)西珠單抗(kd302.7nm)，sea-cd40甚至比巖藻糖基化的達(dá)西珠單抗親本更好地結(jié)合高親和力158v形式(5.2nm對(duì)比37.9nm)。

sea-cd40介導(dǎo)的adcc活性：如上分離人pbmc，并用各種濃度的sea-cd40或sea同種型對(duì)照(sea-h00)處理6、24或48小時(shí)。培養(yǎng)物對(duì)cd19+b細(xì)胞染色，細(xì)胞數(shù)量通過流式細(xì)胞術(shù)定量。

結(jié)果：人pbmc培養(yǎng)物用100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μg/ml的seacd40或非結(jié)合的sea同種型對(duì)照(sea-h00)處理6、24和48小時(shí)，然后評(píng)估cd40陽性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果示于圖4。sea-cd40治療導(dǎo)致cd40+cd19+b細(xì)胞以劑量和時(shí)間依賴性方式顯著降低，甚至降至低亞(lowsub)μg/ml濃度。sea-cd40對(duì)單核細(xì)胞/dc數(shù)量沒有顯著影響(單核細(xì)胞/dc數(shù)據(jù)未顯示)。

人全血或pbmc中細(xì)胞因子生產(chǎn)的評(píng)估：人全血由astarte生物公司提供。簡(jiǎn)單來說，將100ml血液收集到肝素管中，并在抽取后4小時(shí)內(nèi)送至西雅圖遺傳學(xué)公司。將留存一半血液用于全血培養(yǎng)物，另一半用于分離pbmc，如上所述。將100μl全血等分到3-96平底組織培養(yǎng)板(克斯塔(costar)公司)中。將分離的pbmc在viacell中計(jì)數(shù)，并以1x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于含有10％fbs(亞特蘭大生物(atlantabiologics)公司)、1x青霉素/strepa和x谷氨酰胺(pbmc培養(yǎng)基)的dmem中。對(duì)于pbmc，將100ul重懸、純化的pbmc等分到3-96個(gè)平底組織培養(yǎng)板中。在pbmc培養(yǎng)基中制備sea-h00和sea-cd40的10x系列稀釋液，將全血和分離的pbmc培養(yǎng)物用遞減濃度的sea-h00或sea-cd40(100、10、1.0、0.1、0.01、0.001、0.0001或0μg/ml)處理。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于全血和pbmc培養(yǎng)物一式兩份進(jìn)行sea-cd40處理。在每個(gè)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(6、24和48小時(shí))中，將含有全血或純化的pbmc的96孔板用eppendorf5810r中的板適配器以800rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。去除血清或組織培養(yǎng)物上清液，并轉(zhuǎn)移到96帶狀管架中，并將樣品在-80℃下冷凍直到加工。

將冷凍的組織培養(yǎng)物上清液和血清在4℃下解凍過夜，并使用來自密理博(millipore)公司的luminex多重試劑盒進(jìn)行處理用于細(xì)胞因子生產(chǎn)。定制試劑盒設(shè)計(jì)為分析ifnγ，il-12p40，il-6，il-8，mcp-1，mip-1α，il-1β，mip-1β，tnf-α，scd40l?；谝郧暗难芯恐杏眠_(dá)西珠單抗觀察到的細(xì)胞因子挑選分析物。根據(jù)制造商的說明書處理組織培養(yǎng)上清液和血清樣品。簡(jiǎn)言之，每孔用200μl洗滌緩沖液洗滌測(cè)定板，然后向每個(gè)孔中加入25μl標(biāo)準(zhǔn)品或緩沖液、25μl基質(zhì)或樣品、和25μl的多重分析物珠。將樣品在4℃下劇烈搖動(dòng)孵育過夜。用洗滌緩沖液洗滌測(cè)定板兩次。向每個(gè)孔中加入25μl檢測(cè)抗體，并在室溫下孵育1小時(shí)。加入25μl鏈霉親和素-藻紅蛋白(sa-pe)，樣品在室溫下孵育30分鐘。將板用洗滌緩沖液洗滌兩次，并將珠與150μl鞘液一起懸浮。使用luminexmagpix系統(tǒng)與xponent軟件系統(tǒng)組合分析樣品。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子水平。

結(jié)果：人全血培養(yǎng)物用sea同種型對(duì)照或sea-cd40(100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μg/ml)處理6、24或48小時(shí)。收集血清或組織培養(yǎng)上清液，并通過多重luminex分析評(píng)估炎性細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)繪制為相比sea同種型對(duì)照的細(xì)胞因子生產(chǎn)的倍數(shù)增加。如下表2所示，sea-cd40在全血中于6小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)刺激ifnγ，mip1β、和tnfα的強(qiáng)烈生產(chǎn)。在最左邊的列中提供sea-cd40水平。在低至0.010μg/mlsea-cd40的水平下觀察到活性。在圖4a和4b中顯示了24小時(shí)時(shí)的mip1β和tnfα的刺激。

表2

全血

人pbmc用sea同種型對(duì)照或sea-cd40(100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001μg/ml)處理6、24或48小時(shí)。收集血清或組織培養(yǎng)上清液，并通過多重luminex分析評(píng)估炎性細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)繪制為相比sea同種型對(duì)照的細(xì)胞因子生產(chǎn)的倍數(shù)增加。如下表3所示，sea-cd40在pbmc中于6小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)刺激ifnγ，mip1β、和tnfα的強(qiáng)烈生產(chǎn)。在最左邊的列中提供了以μg/ml表示的sea-cd40水平。在低至0.010μg/mlsea-cd40的水平下觀察到活性。在圖5a和5b中顯示了24小時(shí)時(shí)的mip1β和tnfα的刺激。

表3

prmc

評(píng)估pbmc上的激活標(biāo)志物：對(duì)上述細(xì)胞因子分析中保留的細(xì)胞沉淀物評(píng)估共刺激分子表面表達(dá)。將細(xì)胞沉淀重懸于50mlbdfac緩沖液中并轉(zhuǎn)移至96孔圓底微量滴定板中，用人100ug/mlfc片段(密理博公司)在冰上封閉fc受體30分鐘。在含有100mg/ml人fc片段的bdfac緩沖液中制備以1∶100稀釋的pe-cd86(bd)和mhcii(pan抗-dpv，dp，dq抗體，bd)組成的主混物。將5μl主混物加入到含有90μl的每個(gè)孔中，并將樣品在冰上孵育1小時(shí)。然后將細(xì)胞在預(yù)冷卻的eppendorf5810r離心機(jī)中以400g旋轉(zhuǎn)5分鐘。去除上清液，細(xì)胞用200mlbdfacs緩沖液洗滌。將細(xì)胞洗滌兩次，然后重懸于200mlfac緩沖液中。然后用diva軟件(bd生物科學(xué)公司)在lsrii(bd生物科學(xué)公司)上分析樣品。使用flowjo分析軟件評(píng)估cd86和mhcii幾何平均熒光。計(jì)算sea-h00和sea-cd40之間的比例，并且用倍數(shù)變化計(jì)算sea-cd40效力的范圍。

結(jié)果：激活cd40除了引發(fā)細(xì)胞因子產(chǎn)生，還促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的成熟。dc成熟后可以上調(diào)活化標(biāo)志物，包括cd86和mhcii。用seacd40和sea同種型對(duì)照刺激人pbmc培養(yǎng)物6、24或48小時(shí)，并評(píng)估m(xù)hcii類抗原(hladr，dp，dq)和cd86的表面表達(dá)。sea-cd40刺激，而不是同種型對(duì)照，以低至0.01μg/ml的濃度得到mhcii(表4)和cd86(數(shù)據(jù)未顯示)的顯著增加。

表4：mhcii

巖藻糖在sea-cd40的免疫激活中的作用：如上所述分離人pbmc。用各種濃度的sea-cd40、親代抗體sgn40或f(ab)’2型sea-cd40處理pbmc并孵育24小時(shí)。為了評(píng)估b細(xì)胞消耗，用pe-cd19染色bpmc培養(yǎng)物，并通過流式細(xì)胞術(shù)定量b細(xì)胞數(shù)。為了評(píng)估細(xì)胞因子產(chǎn)生，收集pbmc組織培養(yǎng)上清液，并通過luminex平臺(tái)上的多重分析評(píng)估細(xì)胞因子產(chǎn)生。ifnγ產(chǎn)生如圖7所示，(ng/ml)，其他細(xì)胞因子也出現(xiàn)相似的趨勢(shì)。為了評(píng)估抗原呈遞細(xì)胞成熟，在孵育24小時(shí)后收集pbmc，并用pe-抗-cd86或apc-panmhcii類抗原(dr，dq，dp)抗體染色，并通過流式細(xì)胞儀評(píng)估陽性細(xì)胞百分比。數(shù)據(jù)顯示為panmhc標(biāo)志物的平均熒光強(qiáng)度。

結(jié)果：為了評(píng)估b細(xì)胞消耗，用多重濃度的sea-cd40、達(dá)西珠單抗或sea-cd40f(ab’)2處理人pbmc培養(yǎng)物24小時(shí)。結(jié)果示于圖6。與達(dá)西珠單抗處理的培養(yǎng)物相比，sea-cd40處理的培養(yǎng)物中adcc介導(dǎo)的b細(xì)胞消耗顯著更高，并且sea-cd40f(ab)’2喪失了該活性。

另外，在刺激24小時(shí)的sea-cd40、達(dá)西珠單抗和sea-cd40f(ab’)2pbmc培養(yǎng)物中評(píng)估免疫激活終點(diǎn)(細(xì)胞因子和apc激活/成熟標(biāo)志物)。sea-cd40刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖7)和apc成熟(圖8)均顯著高于達(dá)西珠單抗或sea-cd40f(ab)’2。這些數(shù)據(jù)表明，igg結(jié)構(gòu)域上缺乏巖藻糖不會(huì)改變cd40結(jié)合，但會(huì)增加fcγriiia結(jié)合，導(dǎo)致cd40活性增加，并最終增加cd40免疫調(diào)節(jié)活性。

實(shí)施例3：非巖藻糖基化hs2c6抗體的免疫調(diào)節(jié)活性

sea-cd40活性劑量的鑒定：提出sea-cd40在活化抗原呈遞細(xì)胞的劑量水平上是有活性的，其可以通過上調(diào)活化標(biāo)志物(如i類或ii類mhc或cd86)來表征。如上所述評(píng)估用不同濃度的sea-cd40處理6至48小時(shí)后的pbmc上的激活標(biāo)志物(pbmc上的激活標(biāo)志物的評(píng)估)。針對(duì)每種活化標(biāo)志物計(jì)算同型對(duì)照sea-h00和sea-cd40的處理之間的差異并與sea-cd40濃度和處理時(shí)間作圖。對(duì)于cd86和mhcii，在24小時(shí)觀察到最陡峭的響應(yīng)-濃度曲線，對(duì)于mhci為48小時(shí)。使用以下等式，通過非線性回歸擬合響應(yīng)濃度數(shù)據(jù)(24小時(shí)cd86、24小時(shí)mhcii和48小時(shí)mhci)，其中0％和100％響應(yīng)被定義為每個(gè)活化標(biāo)志物的數(shù)據(jù)集中的最小值和最大值。ec50是50％響應(yīng)的sea-cd40濃度。

結(jié)果：活化標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)化響應(yīng)與log(濃度)和非線性擬合回歸線如圖9所示。mhci，cd86和mhcii的ec50估計(jì)值分別為0.011，0.14和0.41μg/ml。估計(jì)sea-cd40以0.2μg/ml分別誘導(dǎo)mhci、cd86和mhcii的最大上調(diào)約90％，60％和30％，對(duì)應(yīng)于在人中10μg/kg的iv劑量可達(dá)到的理論血漿cmax。該劑量被提出作為理論上的第一預(yù)期活性劑量。

實(shí)施例4：非巖藻糖基化hs2c6抗體的免疫調(diào)節(jié)活性

由sea-cd40產(chǎn)生的t細(xì)胞響應(yīng)：在astarte生物公司從顯示出與m1流感肽具有高度反應(yīng)性的hla-a2供體產(chǎn)生抗m1t細(xì)胞系。這些細(xì)胞用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)標(biāo)記并與自體pbmc組合。在存在或不存在遞減濃度(1、0.1、0.01μg/ml)的sea-cd40或達(dá)西珠單抗的情況下，用10μg/ml的m1流感肽刺激培養(yǎng)物5天。收集培養(yǎng)物上清液并通過luminex平臺(tái)上的多重分析來分析細(xì)胞因子，并通過m1特異性四聚體結(jié)合鑒定抗原特異性t細(xì)胞。

結(jié)果：來自顯示對(duì)m1流感肽有高度反應(yīng)性的hla-a2供體的pbmc，在存在或不存在遞減濃度的sea-cd40或達(dá)西珠單抗的情況下用m1流感肽刺激持續(xù)5天。結(jié)果如圖10a和10b所示。sea-cd40刺激的培養(yǎng)物顯示出對(duì)m1流感抗原的響應(yīng)增加，如ifnγ生產(chǎn)的增加和通過四聚體結(jié)合增加所測(cè)定的抗原特異性t細(xì)胞的增加所見。sea-cd40刺激抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)下降到0.1ug/ml，并且該活性比與達(dá)西珠單抗相關(guān)的響應(yīng)更強(qiáng)烈。

sea-cd40與抗免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗體組合產(chǎn)生的t細(xì)胞響應(yīng)：在astarte生物公司從顯示出與m1流感肽具有高度反應(yīng)性的hla-a2供體產(chǎn)生抗m1t細(xì)胞系。這些細(xì)胞用cfse標(biāo)記并與自體pbmc組合。在存在或不存在遞減濃度(1、0.1、0.01μg/ml)的sea-cd40和/或1μg/ml抗ctla4或抗pd-1抗體的情況下，用10μg/ml的m1流感肽刺激培養(yǎng)物5天。收集培養(yǎng)物上清液并通過luminex平臺(tái)上的多重分析來分析細(xì)胞因子，并通過m1特異性四聚體結(jié)合鑒定抗原特異性t細(xì)胞。

結(jié)果：在存在或不存在遞減濃度的sea-cd40和/或恒定濃度的抗ctla4阻斷抗體或抗pd-1抗體的情況下，用m1流感肽刺激來自與m1流感肽有高度反應(yīng)性的hla-a2供體的pbmc。結(jié)果示于圖11和12。雖然sea-cd40、抗ctla4抗體和抗pd-1抗體單獨(dú)刺激抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)，但是當(dāng)sea-cd40和抗ctla4抗體或抗pd-1抗體組合時(shí)，觀察到對(duì)m1流感抗原的響應(yīng)增加，如ifn-γ生產(chǎn)的增加(圖11)和通過四聚體結(jié)合增加所測(cè)定的抗原特異性t細(xì)胞的增加(圖12，使用來自mbl的四聚體/apc-hla-a*02：01流感-m1(gilgfvftl)四聚體)所見。sea-cd40刺激抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)降至0.1μg/ml，并通過與免疫檢查點(diǎn)抗體組合增強(qiáng)該活性。

來自癌癥患者的pcmc中由sea-cd40產(chǎn)生的t細(xì)胞響應(yīng)：為了單獨(dú)評(píng)估抗cd40抗體，從10ml腫瘤患者血液中分離pbmc，并將25萬個(gè)細(xì)胞接種在24孔板中。樣品用增加濃度的僅sea-cd40、或者1ug/ml含有magea1/magea3/ny-eso的組合肽庫和增加濃度的sea-cd40或sgn-40處理。將樣品在10％co2于37℃下培養(yǎng)5天，收集組織培養(yǎng)上清液并評(píng)估inf-γ水平。

為了評(píng)估與免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體組合的sea-cd40，從10ml診斷為乳腺癌、胰腺癌或黑素瘤癌的患者血液中分離pbmc，并將25萬個(gè)細(xì)胞接種在24孔板中。樣品用增加濃度的sea-cd40、1ug/ml含有magea1/magea3/ny-eso的組合肽庫、和1μg/ml抗-pd1或抗-ctla4處理。將樣品在10％co2于37℃下培養(yǎng)5天，收集組織培養(yǎng)上清液并評(píng)估inf-γ水平。

結(jié)果：如上所述從全血中分離來自供體的pbmc。供體是三名診斷為黑素瘤的患者，三名診斷為乳腺癌的患者和三名診斷為胰腺癌的患者。在存在或不存在增加濃度的sea-cd40或sgn-40情況下，用常見腫瘤抗原蛋白(magea1/mage3/ny-eso)的肽庫刺激供體pbmc持續(xù)5天。收集組織培養(yǎng)上清液，并對(duì)inf-γ生產(chǎn)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果示于圖13。與sgn-40處理相比，9名患者中有6名表現(xiàn)出抗原依賴性inf-γ響應(yīng)，其被sea-cd40處理顯著增強(qiáng)。在sea-cd40處理的pbmc中，在低至10μg/ml的濃度下觀察到刺激。

如上所述從全血中分離來自供體的pbmc。如上，供體是三名診斷為黑素瘤的患者，三名診斷為乳腺癌的患者和三名診斷為胰腺癌的患者。在存在或不存在增加濃度的sea-cd40和/或恒定濃度的抗ctla4或抗-cd4阻斷抗體的情況下，用常見腫瘤抗原蛋白(magea1/mage3/ny-eso)的肽庫刺激供體pbmc。結(jié)果示于圖14。雖然sea-cd40和針對(duì)檢查點(diǎn)阻斷靶標(biāo)pd1和ctla4的抗體僅刺激抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)，但是當(dāng)sea-cd40與抗ctla4抗體或抗pd1抗體組合時(shí)，觀察到對(duì)腫瘤抗原的強(qiáng)烈信號(hào)，如inf-γ生產(chǎn)所測(cè)。

實(shí)施例5：非巖藻糖化抗cd40抗體活性的小鼠模型

已經(jīng)證明小鼠模型在評(píng)估新型癌癥治療功效和機(jī)制方面非常有用。在小鼠癌癥模型中研究sea-cd40一直很困難，因?yàn)閟ea-cd40不能識(shí)別鼠cd40。因此，為了評(píng)估非巖藻糖基化抗cd40抗體的活性，開發(fā)了同基因鼠腫瘤模型。人igg1和人fcγriii/cd16的鼠功能等價(jià)物分別是鼠igg2a和fcγriv，并且鼠igg2a與鼠fcγriv的結(jié)合介導(dǎo)adcc。參見例如bruhns，blood119：5640-5649(2012)和nimmeriahn等immunity23：41-51(2005)。大鼠抗體1c10用于產(chǎn)生sea-cd40的替代物。參見例如heath等，eur.j.immunol.24：1828-1834(1994)。簡(jiǎn)言之，將識(shí)別鼠cd40的大鼠單克隆抗體，1c10抗體的vl和vh基因片段，分別框內(nèi)5’克隆到鼠cκ和鼠igg2ach1-ch2-ch3片段中。所得基因在cho細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生嵌合1c10抗體，具有igg2a同種型的大鼠vl和vh結(jié)構(gòu)域和鼠輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域(migg2a1c10)。使用實(shí)施例1中所述的方法，在cho細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在2-氟巖藻糖存在下表達(dá)migg2a1c10，以產(chǎn)生migg2a1c10的非巖藻糖基化形式(migg2asea1c10)。使用小鼠b16黑素瘤模型測(cè)試巖藻糖基化的migg2a1c10和migg2asea1c10的抗腫瘤活性。

評(píng)估非巖藻糖化鼠抗體與鼠fcγ受體的結(jié)合：將穩(wěn)定表達(dá)鼠fcγri或fcγriv的cho細(xì)胞與濃度增加的巖藻糖基化的migg2a1c10或非巖藻糖基化的migg2a1c10(migg2asea-1c10)一起孵育。洗滌樣品并加入飽和量的pe-抗小鼠igg，并將樣品在冰上孵育30分鐘。再次洗滌樣品，通過流式細(xì)胞儀分析標(biāo)記的細(xì)胞。

結(jié)果：評(píng)估替代性抗cd40抗體與表達(dá)鼠fcγri或fcγriv(人fcγriii/cd16的鼠等價(jià)物)的中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果如圖15a和15b所示。如預(yù)期，migg2a1c10以與migg2asea1c10相似的親和力結(jié)合至fcγr1。參見例如圖15a。然而，非巖藻糖基化的migg2asea1c10以比巖藻糖基化親本抗體migg2a1c10顯著更高的親和力結(jié)合fcγriv。參見例如圖15b。

在鼠腫瘤模型中評(píng)估非巖藻糖基化抗cd40抗體：將250.0e+3b16f10黑素瘤細(xì)胞皮下給予c57bl/6小鼠。將小鼠隨機(jī)分組，各組具有約50mm³的平均腫瘤尺寸。然后每隔一天給予同種型對(duì)照(migg2a)、巖藻糖基化的migg2a1c10或非巖藻糖基化的migg2a1c10(migg2asea1c10)的腹膜內(nèi)注射，總共三劑。監(jiān)測(cè)小鼠直到腫瘤尺寸達(dá)到1000mm³，此時(shí)處死小鼠。

結(jié)果：b16f10同基因黑色素瘤模型用于評(píng)估非巖藻糖基化抗cd40抗體替代物的體內(nèi)功效。將b16f10黑素瘤細(xì)胞植入c57bl/6小鼠，然后用migg2a同種型對(duì)照、巖藻糖基化的migg2a1c10或非巖藻糖基化的migg2a1c10(migg2asea1c10)處理。監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)擔(dān)，當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到1000mm³時(shí)處死小鼠。結(jié)果示于圖16。與巖藻糖基化的親本1c10igg2a抗體相比，用非巖藻糖基化sea-1c10migg2a處理的小鼠顯示出顯著的存活益處和腫瘤延遲。

實(shí)施例6：sea-cd40消耗b細(xì)胞并促進(jìn)t細(xì)胞活化

將sea-cd40活性與相關(guān)巖藻糖基化抗體和完全激動(dòng)性抗cd40抗體，克隆21.4.1，進(jìn)行比較?？贵w21.4.1是人抗cd40igg2k激動(dòng)性抗體，其是cp-870,893的親本克隆，正在實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)中與pdl1組合測(cè)試的抗體。關(guān)于抗體21.4.1的氨基酸序列信息，參見例如美國(guó)專利號(hào)7,338,660，其全部并入本文用于所有目的。測(cè)試了抗體的三個(gè)功能區(qū)域：驅(qū)動(dòng)人b細(xì)胞分化、激活和消耗的能力，激活原代人pbmc培養(yǎng)物的能力以及驅(qū)動(dòng)抗原特異性響應(yīng)的能力。

評(píng)估抗-cd-40抗體對(duì)b細(xì)胞的活化：使用來自新鮮人全血或人外周血單核細(xì)胞(pbmc)的純化b細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用rosettesep分離試劑盒從新鮮人體全血中分離b細(xì)胞。分離純化的b細(xì)胞與濃度遞增的sea-cd40、抗體21.4.1、或六聚體cd40配體，恩佐生物科學(xué)公司(enzolifesciences)(10、1、0.1、0.01、0.001μg/ml)孵育24小時(shí)。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估作為cd80上調(diào)的b細(xì)胞活化。

如上所述分離pbmc，然后用濃度遞增的sea-cd40、抗體21.4.1或六聚體cd40l(10、1、0.1、0.01、或0.001μg/ml)培養(yǎng)24小時(shí)。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估用cd19染色評(píng)估的b細(xì)胞的總數(shù)。

結(jié)果：sea-cd40免疫調(diào)節(jié)活性取決于抗體的fc部分及其與cd16，fcγriii受體的相互作用。結(jié)果示于圖17。在缺乏表達(dá)sea-cd40交聯(lián)所需的fcγ受體的細(xì)胞的純化b細(xì)胞培養(yǎng)物中，sea-cd40不誘導(dǎo)b細(xì)胞活化。這與cd40激活抗體21.4.1不同，其能類似于cd40配體地驅(qū)動(dòng)純b細(xì)胞培養(yǎng)物中的b細(xì)胞活化。

pbmc包括表達(dá)fcγ受體的細(xì)胞。該細(xì)胞群的結(jié)果示于圖18。對(duì)于pbmc培養(yǎng)物，sea-cd40能夠促進(jìn)b細(xì)胞的adcc消耗，而抗體21.4.1處理沒有消耗b細(xì)胞。

評(píng)估抗-cd-40抗體對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化：如上所述分離人pbmc培養(yǎng)物。用濃度遞增(0.0、0.001、0.01、0.1、1.0或10μg/ml)的sea-cd40、達(dá)西珠單抗、抗體21.4.1或sea同種型對(duì)照刺激pbmc培養(yǎng)物24小時(shí)。cd80的上調(diào)是單核細(xì)胞成熟的標(biāo)志。通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)cd80的表面表達(dá)。

結(jié)果：結(jié)果示于圖19。如cd80上調(diào)所測(cè)，pbmc的sea-cd40處理誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的強(qiáng)烈活化，并且該活性與cd40激活抗體21.4.1所見的活化一致。

評(píng)估抗-cd40抗體對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)：如上所述分離人pbmc培養(yǎng)物。用濃度遞增(0.0、0.001、0.01、0.1、1.0或10μg/ml)的sea-cd40、達(dá)西珠單抗、抗體21.4.1或sea同種型對(duì)照刺激pbmc培養(yǎng)物24小時(shí)。刺激后，收集組織培養(yǎng)上清液，并通過多重luminex分析評(píng)估炎性細(xì)胞因子。

結(jié)果：結(jié)果示于圖20和圖21。圖20顯示sea-cd40和cd40激活抗體21.4.1誘導(dǎo)細(xì)胞因子ifn-γ和趨化因子對(duì)于引發(fā)強(qiáng)烈t細(xì)胞響應(yīng)是重要的。圖21顯示了抗體對(duì)白介素10(il10)的誘導(dǎo)。與促進(jìn)il10生產(chǎn)的抗體21.4.1相反，sea-cd40降低免疫阻滯細(xì)胞因子il-10的水平。

評(píng)估抗-cd40抗體對(duì)t細(xì)胞的誘導(dǎo)：如上所述分離人pbmc培養(yǎng)物。1x10⁶pbmc在dmem+10％fbs中培養(yǎng)，并與5ug的m1流感肽、與濃度遞增(0.0、0.001、0.01、0.1、1.0或10μg/ml)的sea-cd40、達(dá)西珠單抗、或抗體21.4.1孵育持續(xù)5天。然后收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。在上清液中評(píng)估ifn-γ水平。使用流式細(xì)胞術(shù)通過四聚體染色評(píng)估流感抗原特異性t細(xì)胞。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定t調(diào)節(jié)細(xì)胞，一種cd4+、cd25+、低cd127細(xì)胞群的百分比。

結(jié)果：結(jié)果示于圖22-24。在五天孵育后，與達(dá)西珠單抗或抗體21.4.1相比，sea-cd40誘導(dǎo)更高水平的ifn-γ，參見例如圖22。圖23顯示sea-cd40誘導(dǎo)強(qiáng)烈的流感抗原特異性t細(xì)胞響應(yīng)，類似于抗體21.4.1所見。然而，圖24顯示sea-cd40還減少流感肽刺激后存在的免疫抑制性t調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量。該活性可能與用sea-cd40處理pbmc后所觀察到的il10產(chǎn)生減少有關(guān)。如圖24所示，相比之下，與抗體21.4.1孵育后，pbmc顯示出t調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量增加。

應(yīng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修飾或改變，且它們包括在本申請(qǐng)的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請(qǐng)通過引用全文納入本文以用于所有目的。

非正式序列表

seqidno：1；hs2c6重鏈

seqidno：2，hs2c6輕鏈

序列表

<110>西雅圖基因公司(seattlegenetics,inc.)

<120>非巖藻糖基化抗cd40抗體的劑量和給藥

<130>0040-00712pc

<150>us62/072,031

<151>2014-10-29

<150>us62/134,955

<151>2015-03-18

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>444

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>hs2c6重鏈

<400>1

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglytyrserphethrglytyr

202530

tyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaargvalileproasnalaglyglythrsertyrasnglnlysphe

505560

lysglyargphethrleuservalaspasnserlysasnthralatyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaarggluglyiletyrtrptrpglyglnglythrleuvalthrval

100105110

serseralaserthrlysglyproservalpheproleualaproser

115120125

serlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallys

130135140

asptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleu

145150155160

thrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleu

165170175

tyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythr

180185190

glnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysval

195200205

asplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcyspro

210215220

procysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphe

225230235240

proprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluval

245250255

thrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallysphe

260265270

asntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlyspro

275280285

argglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthr

290295300

valleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysval

305310315320

serasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysala

325330335

lysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarg

340345350

gluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysgly

355360365

phetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro

370375380

gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyser

385390395400

phepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglngln

405410415

glyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhis

420425430

tyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440

<210>2

<211>219

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>hs2c6輕鏈

<400>2

aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargserserglnserleuvalhisser

202530

asnglyasnthrpheleuhistrptyrglnglnlysproglylysala

354045

prolysleuleuiletyrthrvalserasnargpheserglyvalpro

505560

serargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile

65707580

serserleuglnprogluaspphealathrtyrphecysserglnthr

859095

thrhisvalprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

115120125

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

130135140

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

145150155160

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

165170175

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

180185190

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

195200205

provalthrlysserpheasnargglyglucys

210215