本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，尤其是包括含佐劑的免疫原性組合物的至少2次施用（其中后續(xù)施用被延遲）的免疫方法。

背景技術(shù)：

疫苗接種是用于預(yù)防傳染性疾病的最有效方法之一。但是，抗原的單次施用經(jīng)常不足以賦予最佳免疫和/或持久應(yīng)答。用于建立針對特定病原體的強(qiáng)且持久的免疫的方案包括將佐劑加入疫苗中和/或重復(fù)的疫苗接種，即通過施用一個或多個另外劑量的抗原來強(qiáng)化免疫應(yīng)答。這樣的另外施用可以用相同疫苗(同源強(qiáng)化)或用不同疫苗(異源強(qiáng)化)執(zhí)行。用于同源強(qiáng)化的最常見方案是不僅施用相同疫苗，而且以與早前施用相同的劑量施用它。

結(jié)核病(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）和其它分枝桿菌屬（Mycobacterium）種的感染造成的慢性傳染性疾病。它是發(fā)展中國家的一種主要疾病以及是世界發(fā)達(dá)地區(qū)的一個日益嚴(yán)重的問題。

蛋白抗原Mtb72f和M72 (描述在例如國際專利申請WO2006/117240和WO2012/080369，它們通過引用并入本文)或其片段或衍生物是具有用于治療或預(yù)防結(jié)核病的潛在益處的蛋白抗原。以前的研究已經(jīng)得出將M72與免疫刺激劑3-O-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A (3D-MPL)和QS21結(jié)合地在脂質(zhì)體制劑中并在0、1個月時間表中施用給人類，其中使用10 ug M72、25 ug 3D-MPL和25 ug QS21(Leroux-Roels等人Vaccine 2013 31 2196-2206, Montoya等人J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375)。

利用抗原M72的候選疫苗目前處于IIB期測試(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01755598)中，以在生活于TB流行國家中的18-50歲成年人中與安慰劑相比評價兩劑針對肺TB的保護(hù)效力。

仍然需要針對疾?。òńY(jié)核?。┻M(jìn)行免疫的新方法，所述新方法是非常有效的、安全的、有成本效益的、持久的，且誘導(dǎo)廣譜的交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答。

發(fā)明概述

現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在使用含佐劑的M72疫苗的多次劑量免疫方法中，當(dāng)后續(xù)劑量(強(qiáng)化劑量)與早前劑量(激發(fā)劑量)相比延遲時，所述免疫是更有效的。使用的佐劑包含TLR4激動劑、3D-MPL和免疫學(xué)活性的皂苷級分QS21。

因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物施用給所述受試者，隨后將包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物施用給所述受試者，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

任選地，所述第二免疫原性組合物包含第二佐劑，其中所述第二佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷。適當(dāng)?shù)兀龅诙魟┌琓LR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷且具有與所述第一佐劑共有的這兩種組分中的至少一種。

附圖簡述

圖1：來自以標(biāo)準(zhǔn)方案和延遲方案施用M72的小鼠的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答

圖2：來自以標(biāo)準(zhǔn)方案和延遲方案施用M72的小鼠的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答

圖3：來自以標(biāo)準(zhǔn)方案和延遲方案施用M72的小鼠的CD4 T細(xì)胞細(xì)胞因子概況

圖4：來自以標(biāo)準(zhǔn)方案和延遲方案施用M72的小鼠的CD8 T細(xì)胞細(xì)胞因子概況

圖5：來自以標(biāo)準(zhǔn)方案和延遲方案施用M72的小鼠的抗M72血清學(xué)。

序列標(biāo)識符的簡要描述

SEQ ID No. 1：M72的多肽序列

SEQ ID No. 2：具有兩個N-端His殘基的M72蛋白的多肽序列

SEQ ID No. 3：Mtb72f的多肽序列。

發(fā)明詳述

結(jié)核病(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）和其它分枝桿菌屬（Mycobacterium）種的感染造成的慢性傳染性疾病。它是發(fā)展中國家的一種主要疾病以及是世界發(fā)達(dá)地區(qū)的一個日益嚴(yán)重的問題。認(rèn)為超過20億人被TB桿菌感染，每年有約900萬新TB病例和150萬例死亡(世界衛(wèi)生組織Tuberculosis Facts 2014)。10%的被TB桿菌感染的人會發(fā)展為活動性TB，每個具有活動性TB的人平均每年感染其他10-15人。

結(jié)核分枝桿菌通過呼吸途徑感染個體。肺泡巨噬細(xì)胞吞噬該細(xì)菌，但是它能夠通過抑制具有酸性溶酶體的吞噬體融合而存活和增殖。隨后發(fā)生涉及CD4+和CD8+ T細(xì)胞的復(fù)雜免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致肉芽腫的形成。結(jié)核分枝桿菌作為病原體的成功關(guān)鍵在于以下事實：該分離的、但是未根除的細(xì)菌可能長期存在，使得個體容易隨后發(fā)展為活動性TB。

在感染后的第一年，少于5%的感染個體會發(fā)展為活動性TB。該肉芽腫可以存在數(shù)十年，并被認(rèn)為在缺乏氧和營養(yǎng)物的休眠狀態(tài)下包含活結(jié)核分枝桿菌。但是，最近已經(jīng)提出，大部分處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌位于遍布體內(nèi)的非巨噬細(xì)胞的細(xì)胞類型中(Locht等人, Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677)。當(dāng)宿主的天然免疫和病原體之間的平衡發(fā)生變化時（例如作為免疫抑制事件的結(jié)果），發(fā)生活動性TB的發(fā)展(Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2):87-95)。

還已經(jīng)提出描述潛伏性TB和活動性TB之間的平衡的動態(tài)假設(shè)(Cardana P-J Inflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection2009 37(2):80-86)。

盡管感染在相當(dāng)長時間內(nèi)可以是無癥狀的，但是活動性疾病最常顯現(xiàn)為肺的急性炎癥，從而導(dǎo)致疲倦、重量減輕、發(fā)熱和持續(xù)咳嗽。如果未經(jīng)治療，通常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。

結(jié)核病通?？梢允褂瞄L期抗生素療法進(jìn)行控制，盡管這樣的治療不足以防止該疾病的擴(kuò)散?；钴S地感染的個體可以是很大程度上無癥狀的，但在一定時間具有傳染性。此外，盡管對治療方案的順應(yīng)性是關(guān)鍵的，但是患者行為難以監(jiān)測。一些患者并未完成療程，這可以導(dǎo)致無效治療和抗藥性的發(fā)展。

多藥抗性的TB (MDR-TB)是對一線藥物沒有應(yīng)答的一種形式。所有TB病例中的3.3%是MDR-TB，據(jù)估計每年有440,000例新MDR-TB病例發(fā)生。當(dāng)在對一線藥物的耐受之上發(fā)生對二線藥物的耐受時，產(chǎn)生廣泛藥物抗性的TB (XDR-TB)。已經(jīng)在58個國家中證實了事實上無法治療的XDR-TB (世界衛(wèi)生組織Tuberculosis Facts 2010)。

即使完成了抗生素治療的整個療程，結(jié)核分枝桿菌的感染可能無法從受感染的個體根除，并可能作為可以再活化的潛伏感染保留下來。為了控制結(jié)核病的擴(kuò)散，對疾病的有效疫苗接種時間表和準(zhǔn)確早期診斷是最為重要的。

目前，用減毒活細(xì)菌進(jìn)行疫苗接種是最廣泛使用的用于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的方法。用于該目的的最常用的分枝桿菌是卡介苗(BCG)，即60多年前第一個開發(fā)的牛分枝桿菌（M. bovis）的無毒株。它在TB流行區(qū)域在出生后施用。但是，BCG的安全性和效力成為爭論的來源——盡管在兒童中顯示出對嚴(yán)重疾病的保護(hù)，但是BCG對疾病的效力是可變的。此外，一些國家，諸如美國，沒有用這種藥劑給普通民眾接種疫苗。

已經(jīng)證實在分枝桿菌感染的早期階段被強(qiáng)烈表達(dá)的多種蛋白會在動物疫苗接種模型中提供保護(hù)效力。但是，使用在感染的早期階段被高度表達(dá)的抗原的疫苗接種可能不會提供用于處理感染的晚期階段的最佳免疫應(yīng)答。在潛伏感染期的充分控制可能需要這樣的T細(xì)胞：其對在該時期表達(dá)的特定抗原是特異性的。直接靶向休眠的久存細(xì)菌的暴露后疫苗可能有助于保護(hù)免于TB再活化，由此增強(qiáng)TB控制，或者甚至能夠清除感染。因此，靶向潛伏性TB的疫苗可以顯著地和經(jīng)濟(jì)地降低總TB感染率。

基于晚期階段抗原的亞單位疫苗也可以與早期階段抗原聯(lián)合使用以提供多階段疫苗?？蛇x地，早期和/或后期階段抗原可以用于補(bǔ)充和改善BCG疫苗接種(通過強(qiáng)化BCG應(yīng)答或者通過先進(jìn)重組BCG菌株的開發(fā))。

Mtb72f和M72是具有用于治療或預(yù)防結(jié)核病的潛在益處的蛋白抗原。已經(jīng)證實Mtb72f在許多動物模型中提供保護(hù)(參見，例如: Brandt等人Infect. Immun. 2004 72(11):6622-6632; Skeiky等人J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Tsenova等人Infect. Immun. 2006 74(4):2392-2401)。Mtb72f還已經(jīng)是臨床研究的主題(Von Eschen等人2009 Human Vaccines 5(7):475-482)。M72是一種改進(jìn)的抗原，其與Mtb72f相比包括單個絲氨酸至丙氨酸突變，從而導(dǎo)致改善的穩(wěn)定性特征。還已經(jīng)證實M72相關(guān)抗原在潛伏性TB模型中具有價值(國際專利申請WO2006/117240，通過引用并入本文)。以前的臨床研究已經(jīng)得出將M72與免疫刺激劑3-O-去酰化單磷酰脂質(zhì)A (3D-MPL)和QS21結(jié)合地在脂質(zhì)體制劑中并在0、1個月時間表中施用給人類，其中使用10 ug M72、25 ug 3D-MPL和25 ug QS21 (Leroux-Roels等人Vaccine 2013 31 2196-2206, Montoya等人J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375)。

利用抗原M72的候選疫苗目前處于IIB期測試(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01755598)中，以在生活于TB流行國家中的18-50歲成年人中評價與安慰劑相比兩劑針對肺TB的保護(hù)效力。盡管如此，仍然需要改進(jìn)的疫苗接種方案。

在第一方面，提供了一種用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物施用給所述受試者，隨后將包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物施用給所述受試者，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

如本文中使用的，施用第一組合物、“隨后”施用第二組合物指示在第一組合物的施用和第二組合物的施用之間已經(jīng)逝去的時間間隔。

還提供了用在用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，所述方法包括將所述第一免疫原性組合物施用給所述受試者，隨后將包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物施用給所述受試者，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

類似地，提供了用在用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物，所述方法包括將包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物施用給所述受試者，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，隨后將所述第二免疫原性組合物施用給所述受試者，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

進(jìn)一步，提供了包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物在藥物制備中的用途，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，所述藥物用在用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中，所述方法包括將所述第一免疫原性組合物施用給所述受試者，隨后將包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物施用給所述受試者，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

另外，提供了第二免疫原性組合物在藥物制備中的用途，所述藥物用在用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中，所述方法包括將包含M72相關(guān)抗原和第一佐劑的第一免疫原性組合物施用給所述受試者，其中所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷，隨后將包含M72相關(guān)抗原的第二免疫原性組合物施用給所述受試者，且其中所述第一次施用和第二次施用之間的間隔是在2個月至5年之間。

任選地，所述第二免疫原性組合物包含第二佐劑，其中所述第二佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷。適當(dāng)?shù)?，所述第二佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷且具有與所述第一佐劑共有的這兩種組分中的至少一種。

適當(dāng)?shù)兀鍪茉囌呤侨恕?/p>

通常，本發(fā)明的方法的目的是，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答，即針對有關(guān)的病原體給受試者免疫或接種疫苗。因此，本發(fā)明可以用于預(yù)防、治療或改善分枝桿菌感染，諸如結(jié)核分枝桿菌感染。具體地，本發(fā)明可以提供以下目的：

- 預(yù)防由感染或再活化引起的活動性結(jié)核病，諸如通過施用給未被感染的受試者或可選地具有潛伏感染的受試者；

- 預(yù)防潛伏性結(jié)核病，諸如通過施用給未被感染的受試者；

- 治療潛伏性結(jié)核?。?/p>

- 預(yù)防或延遲結(jié)核病的再活化，特別是延遲TB再活化，例如延遲數(shù)月、數(shù)年的時段或不確定；或者

- 治療活動性結(jié)核病。

術(shù)語“活動性感染”表示具有顯現(xiàn)的疾病征狀和/或損傷(適當(dāng)?shù)鼐哂酗@現(xiàn)的疾病征狀)的感染，例如，結(jié)核分枝桿菌感染。

術(shù)語“非活動性感染”、“休眠感染”或“潛伏感染”或“潛伏性結(jié)核病”表示未顯現(xiàn)疾病征狀和/或損傷(適當(dāng)?shù)貨]有顯現(xiàn)的疾病征狀)的感染，例如，結(jié)核分枝桿菌感染。具有潛伏感染的受試者將適當(dāng)?shù)厥菧y試為感染陽性的受試者，例如通過基于PPD或T細(xì)胞的測定，但是所述受試者還沒有表現(xiàn)出疾病征狀和/或與活動性感染相關(guān)的損傷。

術(shù)語“原發(fā)性結(jié)核病”表示在感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)以后直接形成的臨床疾病，例如，疾病征狀的顯現(xiàn)。參見，Harrison’s PrinciplesofInternalMedicine，第150章，第953-966頁(第16版, Braunwald, 等人,編, 2005)。

術(shù)語“繼發(fā)性結(jié)核病”或“原發(fā)后結(jié)核病”表示休眠的、非活動性的或潛伏性感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)的再活化。參見，Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine, 第150章, 第953-966頁(第16版, Braunwald, 等人, 編, 2005)。

術(shù)語“結(jié)核病再活化”表示感染測試呈陽性(例如，在結(jié)核菌素皮試中呈陽性，適當(dāng)?shù)卦隗w外基于T細(xì)胞的測定中呈陽性)、但是沒有明顯疾病征狀的個體隨后顯現(xiàn)的疾病征狀。適當(dāng)?shù)?，個體將沒有再暴露于感染。該陽性診斷測試指示該個體被感染，但是，該個體可能曾顯示或未曾顯示已經(jīng)進(jìn)行過充分治療以將結(jié)核病帶入非活動性或潛伏狀態(tài)的活動性疾病征狀。

適合地將所述免疫原性組合物施用給未被分枝桿菌感染的受試者或已經(jīng)具有分枝桿菌潛伏感染（諸如結(jié)核分枝桿菌感染）的受試者。

在某些實施方案中，所述受試者以前已經(jīng)用BCG接種疫苗。

在某些實施方案中，所述受試者以前已經(jīng)被結(jié)核分枝桿菌感染。

用在本發(fā)明中的抗原.

本文中使用的術(shù)語“M72相關(guān)抗原”表示在SEQ ID No: 1中提供的M72蛋白或其免疫原性的衍生物。本文中使用的術(shù)語“衍生物”表示與參照序列相比經(jīng)過修飾的抗原。免疫原性的衍生物與參照序列足夠相似以保留參照序列的免疫原性特性且仍然能夠允許產(chǎn)生針對參照序列的免疫應(yīng)答。衍生物可以例如包含參照序列的修飾形式，或可選地可以由參照序列的修飾形式組成。

M72相關(guān)抗原可以例如含有少于1500個氨基酸殘基，諸如少于1200個氨基酸殘基，特別是少于1000個氨基酸殘基，特別是少于800個氨基酸殘基。

T細(xì)胞表位是被T細(xì)胞(例如CD4+或CD8+ T細(xì)胞)識別的氨基酸的短連續(xù)段。T細(xì)胞表位的鑒定可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表位作圖實驗實現(xiàn)(參見，例如，Paul, Fundamental Immunology, 第3版, 243-247 (1993); Beiβbarth等人Bioinformatics2005 21(Suppl. 1):i29-i37)。在不同的遠(yuǎn)親雜交群體(諸如人)中，不同的HLA類型是指特定表位可能不被該群體的所有成員識別。由于T細(xì)胞應(yīng)答在結(jié)核病中的關(guān)鍵參與，為了使識別的水平和免疫應(yīng)答的規(guī)模最大化，M72的免疫原性的衍生物理想地是含有大多數(shù)(或適當(dāng)?shù)厮?完整T細(xì)胞表位的那種。

技術(shù)人員會認(rèn)識到，改變、添加或缺失單個氨基酸或小百分比的氨基酸的對M72蛋白的單獨置換、缺失或添加是這樣的“免疫原性的衍生物”：其中所述改變導(dǎo)致在功能上類似的氨基酸對氨基酸的置換或者不會實質(zhì)上影響免疫原性功能的殘基的置換/缺失/添加。

提供在功能上類似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域眾所周知的。一般而言，這樣的保守置換將落入下文詳細(xì)說明的氨基酸分組之一中，盡管在某些情況下，其它置換也可能是可能的，而不實質(zhì)上影響所述抗原的免疫原性特性。以下八個組各含有通常彼此保守置換的氨基酸：

1) 丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3) 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4) 精氨酸(R)、賴氨酸(K)；

5) 異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；

6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7) 絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和

8) 半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)

(參見，例如，Creighton, Proteins 1984)。

適當(dāng)?shù)?，這樣的置換不發(fā)生在表位區(qū)域，且因此對所述抗原的免疫原性特性不具有顯著影響。

免疫原性的衍生物還可以包括與參照序列相比在其中插入了另外氨基酸的那些。適當(dāng)?shù)?，這樣的插入不發(fā)生在表位區(qū)域，且因此對所述抗原的免疫原性特性不具有顯著影響。插入的一個例子包括輔助目標(biāo)抗原的表達(dá)和/或純化的組氨酸殘基的短段(例如，2-6個殘基)。

免疫原性的衍生物包括與參照序列相比其中已經(jīng)缺失氨基酸的那些。適當(dāng)?shù)兀@樣的缺失不發(fā)生在表位區(qū)域，且因此對所述抗原的免疫原性特性不具有顯著影響。

技術(shù)人員會認(rèn)識到，特定的免疫原性的衍生物可以包含置換、缺失和添加(或它們的任意組合)。

術(shù)語“相同”或百分比“同一性”在兩個或更多個多肽序列的上下文中表示，當(dāng)在對比窗或指定區(qū)域中對比和比對最大對應(yīng)(如使用下述序列對比算法之一或通過手工比對和目檢所測量的)時，兩個或更多個序列或子序列是相同的或具有一定百分比的相同的氨基酸殘基(即，相對指定區(qū)域的70%同一性，任選地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性)。該定義也表示測試序列的互補(bǔ)(compliment)。任選地，所述同一性存在于至少500個氨基酸長度的區(qū)域，諸如至少600個氨基酸或至少700個氨基酸。適當(dāng)?shù)?，所述對比在與參照序列(而不是衍生物序列)的整個長度對應(yīng)的窗口中進(jìn)行。

對于序列對比，一個序列作為參照序列，將測試序列與之對比。當(dāng)使用序列對比算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機(jī)，如果必要的話，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或可以指定可選參數(shù)。序列對比算法然后基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參照序列的百分比序列同一性。

本文中使用的“對比窗”表示，將兩個序列最佳地比對后，其中序列可以與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參照序列進(jìn)行對比的區(qū)段。用于對比的序列的比對方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于對比的序列的最佳比對可以例如通過下述方法實現(xiàn)：Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比對算法，Pearson和Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)的檢索相似性方法，這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)，或者手工比對和目檢(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人, 編. 1995增刊))。

一種有用算法的一個例子是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)的成對比對建立來自一組相關(guān)序列的多序列比對，以顯示關(guān)聯(lián)和序列同一性百分比。它還繪制顯示用于建立比對的簇關(guān)聯(lián)的樹狀圖或系統(tǒng)樹圖。PILEUP使用Feng和Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)的漸進(jìn)比對法的簡化版。使用的方法與Higgins和Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)描述的方法類似。該程序可以比對高達(dá)300個序列，每個序列的最大長度為5,000個核苷酸或氨基酸。該多重比對程序開始于兩個最相似序列的成對比對，從而產(chǎn)生兩個比對序列的簇。然后將該簇與下一個最相關(guān)的序列或比對序列的簇進(jìn)行比對。兩個序列簇通過兩個單獨序列的成對比對的簡單擴(kuò)展進(jìn)行比對。最終比對可以通過一系列漸進(jìn)的成對比對實現(xiàn)。通過指定特定序列和它們的氨基酸坐標(biāo)為序列對比區(qū)域并通過指定程序參數(shù)來運(yùn)行該程序。使用PILEUP，使用下述參數(shù)將參照序列與其它測試序列進(jìn)行對比以確定序列同一性百分比關(guān)系：默認(rèn)間隙權(quán)重(3.00)，默認(rèn)間隙長度權(quán)重(0.10)，以及加權(quán)的末端間隙。PILEUP可以得自GCG序列分析軟件包，例如，7.0版(Devereaux等人, Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984))。

適合用于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一個例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述于Altschul等人, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件通過國家生物技術(shù)信息中心(網(wǎng)站在www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲取。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度為W的短字來鑒定高評分序列對(HSP)，所述短字當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時匹配或滿足某些正值閾值評分T。T指鄰近字評分閾值閾值(Altschul等人, 出處同上)。這些初始鄰近字采樣作為用于啟動搜索的種子以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP。所述字采樣沿著每個序列在兩個方向延伸，直至累計比對評分可以增加。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(對一對匹配殘基的獎勵分；總是>0)和N(對錯配殘基的罰分；總是<0)計算累計評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累計評分。在以下情況下字采樣在每個方向的延伸被停止：累計比對評分較其最大獲得值偏離數(shù)量X；由于一個或多個負(fù)評分殘基比對的累積，累計評分降至0或以下；或者到達(dá)任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用11的字長(w)、10的預(yù)期(E)、M=5、N=-4和兩條鏈的對比作為默認(rèn)值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字長、10的預(yù)期(E)和BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))、50的比對、10的預(yù)期(E)、M=5、N=-4和兩條鏈的對比作為默認(rèn)值。

BLAST算法還執(zhí)行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin和Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的一種相似性量度是最小總和概率(P(N))，它提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然產(chǎn)生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參照核酸的對比的最小總和概率小于約0.2、更優(yōu)選地小于約0.01和最優(yōu)選地小于約0.001，認(rèn)為所述核酸與參照序列類似。

在每種情況下，多肽序列的免疫原性的衍生物將具有與參照序列基本相同的活性?；鞠嗤幕钚允侵福谟锰囟乖腜BMC或全血的體外再刺激測定(例如，再刺激數(shù)小時至長達(dá)兩周之間諸如長達(dá)一天、1天至1周或1-2周的時段)中參照序列的活性的至少50%、適當(dāng)?shù)刂辽?5%和特別是至少90%，所述測定如下測量細(xì)胞的活化：通過淋巴組織增殖，通過培養(yǎng)物上清液中細(xì)胞因子的產(chǎn)生(通過ELISA、CBA等測量)，或者通過胞內(nèi)和胞外染色(例如使用對免疫標(biāo)記物諸如CD3、CD4、CD8、IL2、TNF-α、IFN-γ、CD40L、CD69等特異性的抗體)然后用流式細(xì)胞計數(shù)器表征T和B細(xì)胞應(yīng)答。適當(dāng)?shù)?，基本相同的活性是指在T細(xì)胞增殖和/或IFN-γ產(chǎn)生測定中參照序列的活性的至少50%、適當(dāng)?shù)刂辽?5%和尤其是至少90%。

M72蛋白的特定衍生物包括在N-端具有額外His殘基的那些(例如，兩個His殘基，如SEQ ID No: 2中所提供的；或5個或尤其是6個His殘基的多組氨酸標(biāo)簽，其可以用于鎳親和純化)。Mtb72f (SEQ ID No: 3)，其含有在M72中已經(jīng)被突變的初始絲氨酸殘基，是M72的另一種衍生物，在N-端具有額外的His殘基(例如，兩個His殘基；或5個或尤其是6個His殘基的多組氨酸標(biāo)簽，其可以用于鎳親和純化)的Mtb72f蛋白也是如此。

適當(dāng)?shù)?，M72相關(guān)抗原將包含這樣的序列，諸如由其組成：所述序列與SEQ ID No. 1具有至少70%同一性，諸如至少80%，尤其是至少90%，特別是至少95%，諸如至少98%，例如至少99%。

典型的M72相關(guān)抗原將包含具有小量缺失、插入和/或置換的SEQ ID No: 1或2的免疫原性的衍生物，諸如由其組成。實例是在0-5個位置具有最多達(dá)5個殘基的缺失、在0-5個位置具有最多達(dá)5個殘基的插入和最多達(dá)20個殘基的置換的那些。

M72的其它免疫原性的衍生物是包含SEQ ID No: 1或2的片段的那些，諸如由其組成，所述片段具有至少300個氨基酸的長度，諸如至少350個氨基酸的長度，諸如至少400個氨基酸的長度，諸如至少500個氨基酸的長度，諸如至少600個氨基酸的長度或至少700個氨基酸的長度。由于M72是從兩個單獨抗原衍生出的融合蛋白，至少300個殘基的任意片段將包含多個來自全長序列的表位(Skeiky等人J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8):3998-4007; Dillon Infect. Immun. 1999 67(6):2941-2950)。在某些實施方案中，M72的免疫原性的衍生物包含至少300個來自Mtb39A的殘基。

在特定實施方案中，所述M72相關(guān)抗原將包含SEQ ID No. 1的殘基2-723，例如包含SEQ ID No. 1或2 (或由SEQ ID No. 1或2組成)。

通過前面描述的方法(WO2006/117240)或與其類似的方法可以制備M72相關(guān)抗原。

所述免疫原性組合物可以包含一種或多種另外的抗原組分。另外的抗原組分在結(jié)核病預(yù)防和治療領(lǐng)域中可以意圖強(qiáng)化或補(bǔ)充由M72相關(guān)抗原引起的免疫應(yīng)答，或者另外的抗原可以與其它病原體相關(guān)且意圖為了方便起見而與M72相關(guān)抗原一起施用。當(dāng)許多抗原組分存在于制劑中時，這些可以以單獨多肽或融合蛋白的形式提供。在某些情況下，另外的抗原組分可以作為一種多核苷酸(或多種核苷酸)提供。

所述抗原是結(jié)核分枝桿菌抗原，諸如M72抗原，例如在WO2006/117240中描述的抗原，其被授權(quán)為美國專利號8,470,338且其為了描述用在本發(fā)明中的合適蛋白的目的通過引用并入。

通常，對于施用給人類，所述第一和第二免疫原性組合物包含1 ug至100 ug M72相關(guān)抗原，諸如1 ug至50 ug之間。適當(dāng)?shù)?，所述第一免疫原性組合物含有1 ug至50 ug M72相關(guān)抗原(諸如5 ug至50 ug)，特別是1 ug至20 ug (諸如5 ug至20 ug)和尤其是約或精確的10 ug。

在某些實施方案中，所述第二免疫原性組合物將含有與第一免疫原性組合物相同量的M72相關(guān)抗原。例如，所述第二免疫原性組合物將含有1 ug至50 ug M72相關(guān)抗原(諸如5 ug至50 ug)，特別是1 ug至20 ug (諸如5 ug至20 ug)和尤其是約或精確的10 ug。

在其它實施方案中，所述第二免疫原性組合物將含有與第一免疫原性組合物相比減少的量的M72相關(guān)抗原。例如，所述第二免疫原性組合物將含有1 ug至40 ug M72相關(guān)抗原(諸如2 ug至40 ug)，特別是1 ug至16 ug (諸如2 ug至16 ug)和尤其是小于10 ug (諸如1-8 ug)。

在一個實施方案中，在第二免疫原性組合物中的M72相關(guān)抗原的較低量比第一免疫原性組合物中的量低至少10%，諸如低至少25%，例如低至少2倍，諸如低至少3倍，例如低至少4倍，諸如低至少5倍，例如低至少6倍，諸如低至少7倍，例如低至少8倍，諸如低至少9倍，例如低至少10倍。

在第二免疫原性組合物中的M72相關(guān)抗原的量通常是第一免疫原性組合物中的量的5/4 (即125%)至1/10 (即10%)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述第一和第二免疫原性組合物含有相同的M72相關(guān)抗原。

在某些實施方案中，在所述第一和第二免疫原性組合物中的所有抗原是相同的。

用在本發(fā)明的方法中的佐劑

如上所述，在本發(fā)明的一個方面，所述第一佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷。

因而，在一個實施方案中，所述第一佐劑包含TLR激動劑。在另一個實施方案中，所述第一佐劑包含免疫學(xué)活性的皂苷。在還另一個實施方案中，所述第一佐劑包含TLR激動劑和免疫學(xué)活性的皂苷。

在另一個方面，所述第一佐劑和第二佐劑包含TLR激動劑和/或免疫學(xué)活性的皂苷且共同具有這兩種組分中的至少一種。

因而，在一個實施方案中，所述第一佐劑和第二佐劑都包含TLR激動劑。在另一個實施方案中，所述第一佐劑和第二佐劑都包含免疫學(xué)活性的皂苷。在還另一個實施方案中，所述第一佐劑和第二佐劑都包含TLR激動劑和免疫學(xué)活性的皂苷。

在一個實施方案中，所述第一佐劑和所述第二佐劑由相同組分組成。因而，在這樣的一個實施方案中，兩種佐劑的組分是相同的，盡管非必然地以相同的相對比例。例如，所述第一佐劑和所述第二佐劑可以都由在脂質(zhì)體制劑中的TLR激動劑和皂苷組成，但是TLR激動劑與皂苷的比率在第一佐劑中可以是5:1且在第二佐劑中可以是1:1，在第一佐劑中可以是4:1且在第二佐劑中可以是1:1，在第一佐劑中可以是3:1且在第二佐劑中可以是2:1，在第一佐劑中可以是1:1且在第二佐劑中可以是1:1。

在另一個實施方案中，所述第一佐劑和第二佐劑由相同組分組成且這些組分的相對比例是相同的。但是，在這樣的一個實施方案中，盡管佐劑組分的相對比例是相同的，但是這些組分的絕對量在所述第一和第二免疫原性組合物中可以不同。例如，第二佐劑中所有組分的絕對量可以例如是第一佐劑中所有組分的絕對量的1/5。

如上所述，在一個實施方案中，所述第二佐劑含有比第一佐劑更低量的共有組分(即更低量的TLR激動劑或更低量的皂苷或更低量的二者)。

在一個實施方案中，所述第二佐劑中共有組分的更低量比第一佐劑中的量低至少10%，諸如低至少25%，例如低至少2倍，諸如低至少3倍，例如低至少4倍，諸如低至少5倍，例如低至少6倍，諸如低至少7倍，例如低至少8倍，諸如低至少9倍，例如低至少10倍，諸如低至少15倍，例如低至少20倍。

在另一個實施方案中，所述第二佐劑中共有組分的更低量比第一佐劑中的量低2-50倍，諸如低2-20倍，例如低2-15倍，諸如低2-10倍，例如低3-7倍，諸如低4-6倍。

在第二免疫原性組合物中的共有佐劑組分(諸如所有共有佐劑組分)的量通常是第一免疫原性組合物中的量的5/4 (即125%)至1/10 (即10%)。

如上所述，在一個實施方案中，所述第一佐劑和第二佐劑包含TLR (Toll-樣受體)激動劑。TLR激動劑在佐劑中的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的，且已經(jīng)例如由Lahiri等人(2008) Vaccine 26:6777綜述?？梢员淮碳ひ詫崿F(xiàn)佐劑效應(yīng)的TLR包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9。TLR2、TLR4、TLR7和TLR8激動劑，特別是TLR4激動劑，是優(yōu)選的。

合適的TLR4激動劑包括脂多糖，諸如單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3-O-去酰化單磷酰脂質(zhì)A (3D-MPL)。美國專利4,436,727公開了MPL和它的制備。美國專利4,912,094和復(fù)審證書B1 4,912,094公開了3D-MPL和及其制備方法。另一種TLR4激動劑是吡喃葡萄糖基脂質(zhì)佐劑(GLA)，即一種合成的脂質(zhì)A-樣分子(參見，例如Fox等人(2012) Clin. Vaccine Immunol 19:1633)。在另一個實施方案中，所述TLR4激動劑可以是合成的TLR4激動劑諸如合成的二糖分子，其在結(jié)構(gòu)上類似于MPL和3D-MPL，或可以是合成的單糖分子，諸如公開在例如WO9850399、WO0134617、WO0212258、W03065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065和WO0190129中的氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯(AGP)化合物。這樣的分子還已經(jīng)在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中描述為脂質(zhì)A模擬物。脂質(zhì)A模擬物適當(dāng)?shù)嘏c脂質(zhì)A共有一些功能和/或結(jié)構(gòu)活性，且在一個方面被TLR4受體識別。如本文中所述的AGP在本領(lǐng)域中有時被稱作脂質(zhì)A模擬物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述TLR4激動劑是3D-MPL。TLR4激動劑，諸如3-O-去?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A (3D-MPL)，和它們作為佐劑在疫苗中的用途，已經(jīng)例如在WO 96/33739和WO2007/068907中描述并在Alving等人(2012) Curr Opin in Immunol 24:310中綜述。

在本發(fā)明的方法的另一個實施方案中，所述第一佐劑和所述第二佐劑包含免疫學(xué)活性的皂苷，諸如免疫學(xué)活性的皂苷級分，諸如QS21。

在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了包含皂苷的佐劑。皂苷描述在：Lacaille-Dubois和Wagner (1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2:363。皂苷作為疫苗中的佐劑是已知的。例如，Dalsgaard等人在1974(“Saponin adjuvants”, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, 第44卷, Springer Verlag, Berlin, 243)中描述了Quil A (源自南美洲樹皂皮樹（Quillaja Saponaria Molina）的樹皮)具有佐劑活性。已經(jīng)通過HPLC分離了純化的Quil A的級分，其保留佐劑活性，而沒有與Quil A有關(guān)的毒性(Kensil等人(1991) J. Immunol. 146: 431)。Quil A級分還描述在US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55中。

適合用在本發(fā)明中的兩種這樣的級分是QS7和QS21 (也被稱作QA-7和QA-21)。QS21是用在本發(fā)明中的一種優(yōu)選的免疫學(xué)活性的皂苷級分。QS21已經(jīng)在Kensil (2000) In O’Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press, Totowa, New Jersey, 第15章中綜述。包含Quil A的級分（諸如QS21和QS7）的微粒佐劑系統(tǒng)例如描述在WO 96/33739、WO 96/11711和WO2007/068907中。

除了其它組分以外，所述佐劑優(yōu)選地包含甾醇。甾醇的存在可以進(jìn)一步減小包含皂苷的組合物的反應(yīng)源性，參見例如EP0822831。合適的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、麥角鈣化醇和膽固醇。膽固醇是特別合適的。適當(dāng)?shù)?，所述免疫學(xué)活性的皂苷級分是QS21且QS21:甾醇的比率是1:100至1:1 w/w，諸如1:10至1:1 w/w，例如1:5至1:1 w/w。

在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選的實施方案中，所述TLR4激動劑是3D-MPL，且所述免疫學(xué)活性的皂苷是QS21。

在某些實施方案中，所述佐劑以水包油乳劑（例如包含角鯊烯、α-生育酚和表面活性劑(參見例如W095/17210)）的形式或以脂質(zhì)體的形式存在。脂質(zhì)體呈現(xiàn)（presentation）是優(yōu)選的。

術(shù)語“脂質(zhì)體”當(dāng)在本文中使用時表示包封水性內(nèi)部的單層或多層(特別是2、3、4、5、6、7、8、9或10層，取決于形成的脂質(zhì)膜的數(shù)目)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑是本領(lǐng)域眾所周知的。脂質(zhì)體呈現(xiàn)例如描述在WO 96/33739和WO2007/068907中。能夠形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括具有脂肪或脂肪樣性質(zhì)的所有物質(zhì)。可以構(gòu)成脂質(zhì)體中的脂質(zhì)的脂質(zhì)可以選自甘油酯、甘油磷脂、甘油膦脂、甘油膦酰酯、硫脂、鞘脂、磷脂、isoprenolides、類固醇、硬脂、甾醇、archeolipids、合成陽離子脂質(zhì)和含碳水化合物的脂質(zhì)。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，所述脂質(zhì)體包含磷脂。合適的磷脂包括(但不限于)：作為磷脂酰膽堿合成中的中間體的磷酸膽堿(PC)；天然磷脂衍生物：蛋磷酸膽堿、蛋磷酸膽堿、大豆磷酸膽堿、氫化大豆磷酸膽堿、作為天然磷脂的鞘磷脂；和合成磷脂衍生物：磷酸膽堿(二癸酰基-L-α-磷脂酰膽堿[DDPC]、二月桂?；字Ｄ憠A[DLPC]、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A[DMPC]、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿[DPPC]、二硬脂酰基磷脂酰膽堿[DSPC]、二油酰基磷脂酰膽堿[DOPC]、1-棕櫚酰基、2-油酰基磷脂酰膽堿[POPC]、二反油?；字Ｄ憠A[DEPC])、磷酸甘油(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DMPG]、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油[DPPG]、1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕櫚?；?2-油?；?sn-甘油-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酸[DMPA]、二棕櫚?；字醄DPPA]、二硬脂?；?磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DPPE]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺DSPE 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸絲氨酸、聚乙二醇[PEG]磷脂。

取決于磷脂組成和用于其制備的方法，脂質(zhì)體大小可以從30 nm到數(shù)μm變化。在本發(fā)明的特定實施方案中，脂質(zhì)體大小將在50 nm至500 nm的范圍中，并且在進(jìn)一步實施方案中，50 nm至200 nm。動態(tài)激光散射是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的用于測量脂質(zhì)體大小的方法。

在一個特別合適的實施方案中，用在本發(fā)明中的脂質(zhì)體包含DOPC和甾醇，特別是膽固醇。因而，在一個特定實施方案中，本發(fā)明的組合物包含脂質(zhì)體形式的本文描述的任意量的QS21，其中所述脂質(zhì)體包含DOPC和甾醇，特別是膽固醇。

優(yōu)選地，所述第一佐劑和第二佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的3D-MPL和QS21。

在一個實施方案中，所述第一佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至75微克3D-MPL和12.5至75微克QS21，且所述第二佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至75微克3D-MPL和12.5至75微克QS21。

在另一個實施方案中，所述第一佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) 3D-MPL和12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) QS21，且所述第二佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) 3D-MPL和12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) QS21。適當(dāng)?shù)兀诘谝缓偷诙魟┲校?D-MPL的量與QS21的量相同。

在另一個實施方案中，所述第一佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) 3D-MPL和12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) QS21，且所述第二佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的2.5至7.5微克諸如5微克3D-MPL和2.5至7.5微克諸如5微克QS21。

在另一個實施方案中，所述第一佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) 3D-MPL和12.5至37.5微克諸如20-30微克(例如約或精確的25微克) QS21，且所述第二佐劑包含在脂質(zhì)體制劑中的減少量的3D-MPL或QS21，諸如2.5至20微克諸如2.5至10微克(例如約或精確的5微克) 3D-MPL和諸如2.5至20微克諸如2.5至10微克(例如約或精確的5微克) QS21。適當(dāng)?shù)?，在第一和第二佐劑中?D-MPL的量與QS21的量相同。

眾所周知，對于胃腸外施用，溶液應(yīng)當(dāng)是生理學(xué)上等滲的(即具有藥學(xué)上可接受的摩爾滲透壓濃度)以避免細(xì)胞變形或裂解。藥學(xué)上可接受的摩爾滲透壓濃度通常是指，溶液將具有大約等滲或輕度高滲的摩爾滲透壓濃度。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的免疫原性組合物將具有在250-750 mOsm/kg的范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度，例如，摩爾滲透壓濃度可以是在250-550 mOsm/kg的范圍內(nèi)，諸如在280-500 mOsm/kg的范圍內(nèi)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，諸如通過使用商購可得的滲透壓計，例如可從Advanced Instruments Inc. (USA)得到的Advanced?Model 2020，可以測量摩爾滲透壓濃度?！暗葷B劑”是生理上耐受的并給制劑(例如本發(fā)明的免疫原性組合物)賦予合適張度以防止水穿過與所述制劑接觸的細(xì)胞膜的凈流動的化合物。已知水性佐劑組合物，其含有100 mM氯化鈉或更多，例如在WO 2005/112991和WO2008/142133中的佐劑系統(tǒng)A (ASA)或在WO2007/068907中公開的脂質(zhì)體佐劑。

在某些實施方案中，用于所述組合物的等滲劑是鹽。但是，在其它實施方案中，所述組合物包含非離子等滲劑，且組合物中的氯化鈉濃度或離子強(qiáng)度小于100 mM，諸如小于80 mM，例如小于30 mM，諸如小于10 mM或小于5 mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述非離子等滲劑是多元醇，諸如山梨醇。山梨醇的濃度可以是例如約3%至約15%(w/v)，諸如約4%至約10%(w/v)。在WO2012/080369（其通過引用并入本文）中已經(jīng)描述了包含免疫學(xué)活性的皂苷級分和TLR4激動劑的佐劑，其中所述等滲劑是鹽或多元醇。

在另一個實施方案中，第一佐劑和/或第二佐劑不包含鋁。

所述免疫原性組合物的pH應(yīng)當(dāng)適合用于胃腸外施用。通常，pH是在7.0-9.0的范圍內(nèi)，特別是7.25-8.75，諸如7.5-8.5，尤其是pH 7.75-8.25。約8.0的pH是特別重要的。

免疫方案、靶群體和施用模式

在一個實施方案中，所述受試者在2年時段內(nèi)或可選地在5年時段內(nèi)接受兩劑包含M72抗原的免疫原性組合物。在第二個實施方案中，所述受試者在2年時段內(nèi)或可選地在5年時段內(nèi)接受三劑包含M72抗原的免疫原性組合物。

當(dāng)所述受試者在5年時段內(nèi)接受兩劑包含M72抗原的免疫原性組合物時，這將是第一免疫原性組合物和第二免疫原性組合物。在一個實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是2個月至5年，諸如3個月至5年，諸如3個月和24個月，例如3-18個月，諸如3-14個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是3-10個月，例如3-9個月，諸如3-8個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是4-14個月，例如4-9個月，諸如4-8個月。

當(dāng)所述受試者在5年時段內(nèi)接受三劑包含M72抗原的免疫原性組合物時，這可以是(a)兩劑第一免疫原性組合物和一劑第二免疫原性組合物，或它可以是(b)一劑第一免疫原性組合物和兩劑第二免疫原性組合物。

在(a)的一個實施方案中，第一組合物的初次施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是3個月至5年，諸如3個月至24個月，例如3-18個月，諸如3-14個月。在某些實施方案中，第一組合物的初次施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是3-10個月，例如3-9個月，諸如3-8個月。在某些實施方案中，第一組合物的初次施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是4-14個月，例如4-9個月，諸如4-8個月。在(a)的另一個實施方案中，第一組合物的最終施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是2個月至5年，諸如3個月至5年，諸如3個月至24個月，例如3-18個月，諸如3-14個月。在某些實施方案中，第一組合物的最終施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是3-10個月，例如3-9個月，諸如3-8個月。在某些實施方案中，第一組合物的最終施用和第二組合物的施用之間的時間間隔是4-14個月，例如4-9個月，諸如4-8個月。

在(b)的一個實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的最終施用之間的時間間隔是3個月至5年，諸如3個月至24個月，例如3-18個月，諸如3-14個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的最終施用之間的時間間隔是3-10個月，例如3-9個月，諸如3-8個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的最終施用之間的時間間隔是4-14個月，例如4-9個月，諸如4-8個月。在(b)的另一個實施方案中，所述第一組合物的施用和所述第二組合物的初次施用之間的時間間隔是2個月至5年，諸如3個月至5年，諸如3個月至24個月，例如3-18個月，諸如3-14個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的最終施用之間的時間間隔是3-10個月，例如3-9個月，諸如3-8個月。在某些實施方案中，第一組合物的施用和第二組合物的最終施用之間的時間間隔是4-14個月，例如4-9個月，諸如4-8個月。

在給受試者施用第一組合物2次的情況下，第一組合物的初次施用和第一組合物的另外施用之間的時間間隔可以是2周至2個月。

在給受試者施用第二組合物2次的情況下，第二組合物的初次施用和第二組合物的另外施用之間的時間間隔可以是3個月至5年，諸如3個月至24個月，諸如6-14個月。

在另一個實施方案中，所述第二組合物可以例如作為重復(fù)的每年強(qiáng)化劑來提供，例如持續(xù)1-5年或更多。在一個實施方案中，在第二組合物施用以后至少12個月、至少13個月、至少14個月、至少15個月、至少16個月、至少17個月、至少18個月、至少19個月或至少20個月、或更多個月的時間間隔時，施用第二組合物另外一次或多次。

要使用本發(fā)明的方法治療的受試者可以是任何年齡。在本發(fā)明的一個方面，所述受試者是人。

在一個實施方案中，所述受試者是成年人(通常18-60歲)。

所述第一和第二組合物可以通過多種合適的途徑施用，包括胃腸外施用，諸如肌肉內(nèi)或皮下施用。

在一個特定實施方案中，皮內(nèi)地施用所述第二組合物。本文中使用的術(shù)語皮內(nèi)地意圖表示將抗原施用進(jìn)人皮膚的真皮和/或表皮。通過使用技術(shù)人員已知的任何皮膚方法，包括、但不限于，使用短針裝置(包含約0.2至約0.6 mm長度的微針的裝置)的遞送或使用皮膚貼劑的遞送，可以執(zhí)行免疫原性組合物的皮內(nèi)施用。用于與本文描述的皮膚疫苗一起使用的合適裝置包括短針裝置諸如在US 4,886,499、US5,190,521、US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662和EP1092444中描述的那些。還可以通過限制針在皮膚中的有效穿透長度的裝置（諸如在WO99/34850中描述的那些）施用皮膚疫苗。也合適的是噴射注射裝置，其通過液體噴射注射器或通過針將液體疫苗遞送至真皮。也合適的是彈道粉末/顆粒遞送裝置，其使用壓縮氣體使粉末形式的疫苗加速穿過皮膚的外層到達(dá)真皮。皮膚貼劑通常包含背襯板，所述背襯板包括固體襯底。貼劑將用在本發(fā)明中的抗原和佐劑遞送至真皮或表皮。在特定實施方案中，在本發(fā)明中可用的貼劑包含多個微投射（microprojection）。所述微投射可以具有適合用于刺穿角質(zhì)層、表皮和/或真皮并將抗原和佐劑遞送至表皮或真皮的任何形狀。在一個特定實施方案中，微投射是可生物降解的且包含可生物降解的聚合物。

通過將抗原和佐劑混合，可以制備在本發(fā)明中使用的免疫原性組合物。所述抗原可以以低壓凍干形式或在液體制劑中提供。對于每種組合物，可以提供試劑盒，其包含含有抗原的第一容器和含有佐劑的第二容器。

適當(dāng)?shù)兀鶕?jù)本發(fā)明的免疫原性組合物具有0.05 ml至1 ml之間的人劑量體積，諸如0.1-0.5 ml，特別是約0.5 ml或0.7 ml的劑量體積。可以減小第二免疫原性組合物的體積，且例如在0.05 ml至0.5 ml之間，諸如0.1-0.2 ml。使用的組合物的體積可能取決于遞送途徑，其中較小的劑量通過皮內(nèi)途徑施用。

在本申請中的所有參考文獻(xiàn)（包括專利申請和授權(quán)的專利）的教導(dǎo)通過引用完整地并入本文。被定義為“包含/包括”某些要素的組合物或方法或過程理解為包括(分別)由那些要素組成的組合物、方法或過程。將參考以下非限制性的實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明：

實施例1：使用M72和佐劑AS01的疫苗接種

在小鼠模型中研究了結(jié)核病抗原M72 2-his (SEQ ID No. 2)的延長的和減小的劑量的影響。

材料和方法

動物模型

如下表所示，在第0-14和28或98天通過肌肉內(nèi)途徑給雌性小鼠C57BL/6JOlaHsd（6周齡–12只小鼠/組）注射50μl。

AS01E佐劑含有在脂質(zhì)體制劑中的免疫刺激劑3D-MPL^?(GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, USA)和QS21 (各2.5 ug)。使用佐劑緩沖液執(zhí)行稀釋。

讀出：

全血ICS

第21天- II后7天(G1-7)；

第35天- III后7天(G1-3)；

第105天- III后77天(G1-3)和III后7天(G4-7)

血清學(xué)抗-M72 IgTot

第28天- II后14天(G1-7)

第42天- III后14天(G1-3)

第112天- III后84天(G1-3)和III后14天(G4-7)。

為了具有足夠的體積，在第21、35和105天收集各組3只小鼠的4份合并物的全血。在第28、42和112天收集各份血清。

將小鼠個別地鑒別以便關(guān)聯(lián)ICS和血清學(xué)的PII和PIII結(jié)果。

讀出描述

細(xì)胞免疫應(yīng)答-細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)

白細(xì)胞分離

在每個時間點，從每只小鼠收集血液，并隨后合并(3只小鼠的5份合并物)。將血液收集在含有RPMI/添加劑(補(bǔ)充了谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和2-巰基乙醇的RPMI 1640，含有肝素(1/10))的試管中。將10體積的裂解緩沖液加入全血中，并將試管在室溫(RT)溫育10 min。離心(335g，在室溫10 min)以后，將沉淀物收獲在RPMI/添加劑中并過濾(細(xì)胞過濾網(wǎng)100μm)。將細(xì)胞再次沉淀(335g，在室溫10 min)并再懸浮于完全培養(yǎng)基(補(bǔ)充了谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和2-巰基乙醇和5%熱滅活的胎牛血清的RPMI 1640)中。

新鮮白細(xì)胞的體外刺激

將白細(xì)胞以大約100萬個細(xì)胞/孔鋪板在圓底96-孔平板中。然后將白細(xì)胞用1μg/ml的抗-CD28 (克隆9C10 (MFR4.B)和抗-CD49d (克隆37.51)刺激6小時(37℃，5%CO2)，添加或不添加1μg/ml的覆蓋M72序列的肽。2小時的刺激以后，加入在完全培養(yǎng)基中1/200稀釋的布雷菲德菌素A保持另外4小時。然后將平板轉(zhuǎn)移在4℃過夜。

ICS

使用5-色I(xiàn)CS測定將細(xì)胞染色并進(jìn)行分析。

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至V-底96-孔平板，在4℃在189g離心5 min，用200μl Flow Buffer (PBS 1X, 1%FCS)洗滌以后，將細(xì)胞再懸浮在50μl含有1/50稀釋的抗-CD16/32 (克隆2.4G2)的Flow Buffer中在4℃保持10min。然后，將50μl含有抗-CD4-V450 (克隆RM4-5，1/50稀釋)和抗-CD8-PerCp-Cy5.5 (克隆53-6.7，1/50稀釋)抗體和Live&Death PO (1/500稀釋)的Flow Buffer加入在4℃保持30 min。將細(xì)胞離心(在4℃189g保持5 min)，并用200μl Flow Buffer洗滌。

將白細(xì)胞固定，并通過加入200μl Cytofix/Cytoperm溶液(Becton Dickinson商業(yè)緩沖液)在4℃保持20 min進(jìn)行滲透化處理。將細(xì)胞離心(在4℃189g 5 min)，并用200μl Perm/Wash緩沖液(在蒸餾水中1:10稀釋的Becton Dickinson商業(yè)緩沖液)洗滌。另一個離心步驟以后，將細(xì)胞在50μl含有抗-IL2-FITC (克隆JES6-5H4，1/400稀釋)、抗-IFNγ-APC (克隆XMG1.2，1/50稀釋)和抗-TNFα-PE (克隆MP6-XT22，1/700稀釋)抗體的Perm/Wash緩沖液中在4℃染色1小時。將細(xì)胞用Perm/Wash緩沖液洗滌2次，再懸浮于220μl BD Stabilizing Fixative溶液中。使用LSRII和FlowJo軟件通過流式細(xì)胞計量術(shù)分析染色的細(xì)胞。

體液應(yīng)答-通過Elisa確定的抗-M72 Igtot血清學(xué)

將96-孔Elisa平板用在PBS中的0.25μg/ml的重組抗原M72包被，并在4℃溫育過夜。將來自接種疫苗的小鼠（處于II后和III后）的血清在PBS (0.2%)-BSA中1/10000稀釋，并然后從孔1-12執(zhí)行2倍系列稀釋并溫育。使用標(biāo)準(zhǔn)和對照材料的系列稀釋物計算測試的血清的抗-M72抗體標(biāo)準(zhǔn)滴度和確保測試的有效性。在每個溫育步驟以后將平板用PBS 0.1%吐溫20緩沖液洗滌。然后加入對小鼠Ig特異性的生物素化的山羊抗體，并通過與抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶復(fù)合物和過氧化物酶底物鄰-苯二胺二鹽酸鹽/H₂O₂一起溫育來揭示抗原-抗體復(fù)合物。在490-620 nm記錄光密度(O.D.)。使用回歸模型從ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每份單獨小鼠血清的抗-M72抗體滴度，并以ELISA單位(EU)/ml表達(dá)。然后為每組小鼠計算幾何平均滴度(GMT)。

結(jié)果

T細(xì)胞應(yīng)答

A. M72-特異性的CD4 T和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的動力學(xué)

為了評價分?jǐn)?shù)的和/或延遲的第三劑對CD4 T和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的潛在益處，在本研究中用0.25ug M72的最大劑量免疫小鼠以便在誘導(dǎo)可檢測的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的同時處于CD4 T細(xì)胞應(yīng)答的動態(tài)范圍內(nèi)。

如在圖1中所示，在標(biāo)準(zhǔn)時間表(D0-D14-D28)中施用分?jǐn)?shù)的第三劑沒有提供改善的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答，因為在接受完整劑量、1/5劑量和1/25劑量的組中從7PII至7PIII觀察到可比較的強(qiáng)化。

但是，盡管在合并物之間存在M72特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答的某種變異性，與標(biāo)準(zhǔn)時間表相比，在0.25ug M72的延遲第三劑以后7天觀察到更大強(qiáng)化。此外，在接受延遲的和分?jǐn)?shù)的第三劑或延遲的和不含佐劑的第三劑的小鼠中M72特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答的水平與在用標(biāo)準(zhǔn)時間表中的完整劑量免疫的組中觀察到的水平相當(dāng)。這提示延遲時間表在CD4 T細(xì)胞應(yīng)答水平方面的益處。

在接受標(biāo)準(zhǔn)時間表中的0.25ug M72劑量的小鼠中檢測到低水平的M72-特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答，且第三免疫接種劑量沒有強(qiáng)化M72-特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答(圖2)。

在接受標(biāo)準(zhǔn)時間表中的分?jǐn)?shù)的第三劑的小鼠中觀察到減少的M72-特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。這與以前的數(shù)據(jù)(未顯示)一致，其中CD8 T細(xì)胞應(yīng)答主要受用于免疫小鼠的M72蛋白的劑量范圍影響，且其中較高劑量的M72 (1ug或8ug)誘導(dǎo)比0.1ug或0.25ug M72更高的應(yīng)答水平。

在接受0.25ug M72的延遲第三劑的小鼠中，在所有測試的組中從7PII至7PIII看到M72特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)化。但是，CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的中位值在7PII表現(xiàn)出組之間的變異性(從0.231至0.817)，盡管實際上所有組接受2劑的0.25ug M72/AS01E。

B. M72-特異性的CD4和CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子概況

在7PII和7PIII在接受標(biāo)準(zhǔn)時間表中的完整劑量、1/5劑量和1/25劑量的組中觀察到類似的CD4 T細(xì)胞因子表達(dá)概況。M72-特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答包括2次免疫接種以后的三種(IL2/IFNg/TNFa)和兩種(IFNg/TNFa)。第三免疫接種劑量沒有支持多功能的CD4 Th1細(xì)胞的增進(jìn)，而是增加產(chǎn)生兩種(IL2/IFNg)和一種(僅IFNg)的CD4 T細(xì)胞(圖3)。

施用延遲的第三劑似乎支持多功能的CD4 Th1細(xì)胞的進(jìn)展，因為M72-特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答主要由產(chǎn)生IL2/IFNg/TNFa和IFNg/TNFa的CD4 T細(xì)胞組成(圖3)。AS01進(jìn)一步增強(qiáng)多功能的T細(xì)胞的進(jìn)展，因為在接受延遲的和不含佐劑的第三劑的小鼠中觀察到降低水平的IL2/IFNg/TNFa和IFNg/TNFa和增加水平的僅產(chǎn)生IFNg的CD4 T細(xì)胞。

盡管接受延遲的和分?jǐn)?shù)的第三劑的小鼠中的M72特異性的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答水平類似于用基準(zhǔn)觀察到的水平，所述細(xì)胞因子概況是稍微不同的，且這些數(shù)據(jù)總體上提示在延遲的免疫接種時間表中改善的多功能的CD4 Th1細(xì)胞的進(jìn)展。

已經(jīng)證實多功能的CD4 T細(xì)胞的量級和質(zhì)量與小鼠中的保護(hù)有關(guān)(Derrick等人2011 Vaccine 29:2902-2909)。

在7PII和7PIII在所有組中觀察到類似的M72-特異性的CD8 T細(xì)胞細(xì)胞因子概況(圖4)。M72-特異性的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答主要由產(chǎn)生兩種(IFNg/TNFa)和一種(僅IFNg)的CD8 T細(xì)胞組成。還檢測到非常低水平的產(chǎn)生IL2/INFg/TNFa和TNFa的CD8 T細(xì)胞。

抗體應(yīng)答

A. 抗-M72 Igtot血清學(xué)

如在圖5中所示，在接受標(biāo)準(zhǔn)時間表中的完整劑量、1/5劑量和1/25劑量的組中在14PII和14 PIII之間觀察到抗M72血清學(xué)應(yīng)答的強(qiáng)化。用產(chǎn)生最高M(jìn)72特異性的血清學(xué)應(yīng)答的最高劑量觀察到劑量-范圍效應(yīng)的趨勢。應(yīng)答的持續(xù)時間隨時間下降，如通過在84PIII時較低的血清學(xué)應(yīng)答所證實的。

在接受延遲的第三免疫接種的小鼠中，觀察到較高量級的應(yīng)答。在有和沒有AS01E存在下看到類似水平的M72特異性的Ig，從而提示，單獨的M72足以在延遲的第三免疫接種以后誘導(dǎo)高血清學(xué)應(yīng)答。