本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種水溶性雄黃固體分散體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：雄黃的主要成分為二硫化二砷(As2S2)，中醫(yī)臨床使用雄黃已超過(guò)兩千年歷史。目前臨床上常用的牛黃解毒片、安宮牛黃丸、六神丸、紫金丹和蟾酥丸等中成藥中均含雄黃。研究發(fā)現(xiàn)，將雄黃應(yīng)用于慢性髓細(xì)胞性白血病(又稱慢性粒細(xì)胞性白血病，ChronicMyelogenousLeukemia,CML)可使患者完全緩解率達(dá)72％，采用含雄黃的成方制劑復(fù)方黃黛片(白血康片)治療早幼粒細(xì)胞性白血病(AcutePromyelocyticLeukemia,APL)的完全緩解率達(dá)98.3％，并且無(wú)明顯骨髓抑制現(xiàn)象。相比目前常用的一線化療藥物，如甲磺酸伊馬替尼(Imatinib,IM)、全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)等，雄黃適用范圍更寬，對(duì)APL和CML，特別是對(duì)CML的加速期(acceleratedphase,CML-AP)和終變期(blastphase,CML-BP)患者均有較好療效。雄黃還可用于伴髓系陽(yáng)性表達(dá)的急性淋巴細(xì)胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia,ALL)的治療，患者耐受性好，長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)輕微，且與三氧化二砷(As2O3)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib,IM)、阿糖胞苷和反式維甲酸等一線藥物無(wú)交叉耐藥。但是，雄黃在臨床使用中面臨的重要問(wèn)題是水溶液中溶出困難，不僅難溶于水，也不溶于鹽酸，導(dǎo)致其生物利用低，口服給藥的生物利用度僅有4％，致使臨床使用劑量較大(約為330mg/d-1080mg/d)。傳統(tǒng)中藥加工方法中對(duì)雄黃的加工炮制主要以去除雜質(zhì)礦物和降低毒性雜質(zhì)砒霜(即As2O3)為主要目的，并不能顯著提高雄黃的生物利用度。因此，提高雄黃活性成分As2S2在水中的溶出度，從而改善雄黃的生物利用度，對(duì)于降低雄黃的臨床使用劑量和提高其療效具有極為重要的意義。目前開(kāi)發(fā)雄黃新劑型的技術(shù)主要有：(1)溶劑接力法；(2)脂質(zhì)體包封法；(3)氣流粉碎法；(4)球磨法。但是上述加工方法都存在不足之處。例如，溶劑接力法存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題；脂質(zhì)體包封法和氣流粉碎法生產(chǎn)效率較低，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。球磨法是這其中研究較多的一種納米雄黃制備方法，并有相關(guān)專利文獻(xiàn)報(bào)道(公開(kāi)號(hào)CN1288723A)，該方法可制備出粒徑在1-100nm間的納米雄黃，并且可以在一定程度上提高抗腫瘤活性，但該方法制備的納米雄黃中劇毒副產(chǎn)物As2O3的含量顯著增加，急毒性顯著增加，嚴(yán)重影響用藥安全；另外，由于比表面積增加，表面能加大，導(dǎo)致納米雄黃顆粒的穩(wěn)定性不好，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)氧化(氧化產(chǎn)物為As2O3) 和團(tuán)聚現(xiàn)象，從而影響As2S2的溶出和生物利用度。針對(duì)納米雄黃長(zhǎng)期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致As2O3含量增加和顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象，有研究者通過(guò)直接加熱將納米雄黃與高分子熔融混合，或者用溶劑法將納米雄黃攪拌分散到高分子溶液中，經(jīng)冷卻或者溶劑揮發(fā)而制成固體分散體，用高分子材料防止納米雄黃的團(tuán)聚和儲(chǔ)存中的氧化(專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)CN1478486A)。但是，這種工藝必須先制備出納米雄黃，然后與高分子進(jìn)行混合，并不能解決納米雄黃制備過(guò)程中所面臨的劇毒副產(chǎn)物增加的問(wèn)題。此外，該方法的生產(chǎn)不能一步完成，納米雄黃顆粒只通過(guò)普通攪拌工藝混合于高分子基質(zhì)中，以成團(tuán)方式存在(郭騰.固體分散體技術(shù)對(duì)納米雄黃穩(wěn)定性及體外溶出的影響研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(17):2782-7.)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種生物利用度顯著提高的水溶性雄黃固體分散體，由包括1重量份的雄黃，1-20重量份的高分子和0-5重量份的表面活性劑的原料制備得到。所述雄黃為水飛雄黃,粒徑在20-75μm之間。所述高分子選自以下物質(zhì)中的一種或幾種：聚乙烯醇聚乙二醇共聚物(MacrogolPoly(vinylalcohol)GraftedCopolymer)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)、乙烯基聚吡咯烷酮-乙烯乙酸酯共聚物(PVP-VA)和泊洛沙姆。所述表面活性劑可以為非離子表面活性劑或離子型表面活性劑。所述表面活性劑選自以下物質(zhì)中的一種或幾種：聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇十六十八醇醚和十六十八烷基硫酸鈉?；钚猿煞譃锳s2S2，高分子為分散基質(zhì)，所述固體分散體在水溶液中可以快速溶解，形成穩(wěn)定的橙黃色膠體溶液，其中雄黃膠體粒子的水合直徑范圍在100－1000nm之間，平均水合直徑為400-700nm，水溶性雄黃固體分散體中的As2S2在人工胃液中的累積溶出度為9％-25％。本發(fā)明還有一目的在于提供一種制備水溶性雄黃固體分散體的方法，將上述水溶性雄黃固體分散體的原料混合后加入雙螺桿擠出機(jī)中熱熔擠出，擠出物室溫冷卻后得到水溶性雄黃固體分散體。雙螺桿擠出機(jī)內(nèi)溫度為50-200℃，螺桿轉(zhuǎn)速為5-100r/min。本發(fā)明另有一目的在于提供一種由上述方法制備得到的水溶性雄黃固體分散體，活性成分為As2S2，高分子為分散基質(zhì)，所述固體分散體在水溶液中可以快速溶解，形成穩(wěn)定的橙黃色膠體溶液，其中雄黃膠體粒子的水合直徑范圍在100－1000nm之間， 平均水合直徑為400-700nm，水溶性雄黃固體分散體中的As2S2在人工胃液中的累積溶出度為9％-25％。本發(fā)明再有一目的在于提供一種上述水溶性雄黃固體分散體在制備治療急性和慢性髓細(xì)胞性白血病中的應(yīng)用，所述白血病為急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)、慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)。本發(fā)明的雄黃固體分散體，是一種水溶性固體分散體，該固體分散體解決了雄黃難溶于水而導(dǎo)致其生物利用度低的問(wèn)題，有效提高了雄黃在水中的溶出速度和累積溶出度，提高了雄黃的生物利用度，延長(zhǎng)了血砷循環(huán)時(shí)間，由此增強(qiáng)了雄黃的抗白血病藥效。制備過(guò)程中使用高分子作為分散基質(zhì)，并可或不添加表面活性劑，與水飛雄黃一起，通過(guò)熱熔擠出(HotMeltExtrusion,HME)加工得到雄黃固體分散體。本發(fā)明方法在難溶性藥物雄黃開(kāi)發(fā)中相比于傳統(tǒng)固體分散體制備技術(shù)(熔融法或溶劑法)，明顯提高了難溶藥物的溶出度和生物利用度。還有，該方法制備固體分散體的一體化程度高，原料雄黃不需要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，可直接在擠出機(jī)中與高分子混合，加工過(guò)程簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率高，固體分散體的制備過(guò)程與后續(xù)的加工過(guò)程可直接銜接。本發(fā)明制備固體分散體所用水飛雄黃為《中國(guó)藥典》一部收錄藥物，高分子和表面活性劑均符合《中國(guó)藥典》二部藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)，所制備的雄黃固體分散體的水溶性、生物利用度和抗白血病活性均得到顯著提高，具有工業(yè)化潛力。在臨床應(yīng)用中，本發(fā)明的雄黃固體分散體可以作為一種雄黃藥物的口服新劑型，由于生物利用度的提高，將會(huì)有效減小雄黃用量，特別是在強(qiáng)化治療期和鞏固治療期，可以減少服用次數(shù)和劑量，不僅可以提高患者依從性和降低長(zhǎng)期大劑量服用的毒副作用對(duì)健康帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，而且可以顯著降低治療成本，減輕患者以及國(guó)家醫(yī)保系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益。附圖說(shuō)明圖1所示為水飛雄黃及實(shí)施例1產(chǎn)品的水分散液對(duì)比圖；圖2所示為水飛雄黃、實(shí)施例2產(chǎn)品、實(shí)施例7產(chǎn)品及實(shí)施例10產(chǎn)品在人工胃液中As2S2的累積溶出曲線圖；圖3所示為水飛雄黃及實(shí)施例4產(chǎn)品分別與人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞孵育不同時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)砷含量變化曲線圖；圖4所示為水飛雄黃及實(shí)施例5產(chǎn)品的X-光衍射光譜(XRD)圖；圖5所示為水飛雄黃及實(shí)施例5產(chǎn)品橫斷面的掃描電鏡(SEM)圖；圖6所示為Soluplus及實(shí)施例6產(chǎn)品在水相中顆粒粒徑分布的動(dòng)態(tài)光散射圖；圖7所示為水飛雄黃及實(shí)施例6產(chǎn)品水分散液中雄黃顆粒的掃描電鏡(SEM)圖；圖8所示為水飛雄黃及實(shí)施例8產(chǎn)品口服單次給藥72小時(shí)內(nèi)大鼠血砷濃度變化曲線圖；圖9所示為水飛雄黃及實(shí)施例9產(chǎn)品不同孵育時(shí)間對(duì)人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞增殖的影響圖；圖10所示為水飛雄黃及實(shí)施例9產(chǎn)品不同孵育時(shí)間對(duì)人急性早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞增殖的影響圖。具體實(shí)施方式熱熔擠出技術(shù)(HotMeltExtrusion,HME)作為一種新興的固體分散技術(shù)(SolidDispersions)最早應(yīng)用于塑料加工工業(yè)，上世紀(jì)80年代后被引入藥物研發(fā)領(lǐng)域，其原理是將藥物和作為分散基質(zhì)的高分子添加到擠出機(jī)中，通過(guò)擠出機(jī)內(nèi)螺桿轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的巨大剪切力將藥物顆粒破碎剪小，得到藥物固體分散體。相比于傳統(tǒng)固體分散體制備方法，HME技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)制備過(guò)程中不使用有機(jī)溶劑，避免了終產(chǎn)品中的有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題；(2)制備過(guò)程與下游加工過(guò)程(如粉碎或賦型)直接銜接，整體操作一體化程度高，生產(chǎn)效率高，重現(xiàn)性好和更經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)品質(zhì)量控制容易；(3)制備過(guò)程中，通過(guò)螺桿轉(zhuǎn)動(dòng)提供的剪切和擠壓作用，使得藥物更均勻、緊密地分散在高分子基質(zhì)中；(4)在制備過(guò)程中高分子可以保護(hù)藥物有效成分不被氧化。本發(fā)明的水溶性雄黃固體分散體是以中藥原料——雄黃為活性成分，以兩親性高分子為分散基質(zhì)，其組成為1重量份的水飛雄黃(即中醫(yī)臨床可直接使用的雄黃，粒徑在20-75μm之間)；1-20重量份高分子作為分散基質(zhì)；0-5重量份表面活性劑。作為分散基質(zhì)的高分子包括下述高分子中的一種或者幾種：聚乙烯醇聚乙二醇共聚物(MacrogolPoly(vinylalcohol)GraftedCopolymer，KollicoatIR)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Kollidon)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP，KollidonCL)、乙烯基聚吡咯烷酮-乙烯乙酸酯共聚物(PVP-VA，KollidonVA)、聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)、泊洛沙姆。表面活性劑可以是非離子表面活性劑或離子型表面活性劑，具體可以是以下化合物中的任意一種：聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇十六十八醇醚、十六十八烷基硫酸鈉。按照現(xiàn)有公開(kāi)的固體分散體，尚無(wú)直接以中藥原料藥水飛雄黃為原料或活性成分，提高水飛雄黃的水溶出性和水中累積溶出度，進(jìn)而提高其生物利用度和藥效為目的的技術(shù)報(bào)道。本發(fā)明中制備水溶性雄黃固體分散體的方法，是將中藥原料水飛雄黃與兩親性高 分子加入雙螺桿擠出機(jī)(HaakeMiniLabⅡ(ThermoFisherScientific,Karlsruhe,Germany)中熱熔擠出，通過(guò)螺桿在混合過(guò)程中產(chǎn)生的剪切力和摩擦力，使水飛雄黃由晶體大顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒕☆w粒，并均勻分散在高分子中，得到雄黃固體分散體。用本發(fā)明方法制備得到的雄黃固體分散體遇水后，分散體中的雄黃微?？梢噪S著高分子的溶解而溶出，在水中形成高分子包裹的雄黃微粒，因此，制備得到水溶性雄黃固體分散體能夠在水相中均勻穩(wěn)定分散。由此，極大地改善雄黃在水溶液中的溶出和生物利用度，提高其抗白血病和抗實(shí)體腫瘤的治療效果。此外，本發(fā)明方法直接使用雄黃原料，不必預(yù)先對(duì)雄黃進(jìn)行納米化加工，也就不會(huì)產(chǎn)生納米化過(guò)程中生成的劇毒副產(chǎn)物。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，并對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中所作的任何變動(dòng)都將屬于本發(fā)明。實(shí)施例用以下制備方法制備得到實(shí)施例1-10的水溶性雄黃固體分散體，僅是調(diào)整了原料的組成和制備工藝參數(shù)，具體調(diào)整見(jiàn)表1(表1中提到的)。具體制備方法為：稱取一定重量的水飛雄黃與高分子(及表面活性劑)，先在容器中攪拌混合成物料，再加入到擠出機(jī)中。擠出機(jī)內(nèi)溫度設(shè)定為50-200℃，螺桿轉(zhuǎn)速為5-100r/min。物料由機(jī)頭?？讛D出，室溫冷卻后得到橘黃色固體產(chǎn)品。表1本發(fā)明水溶性雄黃固體分散體的原料組成和制備工藝參數(shù)實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)例中的比較例1為原料藥水飛雄黃。以下實(shí)驗(yàn)例中僅列出某些實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)過(guò)程及數(shù)據(jù)，其它實(shí)施例也做了同樣的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所列實(shí)施例結(jié)果無(wú)異。實(shí)驗(yàn)例一：水溶性評(píng)價(jià)稱取實(shí)施例1產(chǎn)物32mg和比較例1粉末8mg(兩者所含As2S2含量均為8mg)，分別置于試管中，加入8mL純水，超聲處理10min后，得到實(shí)施例1水分散液和比較例1水分散液，如圖1所示，實(shí)施例1產(chǎn)物經(jīng)超聲處理后，水分散液呈橙黃色，表明產(chǎn)物中雄黃可以大量溶出并進(jìn)入水相，形成穩(wěn)定的水分散液；比較例1粉末在水中經(jīng)過(guò)超聲處理后，雄黃仍然沉淀在試管底部(白色箭頭所示)，水相仍呈無(wú)色透明狀態(tài)，表明比較例1中雄黃難以進(jìn)入水相。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1產(chǎn)物可以促進(jìn)其中雄黃在水中的溶出釋放，可以有效提高雄黃在水中的溶出度。表1中所有實(shí)施例的水溶性實(shí)驗(yàn)基本類似，均得到橙黃色水分散液，不再贅述。實(shí)驗(yàn)例二：As2S2在人工胃液中累積溶出度測(cè)定分別稱取實(shí)施例2產(chǎn)物100mg、實(shí)施例7產(chǎn)物200mg、實(shí)施例10產(chǎn)物80mg和比較例1粉末20mg(上述樣品所含As2S2均為20mg)，按《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅲ中小杯法溶出度測(cè)定方法操作(測(cè)試條件37℃水浴，攪拌槳轉(zhuǎn)速100r/min，溶出介質(zhì)為人工胃液，配制方法依照《中國(guó)藥典》二部附錄XA方法自行配制)，于投藥后5、10、20、30、45、60、90和120min吸取2mL液體(隨后用2mL人工胃液補(bǔ)齊)，微波消解后用2％稀硝酸定容至50mL。使用iCAP6300型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行砷含量測(cè)定。結(jié)果表明，實(shí)施例2產(chǎn)物、實(shí)施例7產(chǎn)物、實(shí)施例10產(chǎn)物和比較例1粉末在人工胃液中As2S2累積溶出量分別為25％、16％、9％和0.2％，結(jié)果見(jiàn)圖2。相比于相同As2S2含量的比較例1，各實(shí)施例產(chǎn)物在人工胃液中As2S2累積溶出量均有大幅提高，其中實(shí)施例2與比較例1相比提高了205倍。本發(fā)明的As2S2水中累積溶出量顯著優(yōu)于已報(bào)道的方法(郭騰.固體分散體技術(shù)對(duì)納米雄黃穩(wěn)定性及體外溶出的影響研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(17):2782-7.)，表明采用HME技術(shù)加工制備的雄黃水溶性固體分散體在提高雄黃在水中的溶出量方面具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)和突出的效果。表1中所有實(shí)施例的人工胃液累積溶出度實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本類似，不再贅述。實(shí)驗(yàn)例三：K562細(xì)胞中的總砷含量測(cè)定K562細(xì)胞使用含10％胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo公司)，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞離心收集后，用培養(yǎng)基重懸K562細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，取2.5×105cells/mLK562細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿12mL。分別取實(shí)施例4產(chǎn)物40mg和比較例1粉末20mg(所含As2S2均為20mg)溶于3mL生理鹽水中形成水分散液，向培養(yǎng)基中加入一定量的上述水分散液，使培養(yǎng)基中As2S2終濃度達(dá)到20.8mg/L，孵育6、12、24、48和72h后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞重懸、離心并收集，將細(xì)胞消解后使用XSERIES2型ICP-MS測(cè)定As含量。如圖3，結(jié)果顯示進(jìn)入水相的雄黃會(huì)被K562細(xì)胞攝取。與相同As2S2濃度的比較例1相比，實(shí)施例4產(chǎn)物水分散液中的雄黃會(huì)被K562細(xì)胞大量攝取，在12h達(dá)到峰值，之后逐步降低，至48h，細(xì)胞內(nèi)As含量達(dá)到穩(wěn)態(tài)；而比較例1中雄黃由于難以進(jìn)入水相，所以難以被細(xì)胞攝取。實(shí)驗(yàn)例四：水溶性雄黃固體分散體中雄黃晶體的XRD分析XRD測(cè)試在D8Foucs型衍射儀上進(jìn)行，儀器配置Cu靶X射線管，管壓40kV，管流40mA，掃描范圍2θ＝10°－90°條件下，分別測(cè)定實(shí)施例產(chǎn)物和比較例1粉末的XRD圖譜，以實(shí)施例5的圖譜為代表，見(jiàn)圖4。XRD測(cè)試結(jié)果表明，比較例1粉末的XRD圖譜呈現(xiàn)出典型的As2S2晶體衍射圖譜，基線平穩(wěn)，表明樣品為晶體材料。在實(shí)施例5產(chǎn)物的XRD圖譜中，As2S2晶體衍射峰呈現(xiàn)強(qiáng)度降低、寬化和若干晶體衍射峰缺失現(xiàn)象，且10°－15°區(qū)間的基線抬高，有明顯非晶態(tài)漫反射峰出現(xiàn)，表明實(shí)施例中雄黃顆粒的晶體結(jié)構(gòu)部分被破壞，晶粒尺寸明顯減小。實(shí)驗(yàn)例五：水溶性雄黃固體分散體中雄黃顆粒的分散狀態(tài)分析SEM測(cè)試在Quanta200F場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡上進(jìn)行，其中實(shí)施例產(chǎn)物在室溫下掰斷，橫斷面噴金處理；比較例1粉末在水中超聲分散后滴于硅片上晾干，兩受試材料經(jīng)過(guò)表面噴金處理后，在15kV的加速電壓下掃描其表面，并拍照，以實(shí)施例5的照片為代表，見(jiàn)圖5。SEM測(cè)試結(jié)果表明，比較例1粉末顆粒尺寸較大，顆粒粒徑范圍在25-75μm之間。實(shí)施例5產(chǎn)物橫斷面光滑平整，零星可見(jiàn)分散在高分子基質(zhì)中的雄黃小顆粒(圖5中白色箭頭所示)，表明通過(guò)HEM方法可將水飛雄黃的晶體大顆粒粉碎并均勻分散到高分子基質(zhì)中，得到雄黃固體分散體。實(shí)驗(yàn)例六：水溶性雄黃固體分散體的水分散液中雄黃膠體顆粒粒徑分布DLS分析固體分散體中雄黃膠體顆粒粒徑分布實(shí)驗(yàn)：分別稱取實(shí)施例1產(chǎn)物、實(shí)施例2產(chǎn)物、實(shí)施例3產(chǎn)物、實(shí)施例4產(chǎn)物、實(shí)施例6產(chǎn)物、實(shí)施例8產(chǎn)物和實(shí)施例10產(chǎn)物8mg、10mg、26mg、4mg、30mg、32mg和6mg(上述樣品中As2S2含量相同)，溶于3mL生理鹽水中。吸取1mL上述分散液置于比色皿中，使用NanoZS90納米粒度分析儀進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表2。以實(shí)施例6產(chǎn)物為例，應(yīng)用DLS分析雄黃固體分散體在不同溶出介質(zhì)中的顆粒分布：稱取30mg實(shí)施例6產(chǎn)物，溶于3mL溶出介質(zhì)中(生理鹽水、人工胃液(配制方法依照《中國(guó)藥典》二部附錄XA方法自行配制)或人工腸液(配制方法同人工胃液))。吸取1mL上述分散液置于比色皿中，使用NanoZS90納米粒度分析儀進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖6。表2水溶性雄黃固體分散體水分散液中雄黃膠體顆粒的平均水合直徑實(shí)施例雄黃顆粒的平均水合直徑(nm)實(shí)施例1657.1實(shí)施例2546.0實(shí)施例3446.1實(shí)施例4689.9實(shí)施例6508.0實(shí)施例8400.0實(shí)施例10601.0上述結(jié)果表明，各實(shí)施例產(chǎn)物中雄黃均可與高分子形成膠體顆粒穩(wěn)定分散，分散液中的顆粒有三個(gè)尺寸分布峰，以實(shí)施例6為例，其中峰1為高分子在溶液中形成的膠束；峰2為水分散液中形成的高分子包裹的雄黃顆粒，水合直徑范圍在100－1000nm之間，平均水合直徑為400-700nm，呈正態(tài)分布；峰3為溶液中極少量直徑大于1μm的雄黃顆粒形成的分布峰。比較實(shí)施例6產(chǎn)物在不同溶出介質(zhì)中的測(cè)試結(jié)果可以看出，實(shí)施例6產(chǎn)物在人工胃液中形成的高分子包裹的雄黃顆粒的相對(duì)數(shù)量最多，其次是在人工腸液中和生理鹽水中，說(shuō)明實(shí)施例6產(chǎn)物中所含雄黃可以在生理性溶出介質(zhì)中快速溶出，特別是在胃內(nèi)酸性條件下，溶出速度最快。比較例1粉末不能在水溶液中穩(wěn)定分散，不能用DLS的方法進(jìn)行檢測(cè)，故無(wú)法提供比較例1的DLS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)例七：水溶性雄黃固體分散體的水分散液中雄黃膠體顆粒的SEM分析SEM分析實(shí)驗(yàn)：稱取實(shí)施例產(chǎn)物30.0mg和比較例1粉末2mg(上述樣品中As2S2含量均為2mg)，分別溶于3mL生理鹽水中。取上述兩種藥物的水分散液105r/min離心4h，將水相中雄黃顆粒全部沉出，滴于硅片上晾干，表面噴金后進(jìn)行SEM分析(SEM分析用電鏡型號(hào)和測(cè)試條件同實(shí)驗(yàn)例五)；以實(shí)施例6圖片為代表，結(jié)果見(jiàn)圖7。SEM的結(jié)果顯示，實(shí)施例6產(chǎn)物在水中溶出的雄黃顆粒粒徑明顯小于比較例1，表明本發(fā)明的HME加工可以有效減小雄黃顆粒的粒徑至亞微米級(jí)。實(shí)驗(yàn)例八：大鼠單次口服的生物利用度測(cè)定分別單次口服給予SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)實(shí)施例8產(chǎn)物144mg/只、比較例1粉末9mg/只(上述樣品中As2S2含量均為9mg)，于給藥后0.5、1、2、4、8、12、24、36、48和72h眼眶內(nèi)眥靜脈采集外周血200μL，消解后通過(guò)AFS8230原子熒光光譜儀檢測(cè)血樣中砷含量(檢測(cè)方法依照HJ694-2014)。相比于比較例1，實(shí)施例8口服后可以顯著提高大鼠外周血中砷含量4.41倍，并延長(zhǎng)外周血中砷的循環(huán)時(shí)間，使血砷含量長(zhǎng)時(shí)間保持在一個(gè)較高水平(70小時(shí))，而比較例1組大鼠口服給藥后，血砷在30小時(shí)內(nèi)基本代謝完全，見(jiàn)圖8。其它實(shí)施例與實(shí)施例8有相同的生物利用度，不再贅述。實(shí)驗(yàn)例九：對(duì)白血病細(xì)胞系的殺傷實(shí)驗(yàn)取實(shí)施例9產(chǎn)物25.0mg和比較例1粉末2.5mg(上述樣品中As2S2含量均為2.5mg)分別溶于3mL生理鹽水中配制成水分散液，As2S2濃度為833.3mg/L。向培養(yǎng)基中各加入一定量的上述兩種水分散液，使K562細(xì)胞培養(yǎng)體系中As2S2的濃度為166.7mg/L，使HL-60細(xì)胞培養(yǎng)體系中As2S2的濃度為41.7mg/L。孵育一定時(shí)間后，向培養(yǎng)體系中加入CCK-8試劑，20μL/孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h；之后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板取出，離心，吸取上清100μL/孔，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm和630nm處的吸光度(OD,opticaldensity)值，數(shù)據(jù)扣除背景吸收后計(jì)算培養(yǎng)體系中活細(xì)胞數(shù)量(與已繪制的活細(xì)胞數(shù)-吸光度曲線對(duì)比計(jì)算得到)。另設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組中未添加受試藥物，只添加了與實(shí)驗(yàn)組等量的溶劑生理鹽水，以排除溶劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在未經(jīng)藥物處理的生理鹽水對(duì)照組中，K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞呈現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng)，而比較例1和實(shí)施例9均可抑制K562細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的增殖，相比于相同As2S2濃度的比較例1，實(shí)施例9產(chǎn)物可以顯著提高雄黃對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系K562(見(jiàn)圖9)和急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系HL-60(見(jiàn)圖10)的生長(zhǎng)抑制作用。以上實(shí)驗(yàn)例結(jié)果均表明，本發(fā)明的利用熱熔擠出技術(shù)制備得到的水溶性雄黃固體分散體可以在水相中快速溶解，提高雄黃中有效成分As2S2在水中的累積溶出量，并延長(zhǎng)血砷循環(huán)時(shí)間，由此提高其生物利用度和提高雄黃對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞K562和急性粒細(xì)胞性白血病HL-60的生長(zhǎng)抑制作用，該制備方法具有操作簡(jiǎn)單便利，一體化程度高的優(yōu)點(diǎn)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3