本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及麥冬液體發(fā)酵物、含發(fā)酵物的化妝品及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：
麥冬是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中一味藥材，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》。目前我國藥典中規(guī)定藥用的麥冬為百合科植物麥冬的干燥塊根。中國藥典記載麥冬具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心等功效。麥冬主要化學(xué)成分為多糖、甾體皂苷類、高異黃酮類、氨基酸等；麥冬提取物在化妝品中常作為保濕添加劑使用。乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌，是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱，絕大部分都是人體內(nèi)必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。乳酸菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物為乳酸，乳酸是酸性的，因此可以應(yīng)用于化妝品行業(yè)中用于ph值的調(diào)節(jié)；同時，由于乳酸是皮膚中天然保濕因子NMF的組成部分，因此，保濕是乳酸在化妝品中的一項重要用途。一般中和后的乳酸作為保濕成分使用。本發(fā)明欲提供一種具有補水保濕，抗衰功效的由麥冬與乳酸菌發(fā)酵而得的麥冬液體發(fā)酵物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是以“生物轉(zhuǎn)化理論”為指導(dǎo)，采用麥冬與乳酸菌的液體發(fā)酵體系提供一種具有補水保濕，抗衰功效的產(chǎn)品。本發(fā)明所解決的第一個技術(shù)問題是提供麥冬與乳酸菌的液體發(fā)酵所得的麥冬液體發(fā)酵物。本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物，以麥冬和水組成培養(yǎng)基，然后接種乳酸菌發(fā)酵所得的液體發(fā)酵混合物；其中，培養(yǎng)基以生藥重量計，麥冬重量百分比為5～20％；乳酸菌的接種量為1.0×104～1.0×108cfu/ml。上述技術(shù)方案中，培養(yǎng)基以生藥重量計，優(yōu)選麥冬重量百分比為10％。麥冬為原生藥材或麥冬飲片。上述技術(shù)方案中，乳酸菌的接種量優(yōu)選為1.0×106cfu/ml。本發(fā)明所解決的第二個技術(shù)問題是提供本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物的制備方法，包括以下步驟：A、以麥冬和水組成培養(yǎng)基，以生藥重量計，麥冬重量百分比為5～20％；B、接種乳酸菌，接種量為1.0×104～1.0×108cfu/ml；C、于30℃～40℃和0～200rpm的條件下培養(yǎng)1～5天，即得麥冬液體發(fā)酵物。上述技術(shù)方案中，培養(yǎng)基優(yōu)選添加以生藥重量計，麥冬重量百分比為10％。上述技術(shù)方案中，乳酸菌的接種量優(yōu)選為1.0×106cfu/ml。上述技術(shù)方案中，于37℃和50rpm的條件下培養(yǎng)5天。上述技術(shù)方案中，接種采用的乳酸菌菌種可以選擇使用目前由各種常用方式培養(yǎng)得到的菌種，如用于制造泡菜、酸奶的乳酸菌種等。其中，一種優(yōu)選的菌種來源和培養(yǎng)方式為：A、在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳酸菌菌種；B、將步驟A培養(yǎng)的乳酸菌接種入乳酸菌液體培養(yǎng)基中；C、在30℃～40℃和0～200rpm的條件下培養(yǎng)1～5天所得乳酸菌菌種。上述技術(shù)方案中，步驟B所述乳酸菌液體培養(yǎng)基中含有乳酸菌常規(guī)發(fā)酵的碳源、氮源、微量元素和/或無機(jī)鹽成分，其中：碳源成分為液體培養(yǎng)基總重量的0.5％～10％，氮源成分為0.5％～3％，微量元素和/或無機(jī)鹽成分為0.01％～1％，其余為水，滅菌即可。其中所說的碳源、氮源都可以選擇目前通用培養(yǎng)基中的常用成分，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、酵母膏等常規(guī)培養(yǎng)基組成成分。進(jìn)一步優(yōu)選所述滅菌為經(jīng)115～121℃滅菌15～30min。上述技術(shù)方案中，步驟A所述固體培養(yǎng)基是由步驟B中所述的乳酸菌液體培養(yǎng)基1000ml和瓊脂10～20g組成，按同樣方式作常規(guī)滅菌處理。培養(yǎng)條件為：在30-40℃和0-200rpm的條件下培養(yǎng)1-3天；優(yōu)選培養(yǎng)條件為：在37℃和50rpm的條件下培養(yǎng)1天。本發(fā)明所解決的第三個技術(shù)問題是提供本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物的用途，具體表現(xiàn)為本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物具有明顯的具有補水保濕，抗衰功效。本發(fā)明所解決的第四個技術(shù)問題是提供采用本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物或其提取物為活性成分，加入化妝品上可接受的輔料制備而成的化妝品。本發(fā)明制備的化妝品可為爽膚水、乳液、精華液、面霜、面膜、眼膜等常見的化妝品。采用本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物用于肌膚的護(hù)理，較單獨的麥冬提取物和乳酸菌發(fā)酵物而言，具有良好的吸濕性與保濕作用，從而起到補水保濕的作用；對DPPH自由基和羥基自由基均有更強的清除作用，能夠防治人角質(zhì)細(xì)胞受到的氧化損傷，具有良好的抗氧化作用，從而具備明確的抗衰功效。本發(fā)明麥冬液體發(fā)酵物按常規(guī)方法制備的化妝品也具有明確的補水保濕和抗衰功效。具體實施方式以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，說明但不限制本發(fā)明。實施例1乳酸菌對含有麥冬藥材的液體培養(yǎng)基的生長適應(yīng)性及影響試驗(1)按1.0×105cfu/ml接種量將乳酸菌分別接種于含有5.0％、10.0％、15.0％、20.0％麥冬(均以生藥重量計，以下同)的液體培養(yǎng)基中，于37℃和50rpm條件下培養(yǎng)3～5天，采用平板涂布法檢測發(fā)酵液中的乳酸菌菌落數(shù)。結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果顯示，當(dāng)麥冬含量為10.0％時，乳酸菌的長勢佳，且基本一致；當(dāng)麥冬水提液的濃度大于10％以后，乳酸菌的生長受到抑制。因此在液體發(fā)酵基中，麥冬的最適含量為10％。表1麥冬含量和發(fā)酵時間對乳酸菌培養(yǎng)的影響由表1結(jié)果還可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，乳酸菌的菌落數(shù)逐漸增加，從生產(chǎn)成本考慮，確定本發(fā)明中乳酸菌的發(fā)酵時間為120h，即5天。(2)按1.0×104、1.0×105和1.0×106cfu/ml接種量將乳酸菌分別接種于含有10％麥冬的液體培養(yǎng)基中，于37℃和50rpm條件下培養(yǎng)5天，采用平板涂布法檢測發(fā)酵液中的乳酸菌菌落數(shù)。結(jié)果如表2所示表2接種量對乳酸菌培養(yǎng)的影響由表2結(jié)果可以看出，發(fā)酵液中的活菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，因此，確定本發(fā)明中的接種量為1.0×106cfu/ml。實施例2本發(fā)明組合物的功效試驗及刺激性試驗以上述由以生藥重量計的麥冬按10.0％的百分比加入培養(yǎng)基中，按1.0×106cfu/ml的量接種乳酸菌后，在37℃和50rpm條件下培養(yǎng)5天得到所說的麥冬液體發(fā)酵物，進(jìn)行下述的功效試驗及刺激性試驗。一、吸濕試驗與保濕試驗將由飽和氯化鎂水溶液作為相對濕度(RH)33％的干燥器和由飽和硫酸銨水溶液作為相對濕度(RH)81％的干燥器放入設(shè)定溫度為20±0.1℃的隔水式培養(yǎng)箱里，分別精確稱取1.00g麥冬液體發(fā)酵物干粉，麥冬藥材干粉，乳酸菌液體發(fā)酵物干粉的樣品到直徑為90mm的結(jié)品皿中，再放到兩個干燥器里，24h后取出，準(zhǔn)確稱最各樣品的重量，由試驗前后樣品的重量差，用下式計算出試樣的吸濕率：吸濕率(％)＝100×(W1－W0)/W0式中W0為樣品試驗前重量；Wl為樣品試驗后(24h后)重量。將麥冬液體發(fā)酵物干粉，麥冬藥材干粉，乳酸菌液體發(fā)酵物干粉三個樣品用去離子水稀釋到10％后，分別精確稱取5.00g樣品水溶液到直徑90mm的結(jié)晶皿中，再放到兩個干燥器里，24h后取出，準(zhǔn)確稱量各樣品的重量，由試驗前后樣品的重量差，用下式計算出樣品的保濕率：保濕率(％)＝100×(W3－W2)/W2式中W2為樣品試驗前重量；W3為樣品試驗后(24h后)重量。表3各樣品在不同相對濕度下的吸濕和保濕性能試驗結(jié)果如表3所示，從試驗結(jié)果可知，麥冬發(fā)酵物在低濕和高濕兩種情況下，其吸濕率和保濕率都優(yōu)于未發(fā)酵的麥冬藥材和單一的乳酸菌發(fā)酵物干粉，說明通過本發(fā)放的技術(shù)制備獲得的麥冬液體發(fā)酵物具有更良好的吸水保濕作用。二、抗氧化能力測試試驗1.抗氧化功效檢測樣品制備麥冬液體發(fā)酵產(chǎn)物烘干制干粉，粉碎；麥冬藥材粉碎；乳酸菌液體發(fā)酵物烘干制干粉，粉碎；上述細(xì)粉均過60目篩，取粉末5g溶于100ml水，60℃超聲提取1h后，3000g離心10min，過濾后收集濾液定容為5ml，即濃度為1g/ml，然后稀釋成40-400mg/ml。2.清除·OH自由基能力的測定在試管中分別加入1mlpH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(0.05mol/L)，0.4ml6mmol/L的鄰二氮菲溶液(無水乙醇配制)，充分混勻后，加入0.4ml6mmol/LFeSO4溶液，加入后立即混勻。然后向其中加入0.5ml一定濃度的樣品溶液，混勻，再加入0.5ml0.1％的H2O2，最后補充體積至4ml，同時做空白試驗。另再做損傷和未損傷管。其中損傷管中加入0.5ml0.1％的H2O2，未損傷管不加H2O2，最后補充各體積至4ml。于37℃下保溫1h，測量536nm下的吸光度，重復(fù)兩次，計算平均值。羥自由基清除率＝(Ai-A)/(A0-A)×100％。A為不加樣品時溶液的吸光值，A0為不加樣和H2O2時溶液的吸光值。注意濃度控制，先試驗3-4倍濃度，再逐步稀釋至最適濃度，控制溫度。3.提取物清除DPPH自由基能力的測定取待測樣品1ml和事先用95％乙醇配好的0.4mg/ml的DPPH自由基試劑1ml于10ml的玻璃試管中。樣品加入后振動30s，37℃保溫10min后517nm波長下測定其吸光值(Ai)。同時測定不加DPPH自由基試劑的樣品空白吸光值(Aj)和加DPPH自由基試劑但不加樣品的吸光值(A0)，如下表4所示。表4DPPH試驗加樣表樣品對DPPH的清除百分比I＝1-[(Ai-Aj)/A0]×100％，試驗結(jié)果：通過清除率推算出樣品的EC50。結(jié)果如表5所示。表5樣品清除·OH、DPPH自由基的EC50試驗結(jié)果試驗結(jié)果如表5所示，在清除·OH、DPPH自由基方面，麥冬發(fā)酵物的EC50均低于麥冬藥材和乳酸菌發(fā)酵物，說明其抗氧化效果好，具有更好的自由基清除能力。三、對H2O2誘導(dǎo)的人表皮細(xì)胞的氧化損傷模型的抗衰功效測試試驗采用含10％胎牛血清的DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)人表皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，傳代時用胰蛋白酶進(jìn)行消化。將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期時，接種于96孔板中，接種密度為6×103個/孔，孵育24h后，按以下分組加樣：空白對照組、H2O2損傷模型組、麥冬發(fā)酵物低、中、高劑量組(25，50，100μg/ml)、麥冬藥材組(50μg/ml)、乳酸菌發(fā)酵物組(50μg/ml)；設(shè)置3個復(fù)孔；繼續(xù)孵育48h。終止培養(yǎng)前6h，除空白對照組外，其它各組細(xì)胞加入100mMH2O2，作用2h后，每孔吸去培養(yǎng)基，加入100μlPBS，10mg/ml的MTT，孵育4h后，加入0.1MHCl酸化的10％SDS終止反應(yīng)。4h后，在570nm測量OD值，計算各組細(xì)胞相對于模型細(xì)胞的存活率。表6樣品對H2O2所致細(xì)胞氧化損傷的防治作用試驗結(jié)果如表6所示，麥冬藥材和乳酸菌發(fā)酵物都能一定程度上對H2O2所致人角質(zhì)細(xì)胞氧化損傷起到防治作用；但將二者發(fā)酵后得到的麥冬發(fā)酵物，其同等濃度下(50μg/ml)，其對H2O2所致人角質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的防治功效強于麥冬藥材和單一的乳酸菌發(fā)酵物；從麥冬發(fā)酵物的三個濃度試驗結(jié)果看，說明麥冬發(fā)酵物具有明顯的抗氧化、抗衰老作用，且有顯著的量效關(guān)系。四、麥冬發(fā)酵物安全性試驗采用通行的化妝品原料檢測中的“急性經(jīng)口和急性經(jīng)皮毒性試驗”以及“皮膚和急性眼刺激性/腐蝕性試驗”，試驗結(jié)果均顯示麥冬發(fā)酵物屬于無毒、無刺激性、無腐蝕性的化妝品原料，可用于化妝品的配方中。從上述試驗結(jié)果可知，麥冬液體發(fā)酵物具有良好的保濕吸水的特性，其保濕率，吸濕率均優(yōu)于未發(fā)酵的麥冬藥材和單一發(fā)酵的乳酸菌發(fā)酵物；麥冬液體發(fā)酵物同時具有明顯的抗氧化性，對H2O2所致人角質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷具有良好的保護(hù)和防治作用；且在同等濃度下優(yōu)于未發(fā)酵的麥冬藥材和單一發(fā)酵的乳酸菌發(fā)酵物，提示麥冬液體發(fā)酵物具有很強的補水保濕和抗氧化、抗衰老的作用。由麥冬液體發(fā)酵物為原料，可以采用其發(fā)酵物原液或發(fā)酵物粉，按常規(guī)方法制備的爽膚水、乳液、精華液、面霜、面膜、眼膜等形式的化妝品也應(yīng)具有明確的補水保濕，抗氧化抗衰老功效。