專利名稱：一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
地衣芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一種，可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌，能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，并具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長繁殖。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、飼料加工、環(huán)境污染等行業(yè)。地衣芽孢桿菌是我國20世紀(jì)90年代起開發(fā)利用的新型微生態(tài)制劑，其消長直接影響該制劑的療效和產(chǎn)量的高低。目前，地衣芽孢桿菌的生產(chǎn)方法按發(fā)酵方式可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。但長期以來，無論采用那何種發(fā)酵方式，生產(chǎn)成本一直據(jù)高不下，工業(yè)生產(chǎn)成本難以大幅度降低。國內(nèi)外已有許多學(xué)者對地衣芽孢桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以求提高產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本。保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心的三株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Ll、L2、L3，其中，保藏編號為ACCC11080的地衣芽孢桿菌LI，具有分解木質(zhì)素，促進(jìn)生長的功能；保藏編號為ACCC10613的地衣芽孢桿菌L2，能產(chǎn)生桿菌肽，具有抑制細(xì)菌性及霉菌性根腐病的功能；保藏編號為ACCC11106的地衣芽孢桿菌L3，能抗梨黑星病。目前，上述三株地衣芽孢桿菌的發(fā)酵方式通常為:單株發(fā)酵得到L1、L2、L3的發(fā)酵液，然后將所得發(fā)酵液混合，再進(jìn)行濃縮、制粒、干燥，從而得到最終產(chǎn)品。采用此發(fā)酵方式，生產(chǎn)成本較高，且受發(fā)酵工藝的影響，批次制得的產(chǎn)品性能并不穩(wěn)定。為此，開發(fā)合理的地衣芽孢桿菌發(fā)酵方式，降低生產(chǎn)成本，是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供一種抑菌能力高、生產(chǎn)成本低的地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵工藝。`為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，所述地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)分別為L1、L2、L3,保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；其中，LI的保藏編號為ACCC11080，L2的保藏編號為ACCC10613，L3的保藏編號為ACCC11106 ;包含以下步驟:a)固體斜面培養(yǎng):將三株地衣芽孢桿菌L1、L2、L3在無菌條件下分別接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行分別培養(yǎng)，其中:地衣芽孢桿菌LI的培養(yǎng)條件為30 37°C，24 48h，地衣芽孢桿菌L2的培養(yǎng)條件為25 30°C，24 48h，地衣芽孢桿菌L3的培養(yǎng)條件為28 32°C，24 48h ；b)理化因子誘變:將步驟a)中制得的固體斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下，用0.9%的生理鹽水制備成濃度為IO8 IO9個(gè)/ml (血球計(jì)數(shù)濃度)的菌懸液；并將制得的菌懸液按致死率70% 90%的處理劑量進(jìn)行紫外誘變處理，進(jìn)行搖瓶篩選，根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果，選擇正突變的菌株，進(jìn)行亞硝基胍誘變處理，用0.9%的生理鹽水將亞硝基胍誘變處理后的反應(yīng)液稀釋后涂布分離平板，接入分離平板培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，至長出單菌落；c)搖瓶篩選:無菌條件下，將步驟b)中制得的單菌落從分離平板上分別接入斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，得單菌落斜面；然后將單菌落斜面一對一接入種子搖瓶培養(yǎng)基，于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)22h，得篩選種子液；再在無菌條件下，將篩選種子液以5%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)48h，以芽孢率、抑菌能力(生物圈)、生物量為指標(biāo)，進(jìn)行搖瓶初篩、搖瓶一次復(fù)篩及搖瓶二次復(fù)篩；d)根據(jù)步驟c)中的二次復(fù)篩結(jié)果，選取芽孢率彡90%、抑菌圈彡20mm、生物量^ 20%的菌株，用接種針接入斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，得二代種子斜面，然后在無菌條件下，將二代種子斜面用接種鏟接入種子搖瓶培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)22h，得搖瓶種子液；e)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟d)中的搖瓶種子液合瓶，然后接種種子罐培養(yǎng)基，經(jīng)過一級種子液和二級種子液制備后，進(jìn)入發(fā)酵罐接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0.5°C，罐壓:0.03 0.05MPa, pH 值為 6.3 6.6，流量 1:0.3 ~ 1:0.8，轉(zhuǎn)速 300rpm,至芽孢率大于85%時(shí)放罐。進(jìn)一步地:步驟a)、c)和d)中所述的斜面培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氫二銨0.1 2.0%、氯化鈉0.5 3.5%、硫酸錳0.005 0.1%、硫酸銨0.5 3.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.5%、硫酸鎂0.1 0.5%、瓊脂1.5 2.2%，余量為水；pH值為
6.5 7.5o進(jìn)一步地:步驟b)中所述的紫外誘變處理方式為:將菌懸液暴露在256nm波長的紫外線下，距離30cm，振搖608、908、1208、然后于暗光處，301:培養(yǎng)16h。進(jìn)一步地:步驟b)中所述的亞硝基胍誘變處理方式為:將菌懸液與200mg/L的亞硝基胍溶液等體積混合， 于37°C下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸緩沖液終止反應(yīng)。進(jìn)一步地:步驟b)中所述的分離平板培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.2 2.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、氯化鈉0.5
3.5%、硫酸錳0.005 0.1%、硫酸銨0.5 3.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.5%、硫酸鎂0.1
0.5%、瓊脂1.5 2.2%，余量為水；pH為6.5-7.5。進(jìn)一步地:步驟c)中所述的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖2 4.5%、黃豆餅粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.0%、酵母粉0.2 1.0%、磷酸二氫鉀0.2
1.0%、磷酸氫二鈉0.2 1.0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。進(jìn)一步地:步驟c)與步驟d)中所述的種子搖瓶培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖1.0 2.5%、黃豆餅粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米漿0.2 L 5%、磷酸二氫鉀0.2 L 0%、磷酸氫二鈉0.2 L 0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。進(jìn)一步地:步驟e)中所述的種子罐培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖1.0 2.5%、黃豆餅粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米漿0.2 1.5%、磷酸二氫鉀0.2 1.0%、磷酸氫二鈉0.2 1.0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。進(jìn)一步地:步驟e)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖2 4.5%、黃豆餅粉I 3.5%、玉米粉0.8 2.5%、酵母粉0.2 2.5%、磷酸二氫鉀0.2 2.5%、磷酸氫二鈉0.2 2.5%、硫酸鎂0.02 0.25%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。本發(fā)明有益效果在于，相對于常規(guī)的單株分別發(fā)酵，然后將所得發(fā)酵液混合，再進(jìn)行濃縮、制粒、干燥，從而獲得產(chǎn)品的方法，本發(fā)明通過誘變育種，改變了菌種的成長特性，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，使得原本在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，且分別具有不同生理功能的三株地衣芽孢桿菌L1、L2、L3，通過固體培養(yǎng)、搖瓶種子制備，然后將三株地衣芽孢桿菌的搖瓶種子液合瓶，經(jīng)過一級種子制備、二級種子制備，最后于同一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)，從而降低了生產(chǎn)成本。


圖1為了常規(guī)單株發(fā)酵工藝的流程圖；圖2為本發(fā)明所述三株混合發(fā)酵工藝的流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。本發(fā)明具體實(shí)施方式
中所述的三株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)L1、L2、L3，已保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，其中，地衣芽孢桿菌LI的保藏編號為:ACCC11080，其作用為:分解木質(zhì)素，具有促生長功能；所述的地衣芽孢桿菌L2的保藏編號為:ACCC10613，其作用為:產(chǎn)生桿菌肽，具有抑制細(xì)菌性及霉菌性根腐病的功能；所述的地衣芽孢桿菌L3的保藏編號為:ACCC11106，其作用為抗梨黑星病。實(shí)施例1菌株篩選1、固體斜面培養(yǎng)將三株地衣芽孢桿菌L1、L2、L3在無菌條件下分別接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，其中:地衣芽孢桿菌LI的培養(yǎng)條件為37°C，24h，地衣芽孢桿菌L2的培養(yǎng)條件為30°C，24h，地衣芽孢桿菌L3的培養(yǎng)條件為32°C，24h ；按重量百分比計(jì)，所用的斜面培養(yǎng)基組分為:葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉
1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氫二銨0.1%、氯化鈉0.5%、硫酸錳0.005%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%，余量為水，pH為7.2。2、理化因子誘變?nèi)∩鲜龉腆w斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下，用0.9%的生理鹽水制備菌懸液，濃度控制在IO8 IO9個(gè)/ml (血球計(jì)數(shù)濃度)；然后將上述菌懸液暴露在256nm波長的紫外線下,距離30cm,分別振搖60s、90s、120s，然后于暗光處，30°C培養(yǎng)16h ；在無菌條件下，將上述UV處理的菌懸液，用0.9%的生理鹽水梯度稀釋至KT1 10_6個(gè)/ml (血球計(jì)數(shù)濃度)，涂布于分離平板，于30°C培養(yǎng)48h，然后按照致死率為70% 90%的處理劑量，進(jìn)行搖瓶篩選；按重量百分比計(jì)，所用的分離平板培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%、硫酸錳
0.005%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%，余量為水，pH為7.2 ;根據(jù)上述搖瓶篩選結(jié)果， 選擇正突變的菌株，用pH6.0的磷酸緩沖液制備菌懸液，血球計(jì)數(shù)濃度為IO7 IO9個(gè)/ml ;將Iml上述菌懸液與Iml的200mg/L的亞硝基胍溶液等體積混合，于37°C下作用30min，而后立即用2ml的pH8.0的磷酸緩沖液終止反應(yīng)，用0.9%的生理鹽水將上述反應(yīng)液梯度稀釋至KT1 10_6個(gè)/ml(血球計(jì)數(shù)濃度)，涂布分離平板，于30°C培養(yǎng)48h，直至長出單菌落，所用的分離平板培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%、硫酸錳
0.005%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%，余量為水，pH為7.2 ;在無菌條件下，將上述單菌落從分離平板上接入斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，得單菌落斜面，按重量百分比計(jì)，所用斜面培養(yǎng)基組分為:葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉
1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氫二銨0.1%、氯化鈉0.5%、硫酸錳0.005%、硫酸銨
0.5%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、瓊脂1.5%，余量為水，pH為7.2。將上述單菌落斜面一對一接入種子搖瓶培養(yǎng)基，于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)22h,得初篩種子液；按重量百分比計(jì)，所用的種子搖瓶培養(yǎng)基組分為:葡萄糖2.0%、黃豆餅粉1.0%、酵母粉1.0%、蛋白胨0.5%、玉米漿0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、磷酸氫二鈉0.2%、硫酸鎂0.02%、碳酸鈣0.5%，余量為水，pH為7.0，并在120°C下滅菌30min ；然后在無菌條件下，將初篩種子液以5%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)48h，按重量百分比計(jì)，所用的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖4%、黃豆餅粉1%、玉米粉0.8%、酵母粉0.5%、磷酸二氫鉀0.2%、磷酸氫二鈉0.2%、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5，然后以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量為指標(biāo)進(jìn)行初篩，根據(jù)初篩結(jié)果，選取芽孢率、抑菌圈及生物量比對照株高的菌株進(jìn)入一次復(fù)篩，初篩結(jié)果見表1:表I初篩結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，所述地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)分別為L1、L2、L3,保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；其中，LI的保藏編號為ACCCl 1080，L2的保藏編號為ACCC10613，L3的保藏編號為ACCCl1106 ;其特征在于，包含以下步驟: a)固體斜面培養(yǎng):將三株地 衣芽孢桿菌L1、L2、L3在無菌條件下分別接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行分別培養(yǎng)，其中:地衣芽孢桿菌LI的培養(yǎng)條件為30 37°C，24 48h，地衣芽孢桿菌L2的培養(yǎng)條件為25 30°C，24 48h，地衣芽孢桿菌L3的培養(yǎng)條件為28 32°C，24 48h ； b)理化因子誘變:將步驟a)中制得的固體斜面培養(yǎng)物，在無菌條件下，分別用0.9%的生理鹽水制備成濃度為IO8 IO9個(gè)/ml (血球計(jì)數(shù)濃度)的菌懸液；然后將制得的菌懸液進(jìn)行紫外誘變處理，按照致死率70% 90%的處理劑量進(jìn)行搖瓶篩選，根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果，選擇正突變的菌株，進(jìn)行亞硝基胍誘變處理，并用0.9%的生理鹽水將亞硝基胍誘變處理后的反應(yīng)液稀釋后涂布分離平板，接入分離平板培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，至長出單菌落； c)搖瓶篩選:無菌條件下，將步驟b)中制得的單菌落從分離平板上分別接入斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h,得單菌落斜面；然后將單菌落斜面一對一接入種子搖瓶培養(yǎng)基,于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)22h，得篩選種子液；再在無菌條件下，將篩選種子液以5%的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)48h，以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量為指標(biāo)，進(jìn)行搖瓶初篩、搖瓶一次復(fù)篩及搖瓶二次復(fù)篩； d)根據(jù)步驟c)中的二次復(fù)篩結(jié)果，選取芽孢率>90%、抑菌圈> 20mm、生物量> 20%的菌株，分別用接種針接入斜面培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)48h，得二代種子斜面，然后在無菌條件下，將二代種子斜面用接種鏟接入種子搖瓶培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)22h，得搖瓶種子液； e)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟d)中的搖瓶種子液合瓶，然后接種種子罐培養(yǎng)基，經(jīng)過一級種子液和二級種子液制備后，進(jìn)入發(fā)酵罐接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0.5°C，罐壓:0.03 0.05MPa, pH值為6.3 6.6，流量1:0.3 1:0.8，轉(zhuǎn)速300rpm，至芽孢率大于85%時(shí)放罐。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟a)、c)、d)中所述的斜面培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.2 2.5%、蔗糖0.5 3.5%、酵母粉0.1 2.0%、牛肉膏0.5 1.5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、磷酸氫二銨0.1 2.0%、氯化鈉0.5 3.5%、硫酸錳0.005 0.1%、硫酸銨0.5 3.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.5%、硫酸鎂0.1 0.5%、瓊脂1.5 2.2%、余量為水，pH為6.5 7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟b)中所述的紫外誘變處理方式為:將菌懸液暴露在256nm波長的紫外線下，距離30cm，分別振搖60s、90s、120s，然后于暗光處，30°C培養(yǎng)16h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟b)中所述的亞硝基胍誘變處理方式為:將菌懸液與200mg/L的亞硝基胍溶液等體積混合，于37°C下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸緩沖液終止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟b)中所述的分離平板培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖0.2 2.5%、酵母粉·0.1 2.0%、牛肉膏0.5 L 5%、胰蛋白胨0.5 3.0%、氯化鈉0.5 3.5%、硫酸錳0.005 .0.1%、硫酸銨0.5 3.5%、磷酸氫二鉀0.1 0.5%、硫酸鎂0.1 0.5%、瓊脂1.5 2.2%、余量為水，pH為6.5-7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟c)中所述的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖2 4.5%、黃豆餅粉I .3.5%、玉米粉0.8 2.0%、酵母粉0.2 1.0%、磷酸二氫鉀0.2 1.0%、磷酸氫二鈉0.2 .1.0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟c)與步驟d)中所述的種子搖瓶培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖1.0 2.5%、黃豆餅粉1.0 2.5%、酵母粉0.2 1.0%、蛋白胨0.2 1.0%、玉米漿0.2 1.5%、磷酸二氫鉀0.2 1.0%、磷酸氫二鈉0.2 1.0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為 6.5-7.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟e)中所述的種子罐培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖1.0 2.5%、黃豆餅粉.1.0 2.5%、酵母粉0.2 L 0%、蛋白胨0.2 L 0%、玉米漿0.2 L 5%、磷酸二氫鉀0.2 .1.0%、磷酸氫二鈉0.2 1.0%、硫酸鎂0.02 0.1%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟e)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分按重量百分比計(jì)為:葡萄糖2 4.5%、黃豆餅粉I .3.5%、玉米粉0.8 2.5%、酵母粉0.2 2.5%、磷酸二氫鉀0.2 2.5%、磷酸氫二鈉0.2 .2.5%、硫酸鎂0.02 0.25%、碳酸鈣0.5%、余量為水，pH為6.5-7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三株地衣芽孢桿菌混合液體發(fā)酵工藝，通過人工誘變育種，及工藝配方、培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使得原本在不同條件下培養(yǎng)，且分別具有不同生理功能的三株地衣芽孢桿菌L1、L2、L3，通過固體培養(yǎng)、搖瓶種子制備，然后將三株地衣芽孢桿菌的搖瓶種子液合瓶后，經(jīng)過一級種子液制備、二級種子液制備，最后于同一發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)。采用本發(fā)明的混合發(fā)酵工藝，抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%，節(jié)約成本200%。
文檔編號C12N1/20GK103146624SQ20131010129
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月26日
發(fā)明者張曉紅, 劉姝靜, 朱慧平, 張中親 申請人:山西凱盛肥業(yè)有限公司