針對人血管生成素-2的高親和力人抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了結(jié)合血管生成素-2(Ang-2)的抗體及其使用方法。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，所述抗體是結(jié)合人Ang-2的全人抗體。本發(fā)明的抗體特別用于治療與一種或多種Ang-2生物學活性(包括血管生成)相關的病或疾病。
【專利說明】針對人血管生成素-2的高親和力人抗體
[0001] 本申請為2010年7月27日提交的、發(fā)明名稱為"針對人血管生成素-2的高親和 力人抗體"的PCT申請PCT/US2010/043295的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的 日期為2012年3月28日，申請?zhí)枮?01080043266. 4。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及特異性針對人血管生成素-2(angiopoietin_2) (Ang-2)的抗體，及其 抗原結(jié)合片段。
[0003] 背景
[0004] 血管生成是形成新血管的生物學過程。異常的血管生成與包括例如增殖性視網(wǎng)膜 病變、類風濕性關節(jié)炎和銀屑病的若干疾病病癥相關。另外，眾所周知血管生成對腫瘤生 長和維持是關鍵的。血管生成素-2 (Ang-2)是Tie-2受體（Tie-2)的配體，并已顯示在血 管生成中起作用。Ang-2在本領域中又被稱為Tie-2配體（US 5, 643, 755 ;Yancopoulos等 人，2000, Nature407:242-248)。
[0005] 在 US 6, 166, 185 ;7, 521，053 ;7, 205, 275 ;2006/0018909 和 2006/0246071 中提及 結(jié)合Ang-2的抗體和其他肽抑制劑。在本領域中需要可用于治療由血管生成導致的或惡化 的疾病和病癥的新的Ang-2調(diào)節(jié)劑，包括Ang-2抗體。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明提供了結(jié)合人Ang-2的人抗體。鑒于多種證據(jù)和調(diào)查，本
【發(fā)明者】意識到需 要不結(jié)合或拮抗相關分子Ang-I的Ang-2抑制劑。例如，以前的研究已證明或提示Ang-I 在止血（見，例如 Li 等人，2001，Thrombosis and Haemostasis 85:191-374)和保護成 人維管結(jié)構(gòu)免于血楽滲漏（見，例如Thurston等人，2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston等人，1999, Science 286:2511-2514)中的有益作用。因此，本
【發(fā)明者】意識到，在 某些抗血管生成的治療狀況下，保存Ang-I活性可能是有益的。因此，本發(fā)明提供了特異性 結(jié)合Ang-2但基本上不結(jié)合Ang-I的抗體。本發(fā)明也包括阻礙Ang-2和其受體Tie-2之間 的相互作用但基本上不阻礙Ang-I和Tie-2之間的相互作用的抗體。本發(fā)明的抗體在抑制 Ang-2的促血管生成活性和治療由血管生成過程導致的或與其相關的疾病和病癥中特別有 用。
[0008] 本發(fā)明的抗體可為全長的（例如，IgGl或IgG4抗體）或僅包含抗原結(jié)合部分（例 如，F(xiàn)ab, F(ab'）2或scFv片段），并可經(jīng)修飾以影響功能，例如消除殘留的效應功能。
[0009] 在一個實施方案中，本發(fā)明包含抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體的 抗原結(jié)合片段包含具有選自 SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114 ，118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262 ，266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 41 0, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 514,和 516 的氨基酸序列，或 與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的重 鏈可變區(qū)（HCVR)。在一個實施方案中，抗體或抗體的抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266,和 434 的氨基酸序列的 HCVR。
[0010] 在一個實施方案中，本發(fā)明包含抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段包含具有選自 SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 10 6, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250， 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404 ，408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500,和 504 的氨基酸序列，或與其 具有至少90 %、至少95%、至少98 %或至少99%序列同一性的基本相似的序列的輕鏈 可變區(qū)（LCVR)。在一個實施方案中，抗體或抗體的抗原結(jié)合部分包含具有選自SEQ ID NO:20, 44, 68, 164, 212, 274,和 442 的氨基酸序列的 LCVR。
[0011] 在特定的實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自SEQ ID NO:2/10, 18/20， 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 11 8/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192 ，194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/ 274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 3 54/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/42 8, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500，和 502/504的HCVR和LCVR (HCVR/LCVR)氨基酸序列對。在一個實施方案中，抗體或其片段包含 選自氨基酸序列對SEQ ID N0:18/20, 42/44, 66/68, 162/164,210/212, 266/274,和434/442 的 HCVR 和 LCVR。
[0012] 在下一個方面，本發(fā)明提供了抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體的抗 原結(jié)合片段包含具有選自 SEQ ID NO:8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 29 6, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488,和512的氨基酸序列，或與其具有至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的重鏈⑶R3(HCDR3)結(jié)構(gòu)域；和 選自 SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400 ，424, 448, 472,和496,或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性 的基本相似的序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)結(jié)構(gòu)域。
[0013] 在某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自SEQ ID N0:8/16, 32/40, 5 6/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 2 96/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472，和 488/496 的 HCDR3/IXDR3氨基酸序列對。在一個實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分包含選自SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280,和 440/448 的 HCDR3/LCDR3 氨基酸序列 對。具有這些HCDR3/LCDR3對的抗Ang-2抗體的非限制性實例是分別名為H1H685, H1H690 ，H1H691, H1H696, H1H706, H1M724,和 H2M744 的抗體。
[0014] 在另外的實施方案中，本發(fā)明包含抗體或其片段，所述抗體或其片段還包含具有 選自 SEQ ID NO:4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388， 412, 436, 460, 484,和508的氨基酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至 少99%序列同一性的基本相似的序列的HCDRl結(jié)構(gòu)域；具有選自SEQ ID N0:6, 30, 54, 78， 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486，和 510 的 氨基酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相 似的序列的重鏈 CDR2(HCDR2)結(jié)構(gòu)域；具有選自 SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 18 0, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468,和 492 的氨基酸序列，或與其具 有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本相似的序列的IXDRl結(jié)構(gòu) 域；和具有選自 SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 35 0, 374, 398, 422, 446, 470的氨基酸序列，或與其具有至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少 99%序列同一性的基本相似的序列的LCDR2結(jié)構(gòu)域。
[0015] 本發(fā)明的某些非限制性代表性抗體和抗原結(jié)合片段分別包含選自⑴SEQ ID N0:4,6,8，12，14 和 16(e.g.，HlH685) ;(ii)SEQ ID N0:28,30,32,36,38 和40(6· g.，HlH690) ;(iii)SEQ ID N0:52,54,56,60,62 和 64(e.g.，HlH691) ;(iv)SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 和 160 (e.g.，HlH696); (V) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 和 208 (e.g.，HlH706) ;(vi)SEQ ID N0:268,270,272,276,278 和 280 (e. g.，HlM724);和（vii)SEQ ID N0:436,438,440,444,446 和 448(e.g.，H2M744)的 HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2 和 LCDR3 結(jié)構(gòu)域。
[0016] 在相關的實施方案中，本發(fā)明包含特異性結(jié)合Ang-2的抗體或抗體的抗原結(jié)合 片段，其中抗體或片段包含重鏈和輕鏈⑶R結(jié)構(gòu)域（即⑶R1，⑶R2和⑶R3)，其被包含在 選自 SEQ ID NO:2/10, 18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58,66/68,70/72,74/82,90 /92, 94/96, 98/106,114/116,118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166 /168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240 ，242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314 /322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394 ,402/404,406/408,410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474 /476, 478/480, 482/490, 498/500,和502/504的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列中。在一個實 施方案中，抗體或其片段包含CDR序列，其被包含在選自氨基酸序列對SEQ ID NO :18/20,4 2/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274,和 434/442 的 HCVR 和 LCVR 中。
[0017] 在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼抗Ang-2抗體或其片段的核酸分子。本發(fā)明也 包括攜帶本發(fā)明的核酸的重組表達載體，和已引入這樣的載體的宿主細胞，以及通過在允 許抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細胞，并回收產(chǎn)生的抗體從而生產(chǎn)抗體的方法。
[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其片段，所述抗體或其片段包含由選自 SEQ ID NO: 1，17, 21，25, 41，45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121，137, 141，145, 161，1 65, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241，257, 261，265, 281，285, 289, 305, 309, 31 3, 329, 333, 337, 353, 357, 361，377, 381，385, 401，405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 47 3, 477, 481，497, 501，505, 513,和515的核酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少 98%或至少99%同一性的基本相同的序列編碼的HCVR。在一個實施方案中，抗體或其片段 包含由選自SEQ ID NO: 17, 41，65, 161，209, 265,和433的核酸序列編碼的HCVR。
[0019] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其片段，所述抗體或其片段包含由選自 SEQ ID N0:9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71，81，91，95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163， 167, 177, 187, 191，201，211，215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311，3 21，331，335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431，441，451，455, 465, 4 75, 479, 489, 499,和503的核酸序列，或與其具有至少90%、至少95 %、至少98 %或至少 99%同一'丨生的基本相同的序列編碼的LCVR。在一個實施方案中，抗體或其片段包含由選自 SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211，273,和 441 的核酸序列編碼的 LCVR。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段包含由選自 SEQ ID N0:7, 31，55, 79, 103, 127, 151，175, 199, 223, 247, 271 ，295, 319, 343, 367, 391，415, 439, 463, 487,和 511 的核苷酸序列，或與其具有至少 90%、 至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列編碼的HCDR3結(jié)構(gòu)域；和由選自 SEQ IDN0:15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471，和495的核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同 一性的基本相同的序列編碼的LCDR3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，抗體或其片段包含由選 自 SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279,和 439/447 的核酸序列對編 碼的HCDR3和IXDR3序列。
[0021] 在另外的實施方案中，抗體或其片段還包含：由選自SEQ ID N0:3, 27, 51，75, 99, 1 23, 147, 171，195, 219, 243, 267, 291，315, 339, 363, 387, 411，435, 459, 483,和 507 的核苷酸 序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列編 碼的 HCDRl 結(jié)構(gòu)域；由選自 SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101，125, 149, 173, 197, 221，245, 269, 2 93, 317, 341，365, 389, 413, 437, 461，485,和509的核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列編碼的HCDR2結(jié)構(gòu)域；由選自SEQ ID NO: 11，35, 59, 83, 107, 131，155, 179, 203, 227, 251，275, 299, 323, 347, 371，395, 419, 443, 46 7,和491的核苷酸序列，或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的 基本相同的序列編碼的LCDRl結(jié)構(gòu)域；和由選自SEQ ID NO: 13, 37, 61，85, 109, 133, 157, 18 1，205, 229, 253, 277, 301，325, 349, 373, 397, 421，445, 469,和 493 的核苷酸序列，或與其具 有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的基本相同的序列編碼的IXDR2結(jié)構(gòu) 域。
[0022] 在一個實施方案中，抗體或其片段包含由選自SEQ ID NO: 17和19 ;SEQ ID N0:41 和43;SEQIDN0:65和67;SEQIDN0:161和163;SEQIDN0:209 和211;SEQIDN0:265 和273 ;或SEQ ID NO: 433和441的核酸序列編碼的重鏈和輕鏈⑶R序列。
[0023] 本發(fā)明包括具有修飾的糖基化模式的抗Ang-2抗體。在一些應用中，去除不理想 的糖基化位點的修飾可能是有用的。例如，本發(fā)明包括本文陳述的任意抗體的修飾形式， 其中修飾形式缺乏在寡糖鏈上存在的巖藻糖部分，例如以提高抗體依賴的細胞毒性（ADCC) 功能（見Shield等人（2002) JBC 277:26733)。在其他應用中，可進行半乳糖基化的修飾以 修飾補體依賴的細胞毒性（CDC)。
[0024] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含特異性結(jié)合Ang-2的重組人抗體或其片段的藥 物組合物和可藥用的載體或賦形劑。在相關的方面，本發(fā)明涉及由Ang-2抑制劑和第二種 治療劑的組合的組合物。在一個實施方案中，Ang-2抑制劑是抗體或其片段。在一個實施方 案中，第二種治療劑是與Ang-2抑制劑有利組合的任意試劑?？膳cAng-2抑制劑有利組合 的代表性試劑包括，但不限于，任何抑制或減少血管生成的試劑，其他癌癥治療劑，抗炎劑， 細胞因子抑制劑，生長因子抑制劑，抗造血因子，非留體抗炎藥物（NSAID)，抗病毒劑和抗生 素。
[0025] 在另一個方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗Ang-2抗體或抗體的抗原結(jié)合部分 抑制Ang-2活性的方法，其中所述治療方法包括施用治療有效量的包含本發(fā)明的抗體或抗 體的抗原結(jié)合片段的藥物組合物。治療的疾病是通過去除、抑制或減少Ang-2活性改善、減 輕、抑制或預防的任意疾病或病癥。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗Ang-2抗體或抗體片段在治療由血 管生成過程導致的、與其相關的或通過其持續(xù)的任意病或病癥中有用。在本發(fā)明的某些實 施方案中，抗Ang-2抗體或其抗原結(jié)合部分在治療癌癥中有用。在癌癥治療的情況下，本發(fā) 明的抗Ang-2抗體或其抗原結(jié)合部分可單獨施用或與其他抗癌治療抗體、化學治療劑和/ 或放射治療組合施用。在本發(fā)明的其他實施方案中，抗Ang-2抗體或其抗原結(jié)合片段在治 療一種多種眼部疾病，例如年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等和/或一種或多種 炎癥或傳染性疾病中有用。
[0026] 在檢閱了隨后的詳細描述后，其他實施方案將變得顯而易見。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1是人Ang-2的最后88個C端氨基酸（SEQ ID NO: 518的殘基409至496)與 人Ang-1(SEQ ID N0:531)的相應氨基酸序列的比對。用白色文本和黑色陰影指示hAng-1 和hAng-2之間有差異的殘基。星號（*)指示通過晶體結(jié)構(gòu)分析顯示與人Tie-2相互作用 的 hAng-2 的氨基酸。見 Barton 等人，Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (2006)。三角形 (▲)指示在hAng-2和hAng-Ι之間有差異的與Tie-2相互作用的氨基酸的位置。
[0029] 圖2(圖A-C)描述了蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果，其說明Ang-2結(jié)合分子抑制或無法抑制 Ang-I誘導的Tie-2磷酸化的程度。
[0030] 圖3是實施例13的Ang-2FD-mFC點突變結(jié)合實驗的總結(jié)，其顯示了相對檢測的多 種抗體和肽抗體（peptibody)的野生型，導致解離T1/2減少超過5倍的氨基酸變化（用實 心圓?描述）。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 在描述本發(fā)明之前，應該理解，本發(fā)明并非局限于所描述的具體方法和實驗條件， 因為這些方法和條件是可以改變的。還應理解，本文所用的術語僅出于描述具體實施方案 的目的，并非意在限制本發(fā)明，因為本發(fā)明之范圍僅受所附權利要求書的限制。
[0033] 除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語將具有與本發(fā)明所屬領域普通技 術人員通常所理解的相同含義。如本文使用的，術語"約"當在有關特定陳述的數(shù)值時使用 時，指數(shù)值與陳述值可有不超過1%的改變。例如，如本文使用的，措辭"約100"包括99和 101和所有在中間的數(shù)值（例如99. 1，99. 2, 99. 3, 99. 4等）。
[0034] 盡管與本文所述的方法和材料類似或相當?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明之 實施或試驗，但現(xiàn)將描述的是首選的方法和材料。
[0035] 定義
[0036] 如本文使用的，除非被指定為來自非人物種（例如"小鼠 Ang_2"，"猴Ang-2"等）， 術語"血管生成素-2"或"Ang-2"指人Ang-2或其生物活性片段（例如能夠在體外或體內(nèi) 誘導血管生成的Ang-2蛋白的片段）。人Ang-2由SEQ ID NO: 517中所示的核酸序列編碼 并具有SEQ ID N0:518的氨基酸序列。小鼠和猴Ang-2蛋白的氨基酸序列可從NCBI蛋白 質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中分別以NP_031452和BAE89705. 1的登記號得到。
[0037] 除非被指定為來自非人物種（例如"小鼠 Ang-Γ'，"猴Ang-Γ'等），術語"血管生 成素-1"或"Ang-Ι"指人Ang-I或其生物活性片段。人Ang-I具有如在NCBI蛋白質(zhì)序列 數(shù)據(jù)庫中以登記號AAB50557陳述的氨基酸序列。除非被指定為來自非人物種（例如"小 鼠 Tie-2"，"猴Tie-2"等），術語"Tie-2"（在本領域中又稱"TEK"）指人Tie-2或其生物 活性片段。人Tie-2具有如在NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中以登記號AAA61130陳述的氨基酸 序列。
[0038] 如本文使用的術語"抗體"意指由四條多肽鏈即兩條重鏈（H)和兩條輕鏈（L)以 二硫鍵相互連接而組成的免疫球蛋白分子，以及其多聚體（例如IgM)。每條重鏈包含一個 重鏈可變區(qū)（本文簡稱HCVR或V h)和一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域，ChU 每條輕鏈包含一個輕鏈可變區(qū)（本文簡稱LCVR或VJ和一個輕鏈恒定區(qū)。輕 鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域（Ql)。V1^P'區(qū)可進一步分成被稱為互補決定區(qū)（CDR)的高變 區(qū)，其中散布著保守性更好的被稱為框架區(qū)（FR)的區(qū)域。每個V 1^P'由三個CDR和四個 FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā) 明的不同實施方案中，抗Ang-2抗體（或其抗原結(jié)合部分）的FR可與人種系序列相同，或 可為天然的或人工改造的?？苫?個或多個CDR的并排分析確定氨基酸共有序列。
[0039] 如本文使用的術語"抗體"也包括完整抗體分子的抗原結(jié)合片段。如本文使用的， 術語抗體的"抗原結(jié)合部分"、抗體的"抗原結(jié)合片段"等等包括特異性結(jié)合抗原從而形成 復合物的任意天然存在的、可酶促獲得的、合成的或基因工程的多肽或糖蛋白?？墒褂萌我?合適的標準技術例如蛋白水解消化或涉及操縱和表達編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域和任選的恒定 結(jié)構(gòu)域的DNA的重組基因工程技術從例如完整的抗體分子抗體得到抗原結(jié)合片段。這樣的 DNA是已知的，和/或容易從例如商業(yè)來源、DNA文庫（包括，例如噬菌體抗體文庫）中得到， 或可被合成。可化學地或使用分子生物學技術測序和操縱DNA，例如將一個或多個可變和 /或恒定結(jié)構(gòu)域排列為合適的構(gòu)型，或引入密碼子，產(chǎn)生半胱氨酸殘基，修飾、加入或缺失氨 基酸等。
[0040] 抗原結(jié)合片段的非限制性實例包括：（i)Fab片段；（ii)F(ab'） 2片段；（iii)Fd片 段；（iv)Fv片段；(V)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和（vii)由模擬抗體的高變區(qū) (例如分離的互補決定區(qū)（CDR))的氨基酸殘基組成的最小識別單元。如本文使用的措 辭"抗原結(jié)合片段"也包含其他經(jīng)改造的分子，例如雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和微抗體 (minibody)〇
[0041] 抗體的抗原結(jié)合片段將通常包含至少一個可變結(jié)構(gòu)域?？勺兘Y(jié)構(gòu)域可為任意大 小或氨基酸組成，并將一般包含至少一個CDR，所述CDR鄰近一個或多個框架序列或與一 個或多個框架序列處于同一個讀框中。在具有與 '結(jié)構(gòu)域相連的Vh結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合 片段中，％和八結(jié)構(gòu)域可處于相對彼此任意合適的排列。例如，可變區(qū)可為二聚的并包含 Vh-Vh, Vh-'或 二聚體?？蛇x地，抗體的抗原結(jié)合片段可包含單體的V h或 '結(jié)構(gòu)域。
[0042] 在某些實施方案中，抗體的抗原結(jié)合片段可包含與至少一個恒定結(jié)構(gòu)域共價連 接的至少一個可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段中可找到的可變和恒定結(jié)構(gòu) 域的非限制性代表性構(gòu)型包括：（i)V H-CHl ; (ii)VH-CH2 ; (iii)VH-CH3 ; (iv)VH-CHl-CH2 ; (V) Vh-Ch1-Ch2-Ch3 ； (vi)VH-CH2-CH3 ； (vii) Vh-Cl ； (viii) Vl-ChI ； (ix)VL-CH2 ； (x) VL-CH3 ； (xi) VL-CH1-CH2 ;(xii)VfCHl-CH2-CH3 ;(xiii)VfCH2-CH3 ;和（xiv)VfQ。在包括上面列出的任意 代表性構(gòu)型的任意可變和恒定結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型中，可變和恒定結(jié)構(gòu)域可直接彼此連接或可通 過完整或部分的鉸鏈或連接區(qū)連接。鉸鏈區(qū)可由至少2個（例如5, 10, 15, 20, 40, 60或更 多個）氨基酸組成，其導致在單個多肽分子中鄰近的可變和/或恒定結(jié)構(gòu)域之間的彈性的 或半彈性的連接。此外，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段可包含與彼此和/或與一個或多個 單體Vh或'結(jié)構(gòu)域非共價連接（例如通過二硫鍵）的上面列出的任意可變和恒定結(jié)構(gòu)域 構(gòu)型的同源二聚體或異源二聚體（或其他多聚體）。
[0043] 如同完整的抗體分子，抗原結(jié)合片段可為單特異性或多特異性的（例如雙特異 性）?？贵w的多特異性抗原結(jié)合片段將通常包含至少2個不同的可變結(jié)構(gòu)域，其中每個可變 結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合單獨的抗原或相同抗原上的不同表位。在本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合 片段的上下文中可使用本領域現(xiàn)有的常規(guī)技術改造任意的多特異性抗體形式（包括本文 公開的代表性雙特異性抗體形式）。
[0044] 抗體的恒定區(qū)對抗體固定補體和介導細胞依賴的細胞毒性的能力是很重要的。因 此，可基于是否期望抗體介導細胞毒性選擇抗體的同種型。
[0045] 本文所用的術語"人抗體"意在包括含有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū) 和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明之人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基 (例如通過體外隨機誘變或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變而引入的突變），例如 可在CDR中尤其是在CDR3中包括這樣的氨基酸殘基。但是，本文所用的術語"人抗體"并不 意在包括其中衍生自另一哺乳動物物種如小鼠的CDR序列被嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。
[0046] 如本文使用的，術語"重組人抗體"意在包括通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或 分離的所有人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染進宿主細胞（下文進一步描述）的重組表達載體表達 的抗體，從重組的組合人抗體文庫（下文進一步描述）分離的抗體，從人免疫球蛋白基 因的轉(zhuǎn)基因動物（例如小鼠）中分離的抗體（見例如Taylor等人（1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)或通過任意其他涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的 手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的 可變和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，這樣的重組人抗體經(jīng)歷了體外突變（或，當使用 人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，經(jīng)歷了體內(nèi)體細胞突變），且因此重組抗體的V h和 '區(qū)的氨基 酸序列盡管源自人種系Vh和 '序列并與人種系Vh和 '序列相關，但可能不天然地存在于 體內(nèi)的人抗體種系庫中。
[0047] 人抗體可以兩種與鉸鏈異質(zhì)性相關的形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子 包含約150-160kDa的穩(wěn)定的四鏈構(gòu)造，其中通過鏈間的重鏈二硫鍵將二聚體維持在一起。 在第二種形式中，二聚體不通過鏈間二硫鍵連接，而形成由共價連接的輕和重鏈組成的約 75-80kDa的分子（半抗體）。這兩種形式的分離一直極為困難，甚至在親和純化后亦如此。
[0048] 第二種形式在多種完整IgG同種型中出現(xiàn)的頻率取決于（但不限于）與抗體的鉸 鏈區(qū)同種型相關的結(jié)構(gòu)差異。在人IgG4鉸鏈的鉸鏈區(qū)中的單個氨基酸取代可將第二種形 式的出現(xiàn)顯著降低（Angal等人（1993)Molecular Immunology 30:105)至通常使用人IgGl 鉸鏈所觀察到的水平。本發(fā)明包含在鉸鏈、CH2或CH3區(qū)中具有一個或多個突變的抗體，其 可理想地用于，例如在生產(chǎn)中提高期望的抗體形式的產(chǎn)量。
[0049] 本文所用的"分離抗體"意指基本上不含其它具有不同抗原特異性的抗體（例如 特異性結(jié)合人Ang-2或人Ang-2片段的分離抗體在實質(zhì)上不含特異性結(jié)合人Ang-2之外抗 原的抗體）。術語"特異性結(jié)合"或類似術語指抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原形成在生理條 件下相對穩(wěn)定的復合物。特異性結(jié)合可通過約IxKT 8M或更小的Kd表征。測定兩個分子是 否特異性結(jié)合的方法是本領域熟知的，并包括例如平衡透析、表面等離子共振，等等。但是， 特異性結(jié)合人Ang-2的分離抗體對于其它抗原如來自其它物種的Ang-2分子可具有交叉反 應性。此外，分離抗體可基本上不含其他細胞物質(zhì)和/或化學品。
[0050] 如本文使用的，"中和"或"封閉"抗體意指其與Ang-2的結(jié)合將阻斷Ang-2與其受 體（Tie-2)的相互作用和/或?qū)е翧ng-2的至少一種生物活性被抑制的抗體。通過Ang-2 中和/或阻斷抗體引起的抑制不需要是完全的，只要其可使用合適的測定被檢測出即可。 用于檢測Ang-2抑制的代表性測定在本文別處描述。
[0051] 本文公開的全人抗Ang-2抗體與相應的種系序列相比，可在重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 的框架和/或CDR區(qū)中包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失。通過比較本文公開的 氨基酸序列和可由例如公開的抗體序列數(shù)據(jù)庫獲得的種系序列，可容易地確定這些突變。 本發(fā)明包括源自本文公開的任意氨基酸序列的抗體及其抗原結(jié)合片段，其中在一個或多個 框架和/或CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸被回復突變?yōu)橄鄳姆N系殘基或相應的種系殘 基的（天然或非天然的）保守氨基酸取代（這樣的序列變化在本文中被稱為"種系回復突 變"）。本領域普通技術人員從本文公開的重和輕鏈可變區(qū)序列開始，可容易地產(chǎn)生許多包 含一個或多個單獨的種系回復突變或其組合的抗體和抗原結(jié)合片段。在某些實施方案中， 在V h和/或' 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的所有框架和/或CDR殘基被回復突變?yōu)榉N系序列。在其他實施方 案中，只有某些殘基被回復突變?yōu)榉N系序列，例如只有在FRl的開始8個氨基酸內(nèi)或在FR4 的最后8個氨基酸內(nèi)找到的突變殘基，或只有在CDR1，CDR2或CDR3內(nèi)找到的突變殘基。此 夕卜，本發(fā)明的抗體可包含在框架和/或⑶R區(qū)內(nèi)的2種或多種種系回復突變的任意組合，即 其中某些單獨的殘基被回復突變?yōu)榉N系序列，而某些不同于種系序列的其他殘基被保留。 一旦得到后，可容易地檢測包含一種或多種種系回復突變的抗體和抗原結(jié)合片段的一種或 多種期望的性能，例如提高的結(jié)合特異性、增強的結(jié)合親和力、提高或增強的拮抗或激動的 生物性能（看情形而定）、降低的免疫原性等等。本發(fā)明包含以此一般方式得到的抗體和抗 原結(jié)合片段。
[0052] 本發(fā)明也包括包含具有一個或多個保守取代的本文公開的任意HCVR，LCVR和/或 CDR氨基酸序列變體的抗Ang-2抗體。例如，本發(fā)明包括相對本文公開的任意HCVR，LCVR和 /或CDR氨基酸序列具有例如10個或更少，8個或更少，6個或更少，4個或更少等的保守氨 基酸取代的HCVR，LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗Ang-2抗體。在一個實施方案中，抗體 包含具有8個或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的HCVR。在另 一個實施方案中，抗體包含具有6個或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 18的氨基 酸序列的HCVR。在另一個實施方案中，抗體包含具有4個或更少的保守氨基酸取代的具有 SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的HCVR。在另一個實施方案中，抗體包含具有2個或更少的保 守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:18的氨基酸序列的HCVR。在一個實施方案中，抗體包含具 有8個或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR。在另一個實 施方案中，抗體包含具有6個或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO: 20的氨基酸序列 的LCVR。在另一個實施方案中，抗體包含具有4個或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR。在另一個實施方案中，抗體包含具有2個或更少的保守氨基 酸取代的具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCVR。
[0053] 如本文使用的術語"表面等離子共振"指通過例如使用BIAcore?系統(tǒng)（GE Healthcare, Piscataway, NJ的Biacore Life Sciences部門）檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋 白質(zhì)濃度的改變，允許分析實時相互作用的光學現(xiàn)象。
[0054] 本文所用的術語"KD"意指特定的抗體-抗原相互作用的平衡離解常數(shù)。
[0055] 術語"表位"指與被稱為互補位的抗體分子可變區(qū)中的特定抗原結(jié)合位點相互作 用的抗原決定簇。單個抗原可具有多于一個表位。因此，不同的抗體可結(jié)合抗原的不同區(qū) 域并可具有不同的生物學效應。表位可為構(gòu)象的或線性的。構(gòu)象表位通過來自線性多肽鏈 的不同片段的空間并列的氨基酸產(chǎn)生。線性表位是通過多肽鏈中的鄰近氨基酸殘基產(chǎn)生的 表位。在某些情況下，表位可包括在抗原上的糖、磷酸基或磺酰基部分。
[0056] 術語"基本上同一性"或"基本上相同"當指核酸或其片段時，表示當以適當?shù)暮塑?酸插入或刪除與另一個核酸（或其互補鏈）最佳比對時，用下述任何著名的序列同一性算 法如FASTA、BLAST或GAP測量，在至少約95 %，更優(yōu)選的至少約96 %、97 %、98 %或99 %的 核苷酸堿基中具有核苷酸序列同一'I"生。與參考核酸分子具有基本上同一'I"生的核酸分子可在 某些情況下編碼具有與參考核酸分子編碼的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
[0057] 當應用于多肽時，術語"基本上相似"指兩個肽序列用諸如GAP或BESTFIT等程 序的默認間隙權重達排列到最佳比對時，兩者至少有95%的序列相同性，更優(yōu)選地至少有 98%或99%的序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置的差別僅在于保守的氨基酸取代。 "保守的氨基酸取代"是指這樣一種取代，即一個氨基酸殘基被另一個含有化學性質(zhì)（例如 電荷或疏水性）相似側(cè)鏈（R基團）的氨基酸殘基所取代。一般來說，保守的氨基酸取代 不會在實質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個或更多的氨基酸序列相互之間的差別僅在 于某些保守取代的情況中，可將序列相似性程度向上調(diào)整，以針對取代的保守特性作出校 正。進行這種調(diào)整的方法是本領域技術人員所熟知的。參閱例如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。含有化學性質(zhì)相似側(cè)鏈的氨基酸類別的實例包括：1)脂族側(cè)鏈：甘 氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂族羥基側(cè)鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側(cè) 鏈：天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈：賴氨酸、 精氨酸和組氨酸；和6)含硫側(cè)鏈：天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽，以及7)含硫側(cè)鏈：半胱氨酸和 甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨 酰胺?；蛘?，保守的取代是Gonnet等人（1992)Science 256:144345中所公開的？411250對 數(shù)似然矩陣（PAM2501og-likelihood matrix)中任何正值的變化。"中度保守的"取代是 PAM250對數(shù)似然矩陣中非負值的任何變化。
[0058] 多肽的序列相似性（又稱序列同一性）通常用序列分析軟件來測量。蛋白質(zhì)分析 軟件是用指定給各種取代（包括保守氨基酸取代）、缺失和其它修飾的相似性程度對相似 的序列進行比對。例如，GCG軟件含有諸如Gap和Bestfit的程序，可以默認參數(shù)使用這些 程序，以確定緊密相關的多肽例如來自不同生物物種的同源多肽之間的序列同源性或序列 同一性，或者野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCG 版本6. 1。還可以用GCG版本6. 1中的FASTA程序以默認參數(shù)或推薦參數(shù)來比較多肽序列。 FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查詢序列和被搜索序列之間的最佳重迭區(qū)域的 比對和序列同一性百分數(shù)（Pearson(2000)，出處同上）。當將本發(fā)明之序列與含有大量的 源自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，另一優(yōu)選的算法是BLAST計算機程序，尤其是 BLASTP 或 TBLASTN，使用默認參數(shù)。參閱如 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215:403410 及（1997)Nucleic Acids Res. 25:3389402.
[0059] 人抗體的制備
[0060] 產(chǎn)生單克隆抗體，包括全人單克隆抗體的方法是本領域已知的。在本發(fā)明的上下 文中可使用任意這樣的已知方法用于產(chǎn)生特異性結(jié)合人Ang-2和具有本文公開的任意代 表性抗Ang-2抗體的一種或多種抗原結(jié)合和/或功能特征的人抗體。
[0061] 使用VEL0CIMMUNE?技術或任意其他已知的用于產(chǎn)生單克隆抗體的方法，最初分 離了具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的針對Ang-2的高親和力嵌合抗體。在如下實施例章節(jié) 中，表征抗體和并選擇理想的特征，包括親和力、選擇性、表位等。用期望的人恒定區(qū)替換小 鼠恒定區(qū)以產(chǎn)生本發(fā)明的全人抗體，例如野生型或修飾的IgGl或IgG4。盡管選擇的恒定區(qū) 可根據(jù)特定用途而改變，高親和力抗原結(jié)合和靶特異性特征駐留在可變區(qū)中。
[0062] 生物等價物
[0063] 本發(fā)明的抗Ang-2抗體和抗體片段包含具有與所述抗體不同的氨基酸序列，但保 留結(jié)合人Ang-2的能力的蛋白質(zhì)。當與親本序列比較時，這樣的變體抗體和抗體片段包含 一個或多個氨基酸加入、缺失或取代，但展示與所述抗體基本上等價的生物學活性。類似 地，當與公開的序列比較時，本發(fā)明的抗Ang-2抗體的DNA編碼序列包含一個或多個核苷酸 加入、缺失或取代，但編碼與本發(fā)明的抗Ang-2抗體或抗體片段基本上生物等價的抗Ang-2 抗體或抗體片段。這樣的變體氨基酸和DNA序列的實例已在上文討論。
[0064] 如果兩種抗原結(jié)合蛋白或抗體是醫(yī)藥等效物或醫(yī)藥替代物，當在相似實驗條件下 無論以單劑或以多劑方式以相同摩爾劑量給藥時，其吸收速率和程度均未顯示顯著差別， 則它們被認為是生物等效的。某些抗體如果它們的吸收程度相當?shù)账俾什幌喈?，它?將被認為是等效物或藥物替代物，并仍可被認為是生物等效的，因為這種吸收速率的差別 是有意設計的并反映在標簽上，這種差別對于達到有效的體內(nèi)藥物濃度是非關鍵性的（例 如對于慢性用途），并被認為對于所研究的特定醫(yī)藥產(chǎn)品在醫(yī)學上是無關重要的。
[0065] 在一個實施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在安全性、純度和藥效方面沒有臨床 意義上的差別，則它們是生物等效的。
[0066] 在一個實施方案中，如果一名患者可以在對照產(chǎn)品和生物產(chǎn)品之間轉(zhuǎn)換一次或多 次而不良副作用的風險并未如預期那樣增加，包括與無這種轉(zhuǎn)換的連續(xù)治療相比在免疫原 性方面無顯著的臨床變化或效率降低，則兩種抗原結(jié)合蛋白就是生物等效的。
[0067] 在一個實施方案中，如果兩種抗原結(jié)合蛋白在使用條件下都以一種或多種共同的 作用機制起作用，且這類機制是眾所周知的，則它們就是生物等效的。
[0068] 生物等效性可以體內(nèi)和體外的方法演示。生物等效性的測量包括，例如，（a) -種 在人類或其它哺乳類動物體內(nèi)的試驗，其中血液、血漿、血清或其它生物體液中抗體或其代 謝物的濃度是作為時間的函數(shù)測定的；(b) -種體外試驗，該試驗已與人的體內(nèi)試驗生物 利用率數(shù)據(jù)建立相關聯(lián)系并可根據(jù)人的體內(nèi)試驗生物利用率數(shù)據(jù)合理預測；（c) 一種人類 或其它哺乳類動物的體內(nèi)試驗，其中抗體（或其目標）適當?shù)募毙运幚碜饔檬亲鳛闀r間的 函數(shù)測定的；以及（d) -種控制良好的臨床試驗，該試驗確定抗體的安全性、有效性，或生 物利用率或生物等效性。
[0069] 本發(fā)明抗Ang-2抗體的生物等效變體可通過例如取代生物活性不需要的各種殘 基或序列或刪除生物活性不需要的端部或內(nèi)部殘基或序列而構(gòu)建。例如，對于生物活性并 非必需的半胱氨酸殘基可被刪除或被其它氨基酸取代，以防在復原時形成不必要或不正確 的分子內(nèi)二硫化物橋。
[0070] 抗體的生物和治療特性
[0071] 大體上，當通過與固定在固相上的或在溶液相中的抗原結(jié)合測量時，本發(fā)明的抗 體以小于IOOpM的K D，一般以小于50pM的KD，和在某些實施方案中，以小于40pM的Kd與人 Ang-2結(jié)合。
[0072] 另外，本發(fā)明的某些代表性抗Ang-2抗體可展示一種或多種以下特征：（1)結(jié)合 人Ang-2但不結(jié)合小鼠 Ang-2的能力；（2)結(jié)合人Ang-2和結(jié)合小鼠 Ang-2的能力；（3)結(jié) 合人Ang-2但不結(jié)合人Ang-I,-3或-4的能力；（4)結(jié)合人Ang-2但不結(jié)合小鼠 Ang-I,-3 或-4的能力；（5)結(jié)合人Ang-2和結(jié)合Ang-I, -3或-4的能力；（6)結(jié)合人Ang-2和結(jié)合 小鼠 Ang-1，-3或-4的能力；（7)阻斷人Ang-2結(jié)合人Tie-2的能力；（8)阻斷人Ang-2結(jié) 合小鼠 Tie-2的能力；（9)阻斷小鼠 Ang-2結(jié)合人Tie-2的能力；（10)阻斷小鼠 Ang-2結(jié) 合小鼠 Tie-2的能力；（11)阻斷人Ang-I結(jié)合人Tie-2的能力；（12)阻斷人Ang-I結(jié)合小 鼠 Tie-2的能力；（13)阻斷小鼠 Ang-I結(jié)合人Tie-2的能力；（14)阻斷小鼠 Ang-I結(jié)合小 鼠 Tie-2的能力；（15)抑制人Ang-2誘導的人Tie-2的磷酸化的能力；（16)抑制人Ang-2 誘導的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（17)抑制小鼠 Ang-2誘導的人Tie-2的磷酸化的能 力；（18)抑制小鼠 Ang-2誘導的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（19)抑制人Ang-I誘導的人 Tie-2的磷酸化的能力；(20)抑制人Ang-I誘導的小鼠 Tie-2的磷酸化的能力；（21)抑制 小鼠 Ang-I誘導的人Tie-2的磷酸化的能力；（22)抑制小鼠 Ang-I誘導的小鼠 Tie-2的磷 酸化的能力；（23)在一個實驗模型中抑制體內(nèi)血管生成的能力（例如通過在裸鼠皮下植入 包含MCF-7細胞的基質(zhì)膠栓（Matrigel plug)誘導血管生成）；和/或（24)在小鼠異種移 植模型中抑制或減少腫瘤體積的能力。
[0073] 本發(fā)明也包括以高親和力與包含Ang-2纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域但缺乏Ang_2N端卷 曲螺旋結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體（這樣的構(gòu)建體在本文中被稱為"Ang-2FD"）結(jié)合的抗體。代表 性Ang-2FD構(gòu)建體包括人Ang-2FD(SEQIDN0:519)，小鼠 Ang-2FD(SEQIDN0:520)和猴 Ang-2FD(SEQ ID N0:521)。人、小鼠和猴Ang-2FD構(gòu)建體可為單體或二聚體。Ang-2FD構(gòu)建 體也可包括其他非Ang-2氨基酸序列，例如與Ang-2FD分子連接的人或小鼠 Fc結(jié)構(gòu)域。另 一種代表性Ang-2FD構(gòu)建體在本文中被稱為"hBA2"（或人"bow-Ang2"），其是通過人或小 鼠 Fc結(jié)構(gòu)域彼此連接從而形成類似蝴蝶結(jié)的構(gòu)型的人Ang-2纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域的四聚體。 hBA2 -般由2個Ang-2二聚體組成，其中每個Ang-2二聚體包含2個通過Fc結(jié)構(gòu)域彼此連 接的Ang-2纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域。代表性hBA2成分包括名為hBA2-hIgGl(SEQ ID N0:522) 和hBA2-mIgG2a(SEQ ID N0:523)的多肽。出人意料地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些抗Ang-2抗體以 比已知的Ang-2對照抗體高得多的親和力結(jié)合Ang-2FD構(gòu)建體（見本文陳述的實施例）。
[0074] 在抗Ang-2抗體結(jié)合人或小鼠二聚體Ang-2FD構(gòu)建體的上下文中，高親和力結(jié)合 指抗Ang-2抗體以小于300pM的K d結(jié)合人或小鼠二聚體Ang-2FD。例如，如在25°C下在表 面等離子共振測定中測量的，以高親和力結(jié)合人或小鼠二聚體Ang-2FD的抗Ang-2抗體包 括以小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小于180pM、小于170pM、小于160pM、 小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于ΙΙΟρΜ、小于ΙΟΟρΜ、小于90pM、小于 80pM、小于70pM、小于60pM或小于50pM的Kd結(jié)合人或小鼠二聚體Ang-2-FD的抗體。
[0075] 在抗Ang-2抗體結(jié)合猴二聚體Ang-2FD構(gòu)建體的上下文中，高親和力結(jié)合指抗 Ang-2抗體以小于500pM的Kd結(jié)合猴二聚體Ang-2FD。例如，如在25°C下在表面等離子共 振測定中測量的，以高親和力結(jié)合猴二聚體Ang-2FD的抗Ang-2抗體包括以小于500pM、 小于450pM、小于400pM、小于350pM、小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小 于180pM、小于170pM、小于160pM、小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于 ΙΙΟρΜ、小于ΙΟΟρΜ、小于90pM或小于80pM的Kd結(jié)合猴二聚體Ang-2-FD的抗體。
[0076] 在抗Ang-2抗體結(jié)合人單體Ang-2FD構(gòu)建體的上下文中，高親和力結(jié)合指抗Ang-2 抗體以小于40nM的Kd結(jié)合人單體Ang-2FD。例如，如在25°C下在表面等離子共振測定中 測量的，以高親和力結(jié)合人單體Ang-2FD的抗Ang-2抗體包括以小于40nM、小于30nM、小于 25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小 于4nM、小于3nM、小于2nM、小于InM、小于0· 9nM、小于0· 8nM、小于0· 7nM或小于0· 6nM的 Kd結(jié)合人單體Ang-2-FD的抗體。
[0077] 在抗Ang-2抗體結(jié)合hBA2構(gòu)建體的上下文中，高親和力結(jié)合指抗Ang-2抗體以小 于80pM的Kd結(jié)合hBA2。例如，如在25°C下在表面等離子共振測定中測量的，以高親和力 結(jié)合hBA2的抗Ang-2抗體包括以小于80pM、小于75pM、小于70pM、小于65pM、小于60pM、小 于55pM、小于50pM、小于45pM、小于40pM、小于35pM、小于30pM、小于25pM、小于20pM、小于 18pM、小于16pM、小于14pM或小于12pM的K d結(jié)合hBA2的抗體。
[0078] 本發(fā)明包括結(jié)合Ang-2但基本不結(jié)合Ang-I的抗體。如本文使用的，當在表面等 離子共振測定中檢測與Ang-I的結(jié)合時，如果抗體展示大于約InM的K D，例如大于約5nM、大 于約10nM、大于約50nM、大于約ΙΟΟηΜ、大于約150nM、大于約200nM、大于約250nM、大于約 300nM、大于約350nM、大于約400nM、大于約450nM、大于約500nM或更高的K D，則抗體"基本 不結(jié)合Ang-Γ'，在所述測定中抗體被捕獲在表面上，且全長野生型人Ang-I以約25nM的濃 度以約60 μ 1/分鐘的流速在25°C下注射在捕獲抗體表面上約3分鐘。（見例如實施例4)。 另外，當在這樣的測定或其等價測定中檢測時，如果抗體不能展示與Ang-I的任何結(jié)合，則 抗體"基本不結(jié)合Ang-Γ'。
[0079] 本發(fā)明也包括阻斷Ang-2結(jié)合Tie2但基本不阻斷Ang-I結(jié)合Tie-2的抗體。如本 文使用的，如果當抗體與Ang-I抗原以約100 :1 (抗體：抗原）的比例預混合并允許在25°C 下孵育約60分鐘，然后通過表面等離子共振在Tie-2覆蓋的表面上檢測平衡的混合物與 Tie-2的結(jié)合（5 μ 1/分鐘進行5分鐘，在25°C下），與Tie-2結(jié)合的Ang-I的量是在不相 關的對照分子的存在下的與Tie-2結(jié)合的Ang-I量的至少50%時，抗體"基本不阻斷Ang-I 結(jié)合Tie-2"。（見，例如實施例6)。例如，如果在與抗體預孵育后與Tie-2結(jié)合的Ang-I 的量是在上述實驗條件下與不相關的對照分子預孵育后與Tie-2結(jié)合的Ang-I的量至少約 50 %、至少約55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少 約85 %、至少約90 %、至少約95 %或約100 %，則認為抗體"基本不阻斷Ang-I結(jié)合Tie-2"。
[0080] 另外，本發(fā)明包括阻斷或?qū)嵸|(zhì)減弱Ang-2的生物學活性（例如Ang-2介導的Tie-2 的磷酸化；Ang-2誘導的血管生成；等）但不阻斷或?qū)嵸|(zhì)減弱Ang-I的相應的生物學活性 (例如Ang-I介導的Tie-2的磷酸化；Ang-I誘導的血管生成；等）的抗體。用于測定抗體 是否滿足一種或多種上面列出的特征的測定和試驗將是本領域普通技術人員容易知道和 容易實踐的，和/或可通過本公開充分確定。例如，下面詳細描述的實驗程序可用于測定給 定的抗體是否結(jié)合或不結(jié)合Ang-2和/或Ang-I ;阻斷或不阻斷Ang-2和/或Ang-I結(jié)合 Tie-2 ;抑制或不抑制Ang-2和/或Ang-I介導的Tie-2的磷酸化；等。
[0081] 表位作圖和相關技術
[0082] 為篩選能與特定表位結(jié)合的抗體（例如能阻斷IgE與其高親和力受體結(jié)合的抗 體），可進行常規(guī)的交聯(lián)-阻斷分析，如"Antibodies", Harlow和Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)中所述。其它方法包括丙氨酸掃描突變體分析、肽印跡分析 (Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63)或肽切割分析。另外，還可采用諸如抗原 的表位切除、表位提取和化學修飾的方法（Tomer (2000)Protein Science9 :487-496)。
[0083] 術語"表位"是指抗原上B細胞和/或T細胞對其作出響應的位點。B細胞表位可 由毗連的氨基酸形成，或者由通過蛋白質(zhì)的三級折迭而并列在一起的非毗連氨基酸形成。 由毗連氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑時通常可得以保留，而通過三級折迭形成的表位 在用變性溶劑處理時通常會失去。表位通常包括至少3個、更經(jīng)常是至少5個或8-10個以 獨特空間構(gòu)象出現(xiàn)的氨基酸。
[0084] 修飾輔助概況分析（Modification-Assisted Profiling, MAP)，也被稱為基于抗原 結(jié)構(gòu)的抗體譜分析（Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是一種根據(jù)每 種抗體與經(jīng)化學或酶學修飾的抗原表面的結(jié)合狀況的相似性對大量的抗同一抗原的單克 隆抗體（mAb)進行分類的方法（美國專利2004/0101920號）。每一類均可反映與另一類所 代表的表位截然不同或部分重迭的獨特表位。這種技術可以快速過濾遺傳上相同的mAb，從 而可使鑒定工作集中在遺傳上不同的mAb上。當應用于雜交瘤篩選時，MAP有助于鑒定某 些罕見雜交瘤克隆，后者能產(chǎn)生具有所需特性的mAbs。MP可用來將本發(fā)明的抗Ang-2抗 體分類成結(jié)合不同表位的抗體組。
[0085] 抗Ang-2抗體可結(jié)合氨基端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位或羧基端纖連蛋白樣結(jié)構(gòu) 域（"FD"）內(nèi)的表位。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗Ang-2抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合 FD內(nèi)的表位。
[0086] 已從晶體結(jié)構(gòu)分析中確定了 Ang-2的FD內(nèi)的與Tie-2相互作用的氨基酸。見 Barton 等人，Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532 (2006 年 5 月）。就阻斷 Ang-2 結(jié)合 Tie-2 但基本不阻斷Ang-I結(jié)合Tie-2的抗體（例如H1H685P，見下面的實施例5和6)而言，這 些抗體結(jié)合的表位可包含Ang-2的（a)與Tie-2相互作用和（b)與Ang-I中的相應氨基 酸不相同的一個或多個氨基酸。（見圖1)。因此，這樣的Ang-2優(yōu)先抗體結(jié)合的表位可包 含hAng-2(SEQ ID N0:518)的一個或多個以下氨基酸：S-417 ;K-432 ;I-434 ;N-467 ;F-469 ; Y-475;或S-480。例如，本
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)，與Ang-2(SEQ ID N0:518)的氨基酸F-469，Y-475， 和S-480相互作用的抗體優(yōu)先與Ang-2而不是Ang-I相互作用，且此優(yōu)先的結(jié)合可具有治 療益處。因此，本發(fā)明包括特異性結(jié)合人血管生成素-2(hAng-2)但基本不結(jié)合hAng-Ι的 抗Ang-2抗體，其中所述抗體結(jié)合包含氨基酸F-469, Y-475,和S-480的hAng-2 (SEQ ID N0:518)上的表位。類似地，本發(fā)明包括阻斷hAng-2結(jié)合hTie-2但基本不阻斷hAng-1 結(jié)合hTie-2的抗Ang-2抗體，其中所述抗體結(jié)合包含氨基酸F-469, Y-475,和S-480的 hAng-2 (SEQ ID NO: 518)上的表位。
[0087] 本發(fā)明包括與本文描述的任意特定的代表性抗體（例如H1H685, H1H690, H1H691， H1H696, H1H706, H1M724和/或H2M744)結(jié)合相同表位的抗Ang-2抗體。同樣地，本發(fā)明也 包括與本文描述的任意特定的代表性抗體（例如H1H685, H1H690, H1H691，H1H696, H1H706， H1M724和/或H2M744)競爭結(jié)合Ang-2的抗Ang-2抗體。
[0088] 使用本領域內(nèi)已知的常規(guī)方法，可以容易地確定一種抗體是否與本發(fā)明之對照抗 Ang-2抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，或在結(jié)合過程中競爭。例如，為了確定一種試驗抗體是 否與本發(fā)明之對照抗Ang-2抗體一樣與同樣的表位結(jié)合，讓該對照抗體與Ang-2蛋白或肽 在飽和條件下結(jié)合。然后，評估試驗抗體與該Ang-2分子結(jié)合的能力。如果該試驗抗體在 與對照抗Ang-2抗體飽和結(jié)合之后能夠與Ang-2結(jié)合，就可得出結(jié)論，該試驗抗體和對照抗 Ang-2抗體與不同的表位結(jié)合。在另一方面，如果該試驗抗體在與對照抗Ang-2抗體飽和結(jié) 合之后不能與Ang-2分子結(jié)合，那么該試驗抗體就可與本發(fā)明之對照抗Ang-2抗體所結(jié)合 的同一表位結(jié)合。然后可進行其它常規(guī)實驗（例如肽突變和結(jié)合分析）以確定是否觀察到 的試驗抗體的結(jié)合不足實際上是由于與對照抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，或是否空間阻斷 (或另一現(xiàn)象）是觀察到的結(jié)合不足的原因。這類實驗可采用ELISA、RIA、表面等離子體共 振技術、流式細胞計量法或本領域內(nèi)所具備的任何其它定量或定性的抗體結(jié)合分析。依照 本發(fā)明的某些實施方案，如果，例如，如在競爭結(jié)合測定中所測量的，1倍、5倍、10倍、20倍 或100倍過量的一種抗體抑制至少50%，但優(yōu)選75%，90%或甚至99%的另一種抗體的結(jié) 合（見例如Junghans等人，Cancer Res. 199050 :1495-1502)，則兩種抗體結(jié)合相同（或重 疊）的表位?？蛇x地，如果抗原中降低或消除一種抗體結(jié)合的幾乎所有的氨基酸突變能降 低或消除另一種抗體的結(jié)合，則認為兩種抗體具有相同的表位。如果降低或消除一種抗體 結(jié)合的僅部分氨基酸突變能降低或消除另一種抗體的結(jié)合，則認為兩種抗體具有"重疊的 表位"。
[0089] 為了確定一種抗體是否與對照抗Ang-2抗體在結(jié)合過程中競爭，在兩個方向?qū)嵤?上述結(jié)合方法：在第一個方向，讓對照抗體與Ang-2分子在飽和條件下結(jié)合，然后評估試驗 抗體與該Ang-2分子的結(jié)合。在第二個方向，讓試驗抗體與Ang-2分子在飽和條件下結(jié)合， 然后評估對照抗體與該Ang-2分子的結(jié)合。如果在這兩個方向只有第一個（飽和）抗體能 夠與Ang-2分子結(jié)合，那就可以得出結(jié)論，該試驗抗體與對照抗體在與Ang-2結(jié)合的過程中 競爭。如同本領域普通技術人員所能理解的，與對照抗體在結(jié)合過程中競爭的抗體未必與 對照抗體所結(jié)合的同一表位結(jié)合，但可與一個重疊或鄰近的表位結(jié)合而在空間上阻斷該對 照抗體。
[0090] 物種選擇性和物種交叉反應性
[0091] 根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，抗Ang-2抗體結(jié)合人Ang-2但不結(jié)合來自其他物種 的Ang-2。可選地，本發(fā)明的抗Ang-2抗體在某些實施方案中結(jié)合人Ang-2并結(jié)合來自一種 或多種非人物種的Ang-2。例如，本發(fā)明的Ang-2抗體可結(jié)合人Ang-2,且可結(jié)合或不結(jié)合 (視情況而定）一種或多種小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、 胳馬它、稱猴（cynomologous)、絨猴（marmoset)、恒河猴（rhesus)或黑猩猩Ang-2。
[0092] 免疫綴合物
[0093] 本發(fā)明包括一種與治療基團（"免疫綴合物"）如細胞毒素、化療藥物、免疫抑制 劑或放射性同位素等綴合的抗Ang-2單克隆抗體。細胞毒素包括任何損害細胞的試劑。 適宜于形成免疫綴合物的細胞毒素和化療劑的例子是本領域內(nèi)眾所周知的。參閱如WO 05/103081。
[0094] 多特異性抗體
[0095] 本發(fā)明之抗體可以是單特異性的、雙特異性的，或多特異性的。多特異性mAb可以 針對同一目標多肽的不同表位，或可含有針對一個以上目標多肽的抗原結(jié)合域。參閱，如 Tutt等人（1991) J. Immunol. 147:60-69。本發(fā)明的抗Ang-2抗體或其部分可連接到另一個 功能分子，例如另一個肽或蛋白質(zhì)上，或與之共同表達以形成多特異性分子。例如，一種抗 體或其片段可與一種或多種其它分子實體如另一種抗體或抗體片段實現(xiàn)功能性（例如以 化學偶聯(lián)、基因融合、非共價鍵連接或其它方式）連接，以產(chǎn)生具有第二種結(jié)合特異性的雙 特異性或多特異性抗體。
[0096] 可用于本發(fā)明的代表性雙特異性抗體形式涉及使用第一個免疫球蛋白（Ig)CH3 結(jié)構(gòu)域和第二個Ig CH3結(jié)構(gòu)域，其中第一個和第二個Ig CH3結(jié)構(gòu)域相互之間相差至少一 個氨基酸，且與無氨基酸差別的雙特異性抗體相比，其中至少一個氨基酸的差別降低了雙 特異性抗體與蛋白A的結(jié)合力。在一個實施方案中，第一個Ig CH3結(jié)構(gòu)域與蛋白A結(jié)合， 第二個Ig CH3結(jié)構(gòu)域含有一個降低或消除與蛋白A結(jié)合的突變，例如一個H95R修飾（按 照MGT表現(xiàn)序列編號法；按照歐盟編號法則為H435R)。第二個CH3結(jié)構(gòu)域可進一步包含 一個Y96F修飾（按照MGT編號法；按照歐盟編號法則為Y436F)。可在第二個CH3域內(nèi)找 到的其它修飾包括：在IgGl抗體的情況下為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (按照 MGT 編號法；按照歐盟編號法則為 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I);在 IgG2 抗體的情況下為N44S、K52N和V82I (按照MGT編號法；按照歐盟編號法則為N384S、K392N 和 V422I);以及在 IgG4 抗體的情況下為 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (按照 MGT 編號法；按照歐盟編號法則為 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述雙特異性抗體的各種變化形式均被認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0097] 治療配方和施用
[0098] 本發(fā)明提供了含有本發(fā)明之抗Ang-2抗體或其抗原結(jié)合片段的治療組合物。本 發(fā)明之治療組合物可還包含一種或多種可藥用的載體、賦形劑以及其它加入配方中以提 供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等的試劑（在本文中統(tǒng)稱為"可藥用的載體或稀釋劑"）。在 藥劑化學師所熟知的處方集里可以找到大量的適宜配方：雷氏藥學大全！Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 〇 這些配方包括，如粉 齊U、糊劑、油膏、凝膠、蠟劑、油劑、脂類、含有脂（陽離子或陰離子）的泡囊（如LIPOFECTIN )、DNA綴合物、無水吸收性糊劑、水包油或油包水乳劑、乳膠狀碳蠟（各種分子量的聚 乙二醇）、半固體狀凝膠以及含有聚乙二醇的半固體狀混合物。還可參閱Powell等人 Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (非腸道用配方賦形劑概 論），PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
[0099] 抗體的劑量可根據(jù)待施用的受試者的年齡和體形大小、目標疾病、病癥、施用途徑 等因素而改變。一般根據(jù)體重或體表面積計算優(yōu)選劑量。當本發(fā)明之抗體用于治療在成年 患者中與Ang-2活性相關的病癥和疾病時，通過靜脈內(nèi)施用本發(fā)明之抗體是有利的，通常 是按照約〇. 01至約20mg/kg體重，更優(yōu)選的是按照約0. 02至7、約0. 03至約5,或約0. 05 至約3mg/kg體重的單一劑量。取決于病癥的嚴重程度，治療的頻率和持續(xù)時間可以調(diào)節(jié)。 用于施用Ang-2抗體的有效劑量和時間表可通過經(jīng)驗確定；例如可通過周期性評估監(jiān)控患 者的進展，并相應地調(diào)節(jié)劑量。另外，可使用本領域熟知的方法進行劑量的物種間縮放（例 如，Mordenti 等人，1991，Pharmaceut. Res. 8:1351)。
[0100] 各種遞送系統(tǒng)是已知的并可用于施用本發(fā)明之藥物組合物，例如封裝于脂質(zhì)體、 微粒、微膠囊中、能表達突變體病毒的重組細胞、受體介導的胞吞作用（參閱例如Wu等人 (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。給藥方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈、 皮下、經(jīng)鼻、硬膜外以及經(jīng)口給藥。該組合物可以任何方便的途徑給藥，例如，輸注或快速注 射，經(jīng)上皮或粘膜（例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等）吸收，并可與其它生物活性劑一起施 用。施用可以是全身性或局部性的。
[0101] 本發(fā)明之藥物組合物可用標準的針頭和針筒經(jīng)皮下或靜脈遞送。此外，對于皮下 遞送，一種筆型遞送裝置可方便地用于遞送本發(fā)明之藥物組合物。這種筆型遞送裝置可以 重復使用或一次性使用。可重復使用的筆型遞送裝置一般采用一種可更換的含藥物組合物 的藥筒。一旦藥筒內(nèi)所有藥物組合物均已施用、藥筒變空，則可方便地丟棄空藥筒，并用一 個含藥物組合物的新藥筒取代。然后該筆型遞送裝置可重復使用。在一次性使用的筆型遞 送裝置中，沒有可更換的藥筒。而是，該一次性使用的筆型遞送裝置有一個預先充滿藥物組 合物的貯液器。一旦該貯液器內(nèi)藥物組合物用完，整個裝置則被丟棄。
[0102] 許多可重復使用的筆型和自動注射遞送裝置已用于本發(fā)明之藥物組合物的皮 下給藥。其例子包括但當然不限于AUTOPEN?(Owen Mumford, Inc.，Woodstock，英國）、 DISETR0NIC? 筆（Disetronic Medical Systems, Burghdorf，瑞士）、HUMAL0G MIX 75/25? 筆、HUMAL0G?筆、HUMALIN 70/30?筆（Eli Lilly and Co.，印第安納州印第安納波利 斯）、N0V0PEN?I、II 和 III 型（Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥）、N0V0PEN JUNI0R?(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麥）、BD?筆（Becton Dickinson，新澤西州富蘭克林湖）、0ΡΤΙΡΕΝ?、 0ΡΤΙΡΕΝ PRO?、0ΡΤΙΡΕΝ STARLET?，以及 0PTICLIK?(sanofi-aventis，德國法蘭克福），此 處僅列舉幾個品牌。用于本發(fā)明之醫(yī)藥組合物皮下給藥的一次性使用的筆型給藥裝置的 例子包括但當然不限于 S0L0STAR? 筆（sanofi-aventis)，F(xiàn)LEXPEN?(Novo Nordisk)，以及 KWIKPEN?(Eli Lilly)。
[0103] 用于治療眼部疾病，可例如通過眼藥水、結(jié)膜下注射、結(jié)膜下植入、玻璃體內(nèi)注射、 玻璃體內(nèi)植入、眼球囊下（sub-Tenon)注射或眼球囊下植入施用本發(fā)明抗體和抗原結(jié)合片 段。
[0104] 該醫(yī)藥組合物也可以囊泡尤其是脂質(zhì)體形式遞送（參閱Langer(1990)Science 249:1527-1533 ;Treat 等人（1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer (脂質(zhì)體用于傳染病和癌癥治療），Lopez-Berestein和Fidler (編），Liss, New York, pp. 353-365 ；Lopez-Berestein, ibid. , pp. 317-327 ；一般參閱同上）。
[0105] 在某些情況下，該藥物組合物可以一種控制性釋放系統(tǒng)給藥。在一個實施方 案中，可使用一個泵（參閱 Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.l4:201)。在另一 個實施方案中，可采用聚合物材料。在又一個實施方案中，可將一種控制釋放系統(tǒng)置于 該組合物目標的附件，從而只需要全身性劑量的一部分（參閱例如，Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release(控制釋放的醫(yī)學應用），出處同上， vol. 2, ρρ· 115-138)。
[0106] 可注射制劑可包括靜脈、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、滴注輸液等劑型。這些可注射制 劑可以公知的方法制備。例如，可以將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在無菌水介質(zhì)或通 常用于注射的油性介質(zhì)中，以此方式制備該可注射制劑。作為注射用的水介質(zhì)有例如生理 鹽水、含葡萄糖和其它助劑的等滲溶液等，可結(jié)合使用適當?shù)脑鋈軇绱迹ㄈ缫掖迹?、多?醇（如丙二醇、聚乙二醇），非離子型表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HC0-50(氫化蓖麻 油的聚氧乙烯（50摩爾）加合物）]等。作為油性介質(zhì)，可采用例如芝麻油、豆油等，可結(jié)合 使用增溶劑，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。將如此制備的注射液優(yōu)選地裝入一種適當?shù)陌碴?瓶中。
[0107] 有利地，上述口服或注射用藥物組合物被制備成單位劑量的劑型，以適合一定劑 量的活性成分。這種單位劑量的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射液（安瓿）、栓劑等。 單位劑量的上述抗體含量一般為每劑約5至約500mg ;尤其是注射劑型，優(yōu)選的是上述抗體 含量為約5至約lOOmg，其它劑型中抗體含量為約10至約250mg。
[0108] 抗體的治療用途
[0109] 本發(fā)明的抗體特別用于治療、預防和/或改善與Ang-2活性相關的任意病或疾病， 包括與血管生成相關的病或疾病。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段可用于治療，例如在腦和 腦膜、□咽、肺和支氣管樹、胃腸道、雄性和雌性生殖系統(tǒng)、肌肉、骨、皮膚和附件、結(jié)締組織、 脾、免疫系統(tǒng)、造血細胞和骨髓、肝和泌尿道，和特別是感覺器官例如眼中出現(xiàn)的原發(fā)性和/ 或轉(zhuǎn)移性腫瘤。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段用于治療一種或多種以 下癌癥：腎細胞癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤（malignant gliomas)、骨肉瘤、 結(jié)直腸癌、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀 腺癌或黑色素瘤。
[0110] 本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段也可用于治療一種或多種眼部疾病?？捎帽景l(fā)明的 抗體和抗原結(jié)合片段治療的代表性眼部疾病包括，例如老年性黃斑退化癥、糖尿病視網(wǎng)膜 病變和與脈絡膜新生血管性疾病、血管滲漏、視網(wǎng)膜水腫和炎癥有關的其他眼部疾病。另 夕卜，本發(fā)明的抗Ang-2抗體也可作為青光眼手術的佐劑施用，以預防在青光眼手術后的早 期血管和淋巴管生成（hem-and Iymphangiogenesis)和巨噬細胞至結(jié)膜濾過性小泡的募 集，并改善臨床效果。
[0111] 在本發(fā)明的其他實施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段用于治療高血壓、糖尿病（包 括非胰島素依賴性糖尿?。y屑病、關節(jié)炎（包括類風濕性關節(jié)炎）、哮喘、膿毒癥、腎病和 與損傷、中風或腫瘤相關的水腫。
[0112] Ang-2表達已顯示與多種炎癥和/或傳染性疾病的嚴重度相關（見例 如 Siner 等人，2009，Shock 31:348-353 ;Yeo 等人，2008，卩1'〇。.恥七11。3(1.5(^· (USA) : 105:17097-17102)。相應地，本發(fā)明的抗Ang-2抗體可用于治療、預防或改善一種或 多種炎癥或傳染性疾病?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的抗Ang-2抗體治療、預防或改善的代表性傳 染性疾病包括，但不限于：痕疾（惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)感染）、病毒性出 血熱（例如登革熱）、立克次氏體感染、中毒性休克綜合癥、膿毒癥、丙型肝炎、桿狀巴爾通 體（Bartonella bacilliformis)感染、利什曼病、分枝桿菌感染和埃-巴二氏病毒感染。
[0113] 組合治療
[0114] 組合治療可包括本發(fā)明的抗Ang-2抗體和例如另一種Ang-2拮抗劑（例如抗 Ang-2抗體、肽抗體或CovX-體如CVX-060 (見US 7, 521，425))。本發(fā)明的抗Ang-2抗體可 與另一種抗血管生成劑如，例如VEGF拮抗劑（例如VEGF陷阱，見例如US 7, 087, 411 (在本 文中又被稱為"VEGF抑制性融合蛋白"）），抗VEGF抗體（例如貝伐單抗），VEGF受體的小 分子激酶抑制劑（例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼（pazopanib))，抗DLL4抗體（例如 在US 2009/0142354中公開的抗DLL4抗體，如REGN421)等，或與表皮生長因子受體（EGFR) 的拮抗劑（例如抗EGFR抗體或EGFR活性的小分子抑制劑）一起施用?？捎幸娴嘏c本發(fā)明 的抗Ang-2抗體組合施用的其他試劑包括細胞因子抑制劑，包括小分子細胞因子抑制劑和 結(jié)合細胞因子如 IL-1，IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 ,IL-18或其相應受體的抗體。本發(fā)明也包括治療組合,其包含本文提及的任意抗Ang-2抗 體和VEGF，DLL4, EGFR或任意上述細胞因子中的一種或多種的抑制劑，其中所述抑制劑是 適體、反義分子、核酶、siRNA、肽抗體、納米抗體或抗體片段（例如Fab片段；F(ab'） 2片段； Fd片段；Fv片段；scFv ;dAb片段；或其他改造的分子，如雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微抗 體和最小識別單元）。本發(fā)明的抗Ang-2抗體也可與抗病毒劑、抗生素、鎮(zhèn)痛藥、皮質(zhì)類固醇 和/或NSAID組合施用。本發(fā)明的抗Ang-2抗體也可作為治療方案的一部分施用，所述治 療方案也包括放射治療和/或常規(guī)的化學治療。當與一種或多種其他試劑組合時，本發(fā)明 的抗Ang-2抗體可在其他試劑的施用前施用，與其他試劑的施用同時施用（例如在同一制 劑中或在單獨的制劑中），或在其他試劑的施用后施用。
[0115] 抗體的診斷用途
[0116] 本發(fā)明的抗Ang-2抗體也可用于檢測和/或測量樣品中的Ang-2，例如用于診斷用 途。例如，抗Ang-2抗體或其片段可用于診斷以Ang-2的異常表達（例如過表達、低表達、 缺乏表達等）為特征的病癥或疾病。用于Ang-2的代表性診斷測定可包括，例如使從患者 處取得的樣品接觸本發(fā)明的抗Ang-2抗體，其中所述抗Ang-2抗體用可檢測的標簽或報告 分子標記?？蛇x地，未標記的抗Ang-2抗體可與自身經(jīng)過可檢測標記的第二抗體組合用于 診斷應用?？蓹z測的標簽或報告分子可為放射性同位素，例如 3H, 14C，32P，35S,或125I;熒光 或化學發(fā)光基團如異硫氰酸熒光素或羅丹明；或例如堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶、辣根過 氧化物酶或熒光素酶的酶?？捎糜跈z測或測量樣品中的Ang-2的特定代表性測定包括酶聯(lián) 免疫吸附測定（ELISA)、放射免疫測定（RIA)和熒光激活細胞分類術（FACS)。 實施例
[0117] 舉出以下實施例是為了向本領域一般技術人員就如何利用本發(fā)明之方法和組合 物提供一個完整的披露和說明，并非是為了限制被
【發(fā)明者】視為其發(fā)明的范圍。已作出許多 努力以確保所用數(shù)字（例如量、溫度等）的準確性，但也應考慮到某些實驗誤差和偏差。除 非另有說明，部分是以重量計的部分，分子量是指平均分子量，溫度是指攝氏度，壓力是指 大氣壓或接近大氣壓。
[0118] 實施例1.抗人Ang-2的人抗體的產(chǎn)生
[0119] 對包含編碼人免疫球蛋白重鏈和K輕鏈可變區(qū)的DNA的VEL0GIMMUNE?小鼠 直接施用人Ang-2抗原和刺激免疫應答的佐劑。通過Ang-2特異性免疫測定監(jiān)控抗體免疫 應答。當取得期望的免疫應答時收獲脾細胞并與小鼠骨髓瘤細胞融合，以維持其活力和形 成雜交瘤細胞系。篩選和選擇雜交瘤細胞系以鑒定產(chǎn)生Ang-2特異性抗體的細胞系。使用 此技術得到幾種抗Ang-2嵌合抗體（S卩，具有人可變結(jié)構(gòu)域和小鼠恒定結(jié)構(gòu)域的抗體）；以 此方式產(chǎn)生的代表性抗體定名如下：H1M724, H1M727, H1M728, H2M730, H1M732, H1M737, H2M7 42, H2M743, H2M744, H1M749, H2M750 和 H1M810。
[0120] 如在U. S. 2007/0280945A1中描述的，也可從未與骨髓瘤細胞融合的抗原陽性B細 胞中直接分離抗Ang-2抗體。使用此方法，得到幾種全人抗Ang-2抗體（即具有人可變結(jié) 構(gòu)域和人恒定結(jié)構(gòu)域的抗體）；以此方式產(chǎn)生的代表性抗體定名如下：H1H685，H1H690，H1H 691，H1H693, H1H694, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706 和 H1H707。
[0121] 依照此實施例的方法產(chǎn)生的代表性抗Ang-2抗體的生物學性能在下面陳述的實 施例中詳細描述。
[0122] 實施例2.可變區(qū)基因應用分析
[0123] 為了分析產(chǎn)生的抗體的結(jié)構(gòu)，對編碼抗體可變區(qū)的核酸進行了克隆和測序。從抗 體的核酸序列和預測的氨基酸序列出發(fā)，鑒定了每個抗體重鏈可變區(qū)（HCVR)和輕鏈可變 區(qū)（LCVR)的基因使用。
[0124] 表 1
[0125]
[0126]
【權利要求】
1. 藥物組合物，其包含分離的抗體或抗原結(jié)合片段、和可藥用載體或稀釋劑，用于治療 患有如下疾病的患者： (a) 與血管發(fā)生相關的癌癥；或 (b) 與脈絡膜新生血管相關的眼??； 其中抗體或抗原結(jié)合片段當在表面等離子共振測定中檢測時特異性結(jié)合人血管生成 素-2(hAng-2)但不結(jié)合hAng-Ι，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段包含含有SEQ ID N0:18的 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)（HCVR)的三個互補決定區(qū)（⑶R)，和含有SEQ ID NO:20的氨基 酸序列的輕鏈可變區(qū)（LCVR)的三個CDR。
2. 權利要求1的藥物組合物，其中抗體或抗原結(jié)合片段包含：包含由SEQ ID N0:4的氨 基酸序列組成的重鏈⑶R-1，由SEQ ID N0:6的氨基酸序列組成的重鏈⑶R-2,和由SEQ ID N0:8的氨基酸序列組成的重鏈⑶R-3的重鏈可變區(qū)，和包含由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列 組成的輕鏈CDR-1，由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列組成的輕鏈CDR-2,和由SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列組成的輕鏈CDR-3的輕鏈可變區(qū)。
3. 權利要求1或2的藥物組合物，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合hAng-2,即SEQ ID NO: 518上的表位，所述表位包含選自F-469, Y-475和S-480的至少一個氨基酸。
4. 權利要求1-3任一項的藥物組合物，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合hAng-2上的 表位，所述表位包含氨基酸F-469, Y-475和S-480。
5. 權利要求1至4中任一項的藥物組合物，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段以如表面等 離子共振測定中測量的小于約80pM的KD結(jié)合hAng-2。
6. 權利要求1的藥物組合物，其還包含血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)拮抗劑。
7. 權利要求6的藥物組合物，其中所述VEG F拮抗劑選自抗VEGF抗體、VEGF受體的小 分子激酶抑制劑和VEGF抑制性融合蛋白。
8. 分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其用于制備用于治療患有下述疾病的患者的藥物： (a) 與血管發(fā)生相關的癌癥；或 (b) 與脈絡膜新生血管相關的眼??； 其中抗體或抗原結(jié)合片段當在表面等離子共振測定中檢測時特異性結(jié)合人血管生成 素-2(hAng-2)但不結(jié)合hAng-Ι，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段包含含有SEQ ID N0:18的 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)（HCVR)的三個互補決定區(qū)（⑶R)，和含有SEQ ID NO:20的氨基 酸序列的輕鏈可變區(qū)（LCVR)的三個CDR。
9. 權利要求8的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中抗體或抗原結(jié)合片段包含：包含由 SEQ ID N0:4的氨基酸序列組成的重鏈⑶R-1，由SEQ ID N0:6的氨基酸序列組成的重鏈 ⑶R-2,和由SEQ ID N0:8的氨基酸序列組成的重鏈⑶R-3的重鏈可變區(qū)，和包含由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R-1，由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R-2， 和由SEQ ID NO: 16的氨基酸序列組成的輕鏈⑶R-3的輕鏈可變區(qū)。
10. 權利要求8或9的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合 hAng-2,即SEQ ID N0:518上的表位，所述表位包含選自F-469, Y-475和S-480的至少一個 氨基酸。
11. 權利要求8-10任一項的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片 段結(jié)合hAng-2上的表位，所述表位包含氨基酸F-469, Y-475和S-480。
12.權利要求8-11任一項的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片 段以如表面等離子共振測定中測量的小于約80pM的KD結(jié)合hAng-2。
【文檔編號】A61P27/02GK104258390SQ201410475186
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2010年7月27日 優(yōu)先權日:2009年7月29日
【發(fā)明者】G·瑟斯頓, C·戴利 申請人:瑞澤恩制藥公司