嵌合的治療性抗-cd37抗體hh1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從小鼠單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明的應用包括治療用途，其中將包含本發(fā)明的抗體或其放射免疫綴合物的藥物組合物用于治療B-細胞惡性腫瘤。
【專利說明】嵌合的治療性抗-CD37抗體HH1

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有意外高細胞毒性的嵌合抗體或人源化抗體對血液癌癥的免疫療 法和放射免疫療法以及所述抗體的不同應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及嵌合的和人源化的抗-CD37抗體及其生產(chǎn)和應用。
[0003] 此外，本發(fā)明涉及基于B-細胞耗盡的免疫療法和放射免疫療法。
[0004] 具體地，本發(fā)明涉及用在這樣的療法中的抗-⑶37抗體分子，例如用于治療B細胞 惡性腫瘤和自身免疫病況。
[0005] 使用單克隆抗體（mAb)的免疫療法已經(jīng)作為用于治療癌癥和其它疾病的安全且 選擇性的方法而出現(xiàn)。
[0006] 具體地，由于利妥昔單抗（Rituximab，一種針對B-細胞表面上的⑶20抗原的抗 體）的引入，已經(jīng)擴大了單克隆抗體在基于B-細胞耗盡的療法中（例如在B-細胞惡性腫 瘤的治療中）的作用。
[0007] ⑶37抗原是一種尚未以與B-細胞抗原⑶20相同的程度被視作B細胞惡性腫瘤的 革巴標的細胞表面抗原。
[0008] CD37 (四次穿膜蛋白超家族的一個成員）是一種具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域和2個胞外 環(huán)的、高度糖基化的細胞表面分子。
[0009] 在正常的B-細胞、非霍奇金淋巴瘤（NHL)、包括套細胞淋巴瘤（MCL)、伯基特淋巴 瘤（BL)、小淋巴細胞性淋巴瘤（SLL)和濾泡淋巴瘤（FL)、邊緣帶淋巴瘤（MZL)、彌漫性大B 細胞性淋巴瘤（DLBCL)、成淋巴細胞性淋巴瘤（LL)和慢性淋巴樣白血?。–LL)中觀察到 CD37表達。
[0010] 該表達模式使得CD37成為抗體介導的癌癥治療的有吸引力的靶標。
[0011] ⑶37在1986年被首次描述，并通過鼠單克隆抗體MB-ι進行了表征（Link等 人，1986)。
[0012] ⑶37的生理學作用是未知的。
[0013] CD37特異性的mAb與癌細胞的結(jié)合可能觸發(fā)多種作用機制：首先，在所述抗體結(jié) 合CD37抗原的細胞外結(jié)構(gòu)域以后，它可以激活補體級聯(lián)和裂解靶細胞。
[0014] 其次，抗-CD37抗體可以介導對靶細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)，這發(fā)生在免疫系統(tǒng)的細胞毒性細胞上的適當受體識別結(jié)合的抗體的Fc部分以后。
[0015] 第三，所述抗體可以改變B-細胞的對抗原或其它刺激做出應答的能力。
[0016] 最后，抗-⑶37抗體可以引發(fā)程序性細胞死亡（細胞凋亡）。
[0017] 在2個放射免疫療法試驗中在B-NHL患者中評價了抗-⑶37mAb 細胞非 霍奇金淋巴瘤；Press等人，1989 ;Kaminski等人，1992)。
[0018] 其他人也已經(jīng)公開了表現(xiàn)出潛力的抗-⑶37mAB (例如Heider等人的 W02009/019312和本發(fā)明的發(fā)明人的W0 2011/092295)，但是在證實CD37就治療B-細胞惡 性腫瘤而言是CD20的理想替代物之前，仍然有很長的路。
[0019] 綜上所述，已經(jīng)證實，⑶37抗原經(jīng)常在幾種人B-細胞惡性腫瘤的腫瘤細胞上和在 成熟的正常B-淋巴細胞上表達，并且基于抗-⑶37的療法可以成為一種有前途的治療B細 胞惡性腫瘤的方案。
[0020] 盡管上述的抗-⑶37抗體或抗體樣分子（例如MB-ι)已經(jīng)表現(xiàn)出在B-細胞惡性腫 瘤中的抗腫瘤效力和靶向CD37的潛力，但是需要替代性的抗-CD37抗體來改善基于B-細 胞耗盡的療法。
[0021] 因此，在尋求針對B-細胞惡性腫瘤的新治療方法中，改進的抗-CD37抗體是有利 的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明的一個目的涉及從小鼠單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體。
[0023] 具體地，本發(fā)明的一個目的是，提供一種嵌合抗體或人源化抗體。
[0024] 本發(fā)明的一個方面涉及一種抗體分子，其結(jié)合人CD37,且其衍生自a)鼠單克隆抗 體或b)非人抗體，所述鼠單克隆抗體由i)包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的可變重 鏈和ii)包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的可變輕鏈定義，所述非人抗體識別與在a) 中定義的抗體相同的人CD37表位或識別與所述表位接近或重疊的表位；其中所述抗體分 子是嵌合抗體或人源化抗體。
[0025] 本發(fā)明的另一個方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的DNA分子。
[0026] 本發(fā)明的另一個方面涉及攜帶一種或多種編碼本發(fā)明的抗體的DNA分子的宿主 細胞。
[0027] 本發(fā)明的另一個方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，所述方法包括：用一種或多 種編碼本發(fā)明的抗體的載體轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細胞，培養(yǎng)所述宿主細胞，和回收并純化所 述抗體分子。
[0028] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種藥物組合物，其包含作為活性成分的一種或多種本 發(fā)明的抗體和藥學上可接受的載體。
[0029] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于治療B-細胞惡性腫瘤的藥物組合物。
[0030] 本發(fā)明的另一個方面涉及治療患有B-細胞惡性腫瘤的患者的方法，所述B-細胞 惡性腫瘤選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞白血病、 淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組，所述方法包括：給所述患者施用有效量的 本發(fā)明的藥物組合物。
[0031] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種結(jié)合人CD37的放射免疫綴合物，其包含a)本發(fā) 明的抗體、b)接頭和c)選自由以下組成的組的放射性核素： 211At、213Bi、212Bi、212Pb、 225Ac、 177Lu。
[0032] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種藥物組合物，其包含如上所述的放射免疫綴合物。
[0033] 本發(fā)明的另一個方面涉及用于治療B-細胞惡性腫瘤的如上所述的藥物，所述 B-細胞惡性腫瘤選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞白 血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組。
[0034] 本發(fā)明的另一個方面涉及用于治療B-細胞惡性腫瘤的方法，所述B-細胞惡性腫 瘤選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞白血病、淋巴漿 細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組，所述方法包括：施用有效量的本發(fā)明的藥物組合 物。
[0035] 本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于生產(chǎn)本發(fā)明的放射免疫綴合物的試劑盒，其包 含2個或更多個瓶，其中一個瓶含有綴合物，所述綴合物包含與本發(fā)明的抗體連接的螯合 齊U ;且第二個瓶含有放射性核素。
[0036] 另一個方面是，在使用放射性標記的鼠或嵌合HH1進行治療之前，使用嵌合抗體 封閉正常組織中的⑶37抗原。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1顯示了用于選通Daudi細胞的流式細胞術(shù)點圖以及關(guān)于 抗-⑶37chHHl. 1 (IgGl同種型）結(jié)合和抗-NIP抗體沒有結(jié)合（陰性對照）的直方圖。圖 1顯示了 chHHl的顯著抗原結(jié)合。
[0038] 圖2顯示了 chHHl. 1針對Daudi淋巴瘤細胞的細胞結(jié)合。它顯示了與靶標的快速 且有效的結(jié)合。
[0039] 圖3表明，chHHl具有與利妥昔單抗類似的ADCC，盡管在Daudi淋巴瘤靶細胞中存 在更少的抗原和顯著的⑶37內(nèi)化。
[0040] 圖4顯示了用IL-2刺激的PBMC作為效應細胞和用Rec-Ι細胞作為靶細胞以3種 不同的效應細胞/靶細胞比率的ADCC。3個個體的平均值和SD。
[0041] 圖5顯示了針對用鼠 HH1、利妥昔單抗、chHHl. 1或利妥昔單抗和chHHl. 1的組合 標記的Rec-Ι細胞，得自3個個體的10%血清的⑶C。
[0042] 圖6顯示了 125I-chHHl. 3在注射后24和48小時在雌性裸鼠中的生物分布（％ I. D. /g)。
[0043] 圖7顯示了用NK細胞作為效應細胞，ADCC在Daudi細胞中實現(xiàn)的特異性裂解百 分比。從2個個體采取血液，并用10個NK細胞/1個Daudi細胞的比率進行一個實驗，其 它實驗使用15:1比率。
[0044] 現(xiàn)在將在下面更詳細地描述本發(fā)明。

【具體實施方式】
[0045] 本發(fā)明涉及從小鼠單克隆抗體HH1衍生出的人源化抗體或嵌合抗體。
[0046] 人源化抗體或嵌合抗體是得自非人物種的抗體，其蛋白序列已經(jīng)被修飾以增加它 們與在人類中天然產(chǎn)生的抗體變體的相似性。
[0047] 經(jīng)常將"人源化"方法應用于為施用給人類而開發(fā)的單克隆抗體。
[0048] 當開發(fā)特異性抗體的過程涉及在非人免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生（諸如在小鼠中產(chǎn)生）時， 人源化可能是必要的。
[0049] 以此方式產(chǎn)生的抗體的蛋白序列與在人類中天然存在的同源抗體具有部分不同， 且因此當施用給人患者時可能具有免疫原性。
[0050] 并非為人類施用設計的所有單克隆抗體都需要人源化，因為許多療法是短期干 預。
[0051] 人源化經(jīng)常被視作不同于小鼠-人抗體嵌合體的產(chǎn)生。
[0052] 所以，盡管通常進行抗體嵌合體的產(chǎn)生來獲得更人-樣抗體（通過用得自人的Fc 區(qū)替換抗體的小鼠Fc區(qū)），這類簡單的嵌合體經(jīng)常不會被稱作人源化的。
[0053] 相反，人源化抗體的蛋白序列與人變體的蛋白序列基本上相同，盡管它的一些互 補性決定區(qū)（CDR)區(qū)段的非人起源負責該抗體的結(jié)合它的靶抗原的能力。
[0054] 但是，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語嵌合抗體和人源化抗體互換使用，用于表示已經(jīng) 經(jīng)過遺傳工程改造且從小鼠單克隆抗體HH1衍生出的抗體。
[0055] 從單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體
[0056] 免疫球蛋白重鏈（IgH)是抗體（免疫球蛋白）的大多肽亞基。
[0057] 典型的抗體由2個免疫球蛋白（Ig)重鏈和2個Ig輕鏈組成。
[0058] 存在幾種不同類型的重鏈，所述重鏈定義抗體的類別或同種型。
[0059] 這些重鏈類型在不同動物之間存在差異。
[0060] 免疫球蛋白輕鏈是抗體（免疫球蛋白）的小多肽亞基。
[0061] 在人類中存在2類輕鏈（如在其它哺乳動物中一樣）：由2號染色體上的免疫球 蛋白κ基因座編碼的kappa(K)鏈，和由22號染色體上的免疫球蛋白λ基因座編碼的 lambda ( λ )鏈。
[0062] Β淋巴細胞會產(chǎn)生抗體，每個Β淋巴細胞僅表達一類輕鏈。
[0063] 一旦確定后，輕鏈類別在Β淋巴細胞的壽命中保持固定。
[0064] 在健康的個體中，總κ/λ比率在血清中為大致2:1(測量完整的整個抗體）或 1:1. 5 (如果測量游離輕鏈），高趨異比指示腫瘤。
[0065] κ與λ的確切正常比率范圍為0.26-1. 65。
[0066] κ鏈和λ鏈可以成比例地增加，從而維持正常比率。
[0067] 從小鼠單克隆抗體ΗΗ1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體中的可變鏈和恒定鏈可 以不同于已知序列。
[0068] 這樣的變異的例子從本公開內(nèi)容顯而易見，且包括恒定鏈的選擇、可變鏈的遺傳 變異和Fc結(jié)構(gòu)域的變異，以便調(diào)節(jié)效應子功能。
[0069] 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)遺傳工程改造了從小鼠單克隆抗體HH1衍生出的嵌合人源 化抗體。
[0070] 這些抗體在B-細胞有關(guān)的惡性腫瘤的最佳治療的搜尋中表現(xiàn)出有前途的作用。
[0071] 在本公開內(nèi)容的實驗中證實了這些作用。
[0072] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及一種抗體分子，其結(jié)合人⑶37,且其衍生自a)鼠單 克隆抗體或b)非人抗體，所述鼠單克隆抗體由i)包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的 可變重鏈和ii)包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的可變輕鏈定義，所述非人抗體識別 與在a)中定義的抗體相同的人CD37表位或識別與所述表位接近或重疊的表位；其中所述 抗體分子是嵌合抗體或人源化抗體。
[0073] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌合抗體由以下鏈定義：
[0074] i)包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的可變重鏈，ii)包含SEQ ID N0:3所示 的氨基酸序列的可變輕鏈，iii)人起源的恒定重鏈和輕鏈。
[0075] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述嵌合抗體由以下鏈定義：i)選自由IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4鏈組成的組的恒定重鏈，和ii)作為κ或λ鏈的恒定輕鏈。
[0076] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，是如下定義的恒定重鏈：i)包含SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6和/或SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列，且其中所述恒定輕鏈ii)包含SEQ ID N0:9 所示的氨基酸序列。
[0077] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，是如下定義的恒定重鏈：i)包含SEQ ID N0:11和 /或SEQ ID N0:14所示的氨基酸序列，且其中所述恒定輕鏈ii)包含SEQ ID N0:13所示的 氨基酸序列。
[0078] 具有突變?nèi)L重鏈的DNA chHH1.3Fc序列可以被視作SEQ ID N0:10。
[0079] 具有突變?nèi)L輕鏈的氨基酸chHHl. 3Fc序列可以被視作SEQ ID NO: 11。
[0080] 具有突變?nèi)L重鏈的DNA chHHl. 3Fc序列可以被視作SEQ ID NO: 12。
[0081] 具有突變?nèi)L輕鏈的氨基酸chHHl. 3Fc序列可以被視作SEQ ID NO: 13。
[0082] 沒有突變（恒定區(qū)）的chHHl. 3Fc序列可以被視作SEQ ID NO: 14。
[0083] 編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子
[0084] 人源化過程利用以下事實：使用重組DNA來建立能夠在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中表 達的構(gòu)建體，可以完成單克隆抗體的生產(chǎn)。
[0085] 也就是說，將能夠生產(chǎn)抗體的基因區(qū)段分離，并克隆進可以在罐（tank)中生長的 細胞中，使得從克隆的基因的DNA產(chǎn)生的抗體蛋白可以被一起收獲。
[0086] 涉及重組DNA的步驟會提供可以被容易地利用來改變表達的抗體的蛋白序列的 干預點。
[0087] 因此，在人源化過程中實現(xiàn)的對抗體結(jié)構(gòu)的改變都通過在DNA水平的技術(shù)來實 現(xiàn)。
[0088] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及編碼本發(fā)明的人源化抗體或嵌合抗體的DNA分子。
[0089] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述DNA分子編碼可編碼本發(fā)明的人源化抗體或嵌 合抗體的可變重鏈的區(qū)域。
[0090] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，該可變重鏈編碼區(qū)與編碼人起源的恒定重鏈的區(qū) 域融合。
[0091] 這樣的人恒定重鏈可以選自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4組成的組。
[0092] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述IgGl是由SEQ ID NO:5、SEQ ID N0:6和/或 SEQ ID N0:7所示的序列編碼。
[0093] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述IgG3重鏈是由SEQ ID NO: 10所示的序列編碼。
[0094] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述IgG3輕鏈是由SEQ ID N0:12所示的序列編碼。
[0095] 在本發(fā)明的一個實施方案中，具有H435置換突變的IgG3是由SEQ ID N0:12所示 的序列編碼。
[0096] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，人恒定重鏈包含F(xiàn)c區(qū)中的一個或多個置換。
[0097] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種DNA分子，其包含編碼本發(fā)明的嵌合抗體或人 源化抗體的可變輕鏈的區(qū)域。
[0098] 這樣的可變輕鏈編碼區(qū)域可以與編碼人起源的恒定輕鏈的區(qū)域融合。
[0099] 所述恒定輕鏈可以是κ或λ鏈。
[0100] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述K輕鏈是由SEQ ID N0:9所示的序列編碼。
[0101] 可以為在靶細胞中表達而構(gòu)建和優(yōu)化所述DNA分子。
[0102] 表達載體（或者被稱作表達構(gòu)建體）通常是用于將特定基因（在本發(fā)明的上下文 中，本發(fā)明的DNA分子）引入靶細胞中的質(zhì)粒。
[0103] 一旦表達載體處于細胞中，通過細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機器核糖體復合物來生產(chǎn)由該 基因編碼的蛋白。
[0104] 經(jīng)常將質(zhì)粒工程改造成含有調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列充當增強子和啟動子區(qū)域并 導致在表達載體上攜帶的基因的有效轉(zhuǎn)錄。
[0105] 精心設計的表達載體的目的是，生產(chǎn)大量穩(wěn)定的信使RNA，并因此生產(chǎn)蛋白。
[0106] 表達載體是生物技術(shù)和對于特定疾病（如糖尿?。┑尼t(yī)學治療而言重要的蛋白 (諸如胰島素）的生產(chǎn)的基礎工具。
[0107] 在表達基因產(chǎn)物以后，需要純化蛋白；但是由于將載體引入宿主細胞中，應當從宿 王細胞的蛋白中純化出目標蛋白。
[0108] 因此，為了使純化過程容易，克隆的基因應當具有標簽。該標簽可以是組氨酸 (His)標簽或任意其它標志物肽。
[0109] 因而，本發(fā)明的一個方面因此涉及包含如上所述的DNA分子的表達載體。
[0110] 包含并表達本發(fā)明的抗體的細胞
[0111] 可以將上述的DNA分子或表達載體引入宿主細胞中。
[0112] 這樣的細胞可以通過雜交瘤技術(shù)變成生產(chǎn)嵌合抗體或人源化抗體的永生化細胞。
[0113] 雜交瘤技術(shù)是如下形成雜交細胞系（被稱作雜交瘤）的技術(shù)：將生產(chǎn)特異性抗體 的B細胞與骨髓瘤（B細胞癌）細胞融合，選擇能在組織培養(yǎng)物中生長和不存在抗體鏈合成 的骨髓瘤（B細胞癌）細胞。
[0114] 由雜交瘤產(chǎn)生的抗體都具有單一特異性，且因此是單克隆抗體（與多克隆抗體形 成對照）。
[0115] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及一種宿主細胞，其攜帶本發(fā)明的一種或多種載體或 DNA分子。
[0116] 本發(fā)明的一個實施方案涉及一種宿主細胞，其攜帶：包含編碼HH1的可變重鏈的 DNA分子的表達載體，和包含編碼本發(fā)明的可變輕鏈的DNA分子的第二表達載體。
[0117] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
[0118] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述細胞是雜交瘤細胞。
[0119] 用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法
[0120] 本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體可以通過幾種方法來生產(chǎn)。
[0121] 一種用于生產(chǎn)這樣的抗體的方法包括：用本發(fā)明的一種或多種載體轉(zhuǎn)染哺乳動物 宿主細胞，培養(yǎng)所述宿主細胞，和回收并純化所述抗體分子。
[0122] 另一種用于生產(chǎn)這樣的抗體的方法包括：構(gòu)建產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗 體的雜交瘤細胞。
[0123] 序列同一性
[0124] 如通常定義的，"同一性"在本文中被定義為分別在核苷酸或氨基酸水平的基因或 蛋白之間的序列同一性。
[0125] 因而，在本發(fā)明的上下文中，"序列同一性"是蛋白之間在氨基酸水平的同一性量 度和核酸之間在核苷酸水平的同一'丨生量度。
[0126] 通過在比對多個序列時對比每個序列中的給定位置的氨基酸序列，可以確定蛋白 序列同一性。
[0127] 類似地，通過在比對多個序列時對比每個序列中的給定位置的核苷酸序列，可以 確定核酸序列同一性。
[0128] 為了確定兩個核酸序列或兩個氨基酸的同一性百分比，出于最佳對比目的對所述 序列進行比對（例如，可以在第一個氨基酸序列或核酸序列中引入缺口，以便與第二個氨 基酸或核酸序列最佳比對）。接著對比相應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核 苷酸。
[0129] 當占據(jù)第一個序列中的某一位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二個序列中相應位 置的氨基酸殘基或核苷酸相同時，則所述分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性 百分比是所述序列所共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)（即，同一性百分比=相同位置的數(shù)目 /位置（例如重疊的位置）的總數(shù)X100)。在一個實施方案中，所述兩個序列是相同長度。
[0130] 可以手工比對所述序列，并且計數(shù)相同核酸或氨基酸的數(shù)目?？商鎿Q地，使用數(shù)學 算法可以比對兩個序列，以確定同一性百分比。這樣的算法被并入NBLAST和XBLAST程序 中。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序（總分=100,字長=12)進行，以得到與本發(fā)明 的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可以用XBLAST程序（總分=50,字長=3) 進行，以得到與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。
[0131] 為了進行帶缺口的比對以達到對比目的，可以利用Gapped BLAST?？商鎿Q地，可以 使用PSI-Blast來進行迭代檢索，其檢測多個分子之間的遠緣關(guān)系。當利用NBLAST、XBLAST 和Gapped BLAST程序時，可以使用各種程序的默認參數(shù)。參見http://www. ncbi. nlm. nih. gov?？商鎿Q地，在已經(jīng)比對多個序列之后，例如通過EMBL數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序（www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST)，可以計算序列同一性。
[0132] 通常，可以使用關(guān)于例如"評分矩陣"和"缺口罰分"的默認設置來進行比對。在 本發(fā)明的上下文中，BLASTN和PSI BLAST默認設置可為有益的。
[0133] 在允許缺口或不允許缺口的情況下，使用與上文所述類似的技術(shù)可以確定兩個序 列之間的同一性百分比。在計算同一性百分比時，只對精確匹配計數(shù)。
[0134] 本發(fā)明的一個實施方案涉及一種分離的核酸，其包含與HH1抗體VH序列（SEQ ID N0:2)和/或VL序列（SEQ ID N0:4)具有80%序列同一性的核酸序列。
[0135] 本發(fā)明的一個實施方案涉及一種分離的核酸，包含具有HH1抗體VH序列（SEQ ID NO: 2)和/或VL序列（SEQ ID NO:4)的核酸序列。
[0136] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分離的核酸包含與HH1抗體VH序列（SEQ ID NO:2)和/或VL序列（SEQ ID NO:4)具有至少90%序列同一性（諸如90%同一性、91 %同 一性、92%同一性、93%同一性、94%同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同 一性或99 %同一性）的核酸序列。
[0137] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種抗體，其包含與HH1抗體VH序列（SEQ ID NO: 1)和/或VL序列（SEQ ID N0:3)具有80%序列同一性的多肽序列。
[0138] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種抗體，其包含具有HH1抗體VH序列（SEQ ID N0:1)和/或VL序列（SEQ ID N0:3)的多肽序列。
[0139] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述抗體包含與HH1抗體VH序列（SEQ ID NO: 1) 和/或VL序列（SEQ ID NO:3)具有至少90%序列同一性（諸如90%同一性、91 %同一性、 92 %同一性、93 %同一性、94 %同一性、95 %同一性、96 %同一性、97 %同一性、98 %同一性 或99%同一性）的多肽序列。
[0140] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，這些抗體是從單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗 體或人源化抗體。
[0141] 遺傳變異
[0142] 遺傳變異是由基因中核苷酸的堿基次序的變異造成。該變異造成所述基因的突 變，隨后造成所述基因所編碼的蛋白的突變。
[0143] 這些突變可以是有義突變或錯義突變，或者是置換。
[0144] 本發(fā)明的一個實施方案涉及HH1單克隆抗體VH鏈（SEQ ID N0:2)和/或VL鏈 (SEQ ID N0:4)的分離的核酸序列，其包含至少50個（諸如20個，諸如10個，諸如5個，諸 如4個，諸如3個，諸如2個，諸如1個）有義突變。
[0145] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及HH1單克隆抗體VH鏈（SEQ ID N0:2)和/或VL鏈 (SEQ ID N0:4)的分離的核酸序列，其包含0-50個（諸如1-50個，諸如0-20個，諸如1-20 個，諸如0-10個，諸如1-10個，諸如0-5個，諸如1-5個，諸如3個，諸如1個）有義突變。
[0146] 錯義突變（一類非同義突變）是一種點突變，其中單個核苷酸發(fā)生改變，從而產(chǎn)生 編碼不同氨基酸的密碼子（將一種氨基酸變?yōu)橐粋€終止密碼子的突變被認為是無義突變， 而不是錯義突變）。錯義突變可以使所得到的蛋白沒有功能。
[0147] 但是，并非所有的錯義突變都會導致可觀的蛋白變化。一個氨基酸可以用具有非 常類似的化學特性的氨基酸替代，在這種情況下，蛋白仍可以正常起作用；這被稱為中性、 "安靜（quiet)"或保守突變。
[0148] 可替換地，可以在蛋白的不會顯著影響蛋白二級結(jié)構(gòu)或功能的區(qū)域中進行氨基酸 置換。當一個氨基酸可以由超過一個密碼子編碼（所謂的"簡并編碼"）時，密碼子中的突 變可能不會在翻譯中產(chǎn)生任何變化；這種突變可以是同義突變（一種沉默突變形式），而不 是錯義突變。
[0149] 本發(fā)明的一個實施方案涉及一種抗體，其包含HH1單克隆抗體VH鏈（SEQ ID NO: 2)和/或VL鏈（SEQ ID NO: 4)的多肽序列，該多肽序列包含至少50個（諸如20個，諸 如10個，諸如5個，諸如4個，諸如3個，諸如2個，諸如1個）錯義突變。
[0150] 本發(fā)明的一個實施方案涉及一種抗體，其包含HH1單克隆抗體VH鏈（SEQ ID NO: 2)和/或VL鏈（SEQ ID NO: 4)的多肽序列，該多肽序列包含0-50個（諸如1-50個，諸 如0-20個，諸如1-20個，諸如0-10個，諸如1-10個，諸如0-5個，諸如1-5個，諸如3個， 諸如1個）錯義突變。
[0151] 保守置換是用另一個具有通常類似特性的氨基酸置換一個氨基酸，使得整體功能 性可能不受明顯影響。
[0152] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述錯義突變是保守突變或置換。
[0153] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及分離的核酸序列或多肽序列，其與HH1的可變重鏈 (SEQ ID N0:1)和/或可變輕鏈（SEQ ID N0:3)序列具有80%序列同一性，其中所述序列 變異是保守置換。
[0154] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述序列同一性是80%同一性，諸如90%同一 性、91 %同一性、92%同一性、93 %同一性、94%同一性、95 %同一性、96 %同一性、97%同一 性、98%同一性或99%同一性，且所述序列變異是保守置換。
[0155] 為了改善放射性標記步驟，可能有益的是，將額外的賴氨酸引入例如本發(fā)明的嵌 合抗體或人源化抗體的Fc部分中。
[0156] 這可以減小將結(jié)合賴氨酸的螯合劑連接到該抗體的抗原結(jié)合位點中的概率，由此 降低在放射性標記過程中損害免疫反應性的風險。
[0157] 用于將賴氨酸引入例如HH1的Fc部分中的方法是本領域已知的，例如從Hemminki 等人，1995已知。
[0158] 本發(fā)明的一個實施方案涉及本發(fā)明的放射免疫綴合物，該放射免疫綴合物已在 HH1的Fc部分中用10個Lys (諸如8個Lys，諸如6個Lys，諸如5個Lys，諸如4個Lys，諸 如3個Lys，諸如2個Lys，諸如1個Lys)修飾。
[0159] 可以選擇本發(fā)明的抗體的Fc部分的其它變異，以便優(yōu)化或調(diào)節(jié)一種或多種效應 子功能。
[0160] 例如做出這些效應子功能的調(diào)節(jié)，以增加抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)。
[0161] Fc部分的這樣的變異是本領域已知的。
[0162] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及這樣的本發(fā)明的抗體：其在Fc結(jié)構(gòu)域中具有調(diào)節(jié)一 種或多種效應子功能的一種或多種突變。
[0163] 免疫綴合物
[0164] 免疫綴合物是與第二分子（經(jīng)常是毒素、放射性同位素或標記）綴合（結(jié)合）的 抗體。
[0165] 這樣的嵌合的和人源化的HH1的免疫綴合物是本發(fā)明的所有方面。
[0166] 一種類型是與螯合接頭連接或結(jié)合的本發(fā)明的嵌合的和人源化的HH1。
[0167] 在下面的關(guān)于放射免疫綴合物的部分中討論了螯合接頭，因此其中描述的螯合接 頭都被認為可用于免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與螯合接頭連接或結(jié)合的本發(fā)明的嵌 合的和人源化的HH1。
[0168] 放射免疫綴合物
[0169] 本發(fā)明的一個方面涉及一種結(jié)合人CD37的放射免疫綴合物，其包含根據(jù)本發(fā)明 從單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體、接頭和選自由 211At、213Bi、212Bi、212Pb、 225Ac>227Th>90Y>186Re>188 Re>199Au>194Ir>166H〇>159 Gd>153Sm>149pm>142pr>lll Ag>109pdJ7As>67Cu>47 Sc 和177Lu組成的組的放射性核素。
[0170] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述接頭是螯合接頭。
[0171] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述放射性核素選自由mLu、225Ac、 227Th和9°Y組成 的組。
[0172] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述放射性核素是177Lu。
[0173] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述放射性核素是212Pb。
[0174] 在另一個實施方案中，所述放射性核素是另一種β -發(fā)射體或α -發(fā)射體。
[0175] 可以如下將放射性核素連接至抗體：首先使雙功能螯合劑例如p-SCN-bn_D0TA(M acrocyclics, Tx, USA)與抗體反應，隨后純化以除去未綴合的螯合劑，然后使螯合劑抗體綴 合物與放射性核素反應，隨后純化以除去任何未綴合的放射性核素。
[0176] 可替換地，可以首先組合螯合劑和放射性核素，隨后與抗體綴合。
[0177] 螯合接頭（如，例如，p-SCN-bn-DOTA)可以用于將其它金屬放射性核素以與對于 mLu所述類似的方式綴合至HH1衍生的抗體。
[0178] 可以使用具有足夠的復合能力以及允許與蛋白或肽直接或間接綴合的官能團的 任何類型的接頭。
[0179] 這樣的接頭的例子描述于文獻中（例如Brechbiel，2008 ;Liu，2008)。一些有用 的例子是雙官能的環(huán)狀螯合劑，如P-SCN-bn-DOTA、D0TA-NHS-酯、p-SCN-Bn-TCMC ;雙官能 的直鏈螯合劑，如 p-SCN-Bn-DTPA 和 CHX-A" -DTPA。
[0180] 優(yōu)選通過使用雙官能螯合劑將本發(fā)明中的放射性核素與靶向分子綴合。
[0181] 這些可以是環(huán)狀、線性或支鏈螯合劑。特別應提到的是聚氨基聚酸螯合劑，其包含 線性、環(huán)狀或分支的聚氮雜烷烴主鏈，其中多個酸性（例如，羧基烷基）基團連接在主鏈氮 上。
[0182] 合適的螯合劑的例子包括：D0TA衍生物諸如對異硫氰?；S基-1，4, 7, 10-四 氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（p-SCN-Bz-DOTA)或S-2-(4-異硫氰?；S 基）-1，4, 7, 10-四（2-氨甲?；谆┉h(huán)十二烷，和DTPA衍生物諸如對異硫氰?；S 基-二亞乙基三胺五乙酸（p-SCN-Bz-DTPA)，前者是環(huán)狀螯合劑，后者是線性螯合劑。
[0183] 可以在復合部分與靶向部分綴合之前或之后進行復合部分的金屬化。
[0184] 如果在進行放射性標記之前將螯合劑與抗體綴合，則放射性標記程序?qū)⒁话阍谒?用時間等方面更方便。
[0185] 使用與抗體連接的螯合劑來制備放射性標記的綴合物的原理更寬泛地描述在例 如 Liu, 2008 中。
[0186] 因此，可以使用HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體來制備具有不同輻射性能和 有效半衰期的放射免疫綴合物。
[0187] 例如，可以制備抗-CD37放射免疫綴合物并將其用于制備藥物制劑和用在治療用 途中，所述抗-CD37放射免疫綴合物由根據(jù)本發(fā)明從單克隆抗體HH1衍生出的嵌合抗體或 人源化抗體、螯合接頭和發(fā)射β或α的放射性核素組成，所述放射性核素包括、但不限 于 177Lu、211At、213Bi、212Bi、 212Pb、225AC、227Th、9°Y、 186Re、188Re、199Au、 194Ir、166l 142Pr、inAg、109Pd、77A S、67Cu、47SC。
[0188] 免疫毒素
[0189] 免疫毒素是由與毒素連接的靶向部分組成的人造蛋白。當?shù)鞍捉Y(jié)合細胞時，它通 過胞吞作用被攝入，毒素殺死所述細胞。
[0190] 它們經(jīng)常被用于治療某些種類的癌癥和少數(shù)病毒感染。
[0191] 這些蛋白經(jīng)常由與毒素片段連接的經(jīng)修飾的抗體或抗體片段制成。
[0192] 靶向部分由抗體的靶向特定細胞類型的Fv部分組成。
[0193] 所述毒素經(jīng)常是從細菌或植物蛋白衍生出的細胞毒性蛋白，從所述細菌或植物蛋 白已經(jīng)除去天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使得Fv將毒素導向靶細胞上的抗原。
[0194] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述毒素是化療分子，包括、但不限于烷化劑（順 鉬、卡鉬、奧沙利鉬、氮芥、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺）、抗代謝藥（硫唑嘌呤、巰 噪呤、啼陡）、生物堿（長春新堿、長春堿、長春瑞濱（cinorelbine)、長春地辛、紫杉醇、 多西他賽、依托泊苷、替尼泊苷）、拓撲異構(gòu)酶抑制劑（伊立替康、托泊替康、偶氮絲氨酸 (amascrine)、依托泊苷、替尼泊苷）和細胞毒性的抗生素（放線菌素、多柔比星、柔紅霉素、 calrubicin、伊達比星、表柔比星、博來霉素、普卡霉素、絲裂霉素）。
[0195] 在本發(fā)明的一個實施方案中，經(jīng)由交聯(lián)劑SMCC-酰肼（4-[N_馬來酰亞胺基甲基] 環(huán)己烷-1羧基酰肼）將多柔比星綴合至抗體。
[0196] 免疫毒素如下起作用：抗體（或其它靶向部分）結(jié)合靶細胞上的抗原，隨后毒素進 入細胞并殺死細胞。
[0197] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及包含本發(fā)明的抗體或其片段的免疫毒素。
[0198] 藥物組合物
[0199] 經(jīng)常應用配制在藥物組合物中的抗體來治療疾病。
[0200] 這樣的組合物針對諸如生理耐受性和貯存期限等參數(shù)進行了優(yōu)化。
[0201] 因而，本發(fā)明一個方面涉及藥物組合物，其包含作為活性成分的本發(fā)明的一種或 多種抗-CD37抗體分子（即從HH1衍生出的嵌合抗體或人源化抗體或其片段）和藥學上可 接受的載體。
[0202] 本發(fā)明的一個實施方案涉及如上所述的藥物組合物，其還包含一種或多種額外治 療劑。
[0203] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述一種或多種額外治療劑選自祀向B-細胞抗原 而不是⑶37的藥劑。
[0204] 這樣的抗原可以是B-細胞抗原⑶20。
[0205] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述一種或多種額外治療劑選自誘導細胞凋亡的 藥劑。
[0206] 通常將基于嵌合的或人源化的HH1的放射免疫治療產(chǎn)品提供為藥物組合物，其由 根據(jù)以上描述經(jīng)由螯合劑與溶解在緩沖溶液中的嵌合抗體或人源化抗體HH1連接的放射 性核素組成，這在很大程度上保持放射免疫綴合物的化學完整性，并且就輸注進患者中而 言是生理上可接受的。
[0207] 因而，本發(fā)明的一個方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的放射免疫綴合物 和藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
[0208] 可接受的藥用載體包括、但不限于：無毒的緩沖劑、填充劑、等滲溶液等。更具體 地，所述藥用載體可以是、但不限于：生理鹽水（0.9% )、半生理鹽水、林格氏乳酸鹽、5%右 旋糖、3. 3%右旋糖/0.3%鹽水。生理上可接受的載體可以含有放射分解的穩(wěn)定劑（例如， 抗壞血酸），其在貯存和運輸期間保護放射性藥物的完整性。
[0209] 本發(fā)明的一個實施方案包含本發(fā)明的藥物組合物和一種或多種額外的抗體或放 射免疫綴合物?？贵w包括、但不限于：利妥昔單抗、依帕珠單抗（Epratuzumab)、L19、F8、 F16、加利昔單抗（Galiximab)、托利珠單抗（Toralizumab)、阿侖珠單抗（Alemtuzumab)、奧 法木單抗（Ofatumumab)、維妥珠單抗（Veltuzumab)、阿托珠單抗（Afutuzumab)、托西莫單 抗（Tositumomab)、Reditux、替伊莫單抗（Ibritumomab)、K7153A、37. 1 和 HH1。
[0210] 放射免疫綴合物包括、但不限于：澤娃靈（Zevalin)、Bexxar和Betalutin。
[0211] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，一種或多種額外的抗體或放射免疫綴合物靶向 CD20?？贵w包括、但不限于：利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、阿托珠單抗、托西莫單 抗、Reditux和替伊莫單抗。放射免疫綴合物包括、但不限于：澤娃靈和Bexxar。
[0212] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及本發(fā)明的藥物組合物，其用于治療表達⑶37抗原 的B-細胞惡性腫瘤細胞。
[0213] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物被用于治療選自由B-細胞非霍奇 金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞白血病、小成淋巴細胞性淋巴瘤和多發(fā)性 骨髓瘤組成的組的B-細胞惡性腫瘤。
[0214] 治療
[0215] 根據(jù)本發(fā)明的藥物溶液的治療用途可以是用于治療表達CD37抗原的惡性腫瘤細 胞，包括、但不限于選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛細胞 白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組的B-細胞惡性腫瘤。
[0216] 其它用途可以是治療自身免疫疾病和治療移植相關(guān)的效應。
[0217] 所述療法可以基于、但不限于：β -顆粒-輻射或α -顆粒-輻射或這些的組合。
[0218] 所述療法可以作為單一療法施用，或者與其它療法、優(yōu)選標準治療方法聯(lián)合 施用。這樣的其它療法可以是預處理、外科手術(shù)、化學療法（包括多柔比星、長春堿和 吉西他濱（gemcitabine))、免疫療法、光動力學療法、蛋白酶體抑制劑（包括硼替佐 米（bortezomib))、組蛋白脫乙酰酶抑制劑（包括伏林司他（vorinostat)和辛二酰苯 胺異羥肟酸）、維生素 D3和維生素 D3類似物、細胞周期檢驗點抑制劑（包括UCN-01和 2-(4-(4-氯苯氧基）苯基）-1Η-苯并咪唑-5-甲酰胺）、低氧細胞放射敏化劑（包括 甲硝唑（metronidazole)和米索硝唑（misonidazole))、細胞凋亡誘導物（包括醉爺素 A(withaferin A))放射敏化劑、放射免疫療法或這些中2種或更多種的組合。
[0219] 施用是指靜脈內(nèi)輸注或靜脈內(nèi)注射。更具體地，本發(fā)明的放射免疫綴合物可以通 過連接到滴注器的周圍插管直接施用進靜脈中，所述滴注器防止空氣栓塞并且允許估測進 入患者體內(nèi)的流速。
[0220] 在一個實施方案中，可以以重復方式施用所述放射免疫綴合物。
[0221] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以以重復方式，但是用不同的放射性核素施用 放射免疫綴合物，例如，可以在β-放射免疫療法之后進行α-放射免疫療法，或反之亦然。
[0222] 本發(fā)明的一個方面涉及本發(fā)明的放射免疫綴合物用于治療Β細胞惡性腫瘤的用 途。
[0223] 本發(fā)明的一個實施方案涉及與其它療法聯(lián)合施用或在其它療法基礎上額外施用 的本發(fā)明的放射免疫綴合物的用途。
[0224] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述其它療法選自預處理、化學療法、單克隆抗體療 法、外科手術(shù)、放射療法和/或光動力學療法。
[0225] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述其它療法是骨髓移植或干細胞移植和/或療 法。
[0226] 本發(fā)明的另一個實施方案包含，使用抗-CD20和/或抗-CD37單克隆抗體進行治 療預處理，然后用本發(fā)明的放射免疫綴合物治療。
[0227] 在本發(fā)明的一個實施方案中，如下進行預處理：施用本發(fā)明的嵌合抗體，隨后用 HH1的嵌合抗體的放射免疫綴合物或抗體HH1的放射免疫綴合物進行治療。
[0228] 本發(fā)明的一個方面涉及用于治療選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋 巴細胞白血病、多毛細胞白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組的B-細胞 惡性腫瘤的方法，所述方法包括：施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
[0229] 在本發(fā)明的一個實施方案中，在體外或離體執(zhí)行本發(fā)明的應用和治療方法。
[0230] 在本發(fā)明的一個實施方案中，抗體劑量是l-1000mg/患者，更優(yōu)選5_50mg/患者， 且 177Lu 量為 l_200MBq/kg，更優(yōu)選 10-100MBq/kg 體重。
[0231] 包含本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體的本發(fā)明的藥物組合物可以用于耗盡在它 們的表面上表達⑶37的B細胞。
[0232] 這樣的藥物組合物可以用于治療B-細胞惡性腫瘤。
[0233] 這些B-細胞惡性腫瘤可以選自：B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白 血病、多毛細胞白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
[0234] 本發(fā)明的一個實施方案涉及包含本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體的藥物組合物， 其用于治療在它們的病理學中涉及B-細胞的自身免疫疾病或炎性疾病。
[0235] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及從細胞群體中耗盡表達CD37的B-細胞的方法，所 述方法包括：給所述細胞群體施用本發(fā)明的抗體分子或含有這樣的抗體分子的藥物組合 物。
[0236] 本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于治療患者的方法，所述患者患有選自由B-細 胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤組成的組的B-細胞惡性 腫瘤，所述方法包括：給所述患者施用有效量的包含本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體的藥 物組合物。
[0237] 在一個特定實施方案中，在用放射性標記形式或免疫毒素形式的鼠嵌合的或人源 化的HH1治療之前，將嵌合的或人源化的HH1施用給患者，以封閉正常組織細胞和改善腫瘤 攝取。
[0238] 所述劑量應當足以阻斷正常組織攝取，但是沒有過量，因為這會減少腫瘤攝取。例 如，應當以0. 5mg-lg/患者的劑量施用嵌合的或人源化的HH1。
[0239] 例如，可以在施用放射免疫綴合物之前1周和/或1-5小時施用它。
[0240] 試劑盒
[0241] 本發(fā)明的一個方面涉及一種用于制備本發(fā)明的放射免疫綴合物的試劑盒，其包含 兩個或更多個瓶，其中一個瓶含有綴合物，該綴合物包含與鼠單克隆抗體HH1連接的螯合 齊U ;并且第二個瓶含有放射性核素。
[0242] 試劑盒可能需要進行一些程序，例如在輸注之前進行放射性標記和/或純化。
[0243] 本發(fā)明的一個實施方案涉及本發(fā)明的試劑盒，其中一個或幾個瓶的內(nèi)容物是凍干 的或呈溶液形式。
[0244] 通過將兩個瓶的內(nèi)容物混合以產(chǎn)生放射免疫綴合物，將得到最終產(chǎn)物。因而，在本 發(fā)明的另一個實施方案中，通過將兩個瓶的內(nèi)容物混合來產(chǎn)生放射免疫綴合物。
[0245] 該產(chǎn)物可能需要在使用前進行純化。
[0246] 應當指出，在本發(fā)明的一個方面的背景下描述的實施方案和特征也適用于本發(fā)明 的其它方面。
[0247] 在本申請中引用的所有專利和非專利參考文獻特此通過引用整體并入。
[0248] 現(xiàn)在將在下述非限制性實施例中更詳細地描述本發(fā)明。
[0249] 實施例
[0250] 實施例1嵌合抗體的制備
[0251] 使用V-區(qū)域基因的表達載體，制備嵌合形式的HH1抗體。
[0252] 該載體接受通過RT-PCR得到的VH和VL鏈基因。
[0253] 然后將V-基因測序，并設計新的特異性引物來擴增V-基因，然后將它們克隆進含 有人IgG抗體恒定區(qū)基因 （C γ 3、C γ 1和CH1 γ 3)的pLN0H2載體中。
[0254] 在 SEQ ID N0.8 中顯示了包括恒定區(qū) IgGlCHl(SEQ ID N0.5)、IgGlCH2(SEQ ID NO. 6)、IgGlCH3 (SEQ ID NO. 7)的 pLN0H2 載體。
[0255] 將載體pLN0H2 (SEQ ID NO. 5)和pLNO κ的重鏈和輕鏈組合，以制備組合載體 PLN0H2 γ 1/ κ a CD37。將整個輕鏈基因 （SEQ ID N0:9)、CMV 啟動子和 pLNO κ a CD37 的聚 腺苷酸信號亞克隆到pLN0H2hIgGl α⑶37上。
[0256] 在組合載體中，從它們自己的CMV啟動子表達重鏈和輕鏈。
[0257] 恒定結(jié)構(gòu)域的鑒別
[0258] 從MGT數(shù)據(jù)庫中的人IgGl的序列（登錄號：Ζ17370)，鑒別出pLN0H2序列中的恒 定結(jié)構(gòu)域。
[0259] chHHl抗-⑶37抗體的可變區(qū)的基因和蛋白序列如下：
[0260] VHa CD37(氨基酸序列：SEQ ID N0:1 和核酸序列：SEQ ID N0:2)
[0261] 核酸序列（SEQ ID NO :2):
[0262] gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggtatcctgcaag gcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattgg atatattgatccttacaatggtgatactacctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagt cctccagcacagccttcatccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct tatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
[0263] 氨基酸序列（SEQ ID NO :1):
[0264] EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGKSLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAFIHLNSLTSEDSAVYYCARSPYGHYAMDYWGQGTSVTVSS
[0265] VL a CD37(氨基酸序列：SEQ ID NO :3 和核酸序列：SEQ ID NO :4)
[0266] 核酸序列（SEQ ID NO :4):
[0267] gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctg caaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaaccaggacaatctcctaaactactgatt aactgggcatccacccggcacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctc accatcagcagtatgcaggctgaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttc ggctcggggacaaagttggaaataaaa
[0268] 氨基酸序列（SEQ ID NO :3):
[0269] DIVMTQSHKLLSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVDWYQQKPGQSPKLLINWASTRHTGVPDRFTGSGSGT DYTLTISSMQAEDLALYYCRQHYSTPFTFGSGTKLEIK
[0270] 實施例2用于評價抗原結(jié)合的流式細胞術(shù)
[0271] hchlgGl α a CD37b (chHHl)與表達 CD37 的 Daudi 細胞的結(jié)合分析
[0272] 將細胞染色并固定。
[0273] 通過流式細胞術(shù)，分析構(gòu)建的chHHl的靶標結(jié)合。Daudi細胞表達CD37,用chHHl 或hlgGl a NIP對細胞進行染色。在左圖中，選擇完整的Daudi細胞，在右圖中顯示了這些 染色的細胞的熒光直方圖。chHHl結(jié)合表達CD37的Daudi細胞（實線），而嵌合的α NIP IgGi沒有結(jié)合（虛線）。
[0274] 實施例3嵌合HH1的放射性標記
[0275] 碘化：根據(jù)生產(chǎn)商的描述，使用I0D0GEN預包被的碘化試管 (Pierce, Rockford, IL)，通過間接碘化法用1251對抗體進行標記。
[0276] 用mIn和mLu進行標記：首先使抗體與螯合劑（p-SCN-Bn-DTPA或 p-SCN-Bn-DOTA)反應。
[0277] 將DTPA或D0TA螯合劑溶解于0. 05M HC1中，隨后加到抗體中，通過用碳酸鹽緩沖 液按5:1的比率洗滌，將pH調(diào)到大約8.5。然后再次檢查pH，并且在必要時進行調(diào)節(jié)。將 該溶液在室溫下振蕩60分鐘，然后通過加入50 μ 1 200mM甘氨酸溶液（每mg抗體）來終 止反應。
[0278] 為了除去游離的螯合劑，用PBS(PAA)將經(jīng)過綴合的抗體洗滌4-5次，然后通過用 乙酸銨洗漆調(diào)至 pH 5。然后將 mIn 或 mLu(Perkin Elmer，Boston，Ma，USA)加到0·5mg DOTA-Ab中，并在42°C振蕩1小時。
[0279] 最后，通過在凝膠過濾柱（例如，S印hadex G_25PD10(GE health)或類似柱）上 洗脫來純化產(chǎn)物?？倶擞洰a(chǎn)率在17%到63%之間變動。
[0280] 使用淋巴瘤細胞和經(jīng)改進的Lindmo法來測量放射免疫綴合物的質(zhì)量（實施例4)。
[0281] 實施例4免疫反應性
[0282] 背景：使用免疫反應性分析來測量抗體的結(jié)合抗原陽性的靶細胞的能力。
[0283] 方法：使用2組平行的在大約0. 3ml中的500萬、1000萬、4000萬、1億或3億個 細胞/ml。
[0284] 給一半試管加入未標記的抗體至0. 5mg/ml的濃度，并孵育15min以封閉抗原。
[0285] 此后，將5_20ng/ml放射免疫綴合物加入到所有試管中，并使用振蕩器將混懸液 在4°C孵育大約2小時。
[0286] 此后將試管離心，并取出上清液和儲存用于計數(shù)。將細胞沉淀物（pellet)再懸浮 于lml PBS中并離心。將該洗滌程序重復2次，并合并上清液。在γ計數(shù)器上計數(shù)含有細 胞沉淀物或合并的上清液的試管。
[0287] 使用以下指標計算特異性結(jié)合活性：未封閉的細胞沉淀物計數(shù)（PCN)、合并的上 清液計數(shù)（CSC)和每個樣品的總應用量（TA)。如下計算特異性結(jié)合（SB) :(PCN/TA)_封閉 的（PCN/TA) = SB。
[0288] 為每種細胞濃度計算SB值，并繪制在雙倒數(shù)圖中，并根據(jù)Lindmo等人（JImmunol Methods. 1984年8月3日；72(1) :77-89)確定在無窮抗原接近時的免疫反應級分。
[0289] 結(jié)果：兩批mLu_標記的嵌合HH1的測量結(jié)果分別給出48. 1 %和84. 5%的免疫反 應性。一批1251_標記的嵌合HH1給出67. 6%的免疫反應性?？傊?，這些數(shù)據(jù)與關(guān)于鼠 HH1 常見的那些數(shù)據(jù)非常一致，并且表明，嵌合HH1具有有關(guān)的抗原靶向能力。
[0290] 實施例5在體外結(jié)合腫瘤細胞
[0291] 前言：進行結(jié)合測定，以便確定chHHl的平衡結(jié)合常數(shù)（Kd)、Daudi細胞上的抗原 的平均數(shù)目（ B_)和chHHl的結(jié)合速率常數(shù)（ka) (Dahle等人，2007)。
[0292] 材料和方法：用1251標記chHHl (實施例3)。將在0. 4ml培養(yǎng)基中的500萬細胞 /ml懸浮于試管中。在加入1251_標記的chHHl之前，將一組平行細胞用0. 5mg/ml未標記 的chHHl封閉15分鐘。一組平行細胞沒有封閉。將兩組平行細胞與100、1000、5000和 10000ng/ml 125I-HH1 -起孵育。將細胞孵育5、10、20、30分鐘和1、1.5和2小時。孵育以 后，將細胞用含有5%胎牛血清的PBS洗滌。在γ計數(shù)器中計數(shù)細胞和上清液和洗液。將 實驗重復3次。
[0293] 結(jié)果：典型結(jié)合曲線顯示在圖2中。chHHl的Kd為3. 0±0. 3，Daudi細胞的的Β_ 為330000±4000個CD37抗原/細胞，且chHHl的ka為0. 36±0. 03nM/h。數(shù)據(jù)類似于鼠 HH1 (Kd = 2. 7±0· 3, ΒΜΧ = 340000±5000 個 CD37 抗原 / 細胞，ka0. 72±0· 03nM/h)。
[0294] 實施例6小鼠中的生物分布和腫瘤靶向
[0295] 在雄性Balb/C裸小鼠中研究了 mLu-標記的嵌合HH1的生物分布。
[0296] 材料和方法：使用ρ-SCN-Bn-DOTA作為雙官能螯合劑進行放射性標記，以將放射 性核素連接到抗體（參見實施例3)。通過對每只動物的尾靜脈注射100 μ 1溶液來施用所 述制劑。
[0297] 使用體重為2l_25g的雄性Balb/C裸小鼠。
[0298] 在每只動物中注射120kBq的活性物。每個時間點使用五只動物。在注射后的不 同時間點，在頸椎脫位后進行尸體解剖。確定每個組織樣品的重量，并借助經(jīng)校準的Y檢 測器（Cobra II 自動 γ 檢測器，Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA)來測量 mIn。在測量規(guī)程中，使用注射物的樣品作為參照物。
[0299] 結(jié)果：在注射后1小時、20小時和6天的mLu_嵌合HH1的生物分布顯示在表1 中。數(shù)據(jù)表明，所述抗體具有與用放射性標記的利妥昔單抗所觀察到的結(jié)果類似的相關(guān)生 物分布（Dahle等人，2006Nucl Med Biol, 33, 271-279)。綜上所述，放射性標記的嵌合HH1 的生物分布指示，所述抗體具有用于體內(nèi)應用的相關(guān)性能。
[0300] 表1 mLu-標記的嵌合HH1在雄性Balb/C裸小鼠中的生物分布，以每克的注射劑 量的百分比土 SD
[0301] 組織 1 h 20 h 6天 血液 25.0 士 2.9 15.2 士 1.0 8.9 士 3.5 肺 7.0 士 1.1 5.2 土 0.9 2.9 士 0.7 <^莊 7.8 士 0.8 5.8 士 1.5 3.0 士 1.0 肝臟 10.8 士 2.3 4.9 士 0.1 3.9 士 0.2 脾臟 9.6 士 3.4 4.7 士 0.2 4.8 士 1.1 腎臟 8.0 士 1.6 5.0 士 0.4 3.3 士 1.0 股骨 4.5 士 2.4 2.8+0.6 1.7 士 0.3 胃 1·3±0.5 1.0+0.3 1.0 士 0.5 小腸 3.1 ±0.7 1.7±0.1 1.3 士 0.3 大腸 1.4 士 0.3 1.4士0 2 0.9士 0.2 腦 0.7 士 0.1 0.3 士 0.3 0.3 士 0.1
[0302] 實施例7使用流式細胞術(shù)生存力測量的體外ADCC測定
[0303] 背景：使用天然殺傷（NK)細胞和Daudi淋巴瘤細胞，評價嵌合HH1抗體的ADCC性 能。
[0304] 方法：從志愿者收獲人血液，并用Lymphoprep和Dynabeads處理，以得到分離的 NK細胞。將Daudi細胞用Di0C18處理以對細胞染色。
[0305] 通過在37°C孵育30分鐘，用10yL Di0C18(每106個靶細胞/mL)標記Daudi靶 細胞。將細胞用PBS洗滌2次，并在細胞培養(yǎng)基中重新懸浮至lml。
[0306] 如下用抗體標記Di0C18處理過的Daudi細胞：加入嵌合HH1或作為對比的利妥昔 單抗至10 μ g/ml的濃度，并在冰上孵育15分鐘，然后離心和再懸浮，以除去未結(jié)合的抗體。
[0307] 將不同量的NK細胞在細胞培養(yǎng)基中稀釋，以產(chǎn)生4X105/ml(40:l)、2X10 5/ 1111(20:1)、1\105/1111(10:1)和5\10 4/1111(5:1)的濃度。通過加入4(^1^?1/1111培養(yǎng)基來 制備復染劑溶液，制備碘化丙啶復染劑。
[0308] 將標記的Daudi細胞在培養(yǎng)基中稀釋至104/ml。通過將50 μ L效應細胞和50 μ L Daudi細胞混合進反應試管中，開始測定。
[0309] 向反應試管中加入50 μ L PI溶液。在37°C孵育2小時以后，使用流式細胞術(shù)評價 存活的Daudi細胞的百分比。
[0310] 對于chHHl，11 %的Daudi細胞死于ADCC，而對于利妥昔單抗，15%的細胞死于 ADCC。對于兩種抗體，ADCC的誘導百分比沒有顯著不同（參見圖3)。
[0311] 實施例8使用白介素刺激的PBMC的體外ADCC細胞測定
[0312] 背景：通過Cr51釋放測定，評價了鼠和嵌合形式的mAb HH1的ADCC活性。
[0313] 材料和方法：使用Daudi細胞作為靶細胞，并使用IL2刺激的人PBMC作為效應細 胞，評估鼠 HH1和嵌合HH1的介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)的能力。
[0314] 使用補充了 10 %熱滅活的胎牛血清、ImM丙酮酸鈉、2mM L_谷氨酰胺和1 %青 霉素/鏈霉素的RPMI-1640,在組織培養(yǎng)瓶（175cm 2)中培養(yǎng)Daudi細胞（人伯基特氏 (Burkitt' s)淋巴瘤細胞系）。
[0315] 通過每周用新鮮培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2-3次，將培養(yǎng)物維持在3X 105至1. 5X 106/ml 的細胞濃度。將細胞密度在〇. 5X 106/ml至1. OX 106/ml之間的細胞培養(yǎng)物的等分試樣離 心（1200rpm)5min〇
[0316] 將細胞用洗滌緩沖液（含有2% FCS的DPBS)洗滌1次，并沉淀（1200rpm ;5min)。 將細胞沉淀物再懸浮于測定培養(yǎng)基[含有HETOSUO% FCS的RPMI]中，并確定細胞計數(shù)。 將細胞濃度調(diào)至1X l〇6/ml用于進行鉻-51標記。
[0317] 將大約30_50ml得自健康供體的吸附在EDTA玻璃上的全血用于分離PBMC。在 50ml試管中用DPBS(不含鈣和鎂的漢克平衡鹽溶液）對全血進行1:1稀釋。
[0318] 在50ml試管中以2:1比率將稀釋的全血鋪層在Lymphoprep (Medinor)的上 面，并在緩慢制動下在lOOOXg離心20min。從界面抽吸單核細胞，并用DPBS洗滌2次 (300 X g，10min)。
[0319] 使用移液器將沉淀的細胞輕輕再懸浮于培養(yǎng)基（含有10%熱滅活的胎牛血清、 1 %青霉素/鏈霉素的RPMI-1640)中，并在細胞計數(shù)器中確定細胞計數(shù)。
[0320] 將PBMC濃度調(diào)至 5X105/ml，并維持在補充了 25ng/ml IL-2(eBiosciences)的培 養(yǎng)基中，并在C02培養(yǎng)箱在37°C在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3天。收集IL-2刺激的PBMC，計數(shù)， 并以1. 5X 106/ml的濃度再懸浮于測定培養(yǎng)基[含有HEPES、10% FCS的RPMI]中。
[0321] 在1ml的體積，在37°C用3,7MBq鉻_51(Cr51)標記1X106個Daudi細胞1小時。
[0322] 通過離心（2000rpm，5min)，將經(jīng)標記的細胞在含有2% FCS的DPBS中洗滌3次。
[0323] 將經(jīng)標記的細胞等分成等體積，用于鼠和嵌合HH1的結(jié)合，包括不含有抗體的對 照。將所有樣品在37°C孵育10min，然后用含有2% FCS的DPBS洗滌2次，離心（2000rpm， 5min) 3 次。
[0324] 以200 μ 1的終體積，在96-孔圓底微量滴定板中一式三份地進行效應細胞與靶細 胞的共培養(yǎng)。
[0325] 首先，將在100 μ 1體積的測定培養(yǎng)基中的10. 000個靶細胞鋪平板，隨后將不同濃 度的100 μ 1體積中的效應細胞鋪平板，以達到測定的效應細胞：靶細胞比率。
[0326] 作為對照，在單獨的測定培養(yǎng)基中（自發(fā)裂解）或在補充了 1% Triton Χ-100的 測定培養(yǎng)基中（最大裂解）培養(yǎng)靶細胞。
[0327] 將共培養(yǎng)物在潮濕的C02培養(yǎng)箱中在37°C孵育4小時。通過向上清液中的Cr51 釋放，測量細胞毒性效應。在孵育結(jié)束時，通過在室溫離心（1500rpm;5min)，從培養(yǎng)基除去 細胞。將不含細胞的上清液（100 μ 1/孔）轉(zhuǎn)移進96個對應的0.2ml微試管中。通過在 Packard Cobra II Gamma計數(shù)器中計數(shù)，測量釋放的Cr51的量。
[0328] 結(jié)果：實驗結(jié)果呈現(xiàn)在表2中。如所示的，對于所有3個血液供體，用嵌合HH1預 處理的Daudi細胞的細胞裂解是顯著的。
[0329] 與沒有用抗體預處理的Daudi細胞相比，鼠HH1預處理似乎不會造成任何顯著的 裂解。
[0330] 表2.與用抗-⑶37抗體預處理的Daudi淋巴瘤靶細胞相比，用白介素刺激的PBMC 效應細胞處理以后的體外細胞裂解
[0331]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗體分子，其結(jié)合人⑶37,且其衍生自 a) 如下定義的鼠單克隆抗體 i) 包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的可變重鏈；和 ii) 包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的可變輕鏈，或 b) 非人抗體，其識別與在a)中定義的抗體相同的人CD37表位或識別與所述表位接近 或重疊的表位； 其中所述抗體分子是嵌合抗體或人源化抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體分子，所述抗體分子是如下定義的嵌合抗體 i) 包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的可變重鏈； ii) 包含SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的可變輕鏈， iii) 人起源的恒定重鏈和輕鏈。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其中 i) 所述恒定重鏈選自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4鏈組成的組，且 ii) 所述恒定輕鏈是κ或λ鏈。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述恒定重鏈i)包含SEQ ID N0:5、SEQ ID Ν0:6、 SEQ ID Ν0:7和/或SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列，且其中所述恒定輕鏈ii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列。
5. -種DNA分子，其包含編碼權(quán)利要求1-4中的任一項的抗體的可變重鏈的區(qū)域。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA分子，其中所述可變重鏈編碼區(qū)融合至編碼人起源的恒 定重鏈的區(qū)域，且其中所述人恒定重鏈選自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4組成的組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA分子，其中所述IgGl是由SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6和 /或SEQ ID NO: 7所示的序列編碼，或所述IgG3是由SEQ ID NO: 10和/或SEQ ID NO: 12 所示的序列編碼。
8. -種DNA分子，其包含編碼權(quán)利要求1-5中的任一項的抗體的可變輕鏈的區(qū)域。
9. 一種表達載體，其包含權(quán)利要求7的DNA分子和/或權(quán)利要求8的DNA分子。
10. -種宿主細胞，其攜帶一種或多種權(quán)利要求9的載體。
11. 一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-4中的任一項的抗體的方法，所述方法包括：用一種或多 種權(quán)利要求9的載體轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細胞，培養(yǎng)所述宿主細胞，和回收并純化所述抗體 分子。
12. -種藥物組合物，其包含作為活性成分的一種或多種權(quán)利要求1-4中的任一項的 抗-CD37抗體分子和藥學上可接受的載體。
13. -種從細胞群體耗盡表達CD37的B-細胞的方法，所述方法包括：給所述細胞群體 施用權(quán)利要求1-4中的任一項的抗體分子或根據(jù)權(quán)利要求12所述的含有這樣的抗體分子 的藥物組合物。
14. 一種結(jié)合人⑶37的放射免疫綴合物，其包含： a) 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的抗體， b) 接頭，和 c) 放射性核素，其選自由 211At、213Bi、212Bi、212Pb、 225AC、227Th、9°Y、186R e、188Re、199Au、194Ir、 ^Ho^Gd^Sm^Pm^PiVUAg^Pds^Cu'Sc 和 177Lu 組成的組。
15. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的放射免疫綴合物和藥學上可接受 的載體。
16. 用于治療B-細胞惡性腫瘤的根據(jù)權(quán)利要求11或15中的任一項所述的藥物組合 物。
17. -種用于治療選自由B-細胞非霍奇金淋巴瘤、B-細胞慢性淋巴細胞白血病、多毛 細胞白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤組成的組的B-細胞惡性腫瘤的方法，所 述方法包括施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求11和15中的任一項所述的藥物組合物。
18. -種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求14所述的放射免疫綴合物的試劑盒，所述試劑盒包含 2個或更多個瓶，其中一個瓶含有綴合物，所述綴合物包含與根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項 所述的抗體連接的螯合劑；且第二個瓶含有放射性核素。
19. 一種用于預處理B-細胞惡性腫瘤的嵌合的或人源化的HH1抗體的可注射制劑， 其中在用放射性標記的或免疫毒性形式的HH1進行放射免疫療法之前，封閉正常組織中的 CD37。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的制劑，其中所述HH1抗體的量是至少0. 5mg且不超過lg抗 體。
【文檔編號】A61K51/10GK104114192SQ201280069676
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月13日
【發(fā)明者】羅伊·H·拉森, 約斯泰因·達勒 申請人:諾帝克納諾維科特公司