用于將治療劑遞送至腦瘤的細(xì)菌衍生的、完整的微細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞的全身性施用導(dǎo)致微細(xì)胞以治療上顯著的濃度在腦瘤微環(huán)境中快速積聚，而不需要橫跨血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞作用/轉(zhuǎn)胞吞作用或依據(jù)常規(guī)方法通過(guò)其使納米顆粒進(jìn)入該微環(huán)境的任何其它機(jī)制。因此，各種各樣的腦瘤，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的，可通過(guò)全身性施用由多個(gè)這種微細(xì)胞組成的治療有效量的組合物治療，每個(gè)微細(xì)胞是抗腫瘤活性劑比如放射性核素、功能性核酸或編碼其的質(zhì)粒或化療劑的載體。
【專利說(shuō)明】用于將治療劑遞送至腦瘤的細(xì)菌衍生的、完整的微細(xì)胞
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2011年12月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/569, 907的優(yōu)先權(quán) 益處，其內(nèi)容通過(guò)引用將其全部并入本文。

【背景技術(shù)】
[0003] 原發(fā)性腦瘤由衍生自多個(gè)不同細(xì)胞系的不同組的腫瘤組成。依據(jù)世界衛(wèi)生組織分 類（Louis等，2007)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤分為星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)或其混合（少突星形細(xì) 胞）。這些腫瘤進(jìn)一步通過(guò)亞型分類，并且基于組織學(xué)從I至IV分級(jí)，其中等級(jí)IV是最具 攻擊性的。多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM)，其為原發(fā)性惡性腦瘤的最具攻擊性形式，占所有原 發(fā)性腦瘤的大約45%至50% (Wrensch等，2002;Behin等，2003)并且代表年齡35歲以下 的成人中第二大癌癥死亡原因（Allard等，2009)。
[0004] 盡管大量的治療努力，包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)、放射治療和化療，但是對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤 患者的預(yù)后仍非常差（Stewart，2002 ;Stupp等，2005)。大多數(shù)最后發(fā)展為復(fù)發(fā)和進(jìn)行性疾 病，在其后中位生存期大約是6個(gè)月（Wong等，1999 ;Lamborn等，2008)。GBM患者的中位生 存期約是12 - 14個(gè)月（Stupp等，2005)。
[0005] 另外，來(lái)自原發(fā)性腫瘤比如乳腺、肺和皮膚（黑素瘤）的腦轉(zhuǎn)移瘤是顯著的并且日 益增加的公共健康問(wèn)題。2009年在美國(guó)估計(jì)250, 000名患者被診斷患有腦轉(zhuǎn)移瘤（Fox等， 2011)，其大于原發(fā)性腦瘤的發(fā)病率10倍多（Jemal等，2009)?；加心X轉(zhuǎn)移瘤的患者的預(yù)后 非常差，并且大部分患者在診斷后僅生存4 - 6個(gè)月。當(dāng)前治療方案提供的存活好處比較低 (Eichler 和 Loeffler，2007)。
[0006] 由于其擴(kuò)散浸潤(rùn)性質(zhì)并且鄰近重要腦結(jié)構(gòu)，完全外科手術(shù)切除神經(jīng)膠質(zhì)瘤是幾乎 不可能的。全身性治療也被所謂的血腦屏障（BBB)限制。通常，見(jiàn)Cecchelli等（2007)。
[0007] 該屏障存在于腦的毛細(xì)血管內(nèi)皮內(nèi)，并且其成為研究目標(biāo)已超過(guò)100年。實(shí)際上， 從沒(méi)有將用于腦瘤的大部分藥物候選物進(jìn)行臨床的事實(shí)（Pardridge，2007)極大地歸因于 其不能穿過(guò)BBB并且實(shí)現(xiàn)具有治療效果的水平（Groothuis，2000)。
[0008] 盡管在幾十年里廣泛的努力，在腦癌治療中的治愈率仍是極差的。因此，腦癌治療 代表了腫瘤學(xué)中最大的挑戰(zhàn)之一。進(jìn)一步，BBB是在藥物遞送至腦瘤中的主要限制因素已 成為目前共識(shí)。
[0009] 因此，相當(dāng)大的努力普遍涉及發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)足夠小以穿過(guò)BBB并且改進(jìn)GBM患者的 存活結(jié)果的新藥。另外，運(yùn)送藥物經(jīng)過(guò)BBB并且進(jìn)入腦瘤微環(huán)境中的技術(shù)處于開(kāi)發(fā)中。
[0010] 以下是已經(jīng)研究的試圖克服BBB限制的方法。
[0011] ?高滲 BBB 破裂（Kroll 和 Neuwelt，1998)。
[0012] ?化學(xué)屏障修飾（Black等，1997)。
[0013] ?試圖將治療劑連接至具有橫跨BBB的運(yùn)載蛋白的化合物（Bickel等，2001 ;Zhang 和 Pardridge，2007)。
[0014] ?將藥物直接施用至腦瘤和其周圍（Hassenbusch等，2002 ;Hau等，2002 ;Reardon 等，2002 ;Weber等，2002)。該方法需要將攜帶藥物的晶片放置在腫瘤切除床周圍，注入藥 劑至腫瘤切除腔內(nèi)或其周圍，或直接將藥物注入至腫瘤塊內(nèi)。
[0015] ?對(duì)流-加強(qiáng)的遞送或"CED"（Bobo 等，1994 ;Morrison 等，1994 ;Hadjipanayis 等，2008 ;Hadjipanayis等，2010)。在CED中，通過(guò)注射泵施加小的靜水壓力差以直接分布 注射液至中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)的區(qū)域。CED是通過(guò)壓力梯度提供腦中流體對(duì)流的微創(chuàng)外科 手術(shù)過(guò)程，其繞過(guò)BBB。通過(guò)全身性遞送，可將治療劑遞送至腦中而具有最小毒性，因此治療 劑也被遞送至通常進(jìn)入的正常組織和器官。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 鑒于影響該領(lǐng)域中常規(guī)方法的缺點(diǎn)，提供了一種用于全身性施用治療有效量的由 多個(gè)完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞組成的組合物的方法，其中多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)包括抗腫瘤 齊IJ。出于同樣理由，本描述涉及這種組合物制造用于治療腦瘤的藥物的用途。該多個(gè)可包 括至少約1〇 8個(gè)微細(xì)胞，包括但不限于至少約101°個(gè)微細(xì)胞。同樣地，如本文所描述的組合 物可包含少于約10EU游離內(nèi)毒素和/或每10 8個(gè)微細(xì)胞例如每101°個(gè)微細(xì)胞至多1個(gè)母 體細(xì)菌細(xì)胞。
[0017] 微細(xì)胞所包括的抗腫瘤劑可以是放射性核素，例如，比如釔-90、锝-99m、碘-123、 碘-131、銣-82、鉈-201、鎵-67、氟-18、氙-133或銦-111，其可附著至微細(xì)胞表面上的蛋白 質(zhì)或糖，或其可附著在微細(xì)胞表面上附著的腫瘤靶向配體的表面上。在該文中，該組合物可 包含，例如，約30Gy至約lOOGy之間的放射性活度。抗腫瘤劑也可以是化療藥物，例如，其 中該組合物包含其至多約lmg。此外，抗腫瘤劑可以是功能性核酸或編碼功能性核酸的多核 苷酸。因此，該功能性核酸可抑制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管發(fā)生或抵抗化療和/或抑制細(xì)胞 凋亡或細(xì)胞周期停滯的基因。該類功能性核酸的例子是選自以下的核糖核酸分子：siRNA、 miRNA、shRNA、lincRNA、反義 RNA 和核酶。
[0018] 依據(jù)根據(jù)任何上述的某些實(shí)施方式，以上提及的多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)可包括對(duì)非吞 噬哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面受體例如腫瘤細(xì)胞抗原具有特異性的配體。因此，該配體可包括，例 如，特異性識(shí)別這種腫瘤細(xì)胞抗原的抗體。
[0019] 本說(shuō)明書的方法可用于治療一系列腦瘤，舉例但不限于：成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞 腫瘤、少突膠質(zhì)腫瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、垂體腫瘤、腦的原發(fā)性淋巴瘤、松果體腫瘤、腦的 原發(fā)性生殖細(xì)胞腫瘤和其組合。該治療的腫瘤可以是原發(fā)性腦瘤或轉(zhuǎn)移性腦瘤。
[0020] 從以下詳細(xì)描述，其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)將是顯而易見(jiàn)的。給出詳細(xì)描述和具體實(shí) 施例僅為了闡釋，因?yàn)樵凇揪唧w實(shí)施方式】的精神和范圍內(nèi)的多種改變和修飾將從該說(shuō)明書變 得顯而易見(jiàn)。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 圖1.對(duì)人（U87-MG)和犬腦瘤細(xì)胞上EGF受體的定量，所述細(xì)胞用抗EGFR MAb處 理，接著用R-藻紅蛋白結(jié)合的山羊抗小鼠 IgG處理。使用FACS分析細(xì)胞并且與熒光R-藻 紅蛋白微珠標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比。除一抗以外，用相同的方式處理對(duì)照細(xì)胞。EGFR定量結(jié)果揭示， B⑶-1、U87-MG、B⑶-9、B⑶-8和J3T細(xì)胞的每個(gè)細(xì)胞的EGFR濃度（以遞減順序）分別是 2, 866, 854、1，465, 755、930, 440、774, 352和287, 622。每個(gè)細(xì)胞系的結(jié)果顯示為對(duì)照（具 有黑色邊界的曲線）和抗EGFR MAb處理的（不具有黑色邊界的曲線）。
[0023] 圖2.顯示細(xì)胞增殖（MTS)試驗(yàn)的結(jié)果以確定犬和人（U87-MG)腦癌細(xì)胞的阿霉素 敏感性。誤差線，土 SEM。
[0024] 圖3.來(lái)自FACS分析的代表性直方圖顯示EeFK微細(xì)胞_*與犬和人腦癌細(xì)胞結(jié)合 的效率。在每種情況下，>95%的細(xì)胞顯示 EeFK微細(xì)胞的顯著結(jié)合。用非特異性靶向的 8512(1微細(xì)胞處理的細(xì)胞不顯示與細(xì)胞的任何結(jié)合?？筭pl20抗體針對(duì)HIV病毒衣殼蛋 白gpl20,其在任何腫瘤細(xì)胞上未發(fā)現(xiàn)。
[0025] 圖4.用_微細(xì)胞阿霉素和對(duì)照8512(1微細(xì)胞阿霉素處理人和犬腦瘤細(xì)胞3小時(shí)。在用山 羊抗小鼠 IgG2a-AF488(綠色熒光，顯示為較淺的點(diǎn)畫）處理后，可見(jiàn)與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的微 細(xì)胞，該山羊抗小鼠 IgG2a-AF488與用于靶向各自的微細(xì)胞的雙特異性抗體的抗LPS組分 (IgG2a)結(jié)合。右手圖像或每個(gè)垂直圖可見(jiàn)阿霉素自發(fā)熒光（紅色熒光，為較深的點(diǎn)畫），并 且顯示阿霉素在大部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。使用Leica熒光顯微鏡拍攝圖像。比例尺， 20 μ m〇
[0026] 圖5.在具有晚期腦瘤、用_微細(xì)胞處理后的七條狗中腫瘤穩(wěn)定/退化。在左 手垂直柱中顯示在處理每條狗之前（給藥前）的MRI掃描。中間和右手垂直柱顯示用 EeFK 微細(xì)胞處理后的MRI掃描，并且顯示每個(gè)MRI的給藥后值。描繪的MRI部分包括矢形的 (Β⑶-1和-6)、軸向的（Β⑶-2至-5)和冠狀的（Β⑶-7)。每個(gè)MRI下方顯示腫瘤體積（尺 寸以厘米計(jì)），并且箭頭指示各自腫瘤的位置。
[0027] 圖6.對(duì)七條具有腦癌的狗處理后確定血清生物化學(xué)參數(shù)（Β⑶-1至Β⑶7)。每幅 圖中的水平線代表犬中的正常參考范圍。誤差線，土SEM。
[0028] 圖7.對(duì)七條具有腦癌的狗處理后確定血清血液學(xué)參數(shù)（Β⑶-1至Β⑶7)。每幅圖 中的水平線代表犬中的正常參考范圍。誤差線，土SEM。
[0029] 圖8.用_微細(xì)胞阿霉素處理后，在七條腦癌狗中說(shuō)明血清TNFa、IL_6和IL-10應(yīng) 答。
[0030] 圖9.描繪用_微細(xì)胞處理后，在7條腦癌狗中（存活的）的抗LPS抗體應(yīng) 答。
[0031] 圖10.圖解7條具有腦癌的狗的存活（以天計(jì)）（左手y-軸并且用條代表），以及 施用的 KFK微細(xì)胞的劑量值（右手y-軸并且顯示為與每個(gè)條相關(guān)的菱形）。條紋條指 示在進(jìn)行和緩解期的狗。較深的實(shí)條指示顯示穩(wěn)定的疾病直到腫瘤復(fù)發(fā)的狗，可能是由于 發(fā)展了阿霉素抗性，并且這些狗被安樂(lè)死。較淺的實(shí)條表示處于緩解期但是由于不相關(guān)的 感染死亡的狗。
[0032] 圖11. (a)分別顯示在三個(gè)正交平面（冠狀的、矢形的和經(jīng)軸的）中，共配準(zhǔn)的T1 對(duì)比后MRI和SPECT掃描⑴和（iii)，以及融合圖像顯示（ii)。由箭頭指示攝取面積和 其位于的區(qū)域。該攝取低于腦外焦距，在頭的每一側(cè)雙向可見(jiàn)，但是其在腦內(nèi)觀察到唯一攝 取。
[0033] (b)顯示另一種動(dòng)物的結(jié)果。經(jīng)軸視圖僅顯示MRI⑴和SPECT(iii)。在MRI表 明的異常中，強(qiáng)烈攝取是明顯的。圖像（ii)是T1對(duì)比后MRI、SPECT，和融合圖像的共配準(zhǔn) 顯示。箭頭指示放射性標(biāo)記的微細(xì)胞強(qiáng)烈局部化的區(qū)域，其對(duì)應(yīng)在MRI掃描上的異常部分。
[0034] (c)顯示在注射后30分鐘和3小時(shí)全身、2D平面圖像。伴隨甲狀腺和一些頸部攝 取，早期攝取在肝臟可見(jiàn)，在后期掃描可見(jiàn)一些排泄進(jìn)入腸。
[0035] 圖12.在Balb/c nu/nu小鼠（每組η = 8)中的人胰腺癌（MIA PaCa)異種移 植物與游離吉西他濱（Gemcitabine) (Gemzar?)-起靜脈內(nèi)施用，或與包裹吉西他濱的 EGFR-靶向微細(xì)胞（EeFK微細(xì)胞eemzm) -起靜脈內(nèi)施用。所有的微細(xì)胞處理接收每劑量109 個(gè)微細(xì)胞。處理天數(shù)顯示在X-軸下方（三角形）。誤差線：+/_SEM。該圖表顯示在施用后 指示天數(shù)的腫瘤體積。
[0036] 圖13.在Balb/c nu/nu小鼠（每組η = 8)的人乳腺癌（MDA-MB-468)異種移植 物與游離卡鉬（Carboplatin) -起靜脈內(nèi)施用，或與包裹卡鉬的非靶向或EGFR-靶向微細(xì) 胞（EeFK微細(xì)胞-起靜脈內(nèi)施用。所有的微細(xì)胞處理接收每劑量1〇 9個(gè)微細(xì)胞。處理天 數(shù)顯示在X-軸下方（箭頭）。誤差線：+/-SEM。該圖表顯示在施用后指示天數(shù)的腫瘤體積。
[0037] 詳細(xì)描述
[0038] 本公開(kāi)提供用于治療腦瘤的組合物和方法。在這方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用一種或多 種抗腫瘤劑包裹的完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞，當(dāng)以治療上顯著的濃度全身性施用時(shí)，在腦 瘤微環(huán)境中快速地積聚。該發(fā)現(xiàn)是令人意外的，因?yàn)橹睆酱蠹s400nm的微細(xì)胞比能夠穿過(guò) 血腦屏障（BBB)的顆粒常規(guī)理解設(shè)為12nm的上限大得多。見(jiàn)Sarin等（2008)和Laquintana 等（2009)。
[0039] 因此，本發(fā)明人確定，各種各樣的腦瘤，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的，可通過(guò)全身性施用治 療有效量的組合物治療，該組合物由多個(gè)這種微細(xì)胞組成，每個(gè)微細(xì)胞是抗腫瘤的活性劑 的載體。
[0040] ⑷定義
[0041] 除非另有規(guī)定，用于該說(shuō)明書的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員通 常所理解的相同的意思。
[0042] 為了方便，以下提供了在本說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語(yǔ)和 詞的意思。整個(gè)本說(shuō)明書定義了其它術(shù)語(yǔ)和詞。
[0043] 單數(shù)形式"一個(gè)（a)"、"一個(gè)（an)"和"該（the)"包括復(fù)數(shù)指代，除非本文另外明 確規(guī)定。
[0044] 在本文可互換使用的"癌癥（Cancer) "、"瘤（neoplasm) "、"腫瘤（tumor) "、"惡性 腫瘤（malignancy) "和"癌瘤（carcinoma) "指展現(xiàn)異常生長(zhǎng)表型的細(xì)胞或組織，其特征在 于細(xì)胞增殖控制的顯著喪失。本公開(kāi)的方法和組合物特別應(yīng)用于惡性細(xì)胞、預(yù)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞、 轉(zhuǎn)移性細(xì)胞和非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞。
[0045] "藥物（Drug)"指在動(dòng)物中，尤其是在哺乳動(dòng)物和人中產(chǎn)生局部或全身性效果的任 何生理學(xué)或藥理學(xué)活性的物質(zhì)。
[0046] 在該說(shuō)明書中互換使用的術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"、"對(duì)象"、"宿主"和"患者"指期望對(duì)其診斷、 處理或治療的任何哺乳動(dòng)物對(duì)象。個(gè)體、對(duì)象、宿主或患者可以是人或非人動(dòng)物。因此，適 合的對(duì)象可包括但不限于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、馬、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠和小鼠。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"治療（"treatment'"treating"、"treat"）和類似術(shù)語(yǔ)指在腦瘤患者中 獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。該效果在完全地或部分地防止腦瘤或其癥狀方面可 以是預(yù)防性的，和/或在部分或完全穩(wěn)定化或治愈腦瘤和/或歸因于腦瘤的不利效果方面 可以是治療性的。治療包括哺乳動(dòng)物，尤其是人的腦瘤的任何治療。尤其，期望的效果是腫 瘤應(yīng)答，其可以被測(cè)量為腫塊的減少或腫塊增加的抑制。除腫瘤應(yīng)答以外，整體存活率的增 力口、無(wú)進(jìn)展存活率或腫瘤復(fù)發(fā)的時(shí)間或不利效果的減少也可臨床地用作期望的治療效果。 [0048] ⑶治療
[0049] 本公開(kāi)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)反映和證實(shí)，與本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)一致，細(xì)菌衍生的且完整 的微細(xì)胞，其直徑約為400nm，當(dāng)靜脈（i.v.)施用時(shí)，在腦瘤微環(huán)境中以治療上顯著的濃度 快速地積聚。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)該腦瘤穿透不依賴BBB內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞作用/轉(zhuǎn)胞吞作用或依 賴任何其它機(jī)制--已經(jīng)提出納米顆粒是通過(guò)這些機(jī)制進(jìn)入腦瘤微環(huán)境。因此，從常規(guī)知 識(shí)的優(yōu)勢(shì)，這些發(fā)現(xiàn)是非常意料不到的。
[0050] 1.關(guān)于穿過(guò)BBB的尺寸限制的常規(guī)知識(shí)
[0051] 已考慮納米顆粒作為經(jīng)過(guò)BBB服藥的潛在載體（Juillerat_Jeanneret，2008)。在 這方面，示例性的是一種納米顆粒藥物遞送策略，其旨在通過(guò)納米顆粒與包括BBB的內(nèi)皮 細(xì)胞的內(nèi)腔中的受體結(jié)合，接著橫跨內(nèi)皮細(xì)胞并且進(jìn)入腦瘤微環(huán)境的內(nèi)吞作用和轉(zhuǎn)胞吞作 用，進(jìn)行克服。另一方法涉及開(kāi)發(fā)以下討論的"加強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)"，以實(shí)現(xiàn)顆粒通過(guò)BBB 的內(nèi)皮細(xì)胞之間的微小間隙。
[0052] 2.納米顆粒的轉(zhuǎn)胞吞作用
[0053] 顯示包被聚山梨醇酯80 (Tween? 80)的聚氰基丙烯酸丁酯（PBCA)納米顆粒能 夠?qū)崿F(xiàn)腦遞送不以游離形式穿過(guò)BBB的許多藥物（Kreuter等，1995、1997、2001、2002、2003 和 2008 ;Steiniger 等，2004)。
[0054] 因?yàn)榫凵嚼娲减?0選擇性地促進(jìn)在這些納米顆粒表面上某些血漿蛋白質(zhì)，尤其 是載脂蛋白E和B的吸收（Petri等，2007 ;Re等，2011)，因此它使得這些納米顆粒與各自 的低密度脂蛋白受體能夠結(jié)合（LDLr ;Xin等，2011)，該脂蛋白受體已知在與BBB相關(guān)的毛 細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)（Dehouck等，1994)。
[0055] 與LDLr結(jié)合后，納米顆粒通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞納入（Zensi等，2009)，橫跨這些細(xì)胞 進(jìn)行胞轉(zhuǎn)，并且然后運(yùn)送至腦瘤微環(huán)境中。
[0056] 全世界對(duì)治療腦瘤的納米顆粒的努力開(kāi)發(fā)集中于發(fā)現(xiàn)通過(guò)胞轉(zhuǎn)與BBB相關(guān)的內(nèi) 皮細(xì)胞跨越BBB并且進(jìn)入腦瘤微環(huán)境的創(chuàng)新方式。鑒于這些顆粒在細(xì)胞內(nèi)胞轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)期間必 須保持完整并且不被溶酶體降解的事實(shí)，這是主要的挑戰(zhàn)。后者是高度酸性的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室， 其通常降解內(nèi)吞物質(zhì)。
[0057] 該方法另外的嚴(yán)重缺點(diǎn)是LDLr對(duì)BBB不唯一的事實(shí)。它僅在與BBB相關(guān)的內(nèi)皮 細(xì)胞中是過(guò)表達(dá)的。因此，由于這些受體遍及位于整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，所以這些納 米顆粒具有進(jìn)入大量的正常組織和正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可能。至今，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)僅對(duì)與BBB 相關(guān)的血管的唯一的受體，并且因此對(duì)正常組織的嚴(yán)重毒性潛在性仍值得關(guān)注。
[0058] 3.被動(dòng)進(jìn)入腦瘤
[0059] 近來(lái)證據(jù)指示在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤微脈管系統(tǒng)的BBB中的孔大小的生理學(xué)上限僅 約為12nm(Sarin等，2008)。進(jìn)一步，已顯示分子需要像〈400道爾頓一樣?。˙ickel，2005 ; Pardridge，2007)以能夠穿過(guò)在BBB中發(fā)現(xiàn)的孔。
[0060] 該大小約束在本領(lǐng)域的研究和臨床中廣泛地接受。例如，回顧近來(lái)文獻(xiàn)得出結(jié)論： 納米顆粒需要小于12nm并且具有長(zhǎng)的血液半衰期，以穿過(guò)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤微脈管系統(tǒng)的 BBB (Laquintana 等，2009)。
[0061] 在這方面，研究了多種納米顆粒，包括脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒、固體脂質(zhì)納米顆 粒、聚合物微膠粒和樹(shù)形分子。在靜脈施用后，這些顆?？赏鉂B進(jìn)入腦瘤，這是由于腦瘤血 管的破裂的BBB，但是也以較小程度上進(jìn)入正常腦組織（Moghimi等，2005)。
[0062] 在具有破裂的BBB的腦瘤中納米顆粒的被動(dòng)靶向通常與以上提及的加強(qiáng)的滲 透性和滯留（EPR)效果相關(guān)聯(lián)，其被認(rèn)為在藥物遞送至實(shí)體瘤中起到重要作用。例如， Laquintana等（2009)反映了當(dāng)前觀點(diǎn)：典型地范圍在50至150nm之間的脂質(zhì)體保持在微 脈管系統(tǒng)內(nèi)，從而形成膠囊的小化療藥物橫跨脂質(zhì)體膜和橫跨具有惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的BBB 的孔而擴(kuò)散。因此，不認(rèn)為較大的微粒（50至150nm)能夠經(jīng)屏障中的破裂通過(guò)BBB外滲。
[0063] 因此常規(guī)理解是，為了經(jīng)EPR作用被動(dòng)地穿過(guò)BBB并且在腦瘤微環(huán)境中達(dá)到藥理 學(xué)顯著的量，納米顆粒大小應(yīng)該<12nm，和大分子，比如藥物，應(yīng)該具有〈400道爾頓的分子 量。該理解在Pardridge (2010)的綜述文章中被強(qiáng)調(diào)，其強(qiáng)調(diào)"在腦藥物開(kāi)發(fā)中單個(gè)最重要 的因素是有效的腦藥物靶向技術(shù)的可用性"。
[0064] 這是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)（CNS)的大多數(shù)候選藥物不穿過(guò)血腦屏障（BBB)。生物制 藥，其為大分子藥物，不穿過(guò)BBB。因此，在沒(méi)有腦靶向技術(shù)的情況下，重組蛋白質(zhì)、單克隆 抗體、肽、短干擾RNA(siRNA)和基因療法不能用于腦，因?yàn)檫@些藥物不穿過(guò)BBB。關(guān)于小分 子，通常假定這些藥物的確穿過(guò)131313。然而，>98%的所有小分子不穿過(guò)131313(?31(11^(^6等， 2005)。僅具有〈400道爾頓（Da)的分子量（MW)的脂溶性小分子經(jīng)脂類介導(dǎo)穿過(guò)BBB。然 而，大多數(shù)小分子藥物或具有MWMOODa，或具有高水溶性，其阻止通過(guò)BBB的自由擴(kuò)散。因 此，即使CNS藥物開(kāi)發(fā)者關(guān)注小分子，很可能仍需要BBB藥物靶向技術(shù)用于成功完成大部分 藥物的CNS小分子藥物開(kāi)發(fā)程序。
[0065] 4.進(jìn)入腦瘤的另外屏障
[0066] 除了 BBB，腦攝取進(jìn)一步被在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中相對(duì)微量的窗孔和胞飲泡，以 及被周圍細(xì)胞外基質(zhì)、外周細(xì)胞和星狀細(xì)胞足突的存在限制（Hawkins和Davis，2005)。另 外地，由于將藥物從腦中移出的大量的藥物運(yùn)輸?shù)鞍祝珺BB通常被認(rèn)為不受藥物和大分子的 影響。
[0067] 例如，已顯示依賴于ATP的運(yùn)載蛋白可嚴(yán)格地限制治療劑的腦穿透，甚至是預(yù)測(cè) 相對(duì)容易穿過(guò)BBB的具有良好的物理化學(xué)性質(zhì)的那些。這些運(yùn)載蛋白的大部分屬于兩 個(gè)超家族，ATP-結(jié)合盒（ABC)和溶質(zhì)載體蛋白家族。P-糖蛋白（P-gp，ABCB1)、抗乳腺 癌蛋白（BCRP，ABCG2)和多藥耐性相關(guān)蛋白（MRPs，ABCCs)是ABC家族的重要成員。見(jiàn) Schinkel (1999)，Borst 等（2000)，Sun 等（2003)，Schinkel 和 Jonker (2003)，Kusuhara 和 Sugiyama (2005)，Loscher 和 Potschka (2005)，和 Nicolazzo 和 Katneni (2009)。
[0068] 因此，本發(fā)明人確實(shí)令人意外的發(fā)現(xiàn)，盡管微細(xì)胞顯著大于（?400nm)進(jìn)入腦瘤 的納米顆粒的一致上限大?。?lt;12nm)的事實(shí)，但是完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞在腦瘤中積 聚。也出乎意料的發(fā)現(xiàn)微細(xì)胞經(jīng)破裂的BBB被動(dòng)地進(jìn)入腦。在這方面，本發(fā)明人令人意外的 觀察到，與腦瘤相關(guān)的血管不僅是BBB類型的。甚至在早期階段，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)腫瘤具有許多血 管，尤其是在其核處。這種血管顯示完整性的損失；即，該血管具有大穿孔并且是"滲漏的"， 不像BBB類型血管。違反常規(guī)理解，因此，與微細(xì)胞一樣大的微粒，S卩，比以上討論的BBB的 一致孔大小限制大的多，然而小于滲漏的血管壁中的穿孔；因此，它們可通過(guò)這些穿孔被動(dòng) 地外滲并且進(jìn)入腦瘤微環(huán)境。
[0069] 此外，依據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相對(duì)大尺寸的完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞事實(shí)上 是積極（positive)的，甚至是在腦瘤微環(huán)境中如何快速地實(shí)現(xiàn)治療上顯著的微細(xì)胞濃度 的關(guān)鍵因素。微粒越小，即，微粒將越可能被血管中的血流動(dòng)限制。相比之下，微細(xì)胞是相 對(duì)更大質(zhì)量的微粒，并且因此它們被血流動(dòng)產(chǎn)生的力影響較小。因此，微細(xì)胞更可能沿著路 徑通過(guò)毛細(xì)血管，這導(dǎo)致對(duì)毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞壁重復(fù)的碰撞。該純粹的物理現(xiàn)象增加了 微細(xì)胞作為更大的微粒被推動(dòng)通過(guò)滲漏脈管系統(tǒng)中的穿孔的可能性，如本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該 穿孔是腫瘤中破裂的BBB的標(biāo)志。
[0070] 在人腦中有大于1千億的毛細(xì)血管，呈現(xiàn)大約400英里的全長(zhǎng)，但這些毛細(xì)血管的 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的體積僅約1 μ L/g腦（Pardridge，2011)。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，相信腦中血管的非常高 的密度也有助于微細(xì)胞在腦瘤中快速、高濃度的積聚。
[0071] 認(rèn)識(shí)到與BBB相關(guān)的毛細(xì)血管內(nèi)腔的直徑因此可以如1 μ m那么小，本發(fā)明人領(lǐng)悟 到與完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞（?400nm) -樣大的微粒約是與BBB相關(guān)的毛細(xì)血管的直 徑的一半，并且因此將快速地從其中空隙大于400nm大小的破裂的BBB外滲。另一方面，因 為在哺乳動(dòng)物身體的正常脈管系統(tǒng)中的穿孔不超過(guò)約100 μ m大小，所以依據(jù)該發(fā)現(xiàn)，全身 性引入的完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞被保留在通常的血管系統(tǒng)中，直到它們被在網(wǎng)狀內(nèi)皮 系統(tǒng)中的專門的吞噬細(xì)胞清理，或直到它們被動(dòng)地從滲漏脈管系統(tǒng)外滲進(jìn)入腦瘤微環(huán)境。
[0072] 因此，當(dāng)以相等數(shù)量靜脈施用兩種類型的納米顆粒時(shí)，例如，直徑小于12nm的納 米顆粒和完整的、細(xì)菌衍生的微細(xì)胞，則會(huì)預(yù)期較小微粒的循環(huán)濃度會(huì)快速地下降，因?yàn)樗?們會(huì)從正常組織的血液循環(huán)中外滲，該正常組織中的脈管系統(tǒng)具有大于12nm的孔。例如， 已知肝臟和胃腸組織具有約lOOnm的正常脈管系統(tǒng)穿孔（Wisse等，2008)，并且周圍皮膚具 有?40nm范圍的穿孔。相比之下，微細(xì)胞太大以至于不能從正常脈管系統(tǒng)中離開(kāi)；因此，預(yù) 期它們?cè)谡Ｑ貉h(huán)中保持高濃度，從而較大數(shù)量會(huì)外滲進(jìn)入腦瘤微環(huán)境，如上所述。
[0073] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，因此，本公開(kāi)提供用于腦瘤的療法，其需要施用治療有效量的 由多個(gè)完整的、細(xì)菌衍生的、攜帶抗腫瘤劑的微細(xì)胞組成的組合物。包含微細(xì)胞的組合物的 施用優(yōu)選地是全身性的，例如，靜脈或動(dòng)脈內(nèi)。
[0074] (C)抗腫瘤劑
[0075] 正如指出，本公開(kāi)的微細(xì)胞組合物在將抗腫瘤劑遞送至腦瘤中是有用的。在該文 中，詞"抗腫瘤劑"指阻止或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)展、成熟或擴(kuò)散的化學(xué)或生物學(xué)藥物。
[0076] 在該公開(kāi)的文中，與常規(guī)醫(yī)療實(shí)踐一致，選擇用于治療給定的腦瘤患者的抗腫瘤 劑取決于若干因素。這些因素包括但不限于患者的年齡、卡氏評(píng)分（Karnofsky Score)和 患者以前可能接受過(guò)哪些治療。通常，見(jiàn)Principles或Practice of Neuro-Oncology, Μ· Mehta(Demos Medical Publishing 2011),和 Principles Of Neuro-Oncology, D. Schiff 或 P.0, Neill，eds. (McGraw-Hill2005)
[0077] 更通常，推薦對(duì)給定腦癌適用的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，首先，臨床考慮應(yīng)告知要使用的活性劑 的選擇。該觀點(diǎn)將指導(dǎo)，例如，從以下表1中復(fù)制的列表的活性劑選擇，其為洛杉磯加利福 尼亞大學(xué)公布的適于治療腦瘤的抗腫瘤劑。
[0078] 表1.用于治療腦瘤的已知抗腫瘤劑
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療對(duì)象中腦瘤的方法，其包括全身性施用治療有效量的由多個(gè)完整的、 細(xì)菌衍生的微細(xì)胞組成的組合物，其中所述多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)包括抗腫瘤劑。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是放射性核素。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述放射性核素選自釔-90、锝-99m、碘-123、碘-131、 銣-82、鉈-201、鎵-67、氟-18、氙-133 和銦-111。
4. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述放射性核素被附著至所述微細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì) 或糖。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中所述放射性核素被附著至與所述微細(xì)胞的表面相連的 雙特異性抗體。
6. 權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含約30Gy至約lOOGy放射性活 度。
7. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是化療藥物。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述化療藥物具有大于約400道爾頓的分子量。
9. 權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述化療藥物具有的LD5(I低于所述化療藥物對(duì)靶 向癌癥的ED5Q。
10. 權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含至多約lmg的所述化療藥 物。
11. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是功能性核酸或編碼功能性核酸的多 核苷酸。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述功能性核酸抑制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管發(fā)生 或抵抗化療和/或抑制細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期停滯的基因。
13. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述功能性核酸選自siRNA、miRNA、shRNA、lincRNA、 反義RNA或核酶。
14. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是編碼促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因的多核苷 酸。
15. 權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)包括對(duì)非吞噬哺乳 動(dòng)物細(xì)胞表面受體具有特異性的配體。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受體是腫瘤細(xì)胞抗原。
17. 權(quán)利要求16所述的方法，其中所述配體包括特異性識(shí)別所述腫瘤細(xì)胞抗原的抗 體。
18. 權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多個(gè)微細(xì)胞包括至少約108個(gè)微細(xì)胞。
19. 權(quán)利要求18所述的方法，其中所述多個(gè)微細(xì)胞包括至少約101°個(gè)微細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含少于約10EU游離內(nèi)毒素。
21. 權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包含每108個(gè)微細(xì)胞至多1個(gè) 母體細(xì)菌細(xì)胞。
22. 權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腦瘤選自：成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞腫 瘤、少突膠質(zhì)腫瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、垂體腫瘤、腦的原發(fā)性淋巴瘤、松果體腫瘤、腦的原 發(fā)性生殖細(xì)胞腫瘤和其組合。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述腦瘤是轉(zhuǎn)移性腦瘤。
24. 組合物制造用于治療腦瘤的藥物的用途，其中所述組合物包括多個(gè)完整的、細(xì)菌衍 生的微細(xì)胞，所述多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)包括抗腫瘤劑。
25. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述組合物包含作為所述抗腫瘤劑的至多約lmg的 化療藥物。
26. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述抗腫瘤劑是功能性核酸或編碼功能性核酸的多 核苷酸。
27. 權(quán)利要求26所述的用途，其中所述功能性核酸抑制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管發(fā)生 或抵抗化療和/或抑制細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期停滯的基因。
28. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述抗腫瘤劑是編碼促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因的多核苷 酸。
29. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述抗腫瘤劑是放射性核素。
30. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述多個(gè)微細(xì)胞包括至少約101°個(gè)微細(xì)胞。
31. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述組合物包含少于約10EU游離內(nèi)毒素。
32. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述多個(gè)微細(xì)胞的每個(gè)包括對(duì)非吞噬哺乳動(dòng)物細(xì)胞 表面受體具有特異性的配體。
33. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述腦瘤選自：成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞腫瘤、少突 膠質(zhì)腫瘤、室管膜瘤、顱咽管瘤、垂體腫瘤、腦的原發(fā)性淋巴瘤、松果體腫瘤、腦的原發(fā)性生 殖細(xì)胞腫瘤和其組合。
34. 權(quán)利要求33所述的用途，其中所述腦瘤是轉(zhuǎn)移性腦瘤。
35. 權(quán)利要求24所述的用途，其中所述抗腫瘤劑是具有大于約400道爾頓的分子量的 化療藥物。
36. 權(quán)利要求35所述的用途，其中所述化療藥物具有的LD5(I低于所述化療藥物對(duì)靶向 癌癥的ED5(i。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104114153SQ201280069592
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月13日
【發(fā)明者】H·布拉姆巴特, J·麥克迪爾米德 申請(qǐng)人:安吉尼科分子傳輸公司