降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；且降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化。其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼帷⒌?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到8600IU/mg。本發(fā)明進一步公開了融合多肽在治療骨質疏松、心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應用藥物方面的應用。本發(fā)明降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化可提高降鈣素的活性約30倍，生物學活性為100～200IU/mg。
【專利說明】降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的制備與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學【技術領域】，涉及一種融合多肽。更具體地說是一種降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素的融合多肽及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]降鈣素(calcitonin，CT)可直接抑制破骨細胞(osteoclasts，0C)增殖，阻止骨溶解，促進骨形成，并能迅速減輕因骨質疏松而引起的腰錐病疼痛或發(fā)病，是治療骨質疏松癥的首選藥物之一。 它還可以有效調(diào)節(jié)骨鈣與血鈣之間的平衡，并有鎮(zhèn)痛作用；對治療高血鈣癥、變形性骨炎、甲狀腺機能亢進以及各種原因引起的骨骼疼痛(如類風濕、腫瘤)等有非常明顯的效果，在骨痛病的治療中，降鈣素的鎮(zhèn)痛效果可達嗎啡的30~50倍。由于降鈣素能抑制胃酸分泌，它可用于治療急性胃潰瘍；由于降鈣素能抑制胰腺激素分泌及抑制酶的釋放，它可用于治療急性胰腺炎；降鈣素對甲狀旁腺機能亢進也有治療作用。降鈣素在慢性多關節(jié)炎及心血管疾病的治療方面也有一定的潛力。
[0003]鮭魚降鈣素(salmon calcitonin, sCT)是天然降鈣素中活性最高的一種，其活性約是人降鈣素的40倍，與人降鈣素具有同源性。細胞實驗證明鮭魚降鈣素作用在人降鈣素受體上，所產(chǎn)生的第二信使cAMP的量遠遠大于人降鈣素，因此其使用量占臨床用降鈣素的近 50%。
[0004]降鈣素基因相關妝(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是調(diào)節(jié)心血管活動的重要神經(jīng)遞質之一，是迄今所知的人體最強的舒血管物質。降鈣素基因相關肽擴冠狀動脈作用比硝酸甘油、硝普鈉強240倍，它是由辣椒素敏感的感覺神經(jīng)末梢釋放的一種生物活性多肽，廣泛分布于神經(jīng)及心血管系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)中，降鈣素基因相關肽生物活性具有多樣性，如強大的舒血管作用、抑制平滑肌細胞增殖和內(nèi)皮細胞凋亡，也能促進細胞分化增殖，參與血管新生。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠強于P物質(substance P，SP)、心鈉素和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE);比乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)、5_輕色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)等強10000倍左右，比異丙腎上腺素強10~100倍。CGRP血管舒張反應呈現(xiàn)不同程度的劑效一依賴性，即適當加大CGRP的注入劑量時反應增強，濃度低則效應緩慢，但持續(xù)時間長。Shen 等(Shen YT, Pittman TJ, Buie PS.[J].PharmacolExp Ther, 2001, 298 (3):551-558.)認為盡管外源性的a-CGRP可以引起不同部位血管床的舒張，但在正常狀態(tài)下的內(nèi)源性a-CGRP對血管調(diào)節(jié)并不起重要作用。經(jīng)反復實驗驗證降鈣素基因相關肽能夠抑制血管平滑肌細胞增殖、保護內(nèi)皮細胞和抑制血管新生，防治高血壓，防止充血性心力衰竭，防治心絞痛，防治心肌梗死和治療休克。而且具有在脊髓水平調(diào)制痛覺的功能，可調(diào)節(jié)破骨細胞骨吸收和促進成骨細胞分裂。目前市場上只有降鈣素產(chǎn)品，而降鈣素基因相關肽只停留在實驗室研究階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了得到一種既含有降鈣素又含有降鈣素基因相關肽的產(chǎn)品，而提供了一種降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽。本發(fā)明公開了如下的技術內(nèi)容:降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合基因表達的多肽，其特征在于降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHiSArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGluAlaHisLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化。
[0006]本發(fā)明所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼帷⒌?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
[0007]本發(fā)明所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，其中融合多肽生物學活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽生物學活性為100 ~200IU/mg。
本發(fā)明進一步公開了一種藥物組合物，主要含有降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽及一種或多種藥用輔料。所述的組合物為固體制劑或液體制劑。所述的其中固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
[0008]本發(fā)明所用到的輔料指的是藥學上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物，可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤滑劑。例如，可通過壓制濕顆粒來制備片劑?；钚猿煞峙c載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設備中進行顆粒化，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。
[0009]本發(fā)明進一步公開了降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽在制備治療骨質疏松藥物方面的應用。
[0010]本發(fā)明同時也公開了降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽在制備治療心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應用。
[0011]經(jīng)實驗驗證本發(fā)明降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽保留了降鈣素基因相關肽和鮭魚降鈣素各自的酶活性；而且偶聯(lián)反應產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同時加入兩種單一(降鈣素基因相關肽和鮭魚降鈣素)多肽的反應體系反應速度的兩倍以上，同 時過渡態(tài)時間(transienttime)大大縮短,縮短至原過渡態(tài)時間的1/4左右。
[0012]本發(fā)明為了提高msCT生物活性依據(jù)msCT生物活性對構象依存性的現(xiàn)象從而對其氨基酸殘基進行了改造，將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?、?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸(mSCT[Gly8，Ala16，del-Tyr22])，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到 8600IU/mg。
[0013]本發(fā)明降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化可提高降鈣素的活性約30倍C端酰胺化的本發(fā)明降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽生物學活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽生物學活性為100~200IU/mg)。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質由權利要求來限定。
[0015]實施例1
本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的氨基酸序列如下:AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheVaIProThrAsnValGlySerLySAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGIuAlaHi sLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降鈣素基因相關妝與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化。
[0016]本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合基因由上海生工公司合成，融合多肽系本實驗室構建菌株進行轉入番茄后經(jīng)親和層析純化獲得。
[0017]本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合基因中有一段被稱為“親和手柄”(affinity handle)的編碼序列相連接，這段“親和手柄”可以與親和層析柱上的配基特異性地結合，這樣所表達的融合蛋白可以用親和層析的方法快速而簡便地純化出來，所得到的融合多肽蛋白經(jīng)化學方法或酶法切割開來之后，混合產(chǎn)物再上同一親和柱，充作“親和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切開的融合蛋白被吸附于柱上，而重組目的產(chǎn)物則處于流動相中。因此可得到較高純度的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽。
[0018]本實施方式在降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的C端加上一個Gly為肽酰甘氨酸酰化單氧酶酰胺化提供氨基供體。
[0019]本實施方式在CGRP和msCT`氨基酸序列之間設計一個Kpn I酶切位點(如氨基酸序列下劃線所示)，可用于驗證陽性克隆及其它基因操作。對本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽進行動物實驗:
實驗1:
將骨質疏松模型大鼠隨機分成兩組(治療組和模型組)，以正常大鼠為空白對照組；治療組按體重0.g/kg劑量注射本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，模型組注射同等劑量的生理鹽水。實驗進行84天，對大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)進行檢測，并對大鼠進行了骨密度測定。檢測結果如表1和表2所示。
[0020]表1大鼠血清TRAP、ALP、BGP測定結果(X土 S)
I 別鼠數(shù)TRAP(U/L)ALP(U/L)BGP(ug/L)
圣白對照組 _ 10 一 18.67±3.31 ' 152.84±21.081.20±0.25
_ 模型組 —10 一 29.96±3.05 ' 156.22±23.341.32±0.23
_ 治療組1019.25±4.23** 233.70±42.05* 1.97±0.18**
表2大鼠股骨、脛骨、腰椎密度值(X土S)
組別鼠數(shù)股骨(g/cm3)腔骨(g/cm3)腰椎(g/cm3)
空白對照組 10__0.61±0.04__0.58±0.03__0.62±0.04_
模型組 -10_ 0.41±0.12' 0.42±0.080.44±0.06
治療組100.59±0.07*0.59±0.05*0.58±0.04*根據(jù)表1和表2的實驗數(shù)據(jù)說明本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽對骨質疏松具有優(yōu)異的治療效果，證明本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽具有鮭魚降鈣素活性。
[0021]實驗2:
SD大鼠20只造成心肌缺血模型，然后隨機分成兩組(治療組和模型組)，治療組按體重2.5mg/kg劑量注射本實施方式降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，模型組注射同等劑量的生理鹽水。實驗進行4次，對大鼠心肌進行危險區(qū)域(AAR)、壞死區(qū)(IS)及壞死區(qū)與危險區(qū)域的比值檢測，檢測結果如表3所示。
[0022]表3
【權利要求】
1.降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合基因表達的多肽，其特征在于降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；且降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽C端酰胺化。
2.權利要求1所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，其中將msCT第8位的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?、?6位的亮氨酸用丙氨酸置換、再刪除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
3.權利要求1所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽，其中融合多肽生物學活性為4500IU/mg，C端非酰胺化的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽生物學活性為 100 ~200IU/mg。
4.一種藥物組合物，其特征在于含有權利要求1所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽及一種或多種藥用輔料。
5.權利要求4所述的組合物，其中所述的組合物為固體制劑或液體制劑。
6.權利要求5所述的組合物，其中所述的固體制劑為膠囊、軟膠囊、片劑、含片、顆粒劑或滴丸；液體制劑為口服液或注射液。
7.權利要求1所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽在制備治療骨質疏松藥物方面的應用。
8.權利要求1所述的降鈣素基因相關肽與鮭魚降鈣素融合多肽在制備治療心肌缺血造成的心肌梗塞藥物方面的應用。
【文檔編號】A61K38/17GK103665167SQ201210328864
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權日:2012年9月7日
【發(fā)明者】李虹 申請人:天津拓飛生物科技有限公司