專利名稱：一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病與骨質(zhì)疏松癥正威脅著人類的生命健康，尤其給老年人的生活帶來(lái)嚴(yán)重影響。目前治療兩種疾病的有效藥物分別是降鈣素基因相關(guān)肽(haCGRP)和鮭魚降鈣素(sCT)。降鈣素(Calcitonin，CT)具有調(diào)節(jié)鈣-磷代謝、抑制骨基質(zhì)分解、促進(jìn)成骨的功 能?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用的是鮭魚降鈣素(sCT)，其活性比人降鈣素活性高40倍。降I丐素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是迄今所知的人體最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)。CGRP在擴(kuò)張正常、病變冠狀動(dòng)脈的同時(shí)，還可增加側(cè)支循環(huán)，改善血液供應(yīng)。但目前臨床用h a CGRP與sCT主要是通過(guò)組織提取或化學(xué)合成的方法獲得，存在來(lái)源有限和價(jià)格昂貴等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素的來(lái)源有限且價(jià)格昂貴的問(wèn)題，提供一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法。本發(fā)明表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，按以下步驟進(jìn)行—、將宇番一號(hào)番茄種子用無(wú)菌水浸泡2d，然后用體積濃度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、將消毒后的番茄種子用無(wú)菌蒸餾水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培養(yǎng)基上，在26 28°C下光照培養(yǎng)11 13d，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真葉長(zhǎng)出前，取番茄幼苗子葉中部0. 5X0. 5cm作為外植體，將上表皮向下接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2d ；四、用接菌環(huán)挑取一環(huán)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株，接種于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培養(yǎng)基中，于28°C、220rpm振蕩培養(yǎng)，至菌液OD6tltl為0. 4，將菌液于4°C、4500rpm離心收集菌體，然后重懸于50mL YEB培養(yǎng)基中，作為轉(zhuǎn)化用的侵染液；五、將步驟三預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入步驟四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植體吸干表面侵染液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25 27°C暗培養(yǎng)；六、將暗培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)至脫菌培養(yǎng)基中，于25 27°C培養(yǎng)5d，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為18h/d，然后將外植體轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上，于25 27°C培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，光周期為16h光照8h黑暗，每IOd更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出2 3cm的抗性芽，將抗性芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 20d，煉苗，植入裝有沙壤土的花盆中，獲得再生苗，對(duì)再生苗進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因番茄；其中步驟一中消毒液為10% NaC10+2% SDS的水溶液。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)sCT和ha CGRP融合基因。此種方法安全、生產(chǎn)成本低、易于操作，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)治療性蛋白奠定基礎(chǔ)。結(jié)果在1083個(gè)外植體得到的131株轉(zhuǎn)基因抗性植株中，有78株顯示出與質(zhì)粒所擴(kuò)增的目的片段大小一致的條帶，陽(yáng)性率59. 54%，轉(zhuǎn)化率7. 20%。


圖I為具體實(shí)施方式
九中測(cè)序峰圖；圖2為具體實(shí)施方式
九中測(cè)序峰圖；圖3為具體實(shí)施方式
九中測(cè)序峰圖；圖4為具體實(shí)施方式
九中測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)結(jié)果 圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式表達(dá)降I丐素基因相關(guān)肽與鮭魚降I丐素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、將宇番一號(hào)番茄種子用無(wú)菌水浸泡2d，然后用體積濃度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、將消毒后的番茄種子用無(wú)菌蒸餾水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培養(yǎng)基上，在26 28°C下光照培養(yǎng)11 13d，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真葉長(zhǎng)出前，取番茄幼苗子葉中部0. 5X0. 5cm作為外植體，將上表皮向下接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2d ；四、用接菌環(huán)挑取一環(huán)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株，接種于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培養(yǎng)基中，于28°C、220rpm振蕩培養(yǎng)，至菌液OD6tltl為0. 4，將菌液于4°C、4500rpm離心收集菌體，然后重懸于50mL YEB培養(yǎng)基中，作為轉(zhuǎn)化用的侵染液；五、將步驟三預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入步驟四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植體吸干表面侵染液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25 27°C暗培養(yǎng)；六、將暗培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)至脫菌培養(yǎng)基中，于25 27°C培養(yǎng)5d,光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為18h/d，然后將外植體轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上，于25 27°C培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，光周期為16h光照8h黑暗，每IOd更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出2 3cm的抗性芽，將抗性芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 20d，煉苗，植入裝有沙壤土的花盆中，獲得再生苗，對(duì)再生苗進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因番茄；其中步驟一中消毒液為10% NaC10+2% SDS的水溶液。本實(shí)施方式步驟一中所述宇番一號(hào)番茄種子購(gòu)買自哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。本實(shí)施方式步驟四中降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株已在專利文獻(xiàn)《降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因序列及其轉(zhuǎn)基因工程菌株》中公開(kāi)，申請(qǐng)?zhí)枮?00810064960. 9。所述降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌轉(zhuǎn)入了 sCT和h a CGRP融合基因。步驟一中10% NaC10+2% SDS的水溶液為體積濃度為10%的NaClO和體積濃度為2%的SDS的水溶液。本實(shí)施方式步驟四中每升YEB培養(yǎng)基由5g牛肉浸膏、Ig酵母浸膏、5g蛋白胨、5g鹿糖、0. 5g MgSO4 H2O和余量的蒸懼水組成，pH為7. O。
具體實(shí)施方式
ニ 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng) 基為含有0. 5mg/L ZT和0. 5mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或ニ不同的是步驟三中預(yù)培養(yǎng)的條件為在26 28°C下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d。其它與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟五中共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L ZT和0. 5mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟六中脫菌培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L ZT、0. 5mg/L IAA和500mg/L Cef的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟六中篩選培養(yǎng)基為含有0. 5mg/L ZT、0.5mg/L IAA、500mg/L Cef和50mg/L Km的MS培養(yǎng)基。其它
與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟六中生根培養(yǎng)基為含有0. lmg/L IAA、250mg/L Cef和25mg/L Km的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟六中在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為在26 28°C下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d。其它與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，按以下步驟進(jìn)行—、將宇番一號(hào)番茄種子用無(wú)菌水浸泡2d，然后用體積濃度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、將消毒后的番茄種子用無(wú)菌蒸餾水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培養(yǎng)基上，在26 28°C下光照培養(yǎng)12d，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真葉長(zhǎng)出前，取番茄幼苗子葉中部0. 5X0. 5cm作為外植體，將上表皮向下接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2d ；四、用接菌環(huán)挑取一環(huán)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株，接種于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培養(yǎng)基中，于28°C、220rpm振蕩培養(yǎng)，至菌液OD6tltl為0. 4，將菌液于4°C、4500rpm離心收集菌體，然后重懸于50mL YEB培養(yǎng)基中，作為轉(zhuǎn)化用的侵染液；五、將步驟三預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入步驟四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植體吸干表面侵染液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于26°C暗培養(yǎng)；六、將暗培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)至脫菌培養(yǎng)基中，于26°C培養(yǎng)5d,光照強(qiáng)度為20001x,光照時(shí)間為18h/d，然后將外植體轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上，于26°C培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，光周期為16h光照8h黑暗，每IOd更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出2 3cm的抗性芽，將抗性芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d，煉苗，植入裝有沙壤土的花盆中，獲得再生苗，對(duì)再生苗進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因番茄；其中步驟一中消毒液為10%NaC10+2% SDS的水溶液。本實(shí)施方式步驟四中降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株在構(gòu)建時(shí)加入了抗Km基因，對(duì)Km具有抗性，可在含一定濃度的含有Km的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化體則不能生長(zhǎng)，因此篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)后可初步證明目的基因(即sCT和h a CGRP 融合基因)己導(dǎo)入到受體植物中。但由于假陽(yáng)性植株的存在，還要進(jìn)行進(jìn)ー步鑒定——PCR檢測(cè)及PCR產(chǎn)物測(cè)序。具體步驟如下使用TaKaRa植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取步驟六中獲得的再生苗的基因組DNA ；以再生苗的基因組DNA為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因片段的轉(zhuǎn)基因工程菌株質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)化番茄植株，空白對(duì)照為ddH20)，反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，按以下步驟進(jìn)行 一、將宇番一號(hào)番茄種子用無(wú)菌水浸泡2d，然后用體積濃度70%的乙醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ； 二、將消毒后的番茄種子用無(wú)菌蒸餾水洗凈，吸干表面水分后放入1/2MS培養(yǎng)基上，在26 28°C下光照培養(yǎng)11 13d，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d，得番茄幼苗； 三、在番茄幼苗的第一片真葉長(zhǎng)出前，取番茄幼苗子葉中部O.5X0. 5cm作為外植體，將上表皮向下接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2d ； 四、用接菌環(huán)挑取一環(huán)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌株，接 種于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培養(yǎng)基中，于28°C、220rpm振蕩培養(yǎng)，至菌液OD6tltl為O. 4，將菌液于4°C、4500rpm離心收集菌體，然后重懸于50mL YEB培養(yǎng)基中，作為轉(zhuǎn)化用的侵染液； 五、將步驟三預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入步驟四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植體吸干表面侵染液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25 27°C暗培養(yǎng)； 六、將暗培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)至脫菌培養(yǎng)基中，于25 27°C培養(yǎng)5d，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為18h/d,然后將外植體轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上，于25 27°C培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x,光周期為16h光照8h黑暗，每IOd更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出2 3cm的抗性芽，將抗性芽切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 20d，煉苗，植入裝有沙壤土的花盆中，獲得再生苗，對(duì)再生苗進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因番茄；其中步驟一中消毒液為10% NaC10+2% SDS的水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟三中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有O. 5mg/L ZT和O. 5mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟三中預(yù)培養(yǎng)的條件為在26 28°C下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟五中共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含有O. 5mg/L ZT和O. 5mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟六中脫菌培養(yǎng)基為含有O. 5mg/L ZT,O. 5mg/L IAA和500mg/L Cef 的 MS 培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟六中篩選培養(yǎng)基為含有O. 5mg/L ZT、0. 5mg/L IAA,500mg/L Cef 和 50mg/L Km 的 MS 培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟六中生根培養(yǎng)基為含有O. lmg/L IAA、250mg/L Cef和25mg/LKm的MS培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，其特征在于步驟六中在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為在26 28°C下光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為21001x，光照時(shí)間為18h/d。
全文摘要
一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法，涉及一種轉(zhuǎn)基因番茄的制備方法。本發(fā)明是要解決目前降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素的來(lái)源有限且價(jià)格昂貴的問(wèn)題。方法一、將番茄種子浸泡消毒；二、洗凈后放入1/2MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)得番茄幼苗；三、取幼苗子葉中部為外植體，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基；四、制備轉(zhuǎn)化用的侵染液；五、侵染，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基；六、轉(zhuǎn)至脫菌培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出抗性芽，將抗性芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，煉苗，植入土中獲得再生苗，鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因番茄。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)sCT和hαCGRP融合基因，安全、生產(chǎn)成本低、易于操作。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102757979SQ20121027346
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)