專利名稱：一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代人的生活和飲食習(xí)慣的改變，各種疾病的范圍也開始擴(kuò)大。目前心血管疾病與骨質(zhì)疏松癥正威脅著人類的生命健康，尤其給老年人的生活帶來(lái)嚴(yán)重影響。目前治療兩種疾病的有效藥物分別是降鈣素基因相關(guān)肽(haCGRP)和鮭魚降鈣素(sCT)。降鈣素(calcitonin，CT)是Copp等人于1962年發(fā)現(xiàn)并命名的一種具有調(diào)節(jié)血鈣濃度作用的多肽類激素，主要由哺乳動(dòng)物甲狀腺濾泡旁細(xì)胞或魚鳥等其他脊椎動(dòng)物的后鰓體分泌，并與甲狀旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)和維生素D3 (vitamin D3)共稱為隹丐代謝過(guò)程中的三大調(diào)節(jié)激素。降鈣素具有調(diào)節(jié)鈣-磷代謝、抑制骨基質(zhì)分解、促進(jìn)成骨的功能?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用的是鮭魚降鈣素(sCT)，其活性比人降鈣素活性高40倍。降I丐素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是迄今所知的人體最強(qiáng)的舒血管物質(zhì)。CGRP在擴(kuò)張正常、病變冠狀動(dòng)脈的同時(shí)，還可增加側(cè)支循環(huán)，改善血液供應(yīng)。但目前臨床用h a CGRP與sCT主要是通過(guò)組織提取或化學(xué)合成的方法獲得，存在來(lái)源有限和價(jià)格昂貴等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決目前降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素的來(lái)源有限且價(jià)格昂貴的問(wèn)題，提供一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法。本發(fā)明表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、將生菜種子用蒸餾水浸泡2 3h，用體積濃度為8%次氯酸鈉振蕩消毒30min，然后用無(wú)菌水將消毒后的生菜種子沖洗5 6次，每次lmin，吸干種子表面水分后擺放于1/2MS培養(yǎng)上，在25 27°C黑暗條件下培養(yǎng)I天，然后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，得生菜無(wú)菌苗；二、取7日齡的生菜無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)上剪取子葉柄0.5cm I.Ocm作為外植體，以正面朝上平鋪于不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3天；三、將400 u L降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌菌液加入至Ij 20mL含Kan 50mg/L、Rif 50mg/L的LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h后，按體積百分比2%的接種量接種到50mL LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h，獲得活化的菌液；四、取活化后的菌液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至OD6tltl為0. 1，將步驟二預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入稀釋后的菌液中，在恒溫?fù)u床上于28°C、180rpm浸泡5 30min，然后取出外植體吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，于21 23°C黑暗條件下共培養(yǎng)2d ；
五、將共培養(yǎng)2d的外植體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),每隔2周更換一次篩選分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出I. 2cm以上的抗性再生苗，將I. 2 2cm抗性再生苗切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20d，煉苗，移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)液的容器中進(jìn)行水培，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，獲得再生植株，對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因生菜。sCT與h a CGRP都屬于蛋白類物質(zhì)，在高溫條件下易變性失活，因此需以可生食的作物為載體才可以發(fā)揮其預(yù)防和治療的保健與藥用功效。生菜作為葉菜類作物的典型代表，具有新鮮、味美、低熱量和高營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，加之它生、熱皆可食用，使它成為了外源蛋白物質(zhì)表達(dá)的良好媒介。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將sCT-ha CGRP融合基因?qū)肷嘶蚪M中，經(jīng)篩選鑒定后最終獲得含sCT-ha CGRP融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜植株并將其進(jìn)行了擴(kuò)大繁殖，陽(yáng)性率約為80%，轉(zhuǎn)化率較高，可達(dá)到85%。未來(lái)期望能通過(guò)直接食用這種轉(zhuǎn)基因生菜或提取其融合表達(dá)產(chǎn)物來(lái)達(dá)到對(duì)心血管等疾病與骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行預(yù)防和治療的目的。


圖I為具體實(shí)施方式
十中測(cè)序峰圖；圖2為具體實(shí)施方式
十中測(cè)序峰圖；圖3為具體實(shí)施方式
十中測(cè)序峰圖；圖4為具體實(shí)施方式
十中測(cè)序峰圖；圖5為具體實(shí)施方式
十中測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式表達(dá)降I丐素基因相關(guān)肽與鮭魚降I丐素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、將生菜種子用蒸餾水浸泡2 3h，用體積濃度為8%次氯酸鈉振蕩消毒30min，然后用無(wú)菌水將消毒后的生菜種子沖洗5 6次，每次lmin，吸干種子表面水分后擺放于1/2MS培養(yǎng)上，在25 27°C黑暗條件下培養(yǎng)I天，然后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，得生菜無(wú)菌苗；二、取7日齡的生菜無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)上剪取子葉柄0.5cm I. Ocm作為外植體，以正面朝上平鋪于不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3天；三、將400 U L降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌菌液加入至Ij 20mL含Kan 50mg/L、Rif 50mg/L的LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h后，按體積百分比2%的接種量接種到50mL LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h，獲得活化的菌液；四、取活化后的菌液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至OD6tltl為0. 1，將步驟二預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入稀釋后的菌液中，在恒溫?fù)u床上于28°C、180rpm浸泡5 30min，然后取出外植體吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，于21 23°C黑暗條件下共培養(yǎng)2d ；五、將共培養(yǎng)2d的外植體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),每隔2周更換一次篩選分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出I. 2cm以上的抗性再生苗，將I. 2 2cm抗性再生苗切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20d，煉苗，移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)液的容器中進(jìn)行水培，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，獲得再生植株，對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因生菜。本實(shí)施方式步驟一中生菜種子的品種為美國(guó)大速生，購(gòu)自哈爾濱市子子發(fā)種苗研究所。本實(shí)施方式步驟二中LB培養(yǎng)基由10g/L蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/L NaCl和蒸餾水組成。本實(shí)施方式步驟三中降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌已在專利文獻(xiàn)《降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因序列及其轉(zhuǎn)基因工程菌株》中公開，申請(qǐng)?zhí)枮?00810064960. 9。所述降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌轉(zhuǎn)入了 sCT和h a CGRP融合基因。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二和步驟四中不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L 6-BA和0. 2mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟二中預(yù)培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx。其它與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是步驟五中篩選分化培養(yǎng)基為含有 I. 5mg/L 6-BA、0. 2mg/L IAA、25mg/L Kan 和 500mg/L Cefx 的 MS 培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟五中生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/L IAA、25mg/L Kan和500mg/L Cefx的MS培養(yǎng)基。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟五中轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C,光周期為16h光/8h暗,光照強(qiáng)度1600Lx。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟五中轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至七之一不同的是步驟五中水培的條件為溫度21 23°C，光周期為14h光/IOh暗，光照強(qiáng)度200iimol/m. S、空氣相對(duì)濕度70% 80%。其它與具體實(shí)施方式
一至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟五中每升營(yíng)養(yǎng)液由 0. 708g 的 Ca(NO3)2. 4H20、0. 06g 的 NH4H2PO4^O. 099g 的 KCl、0. 245g的 MgSO4. 7H20、8. 341 X 103g 的 FeSO4. 7H20、I. 81 X 103g 的 MnCl2. 4H20、0. 22 X 103g 的ZnSO4. 7H20、2. 86 X IO3g 的 H3BO3'0. 08 X IO3g 的 CuSO4. 5H20、0. 09 X IO3g 的(NH4)6Mo7O24 和余量的蒸餾水組成，PH為5. 8。其它與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，按以下步驟進(jìn)行一、將生菜種子用蒸餾水浸泡3h，用體積濃度為8%次氯酸鈉振蕩消毒30min，然后用無(wú)菌水將消毒后的生菜種子沖洗5次，每次lmin，吸干種子表面水分后擺放于1/2MS培養(yǎng)上，在26°C黑暗條件下培養(yǎng)I天，然后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，得生菜無(wú)菌苗；二、取7日齡的生菜無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)上剪取子葉柄0.8cm作為外植體，以正面朝上平鋪于不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3天，預(yù)培養(yǎng)的條件為溫度22°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx ；三、將400 u L降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌菌液加入至Ij 20mL含Kan 50mg/L、Rif 50mg/L的LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h后，按體積百分比2%的接種量接種到50mL LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h，獲得活化的菌液；四、取活化后的菌液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至OD6tltl為0. 1，將步驟二預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入稀釋后的菌液中，在恒溫?fù)u床上于28°C、180rpm浸泡30min,然后取出外植體吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，于22°C黑暗條件下共培養(yǎng)2d ；五、將共培養(yǎng)2d的外植體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx，每隔2周更換一次篩選分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出I. 2cm以上的抗性再生苗，將I. 2 2cm抗性再生苗切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d，培養(yǎng)條件為溫度22°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx，煉苗，移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)液的容器中進(jìn)行水培，水培的條件為溫度22°C，光周期為14h光/IOh暗，光照強(qiáng)度200iimol/m. S、空氣相對(duì)濕度75%，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，獲得再生植株，對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因生菜。步驟二和步驟四中不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L 6-BA和0. 2mg/L IAA的MS培養(yǎng)基。步驟五中篩選分化培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L 6-BA、0. 2mg/L IAA、25mg/L Kan和500mg/L Cefx的MS培養(yǎng)基。步驟五中生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/L IAA、25mg/L Kan和500mg/L Cefx的MS培養(yǎng)基。步驟五中每升營(yíng)養(yǎng)液由0. 708g的Ca(NO3)2. 4H20、0. 06g的 NH4H2P04、0. 099g 的 KCl、0. 245g 的 MgSO4. 7H20、8. 341 X IO3g 的 FeSO4. 7H20、1. 81 X IO3g的 MnCl2. 4H20、0. 22 X IO3g 的 ZnSO4. 7H20、2. 86 X IO3g 的 H3B03、0. 08 X IO3g 的 CuSO4. 5H20、
0.09 X IO3g的(NH4)6Mo7O24和余量的蒸餾水組成，pH為5. 8。對(duì)步驟五獲得的再生植株進(jìn)行鑒定，鑒定方法為PCR檢測(cè)及PCR產(chǎn)物測(cè)序。具體步驟如下使用TaKaRa植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取步驟五獲得的再生植株的基因組DNA ;以再生植株的基因組DNA為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因片段的轉(zhuǎn)基因工程菌株質(zhì)粒，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因生菜，空白對(duì)照為ddH20)，反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，按以下步驟進(jìn)行 一、將生菜種子用蒸餾水浸泡2 3h，用體積濃度為8%次氯酸鈉振蕩消毒30min，然后用無(wú)菌水將消毒后的生菜種子沖洗5 6次，每次lmin，吸干種子表面水分后擺放于1/2MS培養(yǎng)上，在25 27°C黑暗條件下培養(yǎng)I天，然后再進(jìn)行光照培養(yǎng)，得生菜無(wú)菌苗； 二、取7日齡的生菜無(wú)菌苗，超凈工作臺(tái)上剪取子葉柄0.5cm I. Ocm作為外植體，以正面朝上平鋪于不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3天； 三、將400y L降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合多肽轉(zhuǎn)基因工程菌菌液加入到20mL含Kan 50mg/L、Rif 50mg/L的LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h后，按體積百分比2%的接種量接種到50mL LB培養(yǎng)基中，在28°C、180rpm搖床培養(yǎng)24h，獲得活化的菌液； 四、取活化后的菌液，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至OD_為0.1，將步驟二預(yù)培養(yǎng)后的外植體投入稀釋后的菌液中，在恒溫?fù)u床上于28°C、180rpm浸泡5 30min,然后取出外植體吸干表面菌液，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，于21 23°C黑暗條件下共培養(yǎng)2d ； 五、將共培養(yǎng)2d的外植體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2周更換一次篩選分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至外植體上長(zhǎng)出I. 2cm以上的抗性再生苗，將I. 2 2cm抗性再生苗切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20d，煉苗，移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)液的容器中進(jìn)行水培，每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，獲得再生植株，對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定，獲得的陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因生菜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟二和步驟四中不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有1.5mg/L6-BA 和 0. 2mg/L IAA 的 MS 培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟二中預(yù)培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中篩選分化培養(yǎng)基為含有I. 5mg/L 6-BA、0. 2mg/LIAA、25mg/L Kan 和 500mg/L Cefx 的 MS 培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中生根培養(yǎng)基為含有0.2mg/L IAA、25mg/L Kan和500mg/L Cefx 的 MS 培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件為溫度21 23°C，光周期為16h光/8h暗，光照強(qiáng)度1600Lx。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中水培的條件為溫度21 23°C，光周期為14h光/IOh暗，光照強(qiáng)度200iimol/m. S、空氣相對(duì)濕度70% 80%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，其特征在于步驟五中每升營(yíng)養(yǎng)液由0. 708g的Ca(NO3)2. 4H20、0. 06g的 NH4H2P04、0. 099g 的 KCl、0. 245g 的 MgSO4. 7H20、8. 341 X IO3g 的 FeSO4. 7H20、1. 81 X IO3g的 MnCl2. 4H20、0. 22 X IO3g 的 ZnSO4. 7H20、2. 86 X IO3g 的 H3B03、0. 08 X IO3g 的 CuSO4. 5H20、0.09 X IO3g的(NH4)6Mo7O24和余量的蒸餾水組成，pH為5. 8。
全文摘要
一種表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法，涉及一種轉(zhuǎn)基因生菜的制備方法。是要解決目前降鈣素基因相關(guān)肽與鮭魚降鈣素的來(lái)源有限且價(jià)格昂貴的問(wèn)題。方法一、將生菜種子浸泡、消毒、沖洗，培養(yǎng)得生菜無(wú)菌苗；二、取無(wú)菌苗子葉柄為外植體，平鋪于不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)；三、菌液的活化；四、取活化的菌液稀釋，將外植體投入稀釋后的菌液中浸泡，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基共培養(yǎng)；五、將外植體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長(zhǎng)出抗性再生苗，切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，煉苗，水培，獲得再生植株，鑒定為陽(yáng)性的即為轉(zhuǎn)基因生菜。本發(fā)明用于獲得含sCT-hαCGRP融合基因的轉(zhuǎn)基因生菜。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102796759SQ20121027351
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)