專利名稱：一種基因重組鮭魚降鈣素的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的基因重組鮭魚降鈣素(簡記為sCT)制備工藝。
目前，市場上的商品均為化學(xué)合成，但由于對硬件設(shè)備、合成試劑、生產(chǎn)環(huán)境要求苛刻，使得產(chǎn)品成本昂貴、規(guī)模化生產(chǎn)的固定投入巨大，且易污染環(huán)境。美國UNIGENE公司(Bio/Technology，1993，1164-70)等通過基因工程生產(chǎn)sCT是先由大腸桿菌表達(dá)得到羧基端(C末端)為甘氨酸(簡記為Gly)的sCT前體，再經(jīng)α-酰胺化酶(α-AE)的作用，加工為成熟重組sCT。由于所得的C末端為Gly的由33個氨基酸組成的sCT前體，必須用α-AE才能修飾C末端產(chǎn)生成熟sCT。問題是α-AE目前尚未商品化，通過生物提取或基因工程得到α-AE T藝復(fù)雜，不僅造成sCT生產(chǎn)周期延長，又提高了成本。也有研究通過使用具有乙?；δ艿恼婧思?xì)胞(如鼠垂體細(xì)胞AtT-20)來實(shí)現(xiàn)C末端酰胺化的(Protein Expression and Purification，1996，7347-354)，但是由于產(chǎn)率極低，故至今該酰胺化線路只能停留于實(shí)驗(yàn)室階段。竇鴻等利用大腸桿菌BL(21)為宿主，首先表達(dá)、純化得到33位為丙氨酸(簡記為Ala)的sCT前體再利用羧基肽酶進(jìn)行C端酰胺化，加工出成熟sCT(Productionof Recombinant Salmon Calcitonin by Amidation of Precursor Peptide Using EnzymaticTransacylation and Photolysis in Vitro.Dou Hong，Zhuang Mingqiang，Li Min，ChenChangqing，Mao Jifang.Biochem Biophys Res Commun.2000；267(1)362-367)，但其一，BL(21)宿主表達(dá)目的融合蛋白降解程度大于40％；其二，前體C術(shù)端為Ala，造成酰胺化產(chǎn)率下降；其三，羧基肽酶中帶入的蛋白酶A可降解sCT前體和酰胺化產(chǎn)物。以上種種原因造成生產(chǎn)投入較大、產(chǎn)率較低，成本高。
本發(fā)明提出的制備基因重組鮭魚降鈣素工藝，具體步驟如下(1)構(gòu)建含sCT前體cDNA融合表達(dá)載體pGEX-sCT前體的工程菌；(2)sCT工程菌的發(fā)酵；(3)分離、純化sCT前體；(4)sCT前體的酰胺化及復(fù)性成為成熟sCT；(5)sCT活性的測定；其中，在構(gòu)建sCT前體基因時，首先按其氨基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼編碼成若干DNA片段，并化學(xué)合成DNA片段，再拼接成sCT前體的全長cDNA(見圖3所示)，所拼接成的全長cDNA N端含蛋氨酸(Met)密碼子，以便通過CNBr裂解產(chǎn)生與天然sCT完全相同的N端氨基酸序列，C末端為亮氨酸(Leu)密碼子，以便使由大腸桿菌表達(dá)出的產(chǎn)物，可用羧基肽酶Y(CPD-Y)進(jìn)行C末端酰胺化。
本發(fā)明中，sCT cDNA構(gòu)建時退火、連接后的DNA片段直接與表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，抽提質(zhì)粒，雙酶切，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，再測序證實(shí)，省去利用克隆載體構(gòu)建sCT cDNA中間過程。
本發(fā)明中，構(gòu)建的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主(蛋白酶缺陷型宿主)，以避免表達(dá)的目的蛋白降解，提高產(chǎn)量。
本發(fā)明中，sCT的前體采用羧基肽酶-Y(CPD-Y)進(jìn)行酰胺化時，同時加入鄰硝基苯甘氨酰胺(O-PNGA)，使得sCT前體的第33位Leu被O-PNGA取代，成為光敏感的sCT-O-PNGA，該產(chǎn)物經(jīng)光解得線形sCT，并可通過空氣氧化折疊，重建二硫鍵，得到具有生物活性sCT。
此舉可提高酰胺化效率，降低酰胺化成本。
本發(fā)明中，在利用CPD-Y進(jìn)行C末端酰胺化時，反應(yīng)體系中加入DMSO(二甲亞砜)、Papstatin A，以增加酰胺化效率、抑制CPD-Y帶入的非特異水解酶活性，達(dá)到提高產(chǎn)率降低成本的目的。
本發(fā)明利用基因工程生產(chǎn)重組sCT，其步驟如

圖1所示。下面進(jìn)一步描述各步驟
1.合成sCT前體DNA片段及構(gòu)建含sCT前體cDNA的融合表達(dá)載體的工程菌為提高sCT在大腸桿菌中的表達(dá)量，按照sCT前體的氨基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼，編碼成若干DNA片段，使位于全長cDNA3’端為Leu的密碼子，以便使由大腸桿菌表達(dá)出的產(chǎn)物，可用CPD-Y進(jìn)行C末端酰胺化。DNA片段采用亞磷酸二酯法合成。將合成的DNA片段按常規(guī)用《BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》方法拼接起來。首先將片段磷酸化，再加熱至96℃后，退火到室溫，拼接成全長sCT前體cDNA，然后通過連接酶的作用與經(jīng)BamH1、Xho1雙酶切的pGEX-4T-3表達(dá)載體相連接，成為pGEX-sCT前體表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得工程菌。將其質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定插入序列后，進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的鑒定。
2.sCT工程菌的高密度發(fā)酵將工程菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，作為一級種子，次日將一級種子接種于含2％甘油的2-YT培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)，用作二級種子(詳見Lee SY，TIBTECH，1996，1498-105)，然后將二級種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。整個發(fā)酵過程pH控制在6.9左右，溶解氧在30％左右，攪拌速度逐漸增大，最高轉(zhuǎn)速每分鐘1200轉(zhuǎn)(詳見M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye. Appl Microbiol Biotechnol.1995，42703-708)。
3.分離純化sCT前體按常規(guī)采用親和層析從高密度發(fā)酵獲得的菌體中純化得到谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)-sCT前體的融合蛋白，經(jīng)酶或化學(xué)裂解，再經(jīng)離子交換層析、梯度反相凝膠脫鹽，獲得高純度的sCT的前體。
本步驟中，對融合蛋白可進(jìn)行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。使產(chǎn)生的S-磺酸化sCT(SO3-sCT)具有高穩(wěn)定性、高比活性。
4.sCT前體經(jīng)體外酰胺化，復(fù)性成為成熟sCT將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調(diào)pH值到6.0，加入sCT前體、CPD-Y，DMSO、Papstatin A于30℃保溫，反應(yīng)完成后用RP-C18脫鹽和純化，冷凍干燥，得到光敏感的中間體sCT-O-PNGA。將產(chǎn)物溶解于60mMNaHSO3甲醇-水溶液中，充入氬氣5分鐘，開始光解可得到線形sCT，反應(yīng)完成后用RP-C18脫鹽，再用高效液相(HPLC)純化。純化得到的線形肽，經(jīng)空氣氧化折疊，重建二硫鍵[以二甲基亞砜，半胱氨酸，K3(FeCN6)或谷胱甘肽為介質(zhì)的系統(tǒng)]，得到具有生物活性的sCT。
5.測定活性按《中國藥典》方法，將體重為40-50g同一來源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機(jī)分成5組(對照組、生產(chǎn)樣品高濃度組、生產(chǎn)樣品低濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品高濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品低濃度組)，每組10只，編號后，分別按順序，尾靜脈注射0.4ml相應(yīng)濃度的sCT標(biāo)準(zhǔn)品、生產(chǎn)樣品及空白稀釋液。給藥后準(zhǔn)確1小時，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡(luò)合劑比色法測定血鈣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按《中國藥典》附錄檢定統(tǒng)計法中量反應(yīng)平行線計算，隨機(jī)設(shè)計法計算效價以及實(shí)驗(yàn)誤差。并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)可靠性檢驗(yàn)。
本發(fā)明同以往的基因工程制備sCT工藝相比優(yōu)點(diǎn)在于工藝簡單、成本低廉、生產(chǎn)周期短。
基因重組sCT的制備一.材料與方法1.限制性內(nèi)切酶BamH1、Xho1購自Biolab，T4連接酶、T4激酶購自Promaga；凝血酶、羧基肽酶購自Sigma。
2.菌種與質(zhì)粒pGEX-4T-3購自Pharmacia Biotechs。E.coli WA873購自E.coli Genetic Stock Center，U.S.A。
3.瓊脂糖、生物瓊脂購自Sigma，酵母粉、蛋白胨購自O(shè)xid；質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；Glutathione Sepharose 4B、SP-Sepharose Fast Flowresin、G-25購自Pharmacia Biotech，RP-C18購自Merk。
4.質(zhì)粒DNA的制備及片段的回收按華舜生物工程公司試劑盒操作手冊。其它常規(guī)操作按Molecular Cloning ；發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定用SDS-PAGE法，染色膠用BioRad DENSITOMETER掃描；融合蛋白的純化按GlutathioneSepharose 4B操作手冊進(jìn)行。
5.高密度發(fā)酵參照[M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye.Appl MicrobiolBiotechnol.1995，42703-708]。
6.sCT的復(fù)性參照David Andreu，F(xiàn)ernando Alvericio，Nuria A.SoleMark C.Munson，Mare Ferrer；and George Barany.(1994)in Methods inMolecular Biology.Vol.35Peptide synthesis protocols(PenningtonM.W.and Dunn B.M.，Eds.)，pp91-169，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。
7.活性鑒定按《中國藥典》sCT的生物測定法測定注射sCT后大鼠血清鈣下降程度。
二.具體操作1.合成sCT前體DNA片段及構(gòu)建含sCT前體cDNA的融合表達(dá)載體的工程菌將sCT前體cDNA分為F′1-F′8，8個DNA片段采用亞磷酸二酯法由上海Sangon合成，序列詳見圖3。在連接反應(yīng)管中加入上述8個DNA片段各20pmol，10倍濃度的連接酶緩沖液3μl，T4激酶10單位，再加水19μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，置37℃ 30分鐘，再96℃ 2分鐘滅活T4激酶，經(jīng)30分鐘退火至20℃左右。取10μl退火片段溶液，加入6μl BamH1、Xho1雙酶切的pGEX-4T-3載體溶液、連接酶5單位，再加連接酶緩沖液2μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫蘇糖醇的終濃度分別為50mM、10mM、10mM，在14℃連接過夜。吸取該連接載體溶液10μl，加200μl WA837大腸桿菌溶液(約含106-107個感受態(tài)細(xì)胞)，冰浴30分鐘后，42℃ 90秒鐘，加入800μl LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)45分鐘后涂板。其插入序列通過雙酶切后由1％瓊脂糖凝膠鑒定大小，再由DNA測序證實(shí)。拼接成的全長cDNA為120bp，如圖3所示，其中包括5’BamH1位點(diǎn)(I)，3’Xho1位點(diǎn)(II)，兩個終止密碼(III)，在GST與sCT編碼序列之間加入ATG構(gòu)成CNBr裂解位點(diǎn)(IV)。為便于體外酰胺化修飾，在sCTC術(shù)端加Leu密碼子CTG(V)。
2.高密度發(fā)酵3μl OD600＝0.7的工程菌接種于3ml LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜作為一級種子，次日將3ml一級種子接種于200ml含2％甘油的2-YT培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)至OD600＝0.7用作二級種子，然后按常規(guī)將二級種子接種于含3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。整個發(fā)酵過程pH控制在6.9左右并不斷攪拌，為維持溶解氧在30％左右，需要不斷增加攪拌速度，轉(zhuǎn)數(shù)從起始每分鐘50轉(zhuǎn)，逐漸加大，在7小時左右達(dá)到最高速，每分鐘1200轉(zhuǎn)，然后供應(yīng)純氧，以維持大腸桿菌的需氧量。分批培養(yǎng)5小時后菌體密度達(dá)到50D600隨后進(jìn)入10小時的補(bǔ)料培養(yǎng)階段，菌體生長近10倍。37℃培養(yǎng)12小時，加入0.1mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，隨著目的蛋白表達(dá)量增加到一定程度，菌體的比生長速率明顯減小，生長趨勢開始減緩故終止發(fā)酵。發(fā)酵菌體終濃度53 OD600、重量150克/升，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，最終融合蛋白表達(dá)量占可溶菌體蛋白30％。誘導(dǎo)后融合蛋白表達(dá)量的變化，通過SDS-凝膠電泳圖譜(圖4)可以明顯地看出，加入IPTG后目的蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的增加而增加。圖中泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，泳道2為IPTG誘導(dǎo)前菌體蛋白電泳，3為IPTG誘導(dǎo)1小時菌體蛋白電泳，4為IPTG誘導(dǎo)1.5小時菌體蛋白電泳，4為IPTG誘導(dǎo)2小時菌體蛋白電泳，6為IPTG誘導(dǎo)2.5小時菌體蛋白電泳。分子量30kDa的條帶為目的蛋白，即GST-sCT前體融合蛋白3.純化sCT前體3.1.GST-sCT前體融合蛋白的純化將100g大腸桿菌菌體置于1000ml pH7.2的磷酸緩沖液中，冰浴中超聲破碎，加入20％Triton-X100終濃度1％，靜置30分鐘，15,000g離心25分鐘，取上清液與40ml Glutathione Sepharose 4B混合，溫和振搖30分鐘，500g離心5分鐘，將沉淀裝柱，磷酸緩沖液洗脫至OD280＜0.02，再用3倍于柱體積緩的沖液(10mM glutathione，50mMTris-HCl，pH8.0)洗脫，洗脫樣品用SDS-凝膠電泳分析結(jié)果見圖5，可溶性的菌體總蛋白經(jīng)過親和樹脂純化，獲得的目的融合蛋白GST-sCT前體純度大于80％。
3.2.S-磺酸化及溴化氰裂解用55％飽和(NH4)2SO4沉淀GST-sCT前體融合蛋白，15,000g離心15分鐘，加水調(diào)整蛋白濃度至10mg/ml。加入1/10體積1M Tris-HCl調(diào)至pH8.0，按52mg Na2SO3/ml融合蛋白和25mg Na2S4O4/ml融合蛋白的比例分別加入Na2SO3和Na2S4O4，避光反應(yīng)12小時。經(jīng)G-25柱(6×60cm)脫鹽(預(yù)先用10mMTris-HCl，pH8.0平衡)。收集洗脫液的流穿峰，加尿素至終濃度8M，加濃HCl至終濃度50mM，加入溴化氰避光反應(yīng)4小時，得重組sCT前體等裂解產(chǎn)物(圖5)。
3.3.裂解產(chǎn)物純化將上述裂解反應(yīng)液加4倍體積水，經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow層析柱，用1號液(2M尿素，10mMHCl)洗脫至OD280＜0.02，換2號液(2M尿素，10mMHCl，100mM NaCl)，用分光光度計，以220nm檢測，收集該吸收峰的洗脫液。收集液經(jīng)RP-C18柱，先用3號液(5％乙腈95％水0.1％三氟乙酸)洗脫至OD220＜0.02，再用38％-49％乙腈梯度洗脫，收集樣品，冰凍干燥得到重組sCT前體。HPLC分析產(chǎn)物，條件是流動相丙為水0.1％三氟乙酸，流動相丁為乙腈0.1％三氟乙酸，流速為每分鐘1ml，線性梯度為40分鐘丁流動相由0到80％，所得重組sCT前體產(chǎn)物純度大于95％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定sCT前體，見圖6，圖譜結(jié)果按3×(m/z)-3計算，表明sCT前體的分子量為3708，與理論計算完全一致。
4.體外酰胺化將含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH調(diào)pH值到6.0，加入sCT前體至終濃度1mM、羧基肽酶60μg、DMSO至終濃度4％、PAPSTATIN A50μM，置30℃水浴中120分鐘后用RP-C18脫鹽，冷凍干燥，得到光敏感中間體sCT-O-PNGA，圖譜結(jié)果按3×(m/z)-3計算(圖6)，與理論值相符。將其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水＝1∶1)溶液中，充入氬氣后進(jìn)行光解，可得到線形sCT，反應(yīng)完成后，RP-C18脫鹽，冷凍干燥，用HPLC進(jìn)行純化，條件同上。得到的線形sCT純度大于95％。
5.復(fù)性將sCT 1mg溶于1ml pH為8.0含0.1M Tris-HCl和5mM半胱氨酸的溶液中，置37℃ 5分鐘。HPLC純化產(chǎn)物，條件同上。得到的sCT純度大于99％。用電噴霧質(zhì)譜鑒定sCT見圖7，圖譜表明sCT分子量為3432，與理論計算值完全一致。
6.活性測定按《中國藥典》方法。將體重40-50g同一來源、同一品系、同一性別的健康大白鼠，隨機(jī)分成5組(對照組、人降鈣素類似物樣品高濃度組、人降鈣素類似物樣品低濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品高濃度組、標(biāo)準(zhǔn)品低濃度組)，每組10只，編號后，分別按順序，尾靜脈注射1×10-2單位和5×10-2單位兩種濃度的降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品和人降鈣素類似物樣品0.4ml/只，對照組注射空白稀釋液0.4ml/只。給藥后準(zhǔn)確1小時，分別取血樣，用鄰甲酚酞絡(luò)合劑比色法測定血鈣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按《中國藥典》附錄檢定統(tǒng)計法中量反應(yīng)平行線計算，隨機(jī)設(shè)計法計算效價以及實(shí)驗(yàn)誤差。并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)可靠性檢驗(yàn)。結(jié)果見表2。
表2.測定sCT的活性sCT樣品標(biāo)準(zhǔn)品劑量 0.01單位 0.05單位 0.01單位 0.05單位7.29 5.84 7.55 6.586.71 5.84 7.61 5.556.23 6.57 7.56 6.107.07 6.23 6.81 5.267.15 5.84 7.15 5.59反應(yīng)值y7.39 5.63 7.39 5.608.21 6.29 7.60 5.898.00 5.89 6.70 5.807.45 5.81 6.70 5.657.30 6.00 7.40 6.00結(jié)論回歸非常顯著、偏離平行不顯著，可靠性檢驗(yàn)通過，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。FL％＝33％。效價4100iu/mg。95％可信限率6232-2747。
權(quán)利要求
1.一種基因重組鮭魚降鈣素的制備工藝，包括(1)構(gòu)建含sCT前體cDNA融合表達(dá)載體pGEX-sCT前體的工程菌；(2)sCT工程菌的發(fā)酵；(3)分離、純化sCT前體；(4)sCT前體的酰胺化及復(fù)性成為成熟sCT；(5)sCT活性的測定；其特征在于構(gòu)建sCT前體基因時，首先按其氨基酸序列，用大腸桿菌的偏愛密碼編碼成若干DNA片段，并化學(xué)合成DNA片段，再拼接成sCT前體的全長cDNA，所拼接成的全長cDNA N端含蛋氨酸密碼子，以便通過CNBr裂解產(chǎn)生與天然sCT完全相同的N端氨基酸序列，C末端為亮氨酸密碼子，以便使由大腸桿菌表達(dá)出的產(chǎn)物，可用羧基肽酶Y進(jìn)行C末端酰胺化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征在于構(gòu)建的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主，以避免表達(dá)的目的蛋白降解。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征在于sCT的前體采用羧基肽酶-Y進(jìn)行酰胺化時，同時加入鄰硝基苯甘氨酰胺，使得sCT前體的第33位Leu被O-PNGA取代，成為光敏感的sCT-O-PNGA，該產(chǎn)物經(jīng)光解得線形sCT，并可通過空氣氧化折疊，重建二硫鍵，得到具有生物活性sCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在于在利用CPD-Y進(jìn)行C末端酰胺化時，反應(yīng)體系中加入二甲亞砜、Papstatin A，以增加酰胺化效率、抑制CPD-Y帶入的非特異水解酶活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備工藝，其特征在對融合蛋白進(jìn)行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因重組鮭魚降鈣素(sCT)的制備工藝，是對原工藝作了許多重要改進(jìn)，例如，使大腸桿菌基因表達(dá)的sCT前體C末端為亮氨酸，以便能使用CPD－Y進(jìn)行C末端酰胺化；構(gòu)建的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化由Ecoli.B衍生的大腸桿菌宿主，以避免表達(dá)的目的蛋白降解，提高融合蛋白產(chǎn)量等等。本發(fā)明方法工藝簡單、成本低廉、生產(chǎn)周期短，且不會造成環(huán)境污染。
文檔編號C12N15/16GK1441058SQ0211105
公開日2003年9月10日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者竇鴻, 趙東, 朱彤 申請人:竇鴻, 趙東, 朱彤