專利名稱：利用人hsf4基因及其編碼產物診斷和治療晶狀體病變的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學領域。更具體地，本發(fā)明涉及利用人熱休克蛋白轉錄因子HSF4基因及其編碼產物診斷和治療晶狀體病變(尤其是白內障)的方法，以及含有HSF4基因和/或蛋白的藥物組合物。
背景技術：
白內障是一種常見的眼科疾病，是人類致盲的主要因素之一，是嚴重影響人民生活質量的重要疾病。在白內障中，其主要原因是填充于晶狀體中的晶體蛋白變性、沉積所致。晶體蛋白主要分為三類α-晶體蛋白，β-晶體蛋白，γ-晶體蛋白，γ-晶體蛋白又分為七類A，B，C，D，E，F，S-晶體蛋白。已有文獻報道，一些晶體蛋白的改變可導致晶狀體的病變、白內障。然而，迄今為止，尚沒有充分揭示白內障的確切原因，也沒有人揭示出白內障與某種蛋白存在直接的相關性。
此外，本領域還缺乏早期診斷白內障疾病的有效方法以及非手術治療白內障的有效手段。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的診斷和治療白內障的有效方法，以及相關的治療藥物，診斷技術和試劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的診斷(尤其是早期診斷)白內障等晶狀體病變的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療白內障等晶狀體病變的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療白內障等晶狀體病變的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的白內障易感性進行診斷的方法，它包括步驟
檢測該個體的HSF4基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的HSF4基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患白內障的可能性高于正常人群。
較佳地，被檢測的是HSF4的基因或轉錄本(包含HSF4a，HSF4b以及其他不同的轉錄本)，并與正常HSF4核苷酸序列比較差異。更佳地，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中第348位T→C；SEQ ID NO2中第115位氨基酸由Leu→Pro。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種治療晶狀體病變的方法，它包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常HSF4蛋白。較佳地，HSF4蛋白被局部施用于眼部。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的人HSF4蛋白以及藥學上可接受的載體。較佳地，它是眼藥水或眼藥膏。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測晶狀體病變的試劑盒，它包括特異性擴增HSF4基因或轉錄本的引物。較佳地，它還含有與突變部位結合的探針和/或識別突變位點的酶。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了一常染色體顯性白內障家系的譜系圖。
圖2顯示了該白內障家系病人的白內障眼部病變。
圖3顯示了遺傳連鎖分析結果。
圖4顯示了HSF4基因中的序列變化，其中正常人序列“…CTACTG…”在白內障家系的病人中兩條染色體有一條的核酸序列改變?yōu)椤啊瑿TACCG…”，這一變化直接導致了其編碼產物由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)。
具體實施例方式
熱休克蛋白轉錄因子HSF4是一種已知的蛋白，其基本信息如下英文Homo sapiens for transcript ion factor HSF4(Heat Shocktranscription Factor 4)NCBIContigNT 010478mRNAHomo sapiens heat shock transcription factor 4(HSF4)，mRNAgi|4557650|ref|NM_001538.1|[4557650]HSF4的mRNA序列如SEQ ID NO1所示，ORF位于第5-1393位，編碼一個全長463個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)。HSF4的其他信息可以從Http//www.ncbi.nlm.nih.gov獲得。
本發(fā)明人經過多年研究，首次發(fā)現和證明了熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)與白內障密切相關，而且發(fā)現了它的新功能熱休克蛋白轉錄因子的改變將直接導致晶狀體的病變、白內障。在此基礎上完成了本發(fā)明。
通過對一常染色體顯性白內障家系進行遺傳連鎖分析、候選基因篩選以及大規(guī)模測序，已證實，熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)的突變導致了人類個體表現為晶狀體的病變、白內障。我們的研究表明，人HSF4蛋白轉錄因子不但與熱休克蛋白密切相關，而且具有調控晶狀體蛋白穩(wěn)定的作用，它的穩(wěn)定存在是維持晶狀體正常生理狀態(tài)的關鍵。
根據蛋白同源性比較，人類的熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)比較保守。因此人類的熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)的變異是導致白內障等晶狀體病變的直接原因之一。根據此基因及其表達產物設計的藥物和診斷治療技術，可用于診斷和治療人類的晶狀體的病變。
本發(fā)明的人HSF4核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據HSF4的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
將HSF4編碼序列插入合適的表達載體，再轉入宿主細胞，就可以分離出HSF4蛋白。
基于本發(fā)明的新發(fā)現，HSF4蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療HSF4蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如白內障)，和用于篩選促進HSF4蛋白功能的物質，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人HSF4蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人HSF4蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人HSF4 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人HSF4基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HSF4基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人HSF4蛋白的分子，也包括那些并不影響人HSF4蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人HSF4基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HSF4蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人HSF4蛋白功能的抗體以及不影響人HSF4蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人HSF4基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人HSF4基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人HSF4蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人HSF4蛋白。一種優(yōu)選的抗HSF4抗體是不識別正常HSF4但識別突變HSF4(如SEQID NO2中第115位由Leu→Pro的HSF4)的抗體，或者識別正常HSF4但不識別突變HSF4的抗體。利用該抗體對正常和異常HSF4蛋白的特異性差異，可以方便地進行蛋白質水平的白內障易感性檢測。
利用本發(fā)明HSF4蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與HSF4蛋白發(fā)生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明HSF4蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中， 其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、靜脈內、皮下、或局部給藥(包括眼球旁注射、眼球后注射、眼球內注射)。較佳地是在眼部局部給藥。
正常的HSF4多肽可直接用于疾病治療，例如，用于白內障等晶狀體病變方面的治療。在使用本發(fā)明HSF4蛋白時，還可同時使用其他治療白內障的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明HSF4蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如眼藥水或眼藥膏、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如眼藥水、眼藥膏、針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的HSF4蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
人HSF4蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g可用于治療由于HSF4蛋白的無表達或異常/無活性的HSF4蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構建攜帶HSF4基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人HSF4基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人HSF4蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測檢測樣品中是否存在HSF4蛋白的方法是利用HSF4蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與HSF4蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在HSF4蛋白。
HSF4蛋白的多聚核苷酸可用于HSF4蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HSF4蛋白的多聚核苷酸可用于檢測HSF4蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下HSF4蛋白的異常表達。如HSF4 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷HSF4蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HSF4蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HSF4蛋白的轉錄產物。
本發(fā)明還提供了一種檢測人HSF4基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)確定在人HSF4基因的SEQ ID NO1所示序列的第348位的核苷酸；和(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)。一種具體SNP是348位處T→C。
檢測人類熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)基因的突變也可用于診斷白內障。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA(測序所用引物均是針對基因組DNA，可參見SEQ ID3-8)。HSF4蛋白突變的形式包括與正常野生型HSF4 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1常染色體顯性白內障家系的確定1.1對象一個白內障大家系，其先天性白內障共有5代，65人。其中繞核性白內障患者共有31人(圖1)。
1.2臨床檢查1.2.1視力使用視力表進行裸眼視力和插片校正視力的的檢查。
1.2.2擴瞳檢查使用裂隙燈或手電筒觀察晶體混濁情況，直接眼底鏡觀察眼底情況。
裂隙燈下見該家系的晶體混濁特點是典型的繞核型改變，即混濁的胎兒核包繞著透明的胚胎核，其外又為透明的晶體結構(見圖2)。在調查到的所有患者中，晶體混濁表現除了程度上略有差別外，形態(tài)上一致。除了一名10月的患兒表現為環(huán)繞胚胎核的一圈位于胎兒核內的白色點狀混濁。
該家系發(fā)病特點是雙眼發(fā)病，進展緩慢，視力影響中等，裸眼視力一般在0.1-0.3。伴有低度近視。由于當地醫(yī)療及交通條件限制，一般均在上學后7歲左右發(fā)現視力較差影響學業(yè)，而就診。
在所有患者中除了有一名6歲的女孩伴有單眼的先天性上瞼下垂外，無其它先天性眼部異常。在所有患者中未發(fā)現有全身其它疾病。
1.3分離分析分別使用Li-Mantal-Gart法和SEGRAN B法進行分離分析，分析該家系的遺傳類型。
1.3.1 Li-Mantal-Gart法由于本家系為完全確認，使用單病例法(Singles method或稱Li-Mantal-Gatt法)進行分析，結果如下每戶同胞數家庭數同胞總數患病數同胞中僅有一例患者的家庭數16 6 6 624 8 4 431 3 2 042 8 5 073 21 15 0合計 16 46(J) 31(R) 10(J)分離比P＝(R-J)/(T-J)P欲待校正大估計分離比R患兒總數T同胞總數J家庭內同胞中只有一例患者的家庭數方差SP2＝(R-I)(T-R)/(T-J)3標準誤SE=SP2]]>95％的可信區(qū)間P±1.96SE95％的可信區(qū)間45.185％--77.0152％估計的P值包括0.25，可初步認為本病為一常染色體顯性遺傳病。1.3.2使用軟件應用SEGRAN B法進行分離分析結果如下每戶同胞數同胞中患病數家庭數1 1 62 1 43 2 14 2 14 3 17 5 3由于本家系為完全確認，故i(確認概率)為1，x(散發(fā)概率)為0經檢驗i＝1 x2＝0.1996＜3.84 x＝o x2＝0.17<3.84驗證確認概率i＝1，x＝o有意義SEGRAN B法P＝0.54 經檢驗P＝4.0000478，P＞3.84有統(tǒng)計學意義。故為常染色體顯性遺傳。
1.4病理檢查在對該家系中兩名患者進行ECCE+IOL植入術中，取出其晶體，用眼球固定液固定，嗜伊紅染色，光鏡下觀察。并取相同年齡行眼摘后透明晶體，采用同樣的方法進行病理觀察，作為對照。
光鏡下嗜伊紅染色顯示在胎兒核區(qū)可見散在藍色圓點狀嗜鹼顆粒，而在中央胚胎核區(qū)及其外皮質區(qū)未見該結構。在相同年齡透明晶體中亦未見此改變。
2.1遺傳連鎖分析利用微衛(wèi)星標記進行該家系的連鎖分析。共利用384對微衛(wèi)星引物(RESEARCH GENETICS)對整個基因組進行掃描，將該家系白內障基因定位于人的第16號染色體上。進一步合成引物將致病基因定位到微衛(wèi)星標記D16S3095與D16S3129之間的5.11(cM)厘摩的遺傳距離內，如圖1和3所示。此物理距離大約有7百萬個堿基對，130多個基因。
2.2候選基因對候選基因，設計PCR引物，PCR擴增出候選基因，然后進行測序。經過9對引物對候選基因熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)的測序，發(fā)現熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)與該家系的白內障密切相關。
對下列兩對引物擴增出的PCR產物(第一對和第二對引物的擴增產物分別為483和556bp)進行測序，均發(fā)現該白內障家系中熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)的mRNA(NM 001538)的348T變?yōu)镃(即SEQ ID NO1中)，其編碼產物由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)見圖4。
名稱 序列(5’→3’) 長度 編號第一對 HSF4_Ex23_Fwd AGCGCAGGACTGGCCGTGAG 20SEQ ID NO3HSF4_Ex23_Rev GGGACTGGGTCGCAGGAGCA 20SEQ ID NO4第二對 HSF4_Ex34_Fwd AGTGCTGCCCCAGTATTTCAAG 22SEQ ID NO5HSF4_Ex34_Rev GCCAGTTATGGTCTCATCCCG21SEQ ID NO6通過結構預測，表明改變了HSF4該區(qū)域的蛋白結構。經過與其他物種同源比較，突變處的氨基酸十分保守，并位于HSF4蛋白與DNA相結合的關鍵區(qū)域。
此外，再經過兩百個隨機挑選的正常人比較，均未發(fā)現有此變化。因此表明了熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)與人類的白內障的發(fā)生密切相關，此基因及其編碼產物可對人類的白內障起重要作用。
實施例3白內障檢測試劑盒的制備如圖4所示，正常人序列″…CTACTG…″在白內障家系的病人中兩條染色體有一條的核酸序列改變?yōu)椤濉瑿TACCG…″，這一變化直接導致了其編碼產物由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)，導致了病人表現為白內障。因此，可基于這一突變設計引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測，例如SEQ ID NO3和4，以及SEQ ID NO5和6。
此外，正常人的核酸序列“ACTGG”可被限制性內切酶BsrS I所識別，而第348位發(fā)生T→C突變后，酶切位點就發(fā)生改變。
制備一試劑盒(100人次)，它含有名稱序列(5’→3’)編號 數量正向引物5’-agtgctgccccagtatttcaag-3’SEQ ID NO7 100pmol反向引物5’-gggactgggtcgcaggagca-3’ SEQ ID NO8 100pmolBsrS I酶10UPCR緩沖液 若干酶切緩沖液 若干以病人血液DNA為模板，用該試劑盒擴增HSF4檢測白內障時，擴增出的產物為356bp。正常人經BsrS I酶酶切后，擴增產物可以酶解成252bp、87bp、10bp、7bp的四個片段(酶切位點為10、262、349)。
病人的染色體因“T”變?yōu)椤癈”，將不被限制性內切酶BsrS I所識別，這樣此356bp的PCR產物就可被限制性內切酶BsrS I酶解成339bp、10bp、7bp的三個片段(酶切位點為10、和349)。通過電泳可以輕易地區(qū)分。
實施例4藥物組合物的制備可以通過構建含有人類正常熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)基因轉錄本的表達載體進行表達或通過液相色譜從人和動物天然蛋白中分離而來的正常HSF4蛋白制成針劑，對病人眼下進行肌肉注射，補充正常人類正常熱休克蛋白轉錄因子(HSF4)蛋白使病人的白內障得以改善甚至治愈。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生物工程研究中心<120>利用人HSF4基因及其編碼產物診斷和治療晶狀體病變的方法<130>020717<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1555<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(5)..(1393)<223><400>1ccgg atg gtg cag gaa gcg cca gct gcg ctg ccc acg gag cca ggc ccc 49Met Val Gln Glu Ala Pro Ala Ala Leu Pro Thr Glu Pro Gly Pro1 5 10 15agc ccc gtg cct gcc ttc ctc ggc aag cta tgg gcg ctg gtg ggg gac 97Ser Pro Val Pro Ala Phe Leu Gly Lys Leu Trp Ala Leu Val Gly Asp20 25 30cca ggc aca gac cac ctg atc cgc tgg agc ccg agc ggg acc agt ttc 145Pro Gly Thr Asp His Leu Ile Arg Trp Ser Pro Ser Gly Thr Ser Phe35 40 45ctc gta agc gac cag agc cgt ttc gcc aag gaa gtg ctg ccc cag tat 193Leu Val Ser Asp Gln Ser Arg Phe Ala Lys Glu Val Leu Pro Gln Tyr50 55 60ttc aag cat agc aac atg gcg agc ttc gtg cgc caa ctc aac atg tac 241Phe Lys His Ser Asn Met Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr65 70 75ggt ttt cgg aag gtg gtg agc atc gag cag ggc ggc ctg ctt agg ccg 289Gly Phe Arg Lys Val Val Ser Ile Glu Gln Gly Gly Leu Leu Arg Pro80 85 90 95gag cgc gac cac gtc gag ttc cag cac ccg agc ttc gtg cgc ggc cgc 337Glu Arg Asp His Val Glu Phe Gln His Pro Ser Phe Val Arg Gly Arg100 105 110gag cag cta ctg gag cgc gtg cgg cgc aag gtg ccc gcg ctg cgc ggc 385Glu Gln Leu Leu Glu Arg Val Arg Arg Lys Val Pro Ala Leu Arg Gly115 120 125gac gac ggc cgc tgg cgc ccg gag gac ctg ggt cga cta ctg ggc gag 433Asp Asp Gly Arg Trp Arg Pro Glu Asp Leu Gly Arg Leu Leu Gly Glu130 135 140gtg cag gct ttg cgg gga gtg cag gag agc acc gag gcg cgg ctg cgg 481Val Gln Ala Leu Arg Gly Val Gln Glu Ser Thr Glu Ala Arg Leu Arg145 150 155gag ctc agg cag cag aac gag atc ttg tgg cgg gag gtg gtg aca ctt 529Glu Leu Arg Gln Gln Asn Glu Ile Leu Trp Arg Glu Val Val Thr Leu160 165 170 175cgg cag agc cac ggt cag cag cac cgg gtc att ggc aag ctg atc cag 577Arg Gln Ser His Gly Gln Gln His Arg Val Ile Gly Lys Leu Ile Gln180 185 190tgt ctc ttt ggg cca ctt cag gcg ggg ccg agc aat gca gga ggc aag 625Cys Leu Phe Gly Pro Leu Gln Ala Gly Pro Ser Asn Ala Gly Gly Lys195 200 205aga aag ctg tcc ctg atg ctg gat gag ggg agc tca tgc cca aca cct 673Arg Lys Leu Ser Leu Met Leu Asp Glu Gly Ser Ser Cys Pro Thr Pro210 215 220gcc aag ttc aac acc tgc cct cta cct ggt gcc ctt ctg cag gac ccc 721Ala Lys Phe Asn Thr Cys Pro Leu Pro Gly Ala Leu Leu Gln Asp Pro225 230 235tac ttc atc cag tcg cct tct act tac agc ctc tcc cag aga caa att 769Tyr Phe Ile Gln Ser Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Gln Arg Gln Ile240 245 250 255tgg gcc tta gcc ctc aca ggg cca ggg gcc cca tca tct ctg aca tcc 817Trp Ala Leu Ala Leu Thr Gly Pro Gly Ala Pro Ser Ser Leu Thr Ser260 265 270cag aag act ctc cat ccc ctg agg gga cca ggc ttt ctc cct cca gtg 865Gln Lys Thr Leu His Pro Leu Arg Gly Pro Gly Phe Leu Pro Pro Val275 280 285atg gca gga gcc ccc ccg cca ctg cct gtg gct gtg gtg cag gcc atc 913Met Ala Gly Ala Pro Pro Pro Leu Pro Val Ala Val Val Gln Ala Ile290 295 300ctg gaa ggg aaa ggg agc ttc agc ccc gag ggg ccc agg aat gcc caa 961Leu Glu Gly Lys Gly Ser Phe Ser Pro Glu Gly Pro Arg Asn Ala Gln
305 310 315cag cct gaa cca ggg gat ccc agg gag ata cct gac agg ggg cct ctg 1009Gln Pro Glu Pro Gly Asp Pro Arg Glu Ile Pro Asp Arg Gly Pro Leu320 325 330 335ggc ctg gaa agc ggg gac agg agc cca gag agt ctg ctg cct ccg atg 1057Gly Leu Glu Ser Gly Asp Arg Ser Pro Glu Ser Leu Leu Pro Pro Met340 345 350ctg ctt cag ccc cct caa gaa agt gtg gaa cct gca ggg cct cta gat 1105Leu Leu Gln Pro Pro Gln Glu Ser Val Glu Pro Ala Gly Pro Leu Asp355 360 365gtg ctg ggc ccc agt ctc caa ggg cga gaa tgg acc ctg atg gac ttg 1153Val Leu Gly Pro Ser Leu Gln Gly Arg Glu Trp Thr Leu Met Asp Leu370 375 380gac atg gag ctg tcc ttg atg cag ccc ttg gtt cca gag cgg ggt gag 1201Asp Met Glu Leu Ser Leu Met Gln Pro Leu Val Pro Glu Arg Gly Glu385 390 395cct gag ctg gcg gtc aag ggg tta aat tct cca agc cca ggg aag gac 1249Pro Glu Leu Ala Val Lys Gly Leu Asn Ser Pro Ser Pro Gly Lys Asp400 405 410 415ccc acg ctc ggg gcc cca ctc ctg ctg gat gtc cag gcg gcc ttg gga 1297Pro Thr Leu Gly Ala Pro Leu Leu Leu Asp Val Gln Ala Ala Leu Gly420 425 430ggc cca gcc ctg ggc ctg cct ggg gct tta acc att tat agc act cct 1345Gly Pro Ala Leu Gly Leu Pro Gly Ala Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Pro435 440 445gag agc cgg act gcc tcc tac ttg ggc ccg gaa gcc agt ccc tcc ccc 1393Glu Ser Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Gly Pro Glu Ala Ser Pro Ser Pro450 455 460taagaccccg cgcctctgaa ggggcttgga accagtccgc cgctgcacat ccttcttggc 1453ttcctggccg cctacggggg tgagcgaagc ccccactact aaatggcctc tctccactac 1513cccgactatc cctgcacata aactccgttt ttttttttca cc 1555<210>2<211>463<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Val Gln Glu Ala Pro Ala Ala Leu Pro Thr Glu Pro Gly Pro Ser1 5 10 15Pro Val Pro Ala Phe Leu Gly Lys Leu Trp Ala Leu Val Gly Asp Pro20 25 30Gly Thr Asp His Leu Ile Arg Trp Ser Pro Ser Gly Thr Ser Phe Leu35 40 45Val Ser Asp Gln Ser Arg Phe Ala Lys Glu Val Leu Pro Gln Tyr Phe50 55 60Lys His Ser Asn Met Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly65 70 75 80Phe Arg Lys Val Val Ser Ile Glu Gln Gly Gly Leu Leu Arg Pro Glu85 90 95Arg Asp His Val Glu Phe Gln His Pro Ser Phe Val Arg Gly Arg Glu100 105 110Gln Leu Leu Glu Arg Val Arg Arg Lys Val Pro Ala Leu Arg Gly Asp115 120 125Asp Gly Arg Trp Arg Pro Glu Asp Leu Gly Arg Leu Leu Gly Glu Val130 135 140Gln Ala Leu Arg Gly Val Gln Glu Ser Thr Glu Ala Arg Leu Arg Glu145 150 155 160Leu Arg Gln Gln Asn Glu Ile Leu Trp Arg Glu Val Val Thr Leu Arg165 170 175Gln Ser His Gly Gln Gln His Arg Val Ile Gly Lys Leu Ile Gln Cys180 185 190Leu Phe Gly Pro Leu Gln Ala Gly Pro Ser Asn Ala Gly Gly Lys Arg195 200 205Lys Leu Ser Leu Met Leu Asp Glu Gly Ser Ser Cys Pro Thr Pro Ala210 215220Lys Phe Asn Thr Cys Pro Leu Pro Gly Ala Leu Leu Gln Asp Pro Tyr225 230235 240Phe Ile Gln Ser Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Gln Arg Gln Ile Trp245 250255Ala Leu Ala Leu Thr Gly Pro Gly Ala Pro Ser Ser Leu Thr Ser Gln260 265270Lys Thr Leu His Pro Leu Arg Gly Pro Gly Phe Leu Pro Pro Val Met275 280 285Ala Gly Ala Pro Pro Pro Leu Pro Val Ala ValVal Gln Ala Ile Leu290 295 300Glu Gly Lys Gly Ser Phe Ser Pro Glu Gly Pro Arg Asn Ala Gln Gln305 310315 320Pro Glu Pro Gly Asp Pro Arg Glu Ile Pro Asp Arg Gly Pro Leu Gly325330 335Leu Glu Ser Gly Asp Arg Ser Pro Glu Ser Leu Leu Pro Pro Met Leu340345 350Leu Gln Pro Pro Gln Glu Ser Val Glu Pro Ala Gly Pro Leu Asp Val355 360365Leu Gly Pro Ser Leu Gln Gly Arg Glu Trp Thr Leu Met Asp Leu Asp370 375380Met Glu Leu Ser Leu Met Gln Pro Leu Val Pro Glu Arg Gly Glu Pro385 390 395400Glu Leu Ala Val Lys Gly Leu Asn Ser Pro Ser Pro Gly Lys Asp Pro
405 410 415Thr Leu Gly Ala Pro Leu Leu Leu Asp Val Gln Ala Ala Leu Gly Gly420 425 430Pro Ala Leu Gly Leu Pro Gly Ala Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Pro Glu435 440 445Ser Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Gly Pro Glu Ala Ser Pro Ser Pro450 455 460<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3agcgcaggac tggccgtgag20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4gggactgggt cgcaggagca20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5agtgctgccc cagtatttca ag 22<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6gccagt tatg gtctcatccc g 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7agtgctgccc cagtatttca ag 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8gggactgggt cgcaggagca20
權利要求
1.一種對個體的白內障易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的HSF4基因、轉錄本和/或蛋白，并與正常的HSF4基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患白內障的可能性高于正常人群。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的是HSF4的基因或轉錄本，并與正常HSF4核苷酸序列比較差異。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中第348位T→C；SEQ ID NO2中第115位氨基酸由Leu→Pro。
4.一種治療晶狀體病變的方法，其特征在于，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常HSF4蛋白。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的HSF4蛋白被局部施用于眼部。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的HSF4蛋白以及藥學上可接受的載體。
7.如權利要求6所述的組合物，其特征在于，它是眼藥水或眼藥膏。
8.一種檢測晶狀體病變的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增HSF4基因或轉錄本的引物。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結合的探針；(b)識別突變位點的限制性內切酶。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自SEQ ID NO1中第348位T→C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷白內障等晶狀體病變的方法，它包括檢測個體的HSF4基因、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患白內障等晶狀體病變的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應的檢測試劑盒，以及治療白內障等晶狀體病變的方法和藥物組合物。
文檔編號C12Q1/68GK1438321SQ0211085
公開日2003年8月27日 申請日期2002年2月10日 優(yōu)先權日2002年2月10日
發(fā)明者孔祥銀, 步磊, 褚仁遠 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心