專利名稱：人p51基因及其基因產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的人基因。更詳細(xì)地說(shuō)涉及作為抑制癌基因所公知的、與人p53基因及人p73基因類似的新的人基因及基因產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
p53蛋白是以DNA型腫瘤病毒SV40的大型T抗原和結(jié)合核內(nèi)蛋白而被發(fā)現(xiàn)，其基因(p53基因)被克隆著。最初，認(rèn)為p53基因，通過與ras基因一起導(dǎo)入細(xì)胞，使來(lái)自胚胎的細(xì)胞被轉(zhuǎn)化而得到的，而認(rèn)為癌基因?？墒牵ㄟ^以后的研究，明顯地看出，最初得到的p53基因的克隆是變異型，野生型倒是可以抑制變異型的轉(zhuǎn)化。現(xiàn)在，p53基因的缺失或異常，在很多人的癌中被檢測(cè)出，作為高發(fā)癌性基因病中所知道的Li Fraumeni癥候群中，發(fā)現(xiàn)了p53基因配偶子變異等，可以認(rèn)為p53基因是重要的癌抑制基因[Baker,S.J.,et al.,Science,244,217-221(1989)Nigro,J.M.,Nature,342,705-708(1989)]。
人p53基因由393個(gè)氨基酸構(gòu)成，大體上分為N末端結(jié)構(gòu)域(第1～101的氨基酸領(lǐng)域)、芯結(jié)構(gòu)域(第102～292的氨基酸領(lǐng)域)及C末端結(jié)構(gòu)域(第293～393的氨基酸領(lǐng)域)的三個(gè)領(lǐng)域。N末端結(jié)構(gòu)域包括酸性氨基酸和高脯氨酸領(lǐng)域等的復(fù)制控制所必須的領(lǐng)域，可認(rèn)為是復(fù)制活性化結(jié)構(gòu)域。另外C末端結(jié)構(gòu)域包括很多的堿性氨基酸及形成四聚體的必需領(lǐng)域，可以認(rèn)為擔(dān)負(fù)著非特異DNA結(jié)合和DNA損傷的識(shí)別及抑制轉(zhuǎn)化的作用。
在人癌細(xì)胞檢測(cè)出的p53基因的很多異常是誤義變異，其大部分是相當(dāng)從N末端到100～300氨基酸的部位的芯結(jié)構(gòu)域，特別是集中在超過種被保留下的熱點(diǎn)(Hot Spot)的領(lǐng)域。這樣的芯結(jié)構(gòu)域中的熱點(diǎn)領(lǐng)域是涉及到p58蛋白和DNA結(jié)合的領(lǐng)域，實(shí)際上，由于該領(lǐng)域的變異阻礙了與DNA的特異結(jié)合。
從以上，可明顯地看出，p53蛋白與其他的基因特異結(jié)合后，具有控制復(fù)制因子的作用，該控制復(fù)制因子可以調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)。
作為用p53蛋白誘導(dǎo)復(fù)制的基因，可以舉出p21基因[稱為WAF1或CIP1、或SDI1(EI-Dairy，W.S.，et al.，Cell，75，817(1993))；MDM2(Wu.X.，et al.，Genes Dev.，7，1126(1993))；MCK(Weintraub.H.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4570(1991)Zambetti.G.P.，et al.，Genes Dev.，6，1143(1992))]、GADD45[Kastan，M.B.，et al.，Cell，71，587(1992)]、細(xì)胞周期蛋白G[Cyclin GOkamoto，K.，EMBO J.，13，4816(1994)]、BAX[Miyashita，T.，et al.，Cell，80，293(1995)]及胰島素類的生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白[IGF-BP3Buckbinder，L.，et al.，Nature，377，646(1995)]。
編碼p21基因的蛋白質(zhì)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激活酶(CDK)的阻礙蛋白質(zhì)，野生型p53蛋白可以通過p21抑制地調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[Harper，J.W.，et al.，Cell，75，805(1993)；Xiong，Y.，et al.，Nature，366，707(l993)；Gu，Y.，et al.，Nature，366，701(1993)]。另外也有報(bào)告，p21基因結(jié)合增殖細(xì)胞抗原(PCNA)可直接抑制DNA的復(fù)制[Waga，S.，et al.，Nature，369，574(1994)]。進(jìn)而判明，p21基因是與誘導(dǎo)細(xì)胞的老化具有抑制DNA合成作用的SD11基因相同的基因[Noda，A.，et al.，Exp.Cell Res.，211，90(1994)]。
MDM2結(jié)合p53蛋白后可以將該蛋白的復(fù)制控制活性不活性化，推測(cè)可以作為負(fù)的反饋調(diào)節(jié)因子作用。
IGF-BP3是IGF是信號(hào)化的負(fù)的調(diào)節(jié)因子。因此，由于p53蛋白的IGF-BP3因子的增加，其結(jié)果暗示p53蛋白可以導(dǎo)致抑制IGF性依賴性細(xì)胞的成長(zhǎng)。
另外，有報(bào)告說(shuō)野生型p53蛋白可以誘導(dǎo)骨髓白血性細(xì)胞的編程性細(xì)胞的死亡[Yonish-Roboch，E.，et al.，Nature，352，345(1991)]。用放射線照射胸腺細(xì)胞編程細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)對(duì)于p53缺損的老鼠不會(huì)產(chǎn)生[Lowe，S.W.，Nature，362，847(1993)；Clarke，A.R.，et al.，Nature，362，849(1993)]、另外p53蛋白，可以誘導(dǎo)在水晶體、網(wǎng)膜、腦中失去正常網(wǎng)膜胚種基因(RB基因)活性的細(xì)胞的編程細(xì)胞的死[Pan，H.，andGriep，A.E.，Genes Dev.，8，1285(1994)；Morgenbesser，S.D.，et al.，Nature，371，72(1994)；Howes，K.A.，Genes Dev.，8，1300(1994)；Symonds，H.，et al.，Cell，78，703(1994)]。何瓦特氏提出，p53蛋白對(duì)于RB基因變異的研究是有用的、可以誘導(dǎo)含在RB基因變異的細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡[White，E.，Nature，371，21(1994)]。
另外，對(duì)于只是表達(dá)具有溫度感受性的p53基因的白鼠的紅血球性細(xì)胞系，在溫度下降時(shí)變異的p53基因返回野生型、誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，從其取出的p53基因在p53缺損的線纖維胚細(xì)胞系的軟瓊脂的培養(yǎng)基中可付與增殖的能力(anchorage-independency)[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-291(1995)；Kato et al.，Int.J.Oncol.9269-277]。
BAX可以結(jié)合作為編程性細(xì)胞死亡的抑制因子的bc1-2上，促進(jìn)編程性細(xì)胞死亡[Oltvai，Z.M.，et al.，Cell，74，609(1993)]。由于p53蛋白的BAX基因的增加和bc1-2的減少是與白鼠的白血病細(xì)胞株M1的編程性細(xì)胞死亡有關(guān)系，[Miysashita，T.，et al.，Oncogene，9，1799(1994)]。另外，有報(bào)告說(shuō)對(duì)于編程性細(xì)胞死亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物之一的Fas，在其非小細(xì)胞肺癌和白血病中是增加的[Owen-Schaub，L.B.，et al.，Mol.Cell Bioll.，15，3032(1995)]。
從以上的很多研究?？梢钥闯鰌53蛋白不限于p21基因，可以促進(jìn)或抑制各種基因的復(fù)制。即使在復(fù)制調(diào)節(jié)機(jī)能缺損的變異型p53蛋白中，也顯示了與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白質(zhì)的相互作用后傳遞信號(hào)能力和DNA的損傷修復(fù)功能。
迄今所知道的p53的蛋白功能，可以舉出，復(fù)制調(diào)節(jié)功能、與其他的蛋白質(zhì)結(jié)合的信號(hào)傳遞功能、涉及DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)復(fù)合體的要素、DNA結(jié)合功能、外切核酸酶活性等，這些功能的復(fù)合作用的結(jié)果，可以引起細(xì)胞的細(xì)胞周期停止、誘導(dǎo)細(xì)胞編程性死亡、DNA的修復(fù)、DNA的復(fù)制調(diào)節(jié)及分化誘導(dǎo)。
進(jìn)而，p53蛋白的功能不僅是基因產(chǎn)生損傷時(shí)發(fā)生作用，例如在病毒感染、細(xì)胞因子刺激、低氧狀態(tài)、核甘酸庫(kù)的變化、藥物引起的代謝異常等的各種的應(yīng)激涉及到生體組織時(shí)，該刺激作為觸發(fā)器會(huì)引起p53蛋白質(zhì)的量及質(zhì)的變化。接受量及質(zhì)的調(diào)節(jié)的p53蛋白，通過與其他蛋白質(zhì)的相互作用表達(dá)信號(hào)傳遞和控制其他基因復(fù)制的功能，接受生體緊張的生體的組織的細(xì)胞的DNA被進(jìn)行復(fù)制調(diào)節(jié)，使細(xì)胞周期停止后修復(fù)細(xì)胞、通過編程性細(xì)胞死亡排除細(xì)胞或者促進(jìn)細(xì)胞分化使生體從應(yīng)激的狀態(tài)得到緩解[Ganman，C.E.，et al.，Genes Dev.，9，600-611(1995)；Graeber，T.G.，et al.，Nature，379，88-91(1996)；Linke，S.P.，et al.，Genes Dev.，10，934-937(1996)；Xiang，H.，et al.，J.Neurosci.，16，6753-6765(1996)]。
人的腫瘤一半是存在p53基因的變異，所以近年來(lái)對(duì)于腫瘤的診斷和治療，都在研究p53基因及其蛋白的臨床的應(yīng)用。使用可特異認(rèn)識(shí)p53基因的變異部位的引物，進(jìn)行PCR，檢測(cè)淋巴細(xì)胞和體液中浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞的方法，是可以預(yù)測(cè)腫瘤的浸潤(rùn)范圍或者再發(fā)等的有效的診斷方法[Hayashi，H.，et al.，Lancet，345，l257-1259(1995)]。
進(jìn)而，p53蛋白，由于具有編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)功能，所以使用病毒.載體，向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入野生型p53基因的治療方法已在美國(guó)進(jìn)行著[Roth，J.A.，et al.，Nature Med.，2，985-991(1996)]。最近在日本，有幾個(gè)地方也開始該基因的治療。
另一方面，又指出，人腫瘤半數(shù)以上不具有p53基因的變異，依此可以判斷存在有其他蛋白，該蛋白具有類似p53蛋白抑制腫瘤生成的功能。
本發(fā)明者首先發(fā)現(xiàn)p53的基因變異不是霍奇金型的惡性淋巴腫瘤(NHL)的前兆指標(biāo)。
近年，確認(rèn)了與上述的p53基因高度相同的、被命名為p73的新基因[Kaghad，M.，et al.，Cell，90，809-819(1997)]。根據(jù)本發(fā)明者的見解，p73蛋白在復(fù)制活性化結(jié)構(gòu)域內(nèi)(1～45的氨基酸領(lǐng)域)與人p53顯示29％的相同性，在有6個(gè)變異熱點(diǎn)的相輔的保存領(lǐng)域的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(第113～290的氨基酸領(lǐng)域)的相同性是63％，在低聚化領(lǐng)域(第319～363的氨基酸領(lǐng)域)的相同性是38％?？墒?，對(duì)C末端結(jié)構(gòu)域，在p73蛋白和p53蛋白間看不到有明顯的相同性。
有報(bào)告說(shuō)，通過p73蛋白過剩表達(dá)，可以抑制神經(jīng)胚細(xì)胞株和SAOS2細(xì)胞(骨肉腫瘤細(xì)胞株)的生長(zhǎng)，另外，通過p73的暫時(shí)的表達(dá)，可以促進(jìn)微型·同源腎細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡[Bruce Clurman and MarkGroudine，Nature，389，122-123(1997)；Christine，A.，et al.，Nature，389，191-194(1997)]。
可是p73蛋白，在正常的組織中只是低量的發(fā)現(xiàn)，這一點(diǎn)上是與p53蛋白有著小小的區(qū)別。進(jìn)而，神經(jīng)胚細(xì)胞株中的p73蛋白的表達(dá)，在用紫外線照射和用低量的放線菌素D不能誘導(dǎo)的點(diǎn)上也是與p53蛋白不同。
這樣的p73蛋白不是具有與p53完全相同的功能，今后還需要進(jìn)一步研究。迄今的觀察，報(bào)告了此p73作為神經(jīng)胚腫瘤上推測(cè)的腫瘤抑制因子的位置。
本發(fā)明的目的是提供人腫瘤的形態(tài)形成關(guān)連的新基因及基因產(chǎn)物的信息。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的目的在于提供如上述的作為癌抑制基因的、與公知的p53基因類似性的新基因及其基因產(chǎn)物。
進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供培養(yǎng)含有由該基因的部分DNA構(gòu)成的引物和探針、該基因的載體、導(dǎo)入該載體的形質(zhì)轉(zhuǎn)化體及培養(yǎng)該形態(tài)轉(zhuǎn)化體得到上述基因產(chǎn)物的制造方法。
圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是與p53蛋白及p73β蛋白一起表示p51A蛋白的構(gòu)造的結(jié)構(gòu)域特征的圖。圖中，“TA”是復(fù)制活性領(lǐng)域、“DNA binding”是DNA的結(jié)合領(lǐng)域及“origo”是低聚領(lǐng)域。
圖2是表示用人51A基因編碼的氨基酸序列與p53蛋白及p73β蛋白的各氨基酸序列進(jìn)行比較，觀察三者相同性的圖，三者相同的部分用四方框圍起來(lái)。
圖3是表示用人51B基因編碼的氨基酸序列與p73β蛋白的各氨基酸序列進(jìn)行比較，觀察三者相同性的圖，三者相同的部分用四方框圍起來(lái)。
圖4是模式地比較p53蛋白的alternative splicing variant(p51A、p51B)的結(jié)構(gòu)與p73蛋白的alternative splicing variant(p73α、p73β)的結(jié)構(gòu)的比較圖。
圖5是用照片代替Northen印跡(克隆社的過濾器)的電泳圖，表示各種人組織中的p51mRNA表達(dá)情況。各泳道，1心臟、2腦、3胎盤、4肺、5肝臟、6骨骼肌、7脾臟、8胰臟。
圖6是用照片代替諾占布洛(克隆社的用于RNA過濾器)的電泳圖，表示各種人組織中的p51mRNA表達(dá)情況。各泳道，1乳腺、2前列腺、3唾液腺、4胃、5胸腺、6甲狀腺、7氣管、8子宮。
圖7是用照片表示形成p51A基因的菌落抑制能圖。具體的是表示用p51A表達(dá)質(zhì)粒(p51A)、p53A表達(dá)質(zhì)粒(p53)、帶有HA標(biāo)記的p51A表達(dá)質(zhì)粒(HAp51A)及只用載體(RcCMV)形質(zhì)轉(zhuǎn)化的各細(xì)胞的菌落形成能比較圖的照片圖。
圖8是模式表示用于報(bào)道基因構(gòu)建體的圖。圖中WAF-1 promoterIuc是分別表示殘留二個(gè)的p53調(diào)節(jié)因子的野生型p21WAFⅠ啟動(dòng)子構(gòu)建體、del 1表示除去一個(gè)上流因子的構(gòu)建體及del 2表示除去二個(gè)上流因子的構(gòu)建體。
圖9是表示圖8中所示的具有各種報(bào)道基因構(gòu)建體的各p51A表達(dá)質(zhì)粒(p51A)、p53A表達(dá)質(zhì)粒(p53A)或?qū)⒖刂戚d體(Rc/CWV)導(dǎo)入SAO2細(xì)胞時(shí)的反式激活的圖(參照實(shí)驗(yàn)例2)。
圖10實(shí)驗(yàn)地表示p53應(yīng)答性的PGC報(bào)道基因構(gòu)建體的各p51A表達(dá)質(zhì)粒(p51A)、HA標(biāo)識(shí)的p51A表達(dá)質(zhì)粒(HAp51A)、p53A表達(dá)質(zhì)粒(p53)或?qū)⒖刂戚d體(Rc/CWV)導(dǎo)入SAO2細(xì)胞時(shí)的反式激活的圖(參照實(shí)驗(yàn)例2)。
圖11是表示實(shí)驗(yàn)例4中對(duì)于含有人p51A基因ICI細(xì)胞及4BI細(xì)胞、及不含有p51A基因1-2-3細(xì)胞，調(diào)查在32℃及37℃的不同溫度下培養(yǎng)時(shí)的DNA片段化結(jié)果的照相圖(瓊脂糖電泳的溴化乙錠染色像)。
圖中“1-2-3細(xì)胞”是只導(dǎo)入載體，不含有p-51A基因的對(duì)照細(xì)胞，“ICI細(xì)胞”或“4BI細(xì)胞”是導(dǎo)入用含有p-51A基因表達(dá)載體(pRcCMV/p51A)轉(zhuǎn)化的p51A的1-2-3細(xì)胞。另外，λ/Hind Ⅲ是用噬菌體DNA限制酶的分解物、DNA的大小標(biāo)記(New England Biolabs.Ind.制)。另外，100bp ladder是由具有100bp整數(shù)倍大小DNA片段構(gòu)成的大小標(biāo)記(GIBCO-BRL制)。
圖12～圖14是人p51B基因的編碼領(lǐng)域的堿基序列(下段)和白鼠同種性(白鼠p51B基因)的該序列(上段)的比較圖。此外二者間是相同的堿基時(shí)在圖中標(biāo)記*。
圖15是表示用圖12～圖14人p51B基因及白鼠p51B基因分別編碼人p51B蛋白及白鼠p51B蛋白的氨基酸序列的比較圖。此外二者間是相同的氨基酸時(shí)在圖中標(biāo)記*。
發(fā)明的公開如上所述，人腫瘤組織的半數(shù)以上都不具有作為抑制癌基因的p53基因的變異體，從以前，就已經(jīng)暗示了在p53蛋白以外也存在起著抑制腫瘤形成功能的基因產(chǎn)物(蛋白)。
為此本發(fā)明者們，對(duì)于相關(guān)抑制腫瘤形成的新基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行了不斷的研究，發(fā)現(xiàn)了編碼具有與上述p53蛋白相同活性的蛋白的、來(lái)自人體的新基因，該基因或其基因產(chǎn)物是與編程細(xì)胞性死亡有著明顯的關(guān)系。本發(fā)明在這樣的見解上完成的。
即本發(fā)明是關(guān)于下述1～8的人p51基因及與其相關(guān)的基因。
1，編碼以下的(a)或(b)蛋白質(zhì)的基因(a)具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)在序列號(hào)1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質(zhì)。
2，具有以下的(a)或(b)DNA的基因(a)序列號(hào)2表示的堿基序中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與序列號(hào)2表示的堿基序中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交，而且編碼具有p51活性蛋白質(zhì)的DNA。
3，具有序列號(hào)2所示的堿基序列的上述2的基因。
4，具有以下的(a)或(b)cDNA的基因(a)序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交，而且編碼具有p51活性蛋白質(zhì)的DNA。
5，DNA，其特征是在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與序列號(hào)2表示的堿基序列雜交。
6，DNA，其特征是在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與序列號(hào)2的堿基號(hào)145～1488表示的堿基序列雜交。
7，上述5所述的DNA，其可作為引物使用。
8，上述5所述的DNA，其可作為探針使用。
進(jìn)而，本發(fā)明是下述9～14涉及的人p51蛋白及與其關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽。
9，以下的(a)或(b)蛋白質(zhì)(a)具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)在序列號(hào)1表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質(zhì)。
10，上述9所述的蛋白質(zhì)，在序列號(hào)1中，至少有氨基酸號(hào)1～59、氨基酸號(hào)142～321及氨基酸號(hào)359～397表示的氨基酸序列。
11，多肽，其在序列號(hào)1中，至少具有從復(fù)制活性功能、DNA結(jié)合性及低聚化功能中選擇出一種功能的氨基酸序列。
12，具有以下的(a)或(b)的多肽(a)在序列號(hào)1中具有用氨基酸號(hào)1～59表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有復(fù)制活性化功能的多肽。
13，具有以下的(a)或(b)所示的多肽(a)在序列號(hào)1中具有用氨基酸號(hào)142～321表示的氨基酸序列多肽，
(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有DNA結(jié)合性的多肽。
14，具有以下(a)或(b)所示的多肽(a)在序列號(hào)1中具有用氨基酸號(hào)359～397表示的氨基酸序列多肽，(b)在(a)表示的氨基酸序列中，具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
進(jìn)而，本發(fā)明是p51蛋白的制造方法，其特征是含有上述p51基因的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，從得到的培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明中的“p51”的稱號(hào)，只是為了在說(shuō)明書中使用方便的命名，對(duì)于本發(fā)明的基因及基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))等沒有任何的限定。
本發(fā)明中的基因(DNA)，不僅是二根鏈的DNA，也包括有義鏈及反義鏈的各一根的DNA，另外對(duì)其長(zhǎng)度沒有任何限制。因此，本發(fā)明的基因(DNA)只要沒有特殊的說(shuō)明，是指含有人基因組DNA的二根鏈DNA、及含有cDNA一根鏈DNA(有義鏈)及與該有義鏈相輔配列的一根鏈DNA(反義鏈)及這些片段的任何一種。
本說(shuō)明書中的氨基酸、肽、堿基序列、核酸等的略號(hào)的表示是按照IUPAC、IUB的規(guī)定，“含有堿基序列或氨基酸序列說(shuō)明書的編寫方針”(日本、美國(guó)及歐洲的三極特許廳)及該領(lǐng)域中慣用的符號(hào)來(lái)定義的。
(1)p51基因及其等效物本發(fā)明涉及編碼具有p53蛋白的作用或與其功能同樣或者同等作用或功能蛋白質(zhì)的來(lái)自人的新基因。
本發(fā)明的基因是對(duì)現(xiàn)有的p53基因及p57基因的序列進(jìn)行研究探索，利用選擇出的特定領(lǐng)域進(jìn)行創(chuàng)意的基礎(chǔ)上，利用重新創(chuàng)造的引物，通過進(jìn)行PCR而得到的。具體的是，使用后述實(shí)施例所述的創(chuàng)造的引物，通過進(jìn)行PCR，雖然不能得到相同的p53基因及p57基因。但是可以得到類似二者的基因片段。作為探針使用此DNA片段，可以從人骨骼筋cDNA文庫(kù)任意選擇出的cDNA克隆中，成功地分離出編碼具有與p53蛋白的氨基酸序列高相同性的新蛋白的cDNA克隆。
從得到的cDNA歸納的氨基酸序列的計(jì)算分子量是50，894Da，所以本發(fā)明者為了方便起見將該cDNA(DNA)命名為“人p51A基因(或簡(jiǎn)單地為p51基因)”，進(jìn)而，將用該基因編碼出的具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為“p51A蛋白質(zhì)(或簡(jiǎn)單地為p51蛋白。)”。
通過以后的研究，發(fā)現(xiàn)p51cDNA克隆編碼的基因中選擇地有剪接變異體。另外調(diào)查各種人組織中該基因復(fù)制產(chǎn)物的發(fā)生表達(dá)狀況的結(jié)果，在該產(chǎn)物(蛋白質(zhì))主要存在短型和長(zhǎng)型的剪接形態(tài)。
從這些與剪接變異體相關(guān)的p51cDNA歸納的氨基酸信息，短型的剪接變異體是編碼具有上述448氨基酸(分子量約50，9KDA)的蛋白質(zhì)(p51A蛋白)的基因(p51A基因)，另外長(zhǎng)型的剪接變異體是編碼具有上述641氨基酸(分子量約71，9KDa)的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明者為了方便起見將后者的基因命名為“人p51B基因(或簡(jiǎn)單地為p51B基因)”進(jìn)而，將用該基因編碼出的具有氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為“p51B蛋白質(zhì)(或簡(jiǎn)單地為p51B蛋白。)”。
本發(fā)明中，將上述的p51A基因及p51B基因統(tǒng)稱為“p51基因”，p51A蛋白及p51B蛋白統(tǒng)稱為“p51蛋白”。
此外，確認(rèn)了在p51基因的剪接變異體中存在缺損T領(lǐng)域一部分等、復(fù)數(shù)的存在著。
調(diào)查這些p51基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，本發(fā)明的p51基因產(chǎn)物(p51蛋白)顯示了與p53蛋白類似的復(fù)制活性化作用、細(xì)胞的成長(zhǎng)抑制性、及細(xì)胞編程性死亡誘導(dǎo)活性。另外，p51基因的人組織中的表達(dá)比p53基因的表達(dá)是組織限定的，盡管，與同樣組織限定地表達(dá)p73基因的組織分布重復(fù)，但是比組織分布是更廣泛的范圍。進(jìn)而，在人的腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中確認(rèn)了p51基因的變異。
從這些的見解，更強(qiáng)烈地暗示了本發(fā)明的人p51基因是p53抑制腫瘤基因家族的新成員。
本發(fā)明的p51基因具體例可以舉出后述的實(shí)施例1表示的克隆(p51A、p51B)所具有的DNA序列。
作為p51A克隆具有的基因，可以舉出后述序列表中，編碼由序列號(hào)1所表示的448氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)基因(1344核苷酸)。具體的是在序列號(hào)2中，相當(dāng)開環(huán)讀框的145～1488位表示的堿基序列的基因。
此外，該p51A cDNA克隆的全長(zhǎng)堿基序列是如序列號(hào)2所示的2816核苷酸。本發(fā)明的p51基因中含有用該序列號(hào)2表示的堿基序列的基因。序列號(hào)2所表示的堿基序列中，開始的密碼子(ATG)是位于堿基號(hào)第145-147的位置，多腺苷酸化信號(hào)(AATAA)是位于2786-2791的位置。
具有用p51A基因編碼的448個(gè)的氨基酸的p51A蛋白的氨基酸序列表示在序列號(hào)1中，但是該蛋白具有用氨基酸號(hào)1～59位所表示的復(fù)制活性化領(lǐng)域、用氨基酸號(hào)142～321位所表示的DNA結(jié)合領(lǐng)域、用氨基酸號(hào)353～397位所表示的低聚化域。
對(duì)于該p51A蛋白的各領(lǐng)域的氨基酸序列中，公知蛋白質(zhì)p53及p73對(duì)于各個(gè)相當(dāng)領(lǐng)域的相同性使用GCG軟件(維斯克信·序列分析計(jì)·遺傳·計(jì)算機(jī)·社制)的FASTA程序調(diào)查的結(jié)果，得到表1的結(jié)果)參照?qǐng)D1、圖2)，(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，1435-1441(1988))。為了參考，將用同樣測(cè)定方法得到的蛋白質(zhì)和p73β的蛋白質(zhì)的相同性一起并記。
表1 另一方面，作為p51B克隆具有的基因可以舉出后述序列表中，編碼序列號(hào)4所表示的641氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)的基因(1923核苷酸)。具體的是序列號(hào)5中具有相當(dāng)于開放讀框145～2067位所示的堿基序列的基因。
該p51B cDNA克隆的全長(zhǎng)堿基序列是序列號(hào)5所示的2270核苷酸。本發(fā)明的p51B基因包括含有用該序列號(hào)5表示的堿基序列的基因。
具有用p51B基因編碼的641個(gè)的氨基酸的p51蛋白的氨基酸序列表示在序列號(hào)4上，但是該蛋白具有氨基酸號(hào)1～59位所表示的復(fù)制活性化領(lǐng)域、氨基酸號(hào)142～321位所表示的DNA結(jié)合領(lǐng)域、氨基酸號(hào)353～397位所表示的低聚化域，進(jìn)而，氨基酸號(hào)不能特定的，在C末端側(cè)的領(lǐng)域具有插入的序列(SAM結(jié)構(gòu)域)，這里，是將含有SAM結(jié)構(gòu)域的氨基酸號(hào)353～641位的領(lǐng)域作為廣義的低聚化域。
對(duì)于該p51B蛋白的各領(lǐng)域的氨基酸序列，與p51A蛋白相同地，對(duì)于公知蛋白質(zhì)p73α各個(gè)相當(dāng)領(lǐng)域的相同性使用GCG軟件的FASTA程序調(diào)查的結(jié)果，得到圖3的結(jié)果。在圖3中，四方框圍起的部分是p51B蛋白和p73α共同的氨基酸序列，從這里可以明顯地看出，本發(fā)明的p51B蛋白的氨基酸序列在廣范圍內(nèi)是與p73β的蛋白序列有相同性。
這樣，本發(fā)明的p51基因，包括了具有編碼由序列號(hào)1表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的堿基序列的人p51A基因及具有編碼由序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的堿基序列的人p51B基因。但是本發(fā)明的p51基因不受這些限制，也包括該人p51基因的相同物。
這里所說(shuō)的“人p51基因的相同物”是指具有與上述p51A基因或p51B基因序列相同性、上述結(jié)構(gòu)的特征及基因表達(dá)圖形上的共同性及上述所述的或用其基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的生物學(xué)的功能類似性可認(rèn)識(shí)一個(gè)基因家族的一系列的關(guān)聯(lián)基因，當(dāng)然也包括人p51基因的剪接變異體和等位體(對(duì)立基因)。
作為這樣的相同物，可以舉出用序列號(hào)1表示的特定氨基酸序列中，具有1至數(shù)個(gè)改變的蛋白質(zhì)，而且，編碼具有與該序列p51A蛋白同樣作用或功能的蛋白質(zhì)的基因。該基因可以舉出編碼保持與用序列號(hào)1表示的氨基酸序列有一定相同性的氨基酸序列的物質(zhì)。
上述氨基酸序列的相同性在用上述的GCG軟件的FAST程序測(cè)定中，通常，氨基酸序列的全體大約是45％以上，優(yōu)選的是50％以上。更優(yōu)選的是在復(fù)制活性領(lǐng)域、DNA結(jié)合領(lǐng)域或低聚化域的至少一個(gè)領(lǐng)域有一定的相同性，例如復(fù)制領(lǐng)域的相同性，大約是35％以上、優(yōu)選的是45％以上、DNA結(jié)合領(lǐng)域的相同性是88％以上、優(yōu)選的是90％以上，低聚化域的相同性大約是70％以上、優(yōu)選的是80以上。
即本發(fā)明的基因，只要滿足上述的性質(zhì)，也包括編碼在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的堿基序列的基因。
“氨基酸的缺失、替換或插入”的程度及這些位置，只要是改變了的蛋白質(zhì)與用序列號(hào)1或4所表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(p51A蛋白或p51B蛋白)具有相同功能的同效物，就沒有特別的限制。即本發(fā)明的“p51活性”是指p51A蛋白或p51B蛋白代表的p51蛋白所有的活性及功能，具體的是腫瘤細(xì)胞成長(zhǎng)抑制活性、編程細(xì)胞性死亡誘導(dǎo)活性、細(xì)胞中復(fù)制調(diào)節(jié)功能等。
可認(rèn)為本發(fā)明的p51蛋白是與作為細(xì)胞增殖抑制因子所公知的p53蛋白具有相同的作用。因此在本發(fā)明的說(shuō)明書中，作為p51蛋白的作用或功能所表示的“p51活性”可用公知的p53蛋白的各種作用或功能來(lái)定義。
p53蛋白的作用或功能，可以舉出細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制功能、通過結(jié)合其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的信號(hào)傳遞功能、作為DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)復(fù)合體構(gòu)成要素作用的DNA結(jié)合能及外切核酸酶活性等、或這些功能復(fù)合作用發(fā)揮的細(xì)胞的細(xì)胞周期的停止功能、編程細(xì)胞性死亡作用、DNA修復(fù)功能，DNA復(fù)制調(diào)節(jié)或分化誘導(dǎo)作用等，但是這僅是考慮本發(fā)明的p51蛋白所具有的一部分或者全部的功能。
氨基酸序列等的變異，可以在天然中，例如通過天然變異和翻譯后的修飾而產(chǎn)生，也可以基于來(lái)自天然的基因人為地改變。
本發(fā)明，無(wú)論這些改變、變異的原因及手段如何，包括了編碼本發(fā)明的p51蛋白涉及的具有上述特性的蛋白的所有的變異基因。上述人為的變異手段可以舉出細(xì)胞機(jī)理〔Method in Enzymology，154，350.367-382(11987)；同100，468(1983)；nucleic acids Ress.，12，9441(1984)；續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座Ⅰ“基因研究法Ⅱ”日本生化學(xué)會(huì)編，p105(1986)〕等的基因工學(xué)試驗(yàn)的手法、磷酸三酯法和磷酸磷酸?；ǖ鹊幕瘜W(xué)合成手段〔J.Am.Chen.Soc.89.4801(1967)；同91，3350(1969)Science.150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同24，245(1983)〕及這些的組合方法等。更具體的是，DNA的合成是用核質(zhì)體法或三酯法的化學(xué)合成法，通過市售的自動(dòng)低聚核苷酸合成裝置進(jìn)行。二個(gè)鏈片段，可合成相輔鏈，在適當(dāng)?shù)臈l件下該鏈一起退火，或與適當(dāng)?shù)囊镄蛄幸黄?，使用DNA聚合酶附加相輔鏈，從化學(xué)合成的一根鏈生成物得到。
本發(fā)明的基因的具體形態(tài)，可以舉出，在序列號(hào)2的堿基序列中具有序列號(hào)145～1488所示的堿基序列的基因、另外在序列號(hào)5的堿基序列中具有序列號(hào)145～2067所示的堿基序列的基因。這些堿基序列，是編碼組合上述的序列號(hào)1或4所示的氨基酸序列的各氨基酸殘基密碼的組合例子。為此本發(fā)明的基因，不限制于這些具有特定的堿基序列，對(duì)于各氨基酸殘基可組合任意的密碼子，具有選擇的堿基序列是可能的。密碼子的選擇可按照常法選擇，例如可以考慮利用縮主的密碼子的使用頻度[Neleic Acids Res.，9，43(1981)]。
本發(fā)明的基因如上所示也包括與由序列號(hào)2所示的堿基序列中堿基序列號(hào)145～1488(以下簡(jiǎn)稱鹽基序列(145-1488))所示的堿基序列構(gòu)成的堿基序列具有相同性的堿基序列。
作為這些基因可以舉出，在含有0.1％SDS的0.2×SSC中50℃或含有0.1％SDS的0.1×SSC中60℃下嚴(yán)謹(jǐn)條件下與堿基序列(145～1488)構(gòu)成的DNA雜交所具有的基因。
本發(fā)明的基因，對(duì)于本發(fā)明具體所說(shuō)的序列號(hào)2的序列信息，可以用基因工學(xué)的手段容易地制造和得到[參照Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)]；續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座“基因研究法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ”、日本生化學(xué)會(huì)編(1986)等]。
具體的，根據(jù)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的p51基因的適當(dāng)?shù)钠鹪?，按常?guī)方法調(diào)制cDNA文庫(kù)，從該文庫(kù)，用本發(fā)明的p51基因中特有的適當(dāng)?shù)奶结樅涂贵w，選擇所希望的克隆，以此來(lái)實(shí)施。[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983)等]。
在上述中，cDNA的起源，可以列舉出發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基因的各種細(xì)胞、組織和由這些得來(lái)的培養(yǎng)細(xì)胞等。另外，來(lái)自這些的全RNA的分離、mRNA的分離和精制、cDNA的取得及其克隆等，都是可以按常規(guī)方法實(shí)施。再有，cDNA文庫(kù)已有市售，本發(fā)明中，cDNA文庫(kù)可以使用例如從克隆技術(shù)公司(Clontech.Lab.Inc.)等購(gòu)得的各種cDNA文庫(kù)等。
從cDNA文庫(kù)克隆本發(fā)明的基因的方法，沒有特別的限制，可以按通常的方法實(shí)施。
具體的，可以舉出例如對(duì)由cDNA所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，通過使用該蛋白質(zhì)特異抗體的免疫的篩選，選擇對(duì)應(yīng)cDNA克隆的方法、有選擇地結(jié)合目的DNA序列使用探針的噬菌斑雜交、菌落雜交等及其組合等。
這里所使用的探針，一般可以列舉出以與本發(fā)明的基因的堿序列有關(guān)的信息為基礎(chǔ)，化學(xué)合成的DNA等，已經(jīng)取得的本發(fā)明基因本身及其片段可以很好地利用。另外，可以使用基于本發(fā)明的p51基因的堿基序列信息所設(shè)定的有義引物、反義引物作為篩選用探針。
在取得本發(fā)明的基因之際，可以使用PCR方法[Science，230，1350(1985)]或優(yōu)選使用該法的變型方法的DNA或RNA放大法。特別是，從文庫(kù)取得全長(zhǎng)cDNA較難的場(chǎng)合，優(yōu)選采用RACE法[Rapid amplification ofcDNA ends；實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、12(6)，35(1994)、特別是5′-RACE法(M.A.Frohman，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)]。
在采用所說(shuō)的PCR法之際，基于所使用的引物根據(jù)本發(fā)明被明確的p51基因的序列信息可以適當(dāng)設(shè)定，可以按常規(guī)方法合成。還有，放大的DNA或RNA片段的單離精制可以按上述的常規(guī)方法，例如可以根據(jù)凝膠電泳法、雜交法等實(shí)施。
另外，由上述的方法所得的p51基因或p51的各種DNA片段，按常規(guī)方法，例如，二脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]，或馬庫(kù)隆戈耳巴特法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或更簡(jiǎn)便使用市售的序列盒決定其堿基序列。
若用本發(fā)明的p51基因，例如，通過使用該基因的一部分或全部的堿基序列，可以檢測(cè)人的個(gè)體或各種組織中的本發(fā)明的p51基因的有無(wú)表達(dá)。
所說(shuō)的檢測(cè)可以按常規(guī)方法進(jìn)行，例如，可以列舉出利用RT-PCR[Reverse transcribed-Polymerase chain reaction；E.S.Kawasaki，etal.，Amplification of RNA.In PCR Protocol，A Guide to methods andapplications，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991)]的RNA擴(kuò)增或Northern印跡解析[Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989)]和原位的RT-PCR法[Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993)]和原位雜交等的細(xì)胞中的測(cè)定、NASBA法[Nucleic acid sequence-basedamplification，Nature，350，91-92(1991)]以及其它各種方法。優(yōu)選可以列舉出，使用RT-PCR-SSCPD的檢測(cè)法。
還有，作為此處PCR法所使用的引物，只要是可以特異地?cái)U(kuò)增本發(fā)明p51基因(含部分DNA)的該基因特有的引物，沒有特別的限制，基于本發(fā)明的p51基因的序列消息，可以適當(dāng)設(shè)定。作為通常的引物可以列舉出具有10～35程度，優(yōu)選的是15～30核苷酸長(zhǎng)度的、具有本發(fā)明的p51基因的部分序列的引物。
這樣，在本發(fā)明的基因中也包括為檢出本發(fā)明的人p51基因的、作為特異引物和/或特異探針而使用的DNA片段或者包含這些的。
該DNA片段可以規(guī)定作為在由堿基序列(145-1488)所構(gòu)成的DNA或在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行雜交為特征的DNA。這里作為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，可以列舉出作為引物或探針使用的通常條件，沒有特別的限制，例如，可以列舉出如前所述的含0.1％SDS的0.2×SSC中50℃的條件或含0.1％SDS的1×SSC中60℃的條件。
若用本發(fā)明的人p51基因通過使用通常的基因工程的手法，可以容易地大量地穩(wěn)定地制造含有該基因產(chǎn)物(p51蛋白)的蛋白質(zhì)。
(2)p51蛋白此外，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的基因編碼的p51蛋白。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的具體的形態(tài)，雖然可以列舉出被稱為具有序列號(hào)1所示的氨基酸序列p51A蛋白及具有序列號(hào)4所示的氨基酸p51B的蛋白的蛋白質(zhì)，但本發(fā)明的蛋白質(zhì)不限定所說(shuō)的特定的p51A蛋白和p51B蛋白，其等同物也可。作為等同物，可以列舉出在上述各蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，1或數(shù)個(gè)乃至多個(gè)氨基酸有缺失、替換或插入的氨基酸序列，并且，具有上述的p51活性的蛋白質(zhì)的等同物。具體的，可以列舉出上述的p51基因的相同物(含接枝變異體及等位體的p51相關(guān)基因)的基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)，可基于本發(fā)明所提供的人p51基因的序列信息，按通常方法的基因重組技術(shù)[參照Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，5990(1993)等]進(jìn)行調(diào)制。
(3)含p51蛋白的功能的領(lǐng)域的多肽本發(fā)明還涉及上述p51蛋白的一部分領(lǐng)域的多肽。
所說(shuō)的多肽最好是具有構(gòu)成p51蛋白的各種功能的領(lǐng)域的某一種氨基酸序列的多肽，具體的，是具有從具有p51蛋白的復(fù)制活性化領(lǐng)域、DNA結(jié)合領(lǐng)域以及低聚作用領(lǐng)域中所選擇至少一種的領(lǐng)域的氨基酸序列的多肽。
如上所述，p51蛋白的復(fù)制活性化領(lǐng)域、DNA結(jié)合領(lǐng)域以及低聚作用領(lǐng)域分別位于以序列號(hào)1所示的p51A蛋白的氨基酸序列中的氨基酸號(hào)1～59位、氨基酸號(hào)142～321位以及氨基酸號(hào)359～397位。
從而，本發(fā)明的多肽含有以下各物(ⅰ)具有由序列號(hào)1的氨基酸號(hào)1～59所示的氨基酸序列(以下簡(jiǎn)稱氨基酸序列1(1～59))的多肽及其同效物。
這樣，所說(shuō)的同效物，可以列舉出在氨基酸序列1(1～59)中具有缺失、替換或插入1或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有復(fù)制活性化功能的多肽。關(guān)于氨基酸序列的改變程度，只要具有復(fù)制活性化功能，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(1～59)的相同性保持在35％以上，最好保持在45％以上。
(ⅱ)具有以序列號(hào)1的氨基酸號(hào)142～321所示的氨基酸序列(以下，簡(jiǎn)稱氨基酸序列(142～321))的多肽及其同效物。
再有，所說(shuō)的同效物，可以列舉出具有缺失、替換或插入1或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有DNA結(jié)合性的多肽。關(guān)于氨基酸序列的改變程度，只要具有DNA的結(jié)合性，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(142～321)的相同性保持在88％以上，最好保持在90％以上。
(ⅲ)以序列號(hào)1的氨基酸號(hào)353～397所示的氨基酸序列(以下，簡(jiǎn)稱氨基酸序列(353～397))的多肽及其同效物。
再有，所說(shuō)的同效物，可以列舉出具有缺失、替換或插入1或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有低聚作用功能的多肽，例如，包含p51B蛋白的廣義的低聚作用領(lǐng)域(序列號(hào)4的氨基酸號(hào)353～641)。關(guān)于氨基酸序列的改變程度，只要具有低聚作用功能，就沒有特別的限制，但希望與氨基酸序列1(353～397)的相同性保持在70％以上，最好保持在80％以上。
另外，本發(fā)明，可以是把上述氨基酸序列1(1～59)或同效物、氨基酸序列1(142～321)或同效物、氨基酸序列1(353～397)或同效物中的某一種的氨基酸序列包含在一領(lǐng)域中的多肽，也可以是把所示的任意二個(gè)以上的氨基酸序列作為連續(xù)的或不連續(xù)的領(lǐng)域多肽。
本發(fā)明還包含具有編碼多肽的堿基序列的基因(DNA)。具體的，可以列舉出作為把上述的氨基酸序列1(1～59)編碼的堿基序列，在序列號(hào)2中，以堿基號(hào)145～321所示的堿基序列、作為把氨基酸序列1(142～321)編碼的堿基序列，在序列號(hào)2中，以堿基號(hào)568～1107所示的堿基序列、作為把氨基酸序列1(353～397)編碼的堿基序列，在序列號(hào)2中，以堿基號(hào)1201～1335所示的堿基序列。
(4)p51蛋白的制造方法及用于制造中的使用物。
另外，本發(fā)明還提供該p51蛋白的制造方法、及使用該制造方法的使用物，例如含有上述基因的載體，根據(jù)該載體所進(jìn)行的形質(zhì)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
該蛋白質(zhì)的制造更詳細(xì)的說(shuō)把所希望的蛋白進(jìn)行編碼的基因在宿主細(xì)胞中可以表達(dá)地進(jìn)行重組DNA(表達(dá)載體)，把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)該形質(zhì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)，然后從所得到的培養(yǎng)物中收回所希望的蛋白質(zhì)。
這里所說(shuō)的宿主細(xì)胞可以使用真核生物及原核生物中的一種。
在真核生物細(xì)胞中包含脊椎動(dòng)物、酵母等真核微生物的細(xì)胞。作為脊椎動(dòng)物細(xì)胞，通常使用例如作為猿猴的細(xì)胞的COS細(xì)胞(Cell，23，175(1981))，中國(guó)田鼠的卵巢細(xì)胞以及這些二氫葉酸原還酶欠損株(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77，4216(1980))等，但不限于這些。再有，作為真核微生物，一般使用酵母，其中，使用酵母菌屬酵母較為有利。
作為原核生物的宿主，一般使用大腸菌和枯草菌。大腸菌中更為使用大腸桿菌K12株等。
表達(dá)載體，只要含有本發(fā)明的基因且可以表達(dá)該基因的載體，就沒有特別限制，一般根據(jù)同宿主細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行適當(dāng)選擇。
作為宿主細(xì)胞，在使用脊椎動(dòng)物細(xì)胞的場(chǎng)合，作為表達(dá)載體，可以使用象通常發(fā)現(xiàn)那樣，位于本發(fā)明的基因的上游的啟動(dòng)子、RNA的剪接部位、聚腺苷化部位以及保持復(fù)制完了序列的載體。進(jìn)而這些根據(jù)需要也可有復(fù)制起點(diǎn)。作為該表達(dá)載體，例如，可以列舉出具有SV40的初期啟動(dòng)子的pSV2 dhfr[Mol.Cell，Biol.，1，854(1981)]等。
作為宿主細(xì)胞，在使用酵母等真核微生物的細(xì)胞的場(chǎng)合，作為表達(dá)載體，例如可以使用對(duì)酸性磷酸酶基因具有啟動(dòng)子作用的pAM 82[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，80，1(1983)]等，本發(fā)明的載體，可以在該啟動(dòng)子的上游區(qū)域增加本發(fā)明的基因的辦法進(jìn)行調(diào)制。最好，可以列舉出與原核生物基因融合的融合載體，作為該載體的具體例例如可以列舉出具有分子量為26000的GST結(jié)構(gòu)域(由S.Japonicum得來(lái))的pGEX-2TK和pGEX-4T-2等。
作為宿主細(xì)胞，在使用原核生物的細(xì)胞的場(chǎng)合，作為表達(dá)載體，可以舉出例如可以是在該宿主細(xì)胞中可以復(fù)制的質(zhì)粒載體，為在該載體中表達(dá)所希望的基因，是在該基因的上流中付與啟動(dòng)子及SD(Shine-Dalgarno)堿基序列、蛋白合成開始所需要的開始密碼子(ATG)的表達(dá)質(zhì)粒。特別是，把大腸菌(例如大腸桿菌K12株等)作為宿主細(xì)胞使用的場(chǎng)合，作為表達(dá)載體，一般使用pBR322及其改良的載體。但是，不限于這些，公知的各種菌株及其載體都可以使用。另外，作為上述的啟動(dòng)子，例如可以使用trp啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、PL/PR啟動(dòng)子等。
把本發(fā)明的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法和以此的形質(zhì)轉(zhuǎn)化方法，沒有特別限制，可以采用一般的各種方法。
所得的形質(zhì)轉(zhuǎn)化體可以按常法培養(yǎng)，根據(jù)該培養(yǎng)，在形質(zhì)轉(zhuǎn)換體的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或細(xì)胞膜上，發(fā)現(xiàn)、產(chǎn)生(蓄積、分泌)由按所希望那樣設(shè)計(jì)的基因編碼的本發(fā)明的目的蛋白。
作為在該培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng)基，可以根據(jù)所采用的宿主細(xì)胞適當(dāng)選擇慣用的各種培養(yǎng)基。
對(duì)所得到的本發(fā)明的重組蛋白，根據(jù)希望，通過利用其物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)等的各種分離操作[參照“生化學(xué)數(shù)據(jù)手冊(cè)Ⅱ”、1175～1259頁(yè)、第1版第1次印刷、1980年6月23日株式會(huì)社東京化學(xué)同人發(fā)行；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等]，進(jìn)行分離精制。
作為該方法，具體的，可以列舉出通常的再構(gòu)成處理、通過蛋白沉淀的處理、(鹽析法)、離心分離、滲透壓沖擊法、超聲波破碎、超過濾、分子篩色譜法、(凝膠過濾)、吸著色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、高速液體色譜法、(HPLC)等各種液體色譜法、透析法、這些的組合，作為優(yōu)選的方法可以列舉出利用結(jié)合了對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異抗體的柱的親和色譜法。
再有，把本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼設(shè)計(jì)所希望的基因之際，可以很好地利用在序列號(hào)2中以堿基序列(145～1488)所示的人p51A基因的堿基序列，或在序列號(hào)5中以堿基序列(145～2067)所示的人p51B基因的堿基序列。也可以利用該基因，根據(jù)希望，適當(dāng)選擇變更表示各氨基酸的密碼子。
另外，在以p51A基因或p51B基因編碼的氨基酸序列中，在其一部分氨基酸殘基乃至氨基酸序列通過替換、缺失、插入等改變的場(chǎng)合，可以按例如細(xì)胞特定誘變等上述的各種方法進(jìn)行。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以按由序列號(hào)1所表示的氨基酸序列或序列號(hào)4所表示的氨基酸序列，通過一般的化學(xué)合成法制造。該方法包含根據(jù)通常的液相法及固相法的肽合成法。
所說(shuō)的肽合成法更詳細(xì)地說(shuō)包含基于氨基酸序列信息，把各氨基酸一個(gè)一個(gè)地逐次結(jié)合鏈延長(zhǎng)的所謂的步進(jìn)寬幅延長(zhǎng)法，和預(yù)先合成由數(shù)個(gè)氨基酸構(gòu)成的片段，然后把各片段進(jìn)行偶合反應(yīng)的片段縮合法，本發(fā)明的肽的合成可以采用其中之一法。
上述肽合成法所采用的縮合法可以按常規(guī)方法進(jìn)行，例如可以列舉出疊氮法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化還原法、DPPA(二苯基磷酰疊氮)法、DCC+添加物(1-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰胺、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亞胺)法、伍德沃德法等。這些方法所利用的溶劑，也可以從此種肽縮合反應(yīng)所使用的公知的一般的溶劑中適當(dāng)選擇。作為此例，例如可以列舉出二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、六磷酰胺、二祐烷、四氫呋喃(THF)、醋酸乙酯等及其混合溶劑等。
另外，在上述肽合成反應(yīng)之際，對(duì)于與反應(yīng)無(wú)關(guān)的氨基酸乃至肽中的羧基。一般可通過酯化，可以作成例如甲基酯、乙基酯、叔丁基酯等低級(jí)烷基酯、例如芐基酯、對(duì)甲氧基芐基酯、對(duì)硝基芐基酯等芳烷基酯等進(jìn)行保護(hù)。
再有，具有側(cè)鏈中的官能團(tuán)的氨基酸，例如酪氨酸殘基的羥基可以用乙酰基、芐基、芐氧羰基、叔丁基等進(jìn)行保護(hù)，但也非進(jìn)行這種保護(hù)不可。進(jìn)而，對(duì)于精氨酸殘基的胍基殘基，可用硝基、三甲苯基、對(duì)甲氧基苯磺?；?、亞甲基-2-磺酰基、芐氧羰基、異冰片基氧羰基、金剛烷基氧羰基等適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基進(jìn)行保護(hù)。
具有上述的保護(hù)基的氨基酸，肽及最終所得的本發(fā)明的蛋白質(zhì)上的這些保護(hù)基的脫保護(hù)反應(yīng)可用慣用方法進(jìn)行，例如接觸還原法和液體氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟醋酸、醋酸、甲酸、甲磺酸等方法。
這樣所得的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，可以按上述的各種方法，例如按離子交換樹脂、分配色譜法、凝膠色譜法、對(duì)流分配法等肽化學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的方法，進(jìn)行適當(dāng)精制。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以作為用于作成p51蛋白質(zhì)的特異抗體的免疫抗原加以利用，通過利用這些抗原，可以取得所希望的抗血清(多克隆抗體)及單克隆抗體。
該抗體的制造方法本身，技術(shù)人員應(yīng)理解，在本發(fā)明中也可以按這些常用的方法[參照續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座“免疫生化學(xué)研究法”、日本生化學(xué)學(xué)會(huì)編(1986)等]。這樣所得的抗體，可以有利地用于例如p51蛋白的精制及其借助于免疫學(xué)的手法的測(cè)定乃至識(shí)別等。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為以其為有效成分的醫(yī)藥品，在醫(yī)藥領(lǐng)域中是有用的。
(5)含有p51蛋白的醫(yī)藥組成物因此，本發(fā)明涉及包含上述的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的醫(yī)藥。
該蛋白質(zhì)也包括醫(yī)藥中所允許的鹽。所說(shuō)的鹽包含以本領(lǐng)域周知的方法所調(diào)制的、例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨等無(wú)毒性堿金屬鹽、堿土金屬鹽以及銨鹽等。上述的鹽也可包括借助于本發(fā)明的肽和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸乃至無(wú)機(jī)酸的反應(yīng)的無(wú)毒性酸加成鹽。作為代表的無(wú)毒性酸添加鹽，可以列舉出例如鹽酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、重硫酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磺酸鹽、羥基乙酸酯、馬來(lái)酸鹽、抗壞血酸鹽、苯磺酸鹽、以及石腦酸鹽(ナブシレ一ト)等。
本發(fā)明中，包括以上述的本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為活性成分，含有它的藥學(xué)有效量、適當(dāng)?shù)臒o(wú)毒性醫(yī)藥載體乃至稀釋劑的醫(yī)藥組成物或醫(yī)藥制劑。
作為上述醫(yī)藥組成物(醫(yī)藥制劑)中所利用的醫(yī)藥載體，可以列舉出根據(jù)制劑的使用形態(tài)通常使用的有填充劑、增量劑、結(jié)合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、等稀釋劑或賦形劑等，可根據(jù)由此所得的制劑的給藥單位形態(tài)加以適當(dāng)選擇利用。
特別是，優(yōu)選的本發(fā)明的醫(yī)藥制劑可適當(dāng)使用在通常的蛋白制劑等中能使用的各種成分，例如穩(wěn)定劑、殺菌劑、緩沖劑、等滲化劑、螯合劑、pH調(diào)整劑、表面活性劑等進(jìn)行調(diào)制。
作為上述穩(wěn)定劑，可以列舉出例如人血清白蛋白和通常的L-氨基酸、糖類、纖維素衍生物等，這些可以單獨(dú)或與表面活性劑組合使用。特別是，若按該組合，有時(shí)還進(jìn)一步提高有效成分的穩(wěn)定性。
作為上述的L-氨基酸，沒有特別的限制，例如甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任意一種酸均可。
作為上述的糖，沒有特別的限制，可以使用例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等單糖類、甘露糖醇、肌醇、木糖醇等糖醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖類、葡聚糖、羥丙基淀粉、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等多糖類以及它們的衍生物。
作為表面活性劑，沒有特別的限制，可以使用離子性或非離子性的表面活性劑中的某一種，例如可以使用聚氯氧乙烯二醇山梨糖醇酐烷基酯系列、聚氧乙烯烷基醚系列、山梨糖醇酐單酰酯系列、脂肪酸甘油酯系列等。
作為纖維素衍生物，沒有特別的限制，可以使用甲基纖維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉等。
上述糖類的添加量，每有效成分1μg約0.0001mg以上，優(yōu)選約0.01-10mg左右的范圍是適當(dāng)?shù)?。表面活性劑的添加量，每有效成?μg約0.00001mg以上，優(yōu)選約0.0001-0.01mg左右的范圍是適當(dāng)?shù)?。人血清白蛋白的添加量，每有效成?μg約0.0001mg以上，優(yōu)選約0.001-0.1mg左右的范圍是適當(dāng)?shù)?。氨基酸，每有效成?μg約0.001～10mg左右。另外，纖維素的添加量，每有效成分1μg約0.001mg左右，優(yōu)選約0.001-0.1mg左右，的范圍是適當(dāng)?shù)?。含在本發(fā)明醫(yī)藥制劑中的有效成分量，可在廣范圍內(nèi)選擇，通常是0.00001～70重量％，優(yōu)選的是0.0001～5重量％左右。
在本發(fā)明醫(yī)藥制劑中，可以添加各種添加劑，例如緩沖劑、等滲化劑、螯合劑等。此處，作為緩沖劑可以列舉出硼酸、磷酸、醋酸、檸檬酸、ε-氨基己二酸、谷氨酸和/或它們的鹽(例如它們的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、等堿金屬鹽和堿土金屬鹽)等。
作為等滲化劑，可以列舉出例如氯化鈉、氯化鉀、糖類、甘油等。作為螯合劑，可以列舉出例如依他酸納、檸檬酸等。
本發(fā)明的醫(yī)藥制劑，除可作溶液制劑使用外，還能把它凍結(jié)干燥化作成保存的狀態(tài)后，用時(shí)，可以用含水、生理鹽水等緩沖劑等溶解，調(diào)制到適當(dāng)濃度后使用。
作為本發(fā)明的醫(yī)藥制劑的給藥單位形態(tài)，根據(jù)治療目的可以選擇各種形態(tài)，作為其代表含有片劑、丸劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、膠囊劑等固體給藥形態(tài)、及溶液、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等液劑給藥形態(tài)，還可根據(jù)給藥路徑分成經(jīng)口劑、非經(jīng)口劑、經(jīng)鼻劑、經(jīng)腔劑、坐劑、舌下劑、軟膏劑等，按各自同常的方法來(lái)進(jìn)行調(diào)合、成形乃至調(diào)制。
例如，在形成片劑的形態(tài)之際，作為上述制劑載體可以使用例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸、磷酸鉀等賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、淀粉液、明膠溶液、羧基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等結(jié)合劑；羧基甲基纖維素鈉、羧基甲基纖維素鈣、低取代度羥基丙基纖維素、干燥淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布多糖末、碳酸氫鈉、碳酸鈣等崩解劑；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯等表面活性劑；白糖、硬脂精、可可脂黃油、添加氫油等崩解抑制劑、季銨堿、月桂基硫酸鈉等吸附促進(jìn)劑；甘油、淀粉等保濕劑；淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤(rùn)土、膠體狀硅酸等吸附劑；精制滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等潤(rùn)滑劑等。
片劑，根據(jù)需要，可以作成實(shí)施通常的劑皮的片劑、例如，糖衣片、明膠包衣片、腸溶包衣片、涂層片，也可以作成雙層片或多層片。
在形成丸劑的形態(tài)之際，作為制劑載體，例如可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高嶺土、滑石等賦形劑；阿拉伯膠粉末、黃蓍膠粉末、乙醇等結(jié)合劑；昆布多糖、乙醇等崩解劑等。
膠囊劑，按通常方法將本發(fā)明的有效成分按上述的示例的各種制劑載體混合，填充硬質(zhì)明膠膠囊、軟質(zhì)膠囊等加以調(diào)制。
經(jīng)口給藥用液體給藥形態(tài)，可以包含含有水的醫(yī)藥容許的溶液、乳化液、懸浮液、糖漿、酏劑等，還可以包含潤(rùn)滑劑、乳劑、懸浮劑等助劑，按常法對(duì)此進(jìn)行調(diào)制。
非經(jīng)口給藥用液體投與形態(tài)，例如在滅菌水性乃至非水性溶液、乳化劑、懸浮液等調(diào)制之際，作為稀釋劑可以使用水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯以及橄欖油等植物油，另外，可以配合可以注入的有機(jī)酯類、例如油酸乙酯等。在這些當(dāng)中還可以添加通常的溶解輔助劑、緩沖劑、潤(rùn)滑劑、乳化劑、懸浮劑、分散劑等。
滅菌，通過保留細(xì)菌過濾器的過濾操作，殺菌劑的配合、照射處理以及加熱處理等實(shí)施。另外，在使用之前，可將其溶解于滅菌水和可以適當(dāng)滅菌的溶劑中，調(diào)制成滅菌固體組成物。
在成形坐劑和腔給藥用制劑的形態(tài)之際，作為制劑載體，例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯類、明膠以及半合成甘油酯等。
在成形漿、膏、凝膠等軟膏劑的形態(tài)的成形之際，作為稀釋劑，例如可以使用白色凡士林、石臘、甘油、纖維素衍生物、丙二醇、聚乙二醇、硅膠、膨潤(rùn)土以及橄欖油等植物油。
經(jīng)鼻或舌下給藥用組合物用周知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑，按常法進(jìn)行調(diào)制。
還有，在本發(fā)明的醫(yī)藥制劑中，根據(jù)需要可以含有著色劑、保存劑、香料、風(fēng)味劑、甜味劑等其它醫(yī)藥品等。
上述醫(yī)藥制劑的給藥方法，沒有特別的限制，可根據(jù)各種制劑形態(tài)、患者的年齡、性別、及其它條件、疾病的程度而決定。例如，片劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑以及膠囊劑經(jīng)口給藥，注射劑，可以單獨(dú)或與葡萄糖和氨基酸等通常的補(bǔ)液混合進(jìn)行靜脈給藥，根據(jù)需要，可以單獨(dú)作筋肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮或腹腔內(nèi)給藥，坐劑為直腸內(nèi)給藥，舌下劑作口腔內(nèi)給藥，軟膏劑作經(jīng)皮的局部給藥。
上述醫(yī)藥制劑中應(yīng)含有的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量及其給藥量，沒有特別的限制，根據(jù)所希望的醫(yī)療效果、投與法、治療期間患者的年齡、性別及其它條件雖可在廣范圍內(nèi)作適當(dāng)?shù)剡x擇，但一般地，該投與量，通常，每日每體重1kg投與約0.01μg-10mg左右，優(yōu)選約0.1μg-1mg左右為好，該制劑1日中可分?jǐn)?shù)次給藥。
(6)基因治療本發(fā)明提供利用本發(fā)明的人p51基因的基因治療法。該治療法，采取在有變異p51基因的細(xì)胞處，供給野生型p51功能的方法。把野生型p51基因或其基因產(chǎn)物本來(lái)有的正常功能提供給細(xì)胞時(shí)，可以抑制受容細(xì)胞/標(biāo)的細(xì)胞中的新生物的增殖。上述野生型p51基因，要使用將該基因維持在染色體外的載體或質(zhì)粒，導(dǎo)入目的細(xì)胞。在此場(chǎng)合，該基因從染色體外表達(dá)。
在把野生型p51基因?qū)刖哂羞@樣的變異p51基因的細(xì)胞中，表達(dá)正常p51蛋白的場(chǎng)合，p51基因沒有必要是全長(zhǎng)，只要保持與該基因的所希望機(jī)能實(shí)質(zhì)上相同的機(jī)能，也可以是其改變體，也可以使用由還保持特定機(jī)能的一部分序列構(gòu)成的基因。作為后者的例子，可以列舉出將細(xì)胞的非腫瘤的增殖(細(xì)胞增殖抑制)所需要的p51蛋白的一部分編碼的基因。
野生型p51基因或其一部分，最好導(dǎo)入突然變異細(xì)胞，以便與細(xì)胞內(nèi)存在的內(nèi)因突然變異p51基因之間引起重組。這樣的重組中，需要發(fā)生修正p51基因突然變異的雙重重組。
用于導(dǎo)入所說(shuō)的重組及維持染色體外的為導(dǎo)入雙方所希望的基因載體，在該領(lǐng)域中，是已知的，在本發(fā)明中，所說(shuō)的已知載體的任一種均可使用。
可舉出例如，含有與表達(dá)控制元件連接的p51基因的拷貝，而且在目的細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)該基因產(chǎn)物的病毒載體或質(zhì)粒載體。作為所說(shuō)的載體雖可利用通常上述的表達(dá)用載體，但作為起源載體，最好使用美國(guó)專利第5 252 479好說(shuō)明書及PCT國(guó)際公開WO 93/07282號(hào)說(shuō)明書中所公開的載體(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、Pwp-21和/或pRSVL等)或pRC/CMV(Invitrogen公司制)等，進(jìn)行調(diào)制的載體。最好是后述的各種病毒載體。
另外，作為導(dǎo)入基因治療中，用于載體的啟動(dòng)子優(yōu)選利用構(gòu)成治療各種疾病對(duì)象的患處組織中固有的啟動(dòng)子。
做為其具體的例子，例如對(duì)于肝臟，可以例舉出白蛋白、α-甲脂蛋白、α1-抗胰蛋白酶、鐵傳遞蛋白、甲狀腺運(yùn)載蛋白等。對(duì)于結(jié)腸，可以例舉出羧酸脫水酶Ⅰ、抗癌胚抗原等。對(duì)于子宮及胎盤，可以例舉出雌激素、阿洛嗎他賽得色素、膽甾醇側(cè)鏈切斷、17α羥基酶等。
對(duì)于前列腺，可以列舉出前列腺抗原、gp91-聚焦基因、前列腺特移的激肽釋放酶等。對(duì)于乳房可以列舉出erb-B2、erb-B3、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳漿蛋白質(zhì)。對(duì)于肺可以列舉出活性劑蛋白質(zhì)C尿球蛋白等。對(duì)于皮膚可以列舉出K-14-角蛋白、人角蛋白1或6、白細(xì)胞素等。
對(duì)于腦可以列舉出神經(jīng)膠纖維質(zhì)酸性蛋白質(zhì)、成熟星形細(xì)胞特異蛋白質(zhì)、髓磷酶、酪氨酸羥基酶胰臟蛋白質(zhì)、高血糖素、胰島淀粉狀蛋白多肽等。對(duì)于甲狀腺可以列舉出甲狀球蛋白、降鈣素等。對(duì)于骨可以列舉出α1-膠原、骨鈣素、骨唾酸糖蛋白等。對(duì)于腎臟可以列舉出凝乳酶、肝臟/骨/腎臟堿性磷酸酶、細(xì)胞生成素等對(duì)于胰臟可以舉出淀粉酶、PAP1等。
在基因?qū)胗幂d體的制造中，基于本發(fā)明的p51基因的堿基序列信息，如前所述，通過一般的基因工程手法可以容易地制造、或取得導(dǎo)入的基因(全部或一部分)。
所說(shuō)的導(dǎo)入基因用載體向細(xì)胞的導(dǎo)入例如以電穿孔法、磷酸鈣共沉法、病毒形質(zhì)導(dǎo)入法為主的、在細(xì)胞中，導(dǎo)入DNA的該領(lǐng)域中，按已知的各種方法進(jìn)行。另外，以野生型p51基因所進(jìn)行型質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以自體分離狀態(tài)作為癌的抑制乃至癌轉(zhuǎn)移抑制的醫(yī)藥和治療研究的模型加以利用。
在基因治療中，上述的基因?qū)胗幂d體，通過注射投與患者的腫瘤部位局部或全身的辦法可以導(dǎo)入患者的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)若作全身的給藥也能達(dá)到能轉(zhuǎn)移到其他部位的腫瘤細(xì)胞內(nèi)。在形質(zhì)導(dǎo)入的基因不能永久性地進(jìn)入各標(biāo)的腫瘤細(xì)胞的染色體內(nèi)時(shí)，可以通過定期地反復(fù)給藥達(dá)到。
本發(fā)明的基因治療方法包含，把前述的基因?qū)胗玫牟牧?基因?qū)胗幂d體)直接投與體內(nèi)的體內(nèi)、從患者體內(nèi)取出一度作為標(biāo)的的細(xì)胞，在體外導(dǎo)入基因，然后再把基團(tuán)反回到體內(nèi)的體外法這兩種方法。
另外，把人p51基因直接導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，可以用作為切斷RNA鏈的活性分子的硫辛酸酰胺、進(jìn)行基因治療。
含有本發(fā)明的人p51基因或其片段的基因?qū)胗幂d體及由該載體導(dǎo)入人p51基因的細(xì)胞作為有效成分的本發(fā)明基因治療劑。雖然是以癌為利用對(duì)象，但上述的基因治療(處置)也可以進(jìn)行癌以外的基因性疾病、如AIDS那樣的病毒疾病的治療，也可進(jìn)行以基因標(biāo)識(shí)做為目的。
再有導(dǎo)入基因的標(biāo)的細(xì)胞、根據(jù)基因治療(處理)的對(duì)象可以適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，作為標(biāo)的細(xì)胞除癌細(xì)胞和腫瘤組織以外，還可以列舉出淋巴細(xì)胞、纖維胚細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞等細(xì)胞。
在上述基因治療中的基因?qū)敕椒ㄖ?，包含病毒的?dǎo)入方法及非病毒的導(dǎo)入方法。
作為病毒的輸入方法，如鑒于人p51基因是在正常細(xì)胞里表達(dá)的外來(lái)基因、所以作為載體可舉出使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體方法。作為其他的病毒載體還可以舉出腺病毒載體、HIV(human immunodeficiencyvirns)載體、腺伴隨病毒載體(AAV，adeno-associated viras)皰疹病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)載體及埃布斯坦一巴病毒(EBV，Epstein-Barrvirus)載體。
作為非病毒的基因?qū)敕椒?、可以使用以下的方法。磷酸鈣共淀法；用封入DNA的核糖體和予先以紫外線破壞基因的不活性化仙臺(tái)病毒融合作成膜融合核糖體，它和細(xì)胞膜直接融合后將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的膜融合核糖體法[Kato，K.，ct al.，J.Biol.Chem.，266，22071-22074(1991)]；將質(zhì)粒DNA用金屬包被，用高壓放電物理性地將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)方法[Yang，N.S.et a1.，Proc.Nafl.Acad.Sci.，87，9568-9572(l990)]；將質(zhì)粒DNA直接用體內(nèi)法注入到臟器官和腫瘤里的裸(naked)DNA方法；[Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1467(1990)]；將包埋多重膜正電荷核糖體的基因?qū)氲郊?xì)胞里的陰離子核糖體方法[八木國(guó)夫，醫(yī)學(xué)之路，Vol.175，No.9.635-637(1995)]；為了能只導(dǎo)入特定的細(xì)胞，不讓其他的細(xì)胞進(jìn)入，與可在目的細(xì)胞里表達(dá)的受體的配位體和DNA結(jié)合，進(jìn)行給藥的配位體DNA復(fù)合體法。[Frindeis，et al.，Trends Biotechnol.，11，202(1993)；Miller，et al.，F(xiàn)ASEB J.，9，190(1995)]。
上述的配位體DNA復(fù)合體法還包含以下所舉的方法等。例如，將肝細(xì)胞表達(dá)的脫唾液糖蛋白受體作為靶子，將脫唾液糖蛋白作配位體使用的方法和強(qiáng)烈表達(dá)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)鐵蛋白受體作為標(biāo)的，作為配位體使用的方法等。[Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，87，3410(1990)]。
另外，本發(fā)明所用的基因?qū)敕?，將如上所述的各種生物學(xué)及物理學(xué)的基因?qū)敕ㄟm當(dāng)組合而形成的方法也是可以的。作為該組合而形成的方法，例如，將某種尺寸的質(zhì)粒DNA和與腺病毒。六鄰體蛋白質(zhì)特異的聚賴氨酸抱合抗體組合的方法。根據(jù)該方法，所得到復(fù)合體和腺病毒載體相結(jié)合，用如此得到的三分子復(fù)合體去感染細(xì)胞，由此便可以進(jìn)行本發(fā)明的基因?qū)搿⒃谶@個(gè)方法中，在和腺病毒載體偶合的DNA在被損傷前可以進(jìn)行效率化的結(jié)合，可能成為內(nèi)在化及核內(nèi)體分解。另外，前述的核糖體/DNA復(fù)合體，直接在體內(nèi)可作為導(dǎo)入基因的媒介。
下面具體闡述本發(fā)明的基因?qū)胗貌《据d體的作成方法及向標(biāo)的細(xì)胞或標(biāo)的組織導(dǎo)入基因的方法。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)是由病毒載體和輔助細(xì)胞(包裝細(xì)胞)構(gòu)成。在這里的輔助細(xì)胞是指事先表達(dá)著逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)gag(病毒粒子內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì))、P01(逆轉(zhuǎn)錄酶)、env(外被蛋白質(zhì))等的基因，但是沒有生成病毒粒子的細(xì)胞。另一方面，病毒載體雖然具有包裝信號(hào)和LTR(long terwinal repeats)但是不具有“病毒復(fù)制所必須的gag、P01、env等的構(gòu)造基因。包裝信號(hào)在病毒粒子的裝配時(shí)，成為標(biāo)記序列，重組所希望的導(dǎo)入基因(p51基因或者他的片段)代替病毒基因被插入到被選擇基因(neo，hyg)和克隆細(xì)胞內(nèi)。在這里為得到高力價(jià)的病毒粒子，增加盡可能的短些，將含有包裝信號(hào)的gag基因的一部分盡量多的取得，不留下gag基因的ATG等是非常重要的。
通過將含有所希望的p51基因載體的DNA移入到輔助細(xì)胞里，據(jù)此，再根據(jù)輔助細(xì)胞作成的病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，載體基因組RNA被包裝，形成病毒粒子，被分泌。作為重組的病毒粒子，感染靶細(xì)胞后被病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA被編入到細(xì)胞核里。插入到載體內(nèi)部的基因進(jìn)行表達(dá)。
另外，作為提高所希望基因的導(dǎo)入效率的方法，也可以采用這種方法，即使用含有粘接纖連蛋白的細(xì)胞粘結(jié)構(gòu)成，和與肝素結(jié)合部位接合的區(qū)段的片段的方法[Hanenberg.H.，et al.，Exp.Hemat.，23，747(1995)]。
還有在上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)里被使用的載體，可以舉出起源于小鼠的白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒例子[McLachlin，J.R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Res.Molec.Biol.，38，91-135(1990)]。
關(guān)于利用腺病毒載體的方法，要進(jìn)行詳述的話，該腺病毒載體的作成可以基于巴克奈耳[Berkner，K.L.，Curr.Topics Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)]、瀨戶口康弘等[Setoguchi，Y.，et al.，Blood，84，2946-2953(1994)]、鐘之江裕美等[實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，12，28-34(1994)]及肯納等[Ketner，G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，91，6186-6190(1994)]的方法進(jìn)行。
例如，作成非增殖性腺病毒載體時(shí)，首先要除去腺病毒的初期基因的E1及/或E3基因領(lǐng)域。接著，將含有所希望的外來(lái)基因表達(dá)單位(作為目的的基因，在本發(fā)明中是由p51基因，為轉(zhuǎn)錄此基因的起動(dòng)子、賦與被轉(zhuǎn)錄基因穩(wěn)定性的聚A構(gòu)成)及含有腺病毒基因組DNA一部分的質(zhì)粒載體和含有腺病毒基因組的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染例如293那樣的細(xì)胞里。在這兩者間引起相同性重組，根據(jù)基因表達(dá)單位和E1的替換，可以作成含有所希望的p51基因的本發(fā)明載體的非增殖性腺病毒載體。另外在粘粒載體里編入腺病毒基因組DNA也可以做成附加了末端蛋白質(zhì)3′側(cè)腺病毒載體。進(jìn)而重組作成腺病毒載體時(shí)，也可利用YAC載體。
關(guān)于腺伴隨病毒(AAV)載體的制造概括地說(shuō)，AAV是作為混進(jìn)腺病毒的培養(yǎng)系內(nèi)的小型病毒被表達(dá)的。在這里確認(rèn)了病毒的復(fù)制時(shí)，不需要輔助病毒，在宿主細(xì)胞內(nèi)自主地增殖的小球病毒屬和必須具有輔助病毒的依賴病毒屬的存在。該AAV是宿主領(lǐng)域較寬感染各種細(xì)胞常見的病毒，病毒基因組的大小是由4680堿基的線狀一根鏈DNA構(gòu)成的，其兩端的145堿基具有被稱為1TR(inverted terminal repeat)那樣特征的序列。這個(gè)1TR部分作為復(fù)制開始點(diǎn)，起到引物作用。進(jìn)而，在對(duì)病毒粒子的包裝和對(duì)宿主細(xì)胞染色體DNA的重組該1TR也是必須的。另外，關(guān)于病毒蛋白質(zhì)、基因組左半部分是非構(gòu)造蛋白質(zhì)，即編碼著起著復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的Rep。
重組AAV的作法是利用AAV進(jìn)入染色體DNA里的性質(zhì)而進(jìn)行的，這樣一來(lái)，就可以作成所希望的基因?qū)胗幂d體。這個(gè)方法要更詳細(xì)的說(shuō)的話，首先，留下野生型AAV的5’和3’兩端的1TR作成插入其間所希望導(dǎo)入用的基因(人p51基因)質(zhì)粒。另外，對(duì)于病毒復(fù)制和病毒粒子的形成所必須的病毒蛋白質(zhì)，是從別的輔助質(zhì)粒提供的。必要的是在其兩者間不存在共同的堿基序列、通過基因重組的野生型病毒不再出現(xiàn)。然后，將兩者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞里，進(jìn)行導(dǎo)入，進(jìn)而作為輔助病毒，讓其去感染腺病毒(使用293細(xì)胞時(shí)非增殖型也可以)，產(chǎn)生非增殖性的所希望的重組AAV。接著，因?yàn)檫@個(gè)重組的AAV存在于核內(nèi)，將細(xì)胞凍結(jié)融解之后，回收，將混入的腺病毒加熱到56℃，讓其失去活性。之后，必要時(shí)，使用氯化鈣，用超離心法分離濃縮重組的AAV。向上述那樣就可以得到將希望的基因?qū)胗玫闹亟MAAV。
HIV載體的作成，可以基于島田等的方法進(jìn)行[Shimada，T.，et al.，J.Clin.Invest.，88，1043-1047(1991)]。
HIV病毒，將CD4作成受體特異地感染輔助T細(xì)胞，所以按其利用，就可以作成，作為在人CD4陽(yáng)性細(xì)胞里特異地導(dǎo)入基因可能組織的特異基因?qū)胼d體的HIV載體。該HIV載體最適于AIDS的基因治療。
重組HIV載體的作成，首先，通過巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子和人球蛋白基因的聚A信號(hào)(polyA)表達(dá)gag.Pol.env的結(jié)構(gòu)基因和這些表達(dá)必要的調(diào)節(jié)基因(tat.rev等)，而作成包裝質(zhì)粒的CGPE。接著在HIV的兩個(gè)LTR間插入帶有作為標(biāo)識(shí)基因的胸苷激酶(TK)的起動(dòng)子的新霉素耐性基因(neok)，進(jìn)而，在作為基本的質(zhì)粒載體里增加SV40的復(fù)制機(jī)能，由此在COS細(xì)胞內(nèi)可以高效率增殖地構(gòu)建載體-質(zhì)粒HXN。將這些包裝質(zhì)粒的CGPE和載體質(zhì)粒HXV同時(shí)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞里，由此，形成由大量的neok基因進(jìn)入的所希望的重組病毒，在培養(yǎng)地中可以讓其釋放。
EBV載體的制造，可以基于清水等的方法進(jìn)行[清水則夫、細(xì)胞工學(xué)，14(3)，280-287(1995)]。
關(guān)于本發(fā)明基因?qū)胗肊BV載體的制造簡(jiǎn)略聽說(shuō)EB病毒(Epstein-Barr virusEBV)是1964年，由Epstein氏從Burkitt淋巴腫瘤的培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來(lái)的，屬于皰疹科的病毒[Kieff，E.and Liebowit z，D.Virology，2nd ed.Raven Press，New York，1990，pp.1889-1920]。該EBV里因?yàn)橛锌梢赞D(zhuǎn)化細(xì)胞的活性，為了使其能作為基因?qū)胗幂d體，就必須調(diào)制出沒有這種活性轉(zhuǎn)換的病毒，這個(gè)是如下那樣實(shí)施的。
也就是說(shuō)，首先，將所編入有希望的外來(lái)基因靶DNA近旁的EBV基因組進(jìn)行克隆。在那里加入外來(lái)基因的DNA片段和藥劑耐性基因，作為重組病毒制作用載體。接著，將由適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶產(chǎn)生的重組病毒制作用載體轉(zhuǎn)染到EBV陽(yáng)性Akata細(xì)胞里。由相同重組產(chǎn)生的重組病毒由于表面免疫球蛋白處理產(chǎn)生病毒刺激，可與野生型AkataEBV同時(shí)回收。將此感染在EBV陰性Akata細(xì)胞內(nèi)，在藥劑存在下，通過選擇耐性株，就可以得到野生型EBV不共存的所希望的重組病毒感染的Aktata細(xì)胞。進(jìn)而將病毒活性引進(jìn)到重組病毒感染的Akata細(xì)胞里，就可以產(chǎn)生出大量的重組病毒載體。
不用重組病毒載體而將所希望的基因?qū)氲桨屑?xì)胞里的、非病毒載體制造方法，如可以用基于膜融合核糖體的基因?qū)敕ň涂梢赃M(jìn)行。這是因?yàn)槭鼓ず颂求w(由脂質(zhì)二重膜構(gòu)成的小胞)有進(jìn)入細(xì)胞膜的融合活性，是將核糖體的內(nèi)容物直接導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的方法。
上述膜融合核糖體基因的導(dǎo)入，用中西等的方法，就可以進(jìn)行。[Nakanishi，M.，et al.，Exp.Cell Res.，1 59，399-499(1985)；Nakanishi，M.，etal..Geneintroductioninto animaltissues.In Trends and Future Perspectives inPeptide and Protein Drug Delivery(ed.By Lee，V.H.et al.).，HarwoodAcademic Publishers Gmbh.Amsterdam，1995 pp.337-349]。
下面關(guān)于用該膜融合核糖體進(jìn)行基因?qū)敕ǜ怕匀缦?。用紫外線將基因不活性化的仙臺(tái)病毒和封入所希望的基因及蛋白質(zhì)等的高分子物質(zhì)的核糖體在37℃下使其融合。這個(gè)膜融合核糖體，內(nèi)側(cè)有因?yàn)楹颂求w而產(chǎn)生的空洞，外側(cè)有和包膜病毒相同突起那樣被稱模擬病毒那樣的構(gòu)造。然后，用蔗糖密度斜度離遠(yuǎn)心法精制后，對(duì)于作為靶的培養(yǎng)細(xì)胞或者組織細(xì)胞，在4℃吸附膜融合核糖體。接著，當(dāng)?shù)?7℃時(shí)核糖體的內(nèi)容物導(dǎo)入細(xì)胞。所希望的基因就可以導(dǎo)入到靶細(xì)胞里。在這里作為核糖體使用的脂質(zhì)是具有50％(摩爾比)膽甾醇和卵磷脂及陰電荷的合成磷脂質(zhì)，希望能作成直徑為300nm的一塊膜核糖體后使用。
另外，作為使用其他的核糖體將基因?qū)氲桨屑?xì)胞里，可以舉出用陽(yáng)離子核糖體進(jìn)行基因?qū)氲姆椒?。該方法是基于八木等的方法而?shí)施的[yagi，K.，et al.，B.B.R.C，196，1042-1048(1993)]。這個(gè)方法是，質(zhì)粒也好細(xì)胞也好都給予負(fù)電荷，核糖體膜內(nèi)外兩面給予正電荷，用靜電使質(zhì)粒的進(jìn)入增加，使和細(xì)胞的相互作用增加。在這里所使用的核糖體為具有正電荷的多層膜的大的模核糖體(multilamellar largevesiclesMLV)，但是使用1枚大的核糖體(large unilamellar vesiclesLUV)和1枚小的膜核糖體(small unilamellar vesiclesSUV)與質(zhì)粒作成復(fù)合體，也可以導(dǎo)入所希望的基因。
關(guān)于質(zhì)粒包埋陽(yáng)離子的調(diào)制方法，概括的說(shuō)，如下首先將脂質(zhì)TMAG(N-(a-trimethy lammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride)、DLPC(dilauroy phosphatidylcholine)及DOPE(dioleoyl phosphatidylethanol-amine)按摩爾比1∶2∶2的比例調(diào)制成含有氯仿的溶液(作為脂質(zhì)濃度為1mM)。接著將總量為1μmol的脂質(zhì)注入到尖嘴型試驗(yàn)管里，用輥式蒸發(fā)器將氯仿減壓、除去、調(diào)制成脂質(zhì)薄膜。再次減壓直到將氯仿完全除去，使其干燥。之后將含有20μg的基因?qū)胗觅|(zhì)粒的0.5ml的Dulbecco的磷酸緩沖生理食鹽液-Mg，Ca添加進(jìn)去，用氮置換后，用渦流混合器攪拌20分鐘，就可以得到包埋含有所需基因質(zhì)粒陽(yáng)離子懸浮液。
把上述所得到的包有質(zhì)粒的陽(yáng)離子MLV作為治療劑使用，可以作為一例，例如，將含有表達(dá)目的基因的cDNA的表達(dá)質(zhì)粒上包埋在上述的陽(yáng)離子性MLV中，使得DNA的量為0.6μg，核糖體脂質(zhì)量30nmol，使其在2μl的磷酸緩沖生理食鹽液里懸浮，對(duì)從患者處抽出的靶細(xì)胞或者患者組織隔日投入的這樣方法。
可是，所稱的基因治療根據(jù)日本厚生省的指導(dǎo)方針的定義為以治療疾病為目的，將基因或者導(dǎo)入基因的細(xì)胞注入到人體內(nèi)。但是本發(fā)明的基因治療，不僅是在該指導(dǎo)方針的基礎(chǔ)上，在前述的靶細(xì)胞里導(dǎo)入作為人p51基因等的癌抑制基因，由此導(dǎo)入的基因不僅治療以癌為首的各種疾病，而且還包括可以將成為標(biāo)識(shí)的基因或者導(dǎo)入標(biāo)識(shí)基因的細(xì)胞導(dǎo)入到人的體內(nèi)。
本發(fā)明的基因治療中，在所希望的基因向靶細(xì)胞或者靶組織導(dǎo)入的方法，有2個(gè)代表的方法。
其中的第1個(gè)方法為，從作為治療對(duì)象的患者那里采取靶細(xì)胞后，將該細(xì)胞在體外，例如在白細(xì)胞介素-2(IL-2)等的添加下培養(yǎng)，導(dǎo)入被逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含的p51基因之后，將得到的細(xì)胞再移植的方法(ex vivo法)。該方法適合用于治療以欠缺ADA為首的，因欠缺基因而發(fā)生的基因病和癌癥、AIDS病等的治療。
第2個(gè)方法，是將目的基因(人p51基因)直接注入患者的體內(nèi)或腫瘤組織等的靶部位的基因直接輸入法(直接法)。
上述基因治療的第1種方法，現(xiàn)詳細(xì)的說(shuō)向如下那樣實(shí)施。即，將從患者處采取的單核細(xì)胞用血液分離裝置從單核細(xì)胞中分出，將取出的細(xì)胞在1L-2的存在下AIM-V培養(yǎng)地等的適當(dāng)培養(yǎng)地里，培養(yǎng)72小時(shí)左右，加入含有應(yīng)導(dǎo)入基因(人p51基因)的載體。為了加速基因的導(dǎo)入效率，在魚精蛋白存在的情況下，32℃1小時(shí)，2500轉(zhuǎn)離心分離后，在37℃ 10％二氧化碳?xì)鈼l件下培養(yǎng)24小時(shí)也可以。將這種操作反復(fù)進(jìn)行數(shù)次后，進(jìn)而在1L-2存在下，AIM-Vt培養(yǎng)地里培養(yǎng)48小時(shí)，把細(xì)胞用生理鹽水里洗凈，算出生細(xì)胞數(shù)，基因?qū)胄?，在上述的in situ PCR中例如，所希望的對(duì)象是酵素活性的話，根據(jù)測(cè)定他的活性程度來(lái)確認(rèn)目的基因?qū)胄Ч?br> 另外，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，枝原體感染的有無(wú)，內(nèi)毒素檢索等的安全度進(jìn)行檢查，確認(rèn)安全性后，將導(dǎo)入予測(cè)效果用基因(人p51基因)的培養(yǎng)細(xì)胞點(diǎn)滴靜脈注射到患者身體里。此方法從數(shù)周到數(shù)月的間隔反復(fù)進(jìn)行，以此來(lái)實(shí)施基因治療方法。
在這里病毒載體的投入量，根據(jù)導(dǎo)入靶細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)選擇。通常，作為病毒價(jià)，例如對(duì)于靶細(xì)胞1×108細(xì)胞希望采用1×103cfu到1×108cfu范圍的投入量為好。
作為上述方法的另一種方法，將含有目的基因(人p51基因)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒產(chǎn)生細(xì)胞和患者的細(xì)胞共同培養(yǎng)，向目標(biāo)細(xì)胞里導(dǎo)入基因的方法。
當(dāng)實(shí)施基因治療的第2種方法(直接法)的時(shí)，特別是根據(jù)在體外進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，根據(jù)基因?qū)敕?，?shí)際上，目的基因(人p51基因)是否被導(dǎo)入，要根據(jù)予先載體基因cDNA的PCR法的檢索和根據(jù)in situPCR法進(jìn)行確認(rèn)，或者基于目的基因(人p51基因)的導(dǎo)入所希望的治療效果的特異活性的上升或靶細(xì)胞的增殖增加或增殖抑制，來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。另外，使用病毒載體時(shí)，是否用PCR法進(jìn)行了增殖性逆轉(zhuǎn)錄病毒等的檢索、是否測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性或根據(jù)用PCR法對(duì)膜蛋白(env)基因進(jìn)行監(jiān)控，由此來(lái)確認(rèn)基因治療對(duì)基因輸入的安全性。這種重要性自不待言。
本發(fā)明的基因治療法中特別是以癌和腫瘤為對(duì)象時(shí)，從患者身上采取癌細(xì)胞后，進(jìn)行酶處理等后，樹立培養(yǎng)細(xì)胞后，如用逆轉(zhuǎn)錄病毒，將所希望的基因?qū)氲桨械陌┘?xì)胞里，用G418細(xì)胞篩選之后，測(cè)定1L-12等的表達(dá)量，接著進(jìn)行放射線處理，在患者腫瘤內(nèi)或者腫瘤旁接種的癌治療法。
皰疹單體病毒胸苷激酶(HSV-Tk)基因是，特別是將是核苷酸類似物的鳥嘌呤(GCV)轉(zhuǎn)換為毒性中間體、引起分裂性細(xì)胞死亡，將該基因針對(duì)于腫瘤進(jìn)行基因治療是公知的[美國(guó)專利等5631236號(hào)說(shuō)明書；特表平9-504784號(hào)公報(bào)]。該方法注入編入被稱為自殺基因的前述HSV-TK基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生細(xì)胞，一周后，投入作為抗病毒劑被人所知GCV時(shí)，在基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)GCV接受磷酸化后，被活性化，導(dǎo)致基因?qū)爰?xì)胞自殺，同時(shí)，通過間隙連接的細(xì)胞，使周圍的非導(dǎo)入細(xì)胞也被殺死了。就是這樣利用這些的基因治療方法。本發(fā)明的基因?qū)胼d體或者是含有該載體的細(xì)胞，也以用于上述的基因治療法。
作為別的基因治療法可以舉出，制作免疫核糖體，該核糖體含有結(jié)合了在靶細(xì)胞表面的抗體的基因，將包埋cDNA選擇地有效地導(dǎo)入到靶細(xì)胞里的方法。另外，將含有細(xì)胞因子基因病毒載體和含有自殺基因腺病毒同時(shí)投入的結(jié)合基因療法也是可能的。這些方法是在該領(lǐng)域的從業(yè)者應(yīng)具有的水平。
(7)基因治療用醫(yī)藥組合物本發(fā)明另外還提供導(dǎo)入了本發(fā)明的基因用載體或者目的基因(人p52基因等)的細(xì)胞作為活性成分，把這些和醫(yī)學(xué)的有效量適當(dāng)?shù)臒o(wú)毒性醫(yī)藥載體或者稀釋劑共同作為醫(yī)藥組合物或者醫(yī)藥制劑(基因治療劑)。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物(醫(yī)藥制劑)作為能利用的醫(yī)藥載體，根據(jù)制劑的使用形態(tài)使用通常的填充劑、增量劑、結(jié)合劑、付濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑等的稀釋劑及賦形劑等。根據(jù)這些制劑的投入單位形態(tài)，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
作為本發(fā)明藥制劑的投入單位形態(tài)同樣可以舉出，如與前所述p51蛋白制劑相同的例子，根據(jù)治療目的，可以從各種形態(tài)進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。
例如，含有本發(fā)明的基因?qū)胗幂d體醫(yī)藥制劑，可以調(diào)制成該載體被核糖體包埋在核糖體的形態(tài)或者調(diào)制成用含有所希望的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)。
還可以調(diào)制成，磷酸緩沖生理食鹽液(PH7.4)，林格氏液，細(xì)胞內(nèi)組成液用注射劑里配合的形態(tài)。另外還可以調(diào)制成和精蛋白等基因?qū)肼屎芨叩奈镔|(zhì)共同投入的形態(tài)。
上述醫(yī)藥制劑的給藥方法，沒有特別的限制，根據(jù)各種制劑形態(tài)，患者的年齡，性別及其他條件，患病的程度等而定。
上述醫(yī)藥制劑中，應(yīng)含有的本發(fā)明的有效成分的量及給藥量無(wú)特別規(guī)定，根據(jù)所希望達(dá)到的治療效果，投入法，治療期間，患者的年齡，性別及其他條件，適當(dāng)選擇適用的幅度。
一般來(lái)說(shuō)，作為醫(yī)藥制劑所希望的基因含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的投入量，每日體重1kg，例如作為逆轉(zhuǎn)錄病毒效價(jià)大約從1x103pfu到1x105pfu程度為好。
另外，導(dǎo)入有所希望的導(dǎo)入用基因的細(xì)胞時(shí)，從1x104細(xì)胞/body到1x105細(xì)胞/body的范圍中選擇的話為好。
該制劑也可以分1日1至數(shù)次給藥，也可以從1周及到數(shù)周的間隔來(lái)進(jìn)行給藥。
另外，優(yōu)選的是，也可以和魚精蛋白等提高基因?qū)胄矢叩奈镔|(zhì)及含有這些物質(zhì)的制劑同時(shí)投入使用。
將本發(fā)明的基因治療適用于癌癥治療時(shí)，前邊已講述的各種基因治療方法可以適當(dāng)?shù)亟M合進(jìn)行，前述的基因治療也可以和目前的癌癥化學(xué)療法，放射線療法，免疫療法等組合進(jìn)行。進(jìn)而本發(fā)明的基因治療包括它們的安全性，可以參考NIH的基準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)施[RecombinantDNA Advisory Committee，Human Gene Therapy，4，365-389(1993)]。
(8)在腫瘤診斷方面的應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，為了能夠檢驗(yàn)出促使人的細(xì)胞的腫瘤形成的p51變異基因的存在。通過調(diào)制血液或血清的生物學(xué)類的試樣，萃取所希望的核酸，來(lái)分析p51敏感性變異基因是否存在。另外，根據(jù)本發(fā)明，為了能檢測(cè)出在細(xì)胞或者組織里的新生物，向惡性前驅(qū)的發(fā)展，或者予后指標(biāo)的存在，可以調(diào)制有障礙的生物學(xué)的試樣，來(lái)分析p51新生物變異基因存在與否。使用這種方法就可以檢測(cè)出在細(xì)胞或者組織里新生物，惡性前驅(qū)障礙的進(jìn)行，或者作為予后指標(biāo)是否存在。這些診斷，如癌的診斷及癌治療效果的判定及予后的預(yù)測(cè)等都可以進(jìn)行了。
該檢驗(yàn)的方法例如予先從患有腫瘤患者那里取樣，得到關(guān)于p51變異基因的情況并以此為基礎(chǔ)，如根據(jù)p51基因的變異部位及它的變異序列情報(bào)，作成該變異DNA片段，設(shè)計(jì)成可以進(jìn)行變異基因的篩選和/或可用于擴(kuò)增那樣的形式。具體地講，作成可在噬斑雜交、菌落雜交、Northene印跡法、RNA印跡法等使用的探針、用PCR可以擴(kuò)增變異DNA片段的探針。為此，首先要作成具有和變異相同序列的引物，作為篩選用探針使用，讓其和生物學(xué)的試樣(核酸試樣)相反應(yīng)，可以確認(rèn)含有該p51基因的變異序列的基因是否存在。該核酸試樣，為了能容易地檢測(cè)出靶序列，可以用變性、限制消化、電泳或者斑點(diǎn)印跡法等的種種方法進(jìn)行調(diào)制。
作為前述的篩選方法，特別是用PCR法，靈敏度方面更好一些，該方法是只要p51變異片段作為引物使用，就沒有別的特別限制，以前為眾所周知的方法(science，230，1350-1354(1985))和新的被開發(fā)及將來(lái)要使用的PCR變法(木神、佳之等編，羊土社、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，增刊，8(a)(1990)；蛋白質(zhì)、核酸、酶、臨時(shí)增刊，共立出版(株)，35(17)(1990)]中的任何一種都可以利用。
作為引物使用的DNA片段，是化學(xué)合成的低聚DNA，這些低聚DNA合成是由自動(dòng)DNA合成裝置如使用DNA合成裝置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus富馬西亞社制)而合成的。合成的引物(有義引物或反義引物)的長(zhǎng)度約10～30核苷酸程度。上述作為篩選用的探針通常使用帶有標(biāo)識(shí)的探針，沒有標(biāo)識(shí)的也可以，用直接或間接的與標(biāo)識(shí)的配位體的特異結(jié)合也可進(jìn)行檢測(cè)。適當(dāng)?shù)臉?biāo)識(shí)以及標(biāo)識(shí)探針及配位體方法等在本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域里為人所公知，如用切口平移、隨機(jī)引物或激活酶處理的方法，編入的放射性標(biāo)識(shí)、維生素H、熒光性基、酶、抗體等都被包含在這個(gè)技術(shù)里。
作為檢測(cè)用PCR法，如可以舉出PT-PCR法，可以適用于該領(lǐng)域的各種各樣的變法。
使用PCR法，可以測(cè)定野生型p51基因和/或變異p51基因的存在以及定量這些基因的DNA。該方法是如MSSA法的競(jìng)爭(zhēng)定量法[Kiaoshita，M.et al.CCA，228，83-90(1994)]或者是作為伴隨著一根鏈DNA的高次構(gòu)造變化的移動(dòng)度，利用此變化而作成的突然變異檢驗(yàn)法的PCR-SSCP法(Ohta，M.et al.Genomics，5，874-879(1989))。
在上述的分析法中，調(diào)制含有p51的變異(例如基于從癌癥患者那里得到的部位變異情報(bào)而制成的變異序列)1個(gè)及數(shù)個(gè)引物，與從生物學(xué)試樣得到的DNA雜交后、對(duì)PCR擴(kuò)增片段和p51野生株DNA片段，用標(biāo)準(zhǔn)的SSCP解析法，測(cè)定得到的移動(dòng)度及峰領(lǐng)域，與用前述的引物擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的被檢試樣的移動(dòng)度以及和峰領(lǐng)域的進(jìn)行對(duì)比，由此可以同時(shí)進(jìn)行特定領(lǐng)域變異和該變異產(chǎn)物的定量。
在前述中含有作為測(cè)定對(duì)象變異p51基因的被檢試樣，只要含有該基因的話就沒有特定限定，可以使用，例如可以舉出，血液、血清、尿、切除組織等的生體生物材料。變異p51基因從這些被檢測(cè)試樣中，可以按照通常作法萃取、精制及調(diào)制。
所以，關(guān)于作為本發(fā)明上述標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段將予先測(cè)定的移動(dòng)度與使用p51變異引物對(duì)的被檢試樣中的p51 DNA的PCR擴(kuò)增工序里作為擴(kuò)增產(chǎn)物的被檢試樣的移動(dòng)度相比較，可以較簡(jiǎn)單，良好地進(jìn)行p51 DNA特定領(lǐng)域的變異的檢測(cè)。
進(jìn)而，使用設(shè)定既知階段量的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將其峰領(lǐng)域與以上述的方法的使用p51變異引物對(duì)的被檢測(cè)試樣中的p51 DNA的PCR擴(kuò)增工序里，作為擴(kuò)增產(chǎn)物的被檢試樣的峰領(lǐng)域，進(jìn)行對(duì)比，可以同時(shí)進(jìn)行被檢試樣中的p51變異的定量。在該方法中使用的引物對(duì)、標(biāo)準(zhǔn)、PCR-SSCP解析及其檢驗(yàn)手段等的改變，這些對(duì)于在此領(lǐng)域里的從業(yè)者來(lái)說(shuō)，是很容易得到的，只要使用野生p51基因及變異p51基因的序列，本發(fā)明理所當(dāng)然的包括了這些改變。
關(guān)于本發(fā)明的測(cè)定方法，更詳細(xì)的舉例如下首先從患者血清里用堿、酸處理等通常的作法抽出DNA，在得到的DNA溶液里，將序列號(hào)為1的堿基序列(145-1488)的一部分的特定長(zhǎng)度構(gòu)成的負(fù)鏈部分序列，和將含有熒光標(biāo)識(shí)的該堿基序列(145-1488)的一部分序列的特定長(zhǎng)度構(gòu)成的正鏈部分序列的引物對(duì)，讓其和具有耐熱性DNA聚合酶相作用來(lái)擴(kuò)增標(biāo)識(shí)了的DNA片段。另一方面，基于從患者處得到的p51部位變異情報(bào)，含有化學(xué)合成的變異序列1或由多數(shù)的DNA片段分別加入質(zhì)粒載體上，對(duì)大腸桿菌形成轉(zhuǎn)換大量培養(yǎng)后，使用精制重組的質(zhì)粒，制成如103拷貝、104拷貝、105拷貝、106拷貝、107拷貝及108拷貝的標(biāo)準(zhǔn)。在這里將含有上述的堿基序列(145-1488)的一部分的特定序列的負(fù)鏈部分序列、及含有熒光標(biāo)識(shí)的堿基序列(145-1488)的一部分的特定序列的正鏈部分序列，將此二個(gè)序列的引物對(duì)，讓其和耐熱性DNA聚合酶作用來(lái)擴(kuò)增被標(biāo)識(shí)的DNA片段。把在前述中被擴(kuò)增的DNA溶液在95℃，5分鐘左右的情況下加熱，直接在冰中冷卻，根據(jù)ALF自動(dòng)序列儀(弗爾馬西亞社制)進(jìn)行自動(dòng)序列的SSCP分析，由此可以測(cè)出熒光峰。另外，該SSCP解析的泳動(dòng)最好在大約30℃±10℃的情況下進(jìn)行。
將從患者血清里得到的峰(移動(dòng)度)和標(biāo)準(zhǔn)的峰(移動(dòng)度)相比較，其泳動(dòng)時(shí)間來(lái)確認(rèn)和標(biāo)準(zhǔn)一致的峰，由此就可以判定出患者的p51的變異的類型(種類)。另外，算出標(biāo)準(zhǔn)的峰領(lǐng)域，由此作成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從患者DNA中峰領(lǐng)域的計(jì)算值，可以進(jìn)行該p51 DNA的定量。
(9)p51基因的變異檢驗(yàn)法及各種測(cè)試法本發(fā)明提供了一種將被檢測(cè)試樣中的p51 DNA的特定領(lǐng)域的變異檢驗(yàn)和其定量法能同時(shí)進(jìn)行的簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。
另外，本發(fā)明的測(cè)試方法，利用試劑盒，能簡(jiǎn)單地測(cè)試出試樣中的野生型p51基因及變異p51基因。
故本發(fā)明還提供了能測(cè)試出含有上述野生型p51DNA片段及變異p51DNA片段為特征的野生型p51及變異p51的檢測(cè)用試劑盒。
該試劑盒，至少含有下列必須具備的構(gòu)成成分序列號(hào)2所表示的堿基序列(145-1488)或者它的輔助的堿基序列的一部分或者全部的雜交的DNA片段、或堿基序列(145-1488)的變異序列或者它的變異序列相輔的堿基序列的一部或者全部雜交的DNA片段。其他的成分包括標(biāo)識(shí)劑、PCR法所必需的試劑(例如，Tag DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸、引物等)。另外序列號(hào)5所標(biāo)示的堿基序列(145-2067)可以代替上述序所標(biāo)示的堿基序列(145-1488)。
作為標(biāo)識(shí)劑，可以舉出放射性同位元素或者螢光物質(zhì)等的化學(xué)修飾物質(zhì)等。同時(shí)，DNA部分自身也可預(yù)先用該標(biāo)識(shí)劑偶聯(lián)。還有該試劑盒為了能夠順利進(jìn)行，也可含有反應(yīng)稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)抗體、緩沖液、洗凈液、反應(yīng)停止液等。
另外，本發(fā)明還提供了用前述測(cè)試方法進(jìn)行癌的診斷方法，及用用該方法的診斷劑及診斷用試劑盒。
另外，根據(jù)前述的方法，直接或間接地決定從被檢試樣得到的p51變異序列；由此可以發(fā)現(xiàn)和野生型p51相同性高的相同物新的p51基因，及與其相關(guān)連的基因。
因此，本發(fā)明也提供了一種由根據(jù)所測(cè)定和被檢試樣中的變異p51DNA的序列所決定，篩選被檢試樣中的人p51基因相關(guān)連的關(guān)連基因的方法。
另外，本發(fā)明通過序列號(hào)1所示的用人p51A基因編碼的蛋白質(zhì)，或者在序列號(hào)1里的1個(gè)或數(shù)個(gè)乃至多數(shù)個(gè)氨基酸缺失，替換或者插入氨基酸序列，或者從這些片段合成蛋白、或者合成對(duì)該蛋白的抗體，來(lái)進(jìn)行對(duì)野生型p51及/或者變異型p51的測(cè)試。另外也可以用序列號(hào)4所表示的人p51基因所編碼的蛋白質(zhì)來(lái)代替上述人p51A基因所編碼的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了野生型p51及/或者變異型p51的抗體測(cè)試法、抗原測(cè)試法。根據(jù)該測(cè)試方法，可以基于野生型p51蛋白的變化來(lái)測(cè)試出新生物狀態(tài)的障礙程序或者惡性腫瘤的程度。所發(fā)生的變化，在本領(lǐng)域中，依照前述的慣用技術(shù)根據(jù)p51序列分析可以決定，但是更好的方法是用抗體(多克隆或單克隆抗體)來(lái)檢測(cè)出p51蛋白的差異及p51蛋白的有無(wú)。另外，本發(fā)明測(cè)定法的具體例，p51抗體是從人的血液·血清采取的生體材料，試樣含有液，從其中免疫沉降p51蛋白質(zhì)，而且在聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)，印跡或免疫印跡上可與p51蛋白質(zhì)反應(yīng)。p51抗體可以用免疫組織化學(xué)的技術(shù)檢測(cè)出石臘或者凍結(jié)組織切片中的p51蛋白。抗體產(chǎn)生技術(shù)及精制技術(shù)在該領(lǐng)域?yàn)槿怂?。這些技術(shù)也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。
關(guān)于作為檢驗(yàn)野生型p51或者其突然變異體的方法，更優(yōu)選的具體例子包括使用單克隆抗體和/或多克隆抗體的層狀法的免疫吸附劑分析(ELISA)、放射線免疫檢測(cè)法(RIA)、免疫放射線檢定法(IRMA)及免疫法(IEMA)。
本發(fā)明可以提供相對(duì)p51蛋白具有p51結(jié)合活性的細(xì)胞膜成分或者存在在細(xì)胞表面上的p51受體。該p51受體的取得，是在含有細(xì)胞膜成分的生體材料試料中，使標(biāo)識(shí)p51蛋白共軛，提出·單離、精制p51結(jié)合反應(yīng)物、通過特定的單離物的氨基酸序列可以達(dá)到，該p51受體蛋白的取得及序列決定是本領(lǐng)域的生產(chǎn)者容易作到的。
(10)藥劑篩選的應(yīng)用本發(fā)明是將p51受體多肽或其結(jié)合片段應(yīng)用于各種藥劑的篩選技術(shù)中，可以利用篩選化合物(p51受體反應(yīng)物化合物一般指低分子化合物、高分子化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)部分片段、抗原、或者抗體)。最好是利用p51受體。在相關(guān)篩選試驗(yàn)中使用p51受體多肽或其片段，可在固體支撐體上附著該片段，或者運(yùn)送在細(xì)胞表面的溶液中的游離物。作為藥劑篩選的一例，例如可利用表達(dá)多肽或其片段的重組多肽穩(wěn)定地形質(zhì)轉(zhuǎn)化為原核生物或真核生物宿主細(xì)胞，優(yōu)選的在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中可以利用。使游離或者固定形態(tài)的相關(guān)細(xì)胞應(yīng)用在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合化驗(yàn)中。更具體地說(shuō)，測(cè)定p51受體多肽或其片段和試驗(yàn)的物質(zhì)間復(fù)合體的形成，根據(jù)p51受體多肽或其片段和p51多肽或其片段之間形成的復(fù)合體經(jīng)過試驗(yàn)的物質(zhì)檢測(cè)阻害的程度，可以篩選化合物。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)知的方法，可以提供相關(guān)物質(zhì)和p51受體多肽或其片段接觸，接著測(cè)定該物質(zhì)和p51受體多肽或該片段之間的復(fù)合體存在，或者p51受體多肽或其片段和配位間的復(fù)合體的存在為特征的藥劑的篩選方法。首先，測(cè)定p51受體活性后，相關(guān)的物質(zhì)能夠阻害p51受體、判斷上述被定義的p51的活性，例如能否調(diào)節(jié)細(xì)胞周期？或者可否誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。在相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中，更具體的，是標(biāo)識(shí)p51受體多肽或其片段。從蛋白質(zhì)分離，該蛋白質(zhì)是以蛋白質(zhì)復(fù)合體存在的物質(zhì)，游離(復(fù)合體術(shù)形成)標(biāo)識(shí)的量成為對(duì)于各個(gè)試驗(yàn)因子的p51受體的結(jié)合或者p51受體p51多肽結(jié)合的阻害的尺度。分析p51多肽的小的肽(肽模擬體)，可以測(cè)定具有p51受體阻害活性的物質(zhì)。
在本發(fā)明中，藥劑篩選的其它方法是對(duì)于p51受體多肽具有適當(dāng)結(jié)合親和性的化合物的篩選法，簡(jiǎn)略地說(shuō)，可以舉出在塑料針或者其它的物質(zhì)的表面如同固體支撐體上合成多數(shù)的不同肽試驗(yàn)化合物，接著肽試驗(yàn)化合物與p51受體多肽反應(yīng)，洗凈。然后用現(xiàn)有的方法檢測(cè)反應(yīng)結(jié)合p51受體多肽的方法(PCT特開號(hào)WO84-03564號(hào))。被精制的p51受體直接被復(fù)在使用上述的藥劑篩選技術(shù)的板上。對(duì)于多肽使用非-中和抗體、補(bǔ)足抗體，可以在固相上固定p51受體多肽。本發(fā)明是以競(jìng)爭(zhēng)藥劑篩選試驗(yàn)的使用作為目的，關(guān)于p51受體多肽或其片段的結(jié)合性，使可與p51受體多肽特異地結(jié)合的中和抗體與試驗(yàn)化合物競(jìng)爭(zhēng)。根據(jù)該抗體的得到的該競(jìng)爭(zhēng)，p51受體多肽的1或具有該以上的抗原決定部位的任何肽的存在都可以檢測(cè)。
關(guān)于藥劑篩選，可舉出作為該種方法選擇含有非機(jī)能性p51基因的宿主真核細(xì)胞系或者細(xì)胞的使用。在藥劑化合物的存在下讓宿主細(xì)胞系或者細(xì)胞在一定期間增殖后，測(cè)定該宿主細(xì)胞的增殖速度，確認(rèn)可否調(diào)節(jié)該化合物例如編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞周期。作為測(cè)定增殖速度1個(gè)手段也可以測(cè)定p51受體的生物活性。
本發(fā)明為了開發(fā)出更活性或者穩(wěn)定形態(tài)的p51多肽誘導(dǎo)體，或者例如在活體內(nèi)提高p51多肽的機(jī)能或者妨害藥劑，在它們相互作用為目的的生物學(xué)中，可以制作出活性的多肽或模擬構(gòu)造，例如p51激動(dòng)劑、p51拮抗藥、p51阻化劑等。上述構(gòu)造模擬體，例如通過X線結(jié)晶學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬試驗(yàn)和這些組合方法可以決定p51和其它的蛋白復(fù)合體的三次元構(gòu)造。再者，關(guān)于模擬構(gòu)造的構(gòu)造情報(bào)，可以根據(jù)相同蛋白質(zhì)的構(gòu)造為基準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的模擬試驗(yàn)得出。
作為由上述得到活性或穩(wěn)定的形態(tài)的p51多肽誘導(dǎo)體的方法，例如，可以根據(jù)丙氨酸掃瞄分析。該方法用Ala置換氨基酸殘基，測(cè)定對(duì)于肽的活性的影響的方法，分析肽的各氨基酸殘基，決定該肽在活性和穩(wěn)定性方面的重要領(lǐng)域的方法。該方法可以設(shè)計(jì)更活性的或者穩(wěn)定的p51誘導(dǎo)體。
根據(jù)機(jī)能性化驗(yàn)，分離選擇的靶一特異的抗體，接著可以解析該結(jié)晶構(gòu)造。作為原則，根據(jù)此研究方法得到構(gòu)成繼續(xù)設(shè)計(jì)藥劑的基本藥核芯(藥物母核)。通過生成在機(jī)能性藥理學(xué)中，對(duì)于活性抗體的獨(dú)特型抗體，從化學(xué)或者生物學(xué)生成的肽庫(kù)就可以鑒定或分離肽。故被選擇的肽也予測(cè)可作為藥核芯作用。
可以設(shè)計(jì)、開發(fā)具有被改善的p51活性或者穩(wěn)定性或者p51活性的抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗藥等作用的藥劑。
根據(jù)克隆化p51序列，取得大量的p51多肽后，可以進(jìn)行X線結(jié)晶學(xué)那樣的分析研究。進(jìn)而本發(fā)明通過提供由序列號(hào)1的氨基酸序列構(gòu)成的p51蛋白，不僅可用X線結(jié)晶學(xué)，而且還可以適應(yīng)計(jì)算機(jī)模型技術(shù)。
本發(fā)明通過制成含有人類p51基因的缺痕小鼠(變異小鼠)，可以確認(rèn)人p51基因序列在身體內(nèi)哪個(gè)部位可否給予多樣的p51活性影響，即p51基因產(chǎn)物，并且改變p51基因產(chǎn)物在身體內(nèi)具有的哪些機(jī)能。
該方法是利用基因的相同重組，有意地修飾生物基因情報(bào)的技術(shù)，可以例舉出使用小鼠的胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的方法(Capeccchi，M.r..，Science，244，1288-1292(1989))。
上述變異小鼠的制作方法，作為本領(lǐng)域的技術(shù)人員是通常的技術(shù)，該改變的技術(shù)(野出哲生編、試驗(yàn)醫(yī)學(xué)，增刊，14(20)、(1996)、羊土社)，適應(yīng)本發(fā)明的人野性型p51基因及變異p51基因，容易制作得到變異小鼠。即根據(jù)上述技術(shù)的應(yīng)用，可以設(shè)計(jì)、開發(fā)具有作為被改善的p51活性、或者穩(wěn)定性或者p51活性的抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗藥等作用的藥劑。
本發(fā)明含有以下的方法1.移動(dòng)p51基因到在腫瘤細(xì)胞中，形成抑制腫瘤的方法。
2.移動(dòng)p51蛋白到在腫瘤細(xì)胞中，形成抑制腫瘤的方法、3.含有p51基因或者同效物以及藥學(xué)中許可的載體的醫(yī)藥組合物。
4.含有p51蛋白或者同效物以及藥學(xué)中許可的載體的醫(yī)藥組合物。
5.具有有效成分的p51基因或者同效物的基因治療劑。
6.含有p51基因或者同效物的癌診斷劑。
7.含有p51蛋白或者同效物的癌診斷劑。
8.使用p51基因或者同效物的p51或者p53相關(guān)連的基因的篩選方法。
9.使用p51基因或者同效物篩選抑制細(xì)胞腫瘤形成的抑制作用物的方法。
10.使用p51基因或者同效物篩選p51基因的誘導(dǎo)以及/或者阻害物質(zhì)的方法。
11.用上述篩選方法得到的p51基因的誘導(dǎo)以及/或者阻害物質(zhì)對(duì)于p51基因表達(dá)異常引起的疾病治療的利用。
實(shí)施本發(fā)明的最佳形態(tài)以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例。但是本發(fā)明不受這些實(shí)施例以及實(shí)驗(yàn)例的限制。實(shí)施例1 人p51基因的單離1.人p51基因的克隆以及DNA序列a.本發(fā)明者們使用P73-F1有義引物以及P73-R1反義引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，接著使用P73-F2有義引物以及P73-R2反義引物進(jìn)行Nest增幅。
P73-F15′ -TA(CGT)GCA(CGT)AAA(G)ACA(CGT)TGC(T)CC-3′P73-R13′ -TGC(T)GCA(CGT)TGC(T)CCA(CGT)GGA(CGT)A(C)G-5′P73-F25′ -TA(CGT)ATA(CT)A(C)GA(CGT)GTA(CGT)GAA(G)GG-3′P73-R23′ -ATGAAC(T)A(C)GA(CGT)A(C)GA(CGT)CCA(CGT)AT-5′
具體地說(shuō)，由人骨骼筋聚A+RNA(克隆社制)，使用隨機(jī)引物以及低聚dT引物合成cDNA，以λZipLox(基布克社制)作為載體構(gòu)建的約107噬斑組成cDNA文庫(kù)被擴(kuò)增，提取DNA。以cDNA0.2μg作為模板，使用上述引物-P73-F1及P73-R1，按照Tag聚合酶(基布克BRL社制)的說(shuō)明書，在25周期94℃ 30秒、45℃ 30秒，72℃ 30秒地進(jìn)行擴(kuò)增，接著該100分之1作為模板，使用上述引物P73-F2及P73-R2，按照同樣地反應(yīng)擴(kuò)增。
從p53基因的結(jié)構(gòu)得到推測(cè)的172bp的帶，制作該帶的限制性內(nèi)切酶地圖時(shí)，判明存在p53基因以外的基因。在PGEM7里(Promega社制)亞克隆該帶域、使用ABI377自動(dòng)序列儀(ABI社制)，按照常法決定堿序列時(shí)，盡管類似p53基因的基因，但是來(lái)自具有不同的新規(guī)堿序列的新規(guī)基因的DNA片段。
其它的途徑，由其它的臟器(腦等)來(lái)的cDNA文庫(kù)進(jìn)行同樣的解析時(shí)，來(lái)自類似個(gè)別的p53基因的新規(guī)基因的DNA片段被檢測(cè)出來(lái)，這是由p73基因產(chǎn)生的。
切出被亞克隆的DNA片段，使用BcaBest labeling kit(寶酒制造)制成標(biāo)識(shí)探針。只是使用低聚dt引物，除此之外與上述cDNA文庫(kù)同樣構(gòu)建的未擴(kuò)增的文庫(kù)2.4×106的噬斑，通過噬斑雜交篩選的結(jié)果，得到8個(gè)陽(yáng)性克隆。λZipLox使用Cre-LoxP系、可以容易地變換成質(zhì)粒，使用LICOR社的自動(dòng)序列儀和AB1377自動(dòng)序列儀(ABI社)，按照常法決定變換質(zhì)粒的堿序列。
對(duì)于得到的基因的堿序列和p53基因以及p73基因的堿配列相同性，使用GCG軟件(維斯可辛·序列分析包裝遺傳·計(jì)算機(jī)·組制)用的FASTA程序(Person，W.R.and Lipman，D.J.，Proc.Natl，Acad，Sci，U.SA.，85，1435-1441(1988))，進(jìn)行探索。
關(guān)于相同性檢索的結(jié)果發(fā)現(xiàn)用上述的方法選擇，決定堿基序列的克隆中的2個(gè)發(fā)現(xiàn)具有p53基因及p73基因的高相同性。用這些具有二個(gè)克隆基因的序列編碼的氨基酸推定分子量時(shí)，分別為50，894Da及約71，900Da。本發(fā)明者分別以p51A及p51B命名這些克隆。
上述得到的p51A克隆具有基因(p51A的基因)的整個(gè)堿基序列表示在序列號(hào)2、p51B克隆具有基因(p51B的基因)的整個(gè)堿基序列表示在序列號(hào)5。
p51A純系具有序列號(hào)2所示那樣的，編碼序列號(hào)1所示的氨基酸序列(448氨基酸)的堿基序列(1344核苷酸)、作為開放讀框具有145-1488位的基因。通過由克隆具有的基因的堿序列，而編碼的推定氨基酸序列中，復(fù)制活性化領(lǐng)域是1～59位、DNA結(jié)合領(lǐng)域是142～321位及低聚化域是359-397位。
p51B克隆如序列號(hào)5所示，編碼序列號(hào)4所示的氨基酸序列(641氨基酸)的堿基序列(1923核苷酸)、作為開放讀框具有145-2067位的基因。通過克隆基因具有的堿基序列編碼推定氨基酸序列中，復(fù)制活性化領(lǐng)域是1～59位、DNA結(jié)合領(lǐng)域是142～321位及低聚化域是359-397位，這些是在C末端側(cè)的領(lǐng)域中具有付加的序列(SAM結(jié)構(gòu)域)，把含有該付加的序列353-641位的領(lǐng)域，可以作為廣義的低聚化域。
用本發(fā)明的p51A基因被脊髓(編碼)的氨基酸序列與p53蛋白以及p73β蛋白的氨基酸序列比較，調(diào)查了三者件的相同性(圖2)。在圖中三者間同一的氨基酸，用方框圍起來(lái)。
在圖1中圖解地表示p51A蛋白的構(gòu)造的結(jié)構(gòu)域特征，和p53蛋白以及p73β蛋白。在圖中[TA]表示復(fù)制活性化領(lǐng)域、DNA binding表示DNA結(jié)合領(lǐng)域、oligo表示低聚化域。此外p51蛋白和p73β蛋白的構(gòu)造特征可從p53蛋白的構(gòu)造特征推測(cè)出。
這些的結(jié)果，在全序列、復(fù)制活性化領(lǐng)域、DNA結(jié)合領(lǐng)域以及低聚化域中，各p51A蛋白、p53蛋白以及p73β蛋白的推定氨基酸序列的相同性，在p51A蛋白及p53蛋白間分別為36％、22％、60％、37％；在p51A蛋白及p73蛋白間蛋白間分別為42％、30％、87％、65％；在p53蛋白及p73蛋白間分別為28％、27％、63％、83％(參閱表1)。
p51A蛋白的448氨基酸殘基比p73α蛋白的636氨基酸殘基短、但p51A蛋白的全構(gòu)造的p73的羧基末端部位的割裂部分類似。
從這些結(jié)果中，判斷p51A蛋白的推定氨基酸序列與p53蛋白及p73β蛋白的任何一種都類似，但是比起p53蛋白的氨基酸序列與p73β蛋白的氨基酸序列相同性高，另外p51A蛋白和p73β蛋白的相同性在低聚化域以外的領(lǐng)域，要比p53蛋白和p73β蛋白的相同性高。進(jìn)而在p51A蛋白和p73β蛋白間或p53蛋白和p73β蛋白間或p53蛋白和p51A蛋白間即使沒有相同性領(lǐng)域，也可看到相同性。從以上所述，可以說(shuō)p51A蛋白在氨基酸配列水準(zhǔn)中，比起p53蛋白p73β蛋白近似。
同樣用本發(fā)明的p51B基因編碼的氨基酸序列與p73α蛋白的氨基酸序列比較，調(diào)查了二者間的相同性(圖3)。如圖所示，二者間相同的氨基酸用方框圍起來(lái)。
在圖4中，表示了用p51(A及B)基因編碼的剪接變異體的構(gòu)造的結(jié)構(gòu)域特征和p73蛋白(α及β)。
p51A蛋白和p51B蛋白的分支點(diǎn)在內(nèi)含子10開始，而p73α蛋白和p73β蛋白的分支點(diǎn)在內(nèi)含子13開始。實(shí)施例2在正常人組織里p51 mRNA表達(dá)的確認(rèn)(1)Northen印跡分析在正常人組織里p51mRNA的表達(dá)根據(jù)隨機(jī)低聚核苷酸剪接法標(biāo)識(shí)的人cDNA克隆作為探針的Northen印跡法評(píng)價(jià)的。
Northen印跡分析，按照產(chǎn)品使用法，使用人MTN印跡(HumanMultiple No-them blot；克隆社制、帕羅阿爾特、加里弗尼亞、美國(guó))進(jìn)行實(shí)施。
即在實(shí)施例1中得到的DNA克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的EcoRI片段(與600bpcDNA的5’端相當(dāng))，用[32p]-dCTP(隨機(jī)引物DNA標(biāo)識(shí)盒、貝材卡-漢姆社)標(biāo)識(shí)后，作為探針。
另外，印跡是使用ExpressHyb Hybridization Solution(克隆社制)，按照使用說(shuō)明書中記載的條件進(jìn)行，使用BAS2000(FUJI)檢測(cè)出的。
結(jié)果如圖5及圖6所示。
圖5是由克隆社購(gòu)入的過濾器進(jìn)行Northen雜交，圖6是由克隆社購(gòu)入RNA自己制作過濾器進(jìn)行Northen雜交的結(jié)果。圖5各泳道2μg聚A+RNA、圖6各泳道附加0.5μg的聚A+RNA后泳動(dòng)的結(jié)果。
圖5分別表示各泳道、心臟1、腦2、胎盤3、肺4、肝臟5、骨骼筋6、脾臟7、胰臟8的結(jié)果。圖6的各泳道表示乳腺1、前列腺2、唾液腺3、胃4、胸腺5、甲狀腺6、氣管7、子宮8的結(jié)果。
該結(jié)果，被命名人p51基因的本發(fā)明的基因mRNA(4.4kb)的表達(dá)，與各處發(fā)現(xiàn)的p53mRNA的表達(dá)圖形對(duì)照，莫如是一種限定，在骨骼筋里最高表達(dá)，接著是胎盤、氣管、乳腺、前列腺、唾液腺、胸腺、子宮、胃、肺、腦以及心臟順次表達(dá)著。在其他組織(例如腎腺、小腸、脊髓、脾)中，沒有檢出p51 mRNA的表達(dá)。
P73基因的表達(dá)也是組織限定。雖然p51基因的表達(dá)與p73基因的表達(dá)是重復(fù)的基因(在相同組織被表達(dá))，我們還是知道p51基因比p73基因在更廣泛范圍被表達(dá)。
這樣的人p51基因、p53基因及p73基因在組織分布上有差異，盡管這些基因有類似生物活性，但是在生體內(nèi)按相應(yīng)的組織也可能有不同的功能。
根據(jù)進(jìn)一步的研究了解到各種人組織中p51mRNA上存在著與p73蛋白相同的、編碼p51蛋白短型和編碼p51蛋白長(zhǎng)型的、選擇剪接的形態(tài)(可變剪接變異)。編碼后者p51B長(zhǎng)型的，是與舌的谷氨基酸受體的檢索上突然發(fā)現(xiàn)的被稱為ket具有相同性。骨骼筋中的主要復(fù)制物的3kbRNA是調(diào)查全組織內(nèi)觀察最多的mRNA?？赡芏绦偷腸DNA克隆是來(lái)自此復(fù)制物。有趣的是用正常組織觀察的mRNA，相對(duì)照地，在很多的腫瘤細(xì)胞系中此短型的p51mRNA表達(dá)著。
p51蛋白和p73蛋白的可剪接變異體的結(jié)構(gòu)比較表示在圖4中，其p51B的mRNA是編碼與p73α類似分布量的蛋白質(zhì)。
對(duì)于p51A及p51B兩者間功能的區(qū)別，目前尚不明。實(shí)施例3 p51基因的染色體作圖使用放射混合盤(Gene Bridge 4R Radiation Hybrid Panel；ResenrchGenetics社)將p51基因布列在人染色體上。其結(jié)果p51基因，存在于標(biāo)記AFBM327 YD9和WI-1189間(距前者標(biāo)記，5.66CR)、3q 28-ter。實(shí)施例4各種人癌細(xì)胞株和人腫瘤中的p51變異對(duì)于p51基因最有興趣的是該p53基因所具有的特征，p51基因是否有、或者該基因的變異和人腫瘤的形成關(guān)系。
因此，使用各種腫瘤細(xì)胞株，檢索p51基因是否有變異。另外，檢索的方法，使用以前本發(fā)明者決定p51變異時(shí)使用的酶母的獨(dú)立列陣體的功能分析法(FASAY)(1Shioka et al.，Nat.Genet.5，124-129(1933))。
涉及編碼人51A基因的全系列的相輔DNA片段，用以前使用的PCR擴(kuò)增，取得覆蓋編碼p51A基因全序列的擴(kuò)增片段的堿基序列，通過直接序列確定法決定此堿基序列，檢測(cè)有無(wú)變異。
腫瘤細(xì)胞在5％二氧化碳的條件下，添加10％牛胎兒血清的Dulbecco修飾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Essential Media)中培養(yǎng)。p51A cDNA的所有的可以擴(kuò)增p53cDNA，所以，可以保證細(xì)胞株的cDNA質(zhì)量。
從102的細(xì)胞株分析的67株可能是p51ADNA的片段的擴(kuò)增。其中的35株，可直接用序列確定法確定堿基序列。
可以確認(rèn)頭頸部的癌細(xì)胞株的ho-1-u-1(JCRB 0828)和頸部癌細(xì)胞株的SKG-Ⅲa(JCRB 0611)二個(gè)細(xì)胞株中看到變異。
前者是從ser145來(lái)的leu的變異，后者是從GIn165來(lái)的leu的變異。關(guān)于p53蛋白前者是變異型，后者是通過人乳突瘤病毒的感染而失去p53蛋白的正常功能的。另外，來(lái)自腫瘤細(xì)胞的mRNA存在著各種的剪接變異體。
關(guān)于人的原發(fā)腫瘤，對(duì)用SSCP法及RT-PCR法得到的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，按照直接堿基序列確定法決定，檢索p51A基因變異。在neuroblastoma 8例、colon cancer 8例、breast cancer 8例、lungcancer 8例、brain tumor 8例、esophageal cancer 8例、hepatocellular cancer8例、pancreas cancer 6例、renal cancer 4例的66例的人腫瘤中從肺癌1例檢測(cè)出從Ala 148向Pro的變異。
這些3例的解析都是cDNAd的解析，從單一的染色對(duì)座發(fā)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)例1抑制用p51轉(zhuǎn)化的菌落形成
p53蛋白具有嵌入GI期內(nèi)細(xì)胞的、或誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡能力。
本發(fā)明的p51蛋白，為了調(diào)查抑制菌落的形成能力，在SAOS2的骨肉腫瘤細(xì)胞(寄存號(hào)ATCC HTB85)中，與嘌呤霉素抗性的表達(dá)質(zhì)粒一起(pBABEpuroMorgenstern J.Nuc.Acids Ru，18，3587，1990)轉(zhuǎn)化p51A表達(dá)構(gòu)建、p51A的HA標(biāo)識(shí)的構(gòu)建(HA標(biāo)識(shí)-ATGTATCCATA-TGATGTTCCAGATTATGCT酸序列MYPYDVPDYA)、p53表達(dá)構(gòu)建及載體，調(diào)查菌落形成能。
表達(dá)的載體可以通過克隆以下片段構(gòu)建即p51A DNA的編碼領(lǐng)域片段(2816堿基、序列號(hào)2中堿基號(hào)1～2810、上述p51A cDNA付與標(biāo)記的片段及p53 cDNA的編碼領(lǐng)域片段(1698堿基、鹽基號(hào)62～1760)。接著將骨肉腫瘤細(xì)胞株的SAOS2細(xì)胞在5％二氧化碳的條件下在添加牛胎血清的Dulbecco’s修飾的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將上述SAOS2散布在6cm皿上(1×106細(xì)胞/皿)。24小時(shí)后用含有p51 cDNA鏈的野生型p51表達(dá)載體(pRC MV/p51A)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。同樣地在p51AcDNA上，僅轉(zhuǎn)化成帶有HA標(biāo)記的HA p51A及野生型p53基因以及作為對(duì)照物的pRC CWVD表達(dá)載體。
使用Mammalian transfection kit(stratagene社)將1μg的pBABEpuro導(dǎo)入細(xì)胞。將得到的細(xì)胞固定，用結(jié)晶生物紅進(jìn)行染色。對(duì)于染色的細(xì)胞菌落進(jìn)行照相。各轉(zhuǎn)化分別進(jìn)行二次，分析這樣得到的菌落。
其結(jié)果菌落明顯地減少，在用p53基因及p51基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)觀察到，與其對(duì)稱的只是載體構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)可以培育很多的菌落，對(duì)于這樣的p51基因，可以確認(rèn)其控制形成菌落的能力，但是比p53基因的能力要差。另一方面，附有HA標(biāo)記的p51基因具有與p53基因相同的菌落控制能力(圖7)。實(shí)驗(yàn)例2 p51蛋白的復(fù)制活性化功能試驗(yàn)對(duì)于GI期內(nèi)細(xì)胞的阻止或編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)的p53蛋白的能力是依存p53蛋白的復(fù)制活性化功能，所以對(duì)于p51蛋白試驗(yàn)其是否發(fā)揮活性。
通過p53復(fù)制活性化功能，可調(diào)節(jié)的WafⅠ啟動(dòng)字和RGC(ribosomalgene cluster)序列下游，按照實(shí)施例5的方法與魯西酶·報(bào)導(dǎo)·質(zhì)粒一起將p51A基因的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入，具體的是將SAOS2細(xì)胞與上述的魯西報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒和p51A表達(dá)載體、p53表達(dá)載體或控制載體任何一種一起共轉(zhuǎn)化，對(duì)從轉(zhuǎn)化體得到的裂解物測(cè)定蟲熒光素酶。使用雙向蟲熒光素酶報(bào)導(dǎo)測(cè)定系統(tǒng)(普羅木家公司制)算出轉(zhuǎn)換效率。
圖8中表示用于實(shí)驗(yàn)的報(bào)導(dǎo)構(gòu)建物。在該圖中，在各種的p21WAF1起動(dòng)子的下流調(diào)節(jié)的3個(gè)熒光反射酶基因構(gòu)建物被表示出來(lái)。圖中[WAF-1 promoter1uc]、表示殘留兩個(gè)p53調(diào)節(jié)元件的野生型p21WAF1起動(dòng)子構(gòu)建物，[delⅠ]表示一個(gè)上流的元件被去除的構(gòu)建物，及[del 2]表示除去兩個(gè)元件的構(gòu)建物，其結(jié)果分別表示在圖9及圖10中?？v軸的Relative activity是使用雙向的蟲熒光素酶報(bào)導(dǎo)測(cè)定系統(tǒng)，考慮轉(zhuǎn)化效率換算成的蟲熒光素酶活性。
圖9、表示圖8所示的具有各種的報(bào)導(dǎo)構(gòu)建體的各p51表達(dá)質(zhì)粒(p51A)、p53表達(dá)質(zhì)粒(p53)或載體(Rc/CMV)分別導(dǎo)入到SAOS2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化活性。其結(jié)果，在p51蛋白中表示了具有與p53蛋白相同的可誘導(dǎo)依存反應(yīng)性序列數(shù)的表達(dá)活性。
圖10中，使用p53反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)地所示的PGC報(bào)導(dǎo)構(gòu)建體，表示用報(bào)導(dǎo)該構(gòu)建體所具有的p51A表達(dá)質(zhì)粒(p51A)、p51A中HA標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒(HA p51A)、p53表達(dá)質(zhì)粒(p53)或載體(RcCMV)進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其結(jié)果如圖9所示結(jié)果相同，p51A及HA p51A都是具有p53相同的誘導(dǎo)p53反應(yīng)性序列的數(shù)依存的表達(dá)活性。使用p51A反應(yīng)質(zhì)粒時(shí)活性弱，可以推定因?yàn)樵诩佑衛(wèi)eader sequence下組入表達(dá)載體內(nèi)，其表達(dá)量是少的。
而后的實(shí)驗(yàn)中，在缺少leader sequence時(shí)，p51A蛋白是具有比p53蛋白更強(qiáng)的誘導(dǎo)功能，從上述的菌落形成的抑制能的點(diǎn)上看也具有強(qiáng)烈的活性。
上述的結(jié)果教導(dǎo)我們，p51蛋白，通過其復(fù)制調(diào)節(jié)領(lǐng)域可以保存誘導(dǎo)復(fù)制的能力。通過該元件中的變異誘導(dǎo)，復(fù)制活性消失，所以p51蛋白也利用了與p53蛋白相同的認(rèn)識(shí)序列。
以下這種復(fù)制關(guān)系可以說(shuō)是在體內(nèi)進(jìn)行的嗎？加以確認(rèn)。將具有HA付加抗原表位的p51A基因的發(fā)達(dá)構(gòu)建體，短期導(dǎo)入到SAOS2細(xì)胞中。細(xì)胞吸取了p51基因后p51存在該核內(nèi)，這些細(xì)胞所有都可以使p21 Waf1的含量上升，這件事教導(dǎo)我們可以誘導(dǎo)由p51蛋白或者p53蛋白所控制的公知的p21 Waf1。實(shí)施例3初生腫瘤的p51基因的變異p51的基因變異是以66名患者的初生癌細(xì)胞(8名神經(jīng)芽腫、8名大腸癌、8名乳腺癌、8名肺癌、8名腦腫瘤、8名食道癌、8名肝細(xì)胞癌、8名胰腺癌及4名的腎癌)為對(duì)象，使用逆轉(zhuǎn)錄-PCR一根鏈結(jié)構(gòu)的多態(tài)法(RT-PCR-SSCP)及DNA序列決定法進(jìn)行調(diào)查。
(1)RNA的配制用外科方法摘除新鮮的腫瘤樣品后立即凍結(jié)，在使用之前保持-80℃。RNA按照中川等的文獻(xiàn)記載(Nakagawa，A.，et al.，N.Engl.J.Med.，328，847-854(1993))進(jìn)行提取。
(2)RT-PCR-SSCP及DNA序列的決定使用Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(BRL社制)和隨機(jī)的引物，將全RNA的5μg復(fù)制到cDNA上。為了PCR擴(kuò)增，使用cDNA的第20個(gè)的一個(gè)cDNA。PCR-SSCP按增山等方法(Mashiyama S.et al.，Oncogene，6，1313-1318(1991))進(jìn)行實(shí)施。更具體的是對(duì)于p51A cDNA用三個(gè)引物擴(kuò)增PCR。
以下表示用于PCR的引物堿基序列p51-F1 5’-AAAGAAAGTTATTACCGATG-3’p51-R1 5’-CGCGTGGTCTGTGTTATAGG-3’p51-F2 5’-CATGGACCAGCAGATTCAGA-3’p51-R2 5’-CATCACCTTGATCTGGATG-3’p51-F3 5’-CCACCTGGACGTATTCCACT-3’p51-R3 5’-TGGCTCATAAGGTACCAG-3’p51-F4 5’-CATGAGCTGAGCCGTGAAT-3’p51-R4 5’-TATCTTCATCCGCCTTCCTG-3’p51-F5 5’-ATGAACCGCCGTCCAATT-3’p51-R5 5’-GTGCTGAGGAAGGTACTGCA-3’p51-F6 5’-TGAAGATCAAAGAGTCCCTG-3’p51-R6 5’-CTAGTGGCTTTGTGCCTTTG-3’接著，用加樣緩沖液將32PdCTP中稀釋到1∶10。進(jìn)而在98℃下變性5分鐘，在室溫下，用200伏，用5％丙三醇和5％的聚丙烯酸凝膠分離12小時(shí)到14小時(shí)，電泳后膠體干燥，X線膜曝光一晚直到可以具體地看到移動(dòng)帶。為了確定變異的存在和不存在，將PCR產(chǎn)物在pGEM-T(容易型載體)(普羅麥加)中亞客隆使用ABI377DNA用序列器決定序列。
其結(jié)果，在高度分化的扁平上皮細(xì)胞癌系統(tǒng)的肺癌的組織中，可以看到p51A的推定DNA結(jié)合領(lǐng)域是在氨基酸替換點(diǎn)變異(148位的Ala替換Pro)，其腫瘤表示上述氣管的淋巴轉(zhuǎn)移和胸膜的浸潤(rùn)。任意的選擇5個(gè)克隆都是具有相同的變異，這種腫瘤細(xì)胞所具有的p51基因教導(dǎo)我們可能屬于單一對(duì)立性基因或者單一對(duì)立基因表達(dá)的產(chǎn)物。實(shí)施例4 p51 cDNA導(dǎo)入編程細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)作用p51蛋白與p53蛋白相同地進(jìn)行誘導(dǎo)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡的情況進(jìn)行檢索。
p51蛋白的編程性細(xì)胞死亡的試驗(yàn)，與上述本發(fā)明的方法相同，也就是在32℃培養(yǎng)細(xì)胞株時(shí)，按照使用轉(zhuǎn)化小鼠紅血病細(xì)胞株(1-2-3細(xì)胞株)的方法進(jìn)行(Kato，M.V.，al.，Int.J.Oncol.，9，269(1996))。
此外，小鼠紅白血病細(xì)胞株(1-2-3細(xì)胞株)中、只是發(fā)現(xiàn)了[Friendspleen focus forming virus gp55遺傳----[Xu et al.，Jpn.J.Cancer Res.86284-29l(1995)；Karo et al.，Int.J.Oncol.9269-277]溫度感受性，變異p53蛋白的(Alal 353 Val點(diǎn)變異)的細(xì)胞株。該ts-變異p53蛋白用通常的培養(yǎng)溫度，即37度保留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，p53分子核內(nèi)是否發(fā)揮了所有控制機(jī)能，可是在32℃，移到核內(nèi)誘導(dǎo)p53的活性[Levine，A.J.etal.，Nature 351453-456(1991)]。此細(xì)胞株，在32℃時(shí)可緩慢地誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。
在5％CO2條件下，10％添加小牛胎血清RPMI的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2-3細(xì)胞。接著以PRC/CMV作為表達(dá)載體將p51A基因?qū)朐摷?xì)胞，在選擇培養(yǎng)基下培養(yǎng)根據(jù)新霉素耐性選擇(Neo)，選擇G418耐性細(xì)胞，對(duì)表達(dá)p51A細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡進(jìn)行探討。
即導(dǎo)入用含有p51A基因的表達(dá)載體(pRCCMV/p51A)轉(zhuǎn)化的兩個(gè)p51A導(dǎo)入1-2的細(xì)胞(以下稱ICI細(xì)胞及4BI細(xì)胞)，及作為對(duì)照的載體，將不含有p51A基因的1-2-3細(xì)胞以1×105/ml濃度種植在10cm的直徑板上，在37度和32度兩個(gè)條件下，培養(yǎng)24小時(shí)后回收細(xì)胞。用ProteinaseK及R NaseA處理該細(xì)胞作為DNA樣品，將得到的DNA樣品，進(jìn)行瓊脂電泳。其溴化乙錠染色像表示在圖11中。
從圖中可以看出，在37℃培養(yǎng)下，是不能檢測(cè)1-2-3細(xì)胞的DNA片段(泳道Ⅰ)，可是對(duì)于導(dǎo)入了p51基因的ICI細(xì)胞及4B1細(xì)胞，是可以檢測(cè)出180bp低聚物的DNA片段(泳道2及3)。
在32℃培養(yǎng)下，可以檢測(cè)出1-2-3的DNA片段的同時(shí)(泳道4)，可以促進(jìn)用ICI細(xì)胞及4B1細(xì)胞的DNA片段化(泳道5及6)。其結(jié)果是與如以下所述的編程性細(xì)胞死亡的觀察結(jié)果及p51導(dǎo)入的細(xì)胞繁殖抑制的結(jié)果是相一致的。
細(xì)胞的編程細(xì)胞死亡形態(tài)的變化是否存在，通過各將細(xì)胞固定在玻璃滑片上用吉姆隆進(jìn)行染色后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及染色程度。此外，細(xì)胞的生存數(shù)可用錐蟲藍(lán)進(jìn)行染色后，求出細(xì)胞生存的計(jì)數(shù)。
其結(jié)果，32℃培養(yǎng)的細(xì)胞，在細(xì)胞的表面上有突起物，呈現(xiàn)收縮、形變或腰細(xì)的形態(tài)。另外，吉姆隆染色細(xì)胞標(biāo)本中該核膜的周圍或細(xì)胞內(nèi)的某處有染色質(zhì)凝縮。
另一方面，對(duì)于37℃培養(yǎng)的細(xì)胞沒有觀察這種變化。
32℃培養(yǎng)24小時(shí)后，由于編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞和細(xì)胞周期繼續(xù)繁殖的細(xì)胞混合在一起，p51表達(dá)細(xì)胞的24小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)是105/ml，1-2-3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)是1.7×105/ml。
從以上可以看出溫度32℃處理下的含有p51基因的細(xì)胞，在p53共同可以引起急劇的編程性細(xì)胞死亡。這種事情也說(shuō)明p51蛋白與p53蛋白相同具有明顯地誘導(dǎo)編程細(xì)胞死亡。實(shí)施例5作成人p51B蛋白的C末端領(lǐng)域(氨基酸序列的570～641位的領(lǐng)域)的特異抗體，進(jìn)行人細(xì)胞的免疫染色。
即將人p51B DNA的該編碼領(lǐng)域(堿基序列1851-206位領(lǐng)域)連接在GST融合蛋白表達(dá)載體PGEX-1λT(弗馬西亞社)用大腸菌合成融合蛋白。使用融合蛋白按照常規(guī)方法，使用BALB/C小鼠配置抗血清(多克隆抗體)，用GST蛋白吸收得到p51B蛋白的C末端領(lǐng)域的特異抗體。
將上述的抗體與人皮膚組織凍結(jié)切片進(jìn)行第一次反應(yīng)，接著將熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體進(jìn)行第二次反應(yīng)。
其結(jié)果該抗體對(duì)人皮膚的棘細(xì)胞層到基底層的細(xì)胞核特異地進(jìn)行染色。這種特異性通過上述融合蛋白進(jìn)行處理，使反應(yīng)消失，而用GST蛋白處理這種反應(yīng)是不能消失的。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的基因是相當(dāng)于作為腫瘤抑制基因所公知的p53基因相關(guān)的基因。用這些基因，可以解析各細(xì)胞的表達(dá)水平和功能，或通過表達(dá)物的解析等，能夠解明、診斷、治療與這些有關(guān)的疾病(例如惡性腫瘤等)。
本發(fā)明基因與神經(jīng)系發(fā)現(xiàn)的p73對(duì)比，可以表達(dá)腺組織(前列腺、乳腺)、肌肉組織及胸腺等的免疫系，可能涉及到這些的異常，對(duì)于這些控制物質(zhì)的開發(fā)是有貢獻(xiàn)的。
按照本發(fā)明，提供了作為細(xì)胞增殖抑制基因，有用的新p51基因。本發(fā)明的新基因具有與編碼p53蛋白或p73蛋白基因的類似性。為此，可以利用于解析這些相關(guān)基因的功能和這些疾病相關(guān)疾病的研究，可以用于對(duì)各種疾病的基因診斷及該基因的醫(yī)藥用途的應(yīng)用研究。另外，通過利用本發(fā)明的基因，可以調(diào)查各種人組織的該基因表達(dá)情況，可以解析人體內(nèi)的該功能。
另外，通過該基因，可以用遺傳工學(xué)大量地制造編碼該基因的人p51蛋白。即，通過提供本發(fā)明的基因?qū)⒒蚣盎蚱谓M入載體，制造重組體人p51蛋白，可以探查p51蛋白活性和p51蛋白的結(jié)合活性等的結(jié)合功能。
另外，p51蛋白可利用于p51基因及其產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)的疾病(例如，細(xì)胞的復(fù)制活性相關(guān)的和細(xì)胞編程性死亡的各種疾病，特別是癌)的病態(tài)解析、治療等。
p51蛋白與p53具有同樣的生理學(xué)作用或功能，例如產(chǎn)生病毒的感染、細(xì)胞因子的刺激、低氧狀態(tài)、核苷酸庫(kù)的變化、藥物異常代謝的各種應(yīng)激所涉及的組織和、與其他的蛋白質(zhì)的相互作用的信號(hào)傳遞和其他基因的轉(zhuǎn)錄控制等的功能，調(diào)節(jié)接受生體應(yīng)激生體組織細(xì)胞的DNA的復(fù)制，使細(xì)胞的周期停止，修復(fù)細(xì)胞，排除由于編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞或促進(jìn)細(xì)胞分化，可以防御生體從應(yīng)激狀態(tài)下緩解。
按照本發(fā)明，可以提供含有人p51基因或其等位體的基因治療有用的導(dǎo)入基因載體，該p51基因或?qū)肫涞任惑w的細(xì)胞及以載體或細(xì)胞作為有效成分的基因治療劑及利用他的治療方法。
按照本發(fā)明可以提供有各種癌細(xì)胞的成長(zhǎng)抑制作用，使用在由于該作用的各種癌的疾病及病態(tài)的處置的以p51蛋白作為有效成分的醫(yī)藥。
人p51基因和小鼠的該基因的功能領(lǐng)域顯示了在TA領(lǐng)域的3個(gè)氨基酸以外的所有相同，高度的保存性，其重要性(兩者的堿基的序列的對(duì)比表示在圖12～14及圖15)。
序列表<110>Ikawa,YojiOtsuka Pharmaceutical Co.Ltd.<120>人p51基因及其基因產(chǎn)物<130>P99-16<140><141><150>JP P1998-100467<151>1998-03-27<160>23<170>patentln Ver. 2.0<210>1<211>448<212>PRT<213>人類<220><221>域<222>(1)..(59)<223>反式激活域<220><221>DNA結(jié)合<222>(142)..(321)<223>DNA結(jié)合域<220><221>域<222>(353)..(397)<223>低聚化域<400>1Met Ser Gln Ser Thr Gln Thr Asn Glu Phe Leu Ser Pro Glu Val Phe1 5 10 15Gln His Ile Trp Asp Phe Leu Glu Gln Pro Ile Cys Ser Val Gln Pro20 25 30Ile Asp Leu Asn Phe Vat Asp Glu Pro Ser Glu Asp Gly Ala Thr Asn35 40 45Lys Ile Glu Ile Ser Met Asp Cys Ile Arg Met Gln Asp Ser Asp Leu50 55 60Ser Asp Pro Met Trp Pro Gln Tyr Thr Asn Leu Gly Leu Leu Asn Ser65 70 75 80Met Asp Gln Gln Ile Gln Asn Gly Ser Ser Ser Thr Ser Pro Tyr Asn85 90 95Thr Asp His Ala Gln Asn Ser Val Thr Ala Pro Ser Pro Tyr Ala Gln100 105 110Pro Ser Ser Thr Phe Asp Ala Leu Ser Pro Ser Pro Ala Ile Pro Ser115 120 125Asn Thr Asp Tyr Pro Gly Pro His Ser Phe Asp Val Ser Phe Gln Gln130 135 140Ser Ser Thr Ala Lys Ser Ala Thr Trp Thr Tyr Ser Thr Glu Leu Lys145 150 155 160Lys Leu Tyr Cys Gln Ile Ala Lys Thr Cys Pro Ile Gln Ile Lys Val165 170 175Met Thr Pro Pro Pro Gln Gly Ala Val Ile Arg Ala Met Pro Val Tyr180 185 190Lys Lys Ala Glu His Val Thr Glu Val Val Lys Arg Cys Pro Asn His195 200 205Glu Leu Ser Arg Glu Phe Asn Glu Gly Gln Ile Ala Pro Pro Ser His210 215 220Leu Ile Arg Val Glu Gly Ash Ser His Ala Gln Tyr Val Glu Asp Pro225 230 235 240Ile Thr Gly Arg Gln Ser Val Leu Val Pro Tyr Glu Pro Pro Gln Val245 250 255Gly Thr Glu Phe Thr Thr Val Leu Tyr Asn Phe Met Cys Asn Ser Ser260 265 270Cys Val Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Ile Ile Val Thr Leu275 280 285Glu Thr Arg Asp Gly Gln Val Leu Gly Arg Arg Cys Phe Glu Ala Arg290 295 300Ile Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Lys Ala Asp Glu Asp Ser Ile305 310 315 320Arg Lys Gln Gln Val Ser Asp Ser Thr Lys Asn Gly Asp Gly Thr Lys325 330 335Arg Pro Phe Arg Gln Asn Thr His Gly Ile Gln Met Thr Ser Ile Lys340 345 350Lys Arg Arg Ser Pro Asp Asp Glu Leu Leu Tyr Leu Pro Val Arg Gly355 360 365Arg Glu Thr Tyr Glu Met Leu Leu Lys Ile Lys Glu Ser Leu Glu Leu370 375 380Met Gln Tyr Leu Pro Gln His Thr Ile Glu Thr Tyr Arg Gln Gln Gln385 390 395 400Gln Gln Gln His Gln His Leu Leu Gln Lys His Leu Leu Ser Ala Cys405 410 415Phe Arg Asn Glu Leu Val Glu Pro Arg Arg Glu Thr Pro Lys Gln Ser420 425 430Asp Val Phe Phe Arg His Ser Lys Pro Pro Asn Arg Ser Val Tyr Pro435 440 445<210>2<211>2816<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(145)..(1488)<220><221>polyA信號(hào)<222>(2786)..(2791)<400> 2tcgttgatat caaagacagt tgaaggaaat gaattttgaa acttcacggt gtgccaccct 60acagtactgc cctgaccctt acatccagcg tttcgtagaa acccagctca tttctcttgg 120aaagaaagtt attaccgatc cacc atg tcc cag agc aca cag aca aat gaa 171Met Ser Gln Ser Thr Gln Thr Asn Glu1 5ttc ctc agt cca gag gtt ttc cag cat atc tgg gat ttt ctg gaa cag 219Phe Leu Ser Pro Glu Val Phe Gln His Ile Trp Asp Phe Leu Glu Gln10 15 20 25cct ata tgt tca gtt cag ccc att gac ttg aac ttt gtg gat gaa cca 267Pro Ile Cys Ser Val Gln Pro Ile Asp Leu Asn Phe 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權(quán)利要求
1．編碼以下(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因，(a)具有序列號(hào)1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有序列號(hào)1的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、替換或插入的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質(zhì)，
2．具有以下(a)或(b)的DNA的基因，(a)序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488的堿基序列構(gòu)成的DNA，而且能與編碼p51活性蛋白質(zhì)的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
3．權(quán)利要求2所述的基因，其具有序列號(hào)2所表示的堿基序列。
4．具有以下(a)或(b)的DNA的cDNA，(a)序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，(b)序列號(hào)2表示的堿基序列中，由堿基號(hào)145～1488的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交，而且能與編碼p51活性蛋白質(zhì)的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
5．一種DNA，其特征是在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下能與具有序列號(hào)2表示的堿基序列雜交。
6．一種DNA，其特征是在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下能與具有堿基號(hào)145～1488所示的堿基序列進(jìn)行雜交。
7．權(quán)利要求5所述的DNA，其特征是作為引物被使用。
8．權(quán)利要求5所述的DNA，其特征是作為探針被使用。
9．(a)或(b)表示的蛋白質(zhì)，(a)具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(b)具有序列號(hào)1表示的氨基酸中缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有p51活性的蛋白質(zhì)。
10．權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)，其所具有的氨基酸序列至少是以氨基酸號(hào)1～59、氨基酸號(hào)142～321及氨基酸號(hào)359～397表示的。
11．具有序列號(hào)1所示氨基酸序列的多肽，該多肽至少具有一種從復(fù)制活性功能、DNA結(jié)合功能及低聚化功能選擇出的功能。
12．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號(hào)1中，具有從氨基酸號(hào)1～59表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有復(fù)制功能的多肽。
13．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號(hào)1中，具有以氨基酸號(hào)142～321表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸序列中缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有復(fù)制功能的多肽。
14．具有以下(a)或(b)的多肽(a)在序列號(hào)1中，具有以氨基酸號(hào)359～397表示的氨基酸序列的多肽，(b)具有在(a)中表示的氨基酸中具有缺失、替換或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，而且具有低聚化功能的多肽。
15．一種基因，其編碼權(quán)利要求12～13任何一項(xiàng)所述的多肽。
16．一種載體，其含有權(quán)利要求1的基因。
17．一種宿主細(xì)胞，其是用權(quán)利要求16所述的載體轉(zhuǎn)化的。
18．權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)的制造方法，其特征是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，再?gòu)牡玫降呐囵B(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供包含有作為細(xì)胞繁殖基因所公知的p53基因所關(guān)聯(lián)的家族基因、新的人基因及其基因產(chǎn)物。本發(fā)明是以編碼序列號(hào)1所示的氨基酸序列為特征的人p51基因,在序列號(hào)2中具有表示堿基序列號(hào)145—1488的人p51基因、具有該基因的載體,用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、培養(yǎng)該宿主細(xì)胞,從得到的培養(yǎng)物回收具有序列號(hào)1所示的氨基酸序列p51蛋白的制造方法及序列號(hào)1所示的氨基酸序列p51蛋白。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1295615SQ99804565
公開日2001年5月16日 申請(qǐng)日期1999年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月27日
發(fā)明者井川洋二, 井川俊太郎, 帶刀益夫 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社, 井川洋二