一種多肽-鋅金屬配合物及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鋅-多肽配合物，該配合物由重量比為1∶1～1∶5的動物原料與無機鋅按以下方法制成：在動物原料中加入堿性蛋白酶或枯草桿菌中性蛋白酶水解得到的多肽，再與無機鋅進行配合反應制得；其中，所述無機鋅是氧化鋅、氯化鋅或碳酸鋅，優(yōu)選氧化鋅或碳酸鋅；所述動物原料是低值魚貝類水產(chǎn)品、魚貝類加工后的下腳料或廢棄物。本發(fā)明同時也公開了鋅-多肽配合物在制備治療抗病毒、抑制腫瘤細胞的生長、增強動物對病原體的抗感染能力降低感染性疾病發(fā)病率藥物方面的應用。
【專利說明】一種多肽-鋅金屬配合物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于金屬有機化學【技術領域】，具體涉及金屬多肽配合物。跟具體地說是一種多肽-鋅金屬配合物其制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]鋅(Zn)是人和動物必須的微量元素，被稱為生命元素。目前，有機鋅主要是氨基酸鰲合物，如鋅、硒或鈣等微量元素的氨基酸鰲合物。食用微量元素的氨基酸螯合物不僅可以補充人體或動物所需的微量元素，還可以同時補充人體或動物所需的氨基酸。國知局于1997年4月2日公開了一項發(fā)明專利申請“氨基酸鋅的制備方法及其應用”(申請?zhí)?4114854.8)，該申請公開了一種三甘氨酸鋅鰲合物的制備方法，即將氨基酸和氧化鋅按2: I的摩爾比混合，在水溶液中反應一段時間后濃縮，最后用酒精析出反應產(chǎn)物。國知局于2006年2月11日公開了一項發(fā)明專利申請“氨基酸鰲合物的制備方法”(申請?zhí)?00380105098.7)，該申請公開了一種制備金屬氨基酸鰲合物的方法，即將摩爾比為1:1~1: 4的金屬碳酸鹽和酸性氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)在0~100°C的水溶液中反應，最后取反應物上清經(jīng)冷凍干燥即可。國知局于2006年2月22日授權公告了一項發(fā)明專利“一種有機硒的制備工藝”(申請?zhí)?00410016499.1)，該專利公開了一種蛋氨酸硒的制備方法:將 蛋氨酸鹽和四氯化硒在水溶液或有機溶液中反應0.5~10小時，控制反應時PH2~9、溫度-10~100°C，最后經(jīng)過濾、濃縮和干燥，即可。上述方法所用的螯合劑都是非天然的單一成分的氨基酸，使所得鰲合物營養(yǎng)成分單一，在實際使用中，往往需要幾種氨基酸 微量元素螯合物的配合使用才能體現(xiàn)出較好的效果，應用成本相對較高。而且，由于氨基酸的制備是常采用化學酸水解法，難免會引入化學污染物或者化學殘留物，需要加以嚴密的監(jiān)控與檢測。隨著小分子多肽可以被機體整體吸收理論的證實，有關多肽的開發(fā)就成為營養(yǎng)學或食品科學領域新的關注焦點。由于純品肽的化學合成難度大、成本高，而且化學合成肽往往比從動植物中制備肽的生物活性要低，所以，通過化學合成肽與微量元素反應制備金屬配合物的應用也會受到一定限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種多肽-鋅金屬配合物。
[0004]本發(fā)明的另一目的是提供該配合物的制備方法和應用。
[0005]本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術方案是:
一種多肽-鋅金屬配合物，該配合物由重量比為1:1~1: 5的動物原料與無機鋅按以下方法制成:在動物原料中加入堿性蛋白酶或枯草桿菌中性蛋白酶水解得到的多肽，再與無機鋅進行配合反應制得；其中，所述無機鋅是氧化鋅、氯化鋅或碳酸鋅，優(yōu)選氧化鋅或碳酸鋅；所述動物原料是低值魚貝類水產(chǎn)品、魚貝類加工后的下腳料或廢棄物。
[0006]本發(fā)明所述的多肽-鋅金屬配合物由以下方法制備得到:
(I)原料的預處理:將動物原料切碎或磨碎；(2)蛋白酶水解:取步驟(1)處理后的原料，加入3~5倍的水，攪拌均勻，用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)pH至6.5~9.5，然后按每克原料700~1000U的量加入堿性蛋白酶或枯草桿菌中性蛋白酶，最后在45~60°C下，攪拌或搖蕩，水浴2~3小時，得水解液；所述的pH調(diào)節(jié)劑是碳酸氫鈉、氫氧化鈉或鹽酸；
(3)酶滅活處理:將水解液加熱到95~100°C，維持10分鐘，冷卻至室溫，離心，過濾，取清液；
(4)配合反應:
①用醋酸或NaHCO3調(diào)節(jié)步驟(3)所得清液的pH至4.0~7.0:當所述清液pH小于4.0時，用NaHCO3或NaOH調(diào)節(jié)，當所述清液pH大于7.0時，用醋酸調(diào)節(jié)；
②加入無機鋅溶液，然后加入清液4~5倍的純水于反應體系中，在25°C至100°C的條件下反應0.5~10h，反應過程中間歇攪拌；其中，加入0.lg/ml無機鋅溶液的體積與清液的體積比為1: 10 ;
③反應結束后將其濃縮，冷卻后倒入95%~98%乙醇中進行沉降，過濾分離，最后將分離得到的沉淀物用少量蒸餾水或乙醇洗滌，抽干后80~100°C下干燥即可；或者濃縮以后直接進行熱風干燥或噴霧干燥；其中濃縮的方法可以是真空濃縮，也可以是常壓下加熱濃縮；加熱濃縮的溫度一般在25~100°C之間，溫度越低，所得配合物的活性保留越好，但是所需時間越長。
[0007]本發(fā)明方法中，
在磨碎或切碎的原料溶于水后，即步驟(2)中，在用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)pH至6.5~9.5前，還可以于55°C水浴30分鐘，然后于100°C下熱處理20分鐘，使原料中的蛋白質(zhì)變性，有利于加入蛋白酶后充分水解為 多肽；
當步驟(2)所用的蛋白酶為堿性蛋白酶時，最好將原料和水的混合物的pH值調(diào)至
9.0~9.5，加酶后的水浴溫度為50~60°C ；；
當步驟(2)所用的蛋白酶為枯草桿菌中性蛋白酶時，最好將原料和水的混合物的pH值調(diào)至6.5~7.5，加酶后的水浴溫度為45~55°C ；
步驟(4)中所述清液的pH值優(yōu)選調(diào)節(jié)至4.5~5.5 ;加入無機鋅的量優(yōu)選:與步驟(1)原料重量比為1: 2~1: 3 ;反應時間優(yōu)選I~5小時，反應溫度優(yōu)選25°C~70°C。
[0008]本發(fā)明所述的鋅-多肽配合物不僅含有可被人體和動物體吸收的鋅元素，還含有豐富的多肽成分，具有增強機體免疫能力的作用，可作為補鋅以及提高機體免疫力的營養(yǎng)品、保健品或動物飼料添加劑；所用原料為天然動物原料，且為低值農(nóng)漁產(chǎn)品或農(nóng)漁產(chǎn)品加工后的廢料或下腳料，價格低廉。
[0009]本發(fā)明所述配合物用于制備含有水、果汁、牛奶、蔗糖、維生素、礦物質(zhì)等基礎配料的飲品的方法是:在所述基礎配料中添加0.1~0.3%本發(fā)明所述的配合物。
[0010]本發(fā)明所述配合物用于制備豆(奶)粉食品的方法是:在豆奶或豆粉中添加0.3-0.5%的本發(fā)明所述配合物。
[0011]本發(fā)明所述配合物用于制備主要以淀粉為原料的固體食品的方法是:在原料中添加0.1~0.5%的本發(fā)明所述配合物。
[0012]本發(fā)明所述配合物用于制備主要以豆柏粉為原料的水產(chǎn)飼料的添加劑的使用方法是:在原料中添加3~5%的本發(fā)明所述配合物。[0013]本發(fā)明所述配合物用于制備主要以玉米粉、豆柏粉、面粉、麩皮、糠餅等為原料的豬飼料的添加劑的使用方法是:在原料中添加I~3%的本發(fā)明所述配合物。
[0014]本發(fā)明所述配合物作為主要以玉米粉、豆柏粉、魚粉、菜柏、次面粉、米糠等為原料的禽類飼料的添加劑的使用方法是:在原料中添加2~4%的本發(fā)明所述配合物。
[0015]本發(fā)明進一步公開了鋅-多肽配合物在制備治療抗病毒、抑制腫瘤細胞的生長、增強動物對病原體的抗感染能力降低感染性疾病發(fā)病率藥物方面的應用。
[0016]本發(fā)明同時也公開了多肽-鋅金屬配合物在制備作為增強動物對病原體的抗感染能力，增強機體免疫力、促進動物健康生長藥物方面的應用。
[0017]下面將通過動物實驗來證明本發(fā)明的技術效果。
[0018]一、實驗材料:多肽-鋅金屬配合物，制備方法見實施例1。
[0019]二、實驗動物及分組
選用體重19.85±0.91g、鼠齡9周的健康雄性昆明種小鼠(由廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供)，在安靜、室溫22±2°C條件下喂養(yǎng)，自然光照，每天定時通風。采用國家標準嚙齒類動物飼料按自由飲食、灌胃生理鹽水或鋅-多肽配合物分組飼養(yǎng):第I組(標準飼料對照組)，喂食標準飼料，灌胃生理鹽水；第2組(低劑量組，鋅-多肽配合物濃度為
0.25mg/ml)，喂食標準飼料，灌胃鋅-多肽配合物；第3組(中劑量組，鋅-多肽配合物濃度為0.5mg/ml)，喂食標準飼料，灌胃鋅-多肽配合物；第4組(高劑量組，鋅-多肽配合物濃度為1.0mg/ml)，喂食標準飼料，灌胃鋅-多肽配合物。連續(xù)喂養(yǎng)30d，然后測定小鼠巨噬細胞的吞噬功能和肝臟GSH-PX活力、SOD活力等相關指標。
[0020]三、實驗方法及結果
1、本發(fā)明多肽-鋅金屬配合物對小鼠巨噬細胞活力的影響
通過小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內(nèi)法)，測定巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，從而反映巨噬細胞的吞噬功能，體現(xiàn)機體的抗病能力。由于巨噬細胞能吞噬雞紅細胞，將巨噬細胞和吞噬雞紅細胞溫育后染色，在油鏡下計算吞噬雞紅細胞的巨噬細胞的百分比，并觀察細胞內(nèi)雞紅細胞的形態(tài)，據(jù)此判斷巨噬細胞的吞噬功能和消化功能。
[0021]雞紅細胞懸液制備:
雞斷頭取血，與生理鹽水按1: 9的比例混合，置于有玻璃珠的錐形瓶中，朝一個方向充分搖動，以脫纖維。用生理鹽水洗漆2~3次,離心(2000r/min, IOmin),去上清,用生理鹽水配成I % (v/v)的雞紅細胞懸液。
[0022]吞噬功能測定:
(1)每只小鼠腹腔內(nèi)注射滅菌肉湯培養(yǎng)基Iml巨噬細胞誘導劑；
(2)24h后每鼠腹腔注射I %雞紅細胞懸液lmL。間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠；
(3)將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，輕揉腹部Imin ；
(4)然后吸出腹腔洗液lmL，平均分滴于2片載玻片上涂片，移置37°C孵箱溫育30min；
(5)孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細胞；
(6)晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定5min ；
(7)I: 10 (v/v) Giemsa-磷酸緩沖液染色30min，再用蒸餾水漂洗，晾干；
(8)顯微鏡下觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的情況。[0023]油鏡下計數(shù)巨噬細胞，每張片計數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
[0024]表1不同劑量配合物的吞噬百分率和吞噬指數(shù)(n = 7)
【權利要求】
1.一種多肽-鋅金屬配合物，該配合物由重量比為1:1~1: 5的動物原料與無機鋅按以下方法制成:在動物原料中加入堿性蛋白酶或枯草桿菌中性蛋白酶水解得到的多肽，再與無機鋅進行配合反應制得；其中所述無機鋅是氧化鋅、氯化鋅或碳酸鋅；所述動物原料是低值魚貝類水產(chǎn)品、魚貝類加工后的下腳料或廢棄物。
2.權利要求1所述多肽-鋅金屬配合物的制備方法，該方法包括以下步驟: (1)原料的預處理:將動物原料切碎或磨碎； (2)蛋白酶水解:取步驟(1)處理后的原料，加入3~5倍的水，攪拌均勻，用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)pH至6.5~9.5，然后按每克原料700~1000U的量加入堿性蛋白酶或枯草桿菌中性蛋白酶，最后在45~60°C下，攪拌或搖蕩，水浴2~3小時，得水解液；所述的pH調(diào)節(jié)劑是碳酸氫鈉、氫氧化鈉或鹽酸； (3)酶滅活處理:將水解液加熱到95~100°C，維持10分鐘，冷卻至室溫，離心，過濾，取清液； (4)配合反應:①用醋酸或NaHCCUf節(jié)步驟(3)所得清液的pH至4.0~7.0:當所述清液PH小于4.0時，用NaHCO3或NaOH調(diào)節(jié)，當所述清液pH大于7.0時，用醋酸調(diào)節(jié)；②加入無機鋅溶液，然后加入清液4~5倍的純水于反應體系中,在25°C~100°C的條件下反應0.5~10h，反應過程中間歇攪拌；其中，加入0.lg/ml無機鋅溶液的體積與清液的體積比為1: 10 ;③反應結束后進行真空濃縮或常壓加熱濃縮，冷卻后倒入95%~98%乙醇中進行沉降，過濾分離，最后將分離得到的沉淀物用少量蒸餾水或乙醇洗滌，抽干后干燥即可；或者，濃縮以后直接進行熱風干燥或噴霧干燥；上述步驟中，所述的動物原料與無機鋅的重量比為1:1~1: 5 ;所述的無機鋅是氧化鋅、氯化鋅或碳酸鋅；所述的動物原料是低值魚貝類水產(chǎn)品、魚貝類加工后的下腳料或廢棄物。
3.權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，在用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)pH至6.5~9.5前先經(jīng)過以下處理:于55°C水浴30分鐘，接著100°C下熱處理20分鐘。
4.權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，當所用的蛋白酶是堿性蛋白酶時，原料加水混勻后用碳酸氫鈉或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至9.0~9.5，加酶后的水浴溫度為 50 ~60°C。
5.權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中，當所用的蛋白酶是枯草桿菌中性蛋白酶時，原料加水混勻后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.5~7.5，加酶后的水浴溫度為45~55。。。
6.權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中配合反應的時間為I~5小時。
7.權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中配合反應的溫度為25°C~70。。。
8.權利要求1所述多肽-鋅金屬配合物在制備治療抗病毒、抑制腫瘤細胞的生長、增強動物對病原體的抗感染能力降低感染性疾病發(fā)病率藥物方面的應用。
9.權利要求1所述多肽-鋅金屬配合物在制備作為增強動物對病原體的抗感染能力，增強機體免疫力、促進動物健康生長藥物方面的應用。
【文檔編號】A61P31/12GK103667407SQ201210328857
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權日:2012年9月7日
【發(fā)明者】李虹 申請人:天津拓飛生物科技有限公司