一種青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)是一種青環(huán)海蛇(Hydrophis?cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應(yīng)用。改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis?cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個(gè)氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點(diǎn)12.61。本發(fā)明改造抗菌肽HC-15具有廣譜高效的抗菌活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溶血活性低、制備方法簡(jiǎn)單等有益特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15及其制備方
法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus) 抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Cathelicidins是一個(gè)具有多功能的抗菌肽家族，目前在哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)。Cathelicidins具有廣譜高效的抗微生物活性，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強(qiáng)的殺菌活性，而且對(duì)許多臨床耐藥細(xì)菌同樣具有作用。除此之外，cathelicidins還具有許多其他生物學(xué)活性，如對(duì)多種免疫細(xì)胞具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等。由于具有如此眾多的活性，cathelicidins—直是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。針對(duì)cathelicidins的藥用開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。
[0003]隨著傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當(dāng)使用，微生物耐藥性問(wèn)題變得日益嚴(yán)重，在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠廣泛耐受傳統(tǒng)抗生素的微生物，已有的抗生素對(duì)這些病原微生物無(wú)能為力?？咕氖且活愄烊坏木哂锌刮⑸锘钚缘亩嚯?，大多數(shù)抗菌肽分子量小于10KD，富含堿性氨基酸殘基，能夠形成兩親性的結(jié)構(gòu)。大部分抗菌肽的殺菌機(jī)制是通過(guò)靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。由于作用方式的不同，抗菌肽介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性。
[0004]目前，國(guó)外有許多公司正在進(jìn)行cathelicidins家族抗菌肽的研究開發(fā)，已有多種cathelicidins家族抗菌肽及其改造體進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如牛Indolicidin改造體MB1-226用于治療中心導(dǎo)管導(dǎo)致的血液感染，已進(jìn)入臨床IIIb期。牛Indolicidin改造體MX-594AN用于治療痤瘡感染，已進(jìn)入臨床IIb期試驗(yàn)階段。豬protegrin改造體Iseganan用于治療腫瘤患者口腔感染，已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)階段。
[0005]海蛇屬于爬行綱蛇目眼鏡蛇科，一般生活于大陸架和海島周圍的淺水區(qū)，是一類海岸帶極具開發(fā)潛力的海洋經(jīng)濟(jì)爬行動(dòng)物。世界上約有50多種海蛇，中國(guó)有扁尾海蛇亞科和海蛇亞科共9屬15種。海蛇藥用在中國(guó)歷代醫(yī)書均有記載，其作為祛風(fēng)燥濕、通絡(luò)活血、攻毒和滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效良藥,常用于風(fēng)濕搏癥、四肢麻木、關(guān)節(jié)疼痛、擠癖惡瘡等癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明:海蛇干具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、提聞免疫力等功能；海蛇膽具有顯著止咳，祛痰作用，用于咳嗽、哮喘等呼吸道疾病的治療；海蛇毒具有鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗腫瘤等活性。海蛇所具有的廣泛的藥學(xué)活性，表明其具有極大的藥用開發(fā)潛力。但是與陸地蛇相比，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)海蛇的研究十分滯后，只有為數(shù)不多關(guān)于海蛇分類、生態(tài)、毒液成分和傳統(tǒng)藥學(xué)應(yīng)用的文章報(bào)道。然而對(duì)海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究目前國(guó)內(nèi)外仍是一片空白。[0006]青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)屬于眼鏡蛇科海蛇亞科海蛇屬,在遼寧、山東、江蘇、浙江、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南等省區(qū)沿海均有分布。但是目前關(guān)于青環(huán)海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究還沒(méi)有報(bào)道。
[0007]發(fā)明人將本發(fā)明的青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH改造體HC-15氨基酸全序列經(jīng)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的在于一種青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應(yīng)用。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0010]一種改造體抗菌肽,改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個(gè)氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點(diǎn) 12.61。
[0011]所述改造體抗菌肽為:纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸，且C-末端酰胺化。
[0012]改造體抗菌肽的應(yīng)用，所述改造體抗菌肽HC-15用于制備抗微生物藥物的用途
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明根據(jù)青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)Hc-CATH的改造體HC-15，該改造體具有廣譜高效的抗微生物活性，此外具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、溶血活性低、制備方法簡(jiǎn)單等有益特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0015]實(shí)施例1制備抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15
[0016]1、HC_15的制備方法:根據(jù)青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法設(shè)計(jì)Hc-CATH的改造體HC-15。用自動(dòng)多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱層析脫鹽。
[0017]I1、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。
[0018]II1、純化的HC-15用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0019]測(cè)定結(jié)果為:
[0020]HC-15是青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的一種變異體。HC-15是一種直鏈多肽，含有15個(gè)氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點(diǎn)12.61。HC-15全序列為:纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸，且C-末端酰胺化。
[0021 ] 試驗(yàn)例I抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15的抗菌活性
[0022]1.HC-15抗菌活性檢測(cè)[0023]分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株(標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離菌株共25株)均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)平板上，將經(jīng)過(guò)滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的HC-15樣品溶液10 μ I,于37°C倒置培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強(qiáng)。
[0024]2.HC-15 最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration)測(cè)定:
[0025]試驗(yàn)菌株分別接種到MH液體培養(yǎng)基中(青島海博生物技術(shù)有限公司)，37°C振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液用新鮮MH液體培養(yǎng)基稀釋到2X105cfu/mlo
[0026]取1.9ml上述稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)液，加入經(jīng)0.22 μ m孔徑膜過(guò)濾的2mg/ml的HC-15樣品溶液0.1ml作為第一管，第一管混勻后取出Iml加入第2管中，依次倍比稀釋(參見(jiàn)表1)，自第9管吸出Iml棄去，第10管為對(duì)照管。
[0027]表1稀釋方法
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種改造體抗菌肽，其特征在于:改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個(gè)氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點(diǎn)12.61。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改造體抗菌肽，其特征在于:所述改造體抗菌肽為纈氨酸_精氨酸_賴氨酸_ 苯丙氨酸_賴氨酸_精氨酸_苯丙氨酸_売氨酸_精氨酸_精氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸，且C-末端酰胺化。
3.權(quán)利要求1所述的改造體抗菌肽用于制備撫微生物藥物的用途。
【文檔編號(hào)】A61P31/00GK103665111SQ201210327902
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】王義鵬, 張淑敏, 謝則平 申請(qǐng)人:山東國(guó)際生物科技園發(fā)展有限公司