專利名稱：膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑及抗皺劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑及抗皺劑，特別是涉及膠原產(chǎn)生促進效果等優(yōu)異的植物種子的有機溶劑提取物的處理物。
背景技術：
皮膚自外側起由角質層、表皮、基底膜和真皮構成。
真皮是其中范圍最廣的部分，細胞并不像表皮那樣緊密堆疊。而且細胞外空間大都被稱作“細胞外基質”的巨大分子的網(wǎng)格結構所填充。該細胞外基質在真皮內的成纖維細胞等中產(chǎn)生，由透明質酸、硫酸皮膚素等被稱為酸性粘多糖的多糖類以及膠原、彈性蛋白等纖維性蛋白質構成。細胞外基質與皮膚的彈性、張力、水嫩感、新陳代謝等直接相關。成纖維細胞等中的細胞外基質的產(chǎn)生減弱，則會失去皮膚的彈性和水嫩感，容易發(fā)生肌膚干燥，成為導致皮膚老化的一大原因。
上述纖維性蛋白質主要由膠原構成，其中，I型膠原占全部的80%。除I型膠原夕卜，還已知II1、V、XII和XIV型膠原的存在。老化皮膚上可見的松弛的成因之一在于皮膚組織隨著年齡的增加而變薄。老化的皮膚中，作為真皮的主要基質成分的膠原纖維的減少顯著，這很可能成為皮膚厚度減小的主要原因。因此，認為促進膠原的產(chǎn)生、維持膠原量對于松弛的預防和改善是有效的。
另外，除上述以外，膠原的產(chǎn)生促進對于皮膚的創(chuàng)傷治療的改善、以及骨質疏松癥、關節(jié)炎、腱鞘炎等的治療、高血壓的防止等也是有效的。
迄今為止，作為膠原產(chǎn)生促進劑，已知包含僅以水作為提取溶劑從柏子仁(側柏種子干燥得到的產(chǎn)品)中提取的生藥提取物的膠原產(chǎn)生促進劑(例如參照專利文獻I)。但是，該生藥提取物的膠原產(chǎn)生促進效果具有改善的余地。
另一方面，上述多糖類中的透明質酸具有細胞間隙中的水分的保持、以在組織內形成果凍狀的基質為基礎的細胞的保持、組織的潤滑性和柔軟性的保持、對機械損傷等外力的抵抗、以及細菌感染的防止等多種功能。最近，關于與癌癥轉移的關系，也正在進行大量研究。
另外，除皮膚外，透明質酸還分布在關節(jié)液、玻璃體、韌帶等中，在機體內廣泛分布。因此，除了提高保濕效果外，透明質酸的產(chǎn)生促進對于關節(jié)疼痛(變形性膝關節(jié)病)的治療、皮膚松弛的改善、以干眼癥為主的角結膜上皮損傷的治療、白內障和角膜移植手術時的前房保持等也是有效的。
迄今為止，作為透明質酸產(chǎn)生促進劑，已知含有屬于公牛藻科公牛藻屬的海藻的提取物作為有效成分的透明質酸產(chǎn)生促進劑(例如參照專利文獻2)。
如上所述，除了肌膚的松弛、肌膚干燥等的改善和防止、皮膚老化的防止外，膠原、透明質酸還可應用于膝關節(jié)病的改善劑和眼科手術用制劑等。因此，如果能找到具有膠原、透明質酸這兩者的產(chǎn)生促進效果的物質，則具有能廣泛應用于上述癥狀的改善、預防和治療等的優(yōu)點。
另一方面，專利文獻3中，已知對選自崖柏{Thuja)屬植物、懸鉤子(Rubus)屬植物、越橘(Jaccinimi)屬植物、稱猴桃(Actinidia)屬植物和紫蘇(PerilIa)屬植物中的植物的種子進行提取，制成植物提取物，然后對該植物提取物實施堿處理而得的植物性美白劑的制造方法。
但是，并不知道側柏有機溶劑提取物的處理物具有優(yōu)異的膠原產(chǎn)生促進效果和透明質酸產(chǎn)生促進效果。
現(xiàn) 有技術文獻 專利文獻 專利文獻1:日本特開2010-235482號公報 專利文獻2:日本特開平9-176036號公報 專利文獻3:日本特開2007-223944號公報。發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)有技術而完成的發(fā)明，其目的在于提供膠原產(chǎn)生促進效果和透明質酸產(chǎn)生促進效果等優(yōu)異的植物種子的有機溶劑提取物的處理物。
用于解決課題的手段 為了解決上述課題，本發(fā)明人進行了認真研究，結果發(fā)現(xiàn)，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬ipiatycladus)的植物的種子,得到含有油性成分的提取物,對該提取物進行堿處理和酸處理后，進行水洗，得到的處理物具有優(yōu)異的膠原產(chǎn)生促進效果等，從而完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進劑的特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬ipiatycladus)的植物的種子,得到含有油性成分的提取物,將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
本發(fā)明所述的透明質酸產(chǎn)生促進劑的特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬ipiatycladus)的植物的種子,得到含有油性成分的提取物,將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
本發(fā)明所述的成纖維細胞增殖促進劑的特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬ipiatycladus)的植物的種子,得到含有油性成分的提取物,將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
本發(fā)明的抗皺劑的特征在于,用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬iPlatycladus)的植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
所述促進劑或抗皺劑中，優(yōu)選添加的純堿量為100 300g/L提取物。
所述促進劑或所述抗皺劑中，優(yōu)選屬于柏科側柏屬的植物是側柏iPlatycladusoriental is)。
本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進方法的特征在于，涂敷所述膠原產(chǎn)生促進劑。
本發(fā)明所述的透明質酸產(chǎn)生促進方法的特征在于，涂敷所述透明質酸產(chǎn)生促進劑。
本發(fā)明所述的成纖維細胞增殖促進方法的特征在于，涂敷所述成纖維細胞增殖促進劑。
本發(fā)明所述的皺紋改善方法的特征在于,涂敷所述抗皺劑。
本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進方法的特征在于，口服攝取所述膠原產(chǎn)生促進劑。
本發(fā)明所述的透明質酸產(chǎn)生促進方法的特征在于，口服攝取所述透明質酸產(chǎn)生促進劑。
本發(fā)明所述的成纖維細胞增殖促進方法的特征在于，口服攝取所述成纖維細胞增殖促進劑。
本發(fā)明所述的皺紋改善方法的特征在于，口服攝取所述抗皺劑。
發(fā)明的效果 根據(jù)本發(fā)明，可提供作為膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑、抗皺劑有用的植物種子的有機溶劑提取物的處理物。


圖1是表示側柏種子的水提取物和該種子的有機溶劑提取物的處理物之間的膠原產(chǎn)生促進效果的比較的圖。
圖2是表示側柏種子的有機溶劑提取物的處理物的皺紋改善效果的圖。
具體實施方式
本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進劑的特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬 iPlatycladus)的植物的種子,得到含有油性成分的提取物,將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
本發(fā)明中使用的植物的種子是屬于柏科側柏屬的植物的種子。其中優(yōu)選使用側柏iPlatycladus oriental is)的種子。
側柏原產(chǎn)于中國、朝鮮半島，約250年前傳到日本，現(xiàn)在在日本各地種植，是樹高5 15m的常用灌木或小喬木。
側柏的種子呈黑褐色的長橢球形，也稱“柏子仁”。其在中醫(yī)學上廣泛使用，用于滋養(yǎng)強壯和消炎等。
提取物的具體提取方法、堿處理方法、酸處理方法可采用例如以下方法。
相對于柏科植物的種子的質量，用I 100倍、優(yōu)選I 30倍左右的質量的有機溶劑進行一定時間的提取。所用的種子也可以根據(jù)需要適度地粉碎，過濾時網(wǎng)眼堵塞成為問題時等的情況下，可以在未粉碎狀態(tài)下直接使用。
此外，也可以用少量的有機溶劑反復提取，可以使用索格利特提取器之類的回流裝置。
提取中使用的有機溶劑只要是通常在提取中使用的有機溶劑即可，無特別限定，優(yōu)選揮發(fā)性有機溶劑。
作為有機溶劑，可以單獨或兩種以上組合使用例如甲醇、乙醇等醇類，含水醇類、丙酮、乙酸乙酯、己烷、乙醚等極性或非極性有機溶劑。其中，從價格低、容易減壓濃縮的角度考慮，特別優(yōu)選丙酮、乙酸乙酯、己烷。除此之外，也可以用超臨界二氧化碳氣體進行提取，或者壓榨種子而使用榨汁。
與之相對，含水的提取溶劑會抑制活性成分的提取，因此不優(yōu)選。
從如上所述得到的提取物中除去有機溶劑后，進行堿處理。
堿處理的方法無特別限定，可以通過例如下述方法得到:將有機溶劑提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15Ν、優(yōu)選1 10N的堿水溶液并混合。
更具體而言，例如相對于溶劑蒸餾除去后的提取物，添加0.2 2倍容量的濃堿水溶液后，充分攪拌混合，進行30分鐘 數(shù)天左右的熟化。作為濃堿水溶液，可例舉包含0.5 15Ν、優(yōu)選1 10N的濃度的NaOH、KOH等的水溶液。應予說明，優(yōu)選添加濃堿水溶液，使純堿量達到100 300g/L提取物。
作為混合時的溫度，優(yōu)選室溫 70°C的范圍，更優(yōu)選30 60°C的范圍。熟化時，優(yōu)選進行適當攪拌，以使親水性成分和親油性成分不分離。
對如上所述經(jīng)過堿處理的處理物實施酸處理。
酸處理的方法無特別限定，可例舉例如添加濃度0.5 15N的酸溶液，使pH降至0.5 2左右的方法。
如果實施酸處理，則液狀(油狀)物質分離出來。該液狀物質在具有極高的膠原產(chǎn)生促進效果的同時，也對肌膚顯示出高安全性。
為了促進液狀物質的回收而進行水洗。然后，可以根據(jù)需要進行脫色、脫臭、脫鹽、蒸餾等操作。
從屬于柏科側柏屬的植物的種子中如上所述提取、處理而得的成分除了具有膠原產(chǎn)生促進效果外，還具有促進表皮細胞的透明質酸合成的效果、成纖維細胞增殖促進效果、皺紋改善效果。
因此，本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進劑也可以用作透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑、抗皺劑。
本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進方法、透明質酸產(chǎn)生促進方法、成纖維細胞增殖促進方法、皺紋改善方法的特征在于，涂敷本發(fā)明的膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑、抗皺劑。
上述促進方法或皺紋改善方法也可以涂敷包含本發(fā)明的促進劑或抗皺劑的皮膚外用組合物。
皮膚外用組合物的應用范圍極廣，可應用于各種領域(例如包括準藥品在內的化妝品、醫(yī)藥品、利用微針的注入劑等)。其制品形態(tài)是任意的，可例舉例如軟膏、霜、乳液、化妝水、精華素、凍膠、凝膠、面膜(pack)、面膜(mask)、粉底、微針等。
制備皮膚外用組合物時，配合以液狀成分計優(yōu)選為0.0001 20質量％、更優(yōu)選為0.001 2質量％的作為有效成分的促進劑或抗皺劑。
配合有本發(fā)明所述的促進劑或抗皺劑的皮膚外用組合物可以通過常規(guī)方法制造。皮膚外用組合物中除了作為必需成分的促進劑或抗皺劑以外，可以在不損害本發(fā)明的效果的范圍內適當配合皮膚外用組合物中常用的任意成分。
作為皮膚外用組合物中可以配合的任意成分，可例舉例如氨基酸、脂質、糖、激素、酶、核酸等生理活性物質等。
此外，也可以適當配合水(純水、溫泉水、深層水等)、油劑、表面活性劑、金屬皂、凝膠化劑、粉體、醇類、水溶性高分子、皮膜形成劑、樹脂、包合化合物、香料、除臭劑、鹽類、PH調整劑、清涼劑、來源于動物或微生物的提取物、血液循環(huán)促進劑、收斂劑、抗皮脂溢劑、螯合劑、角質溶解劑、酶、激素類、維生素類、其它植物提取物等。
此外，也可以適當配合依地酸二鈉、依地酸三鈉、檸檬酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬封閉劑，咖啡因、丹寧、維拉帕米、氨甲環(huán)酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、火棘的果實的熱水提取物、各種生藥、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑，葡萄糖、果糖、阿洛酮糖、阿洛糖、塔格糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等糖類，β丙氨酸、甘氨酸、GABA、肌氨酸等離子 通道控制物質，肌肽、類視黃醇等。
此外，通過將本發(fā)明所述的促進劑或抗皺劑與一種或兩種以上的其它藥效劑組合配合，也能配制成各效果更好或者在起到各效果的同時也起到其它藥效的皮膚外用組合物。
作為上述藥效劑，可例舉例如美白劑、紫外線防御劑、抗菌劑、抗炎癥劑、血液循環(huán)促進劑、各種藥效成分、活性氧除去劑、保濕劑、其它促進劑、其它抗皺劑等，但不限定于此。
配合有本發(fā)明所述的促進劑或抗皺劑的皮膚外用組合物的劑型只要能發(fā)揮本發(fā)明的效果即可，無特別限定。皮膚外用組合物的劑型是任意的，可例舉例如溶液體系、可溶化體系、乳化體系、粉末分散體系、水-油雙層體系、水-油-粉末三層體系、軟膏、凝膠、氣溶月父等。
此外，本發(fā)明所述的膠原產(chǎn)生促進方法、透明質酸產(chǎn)生促進方法、成纖維細胞增殖促進方法、皺紋改善方法也優(yōu)選口服攝取本發(fā)明的膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑、抗皺劑。
上述促進方法或皺紋改善方法也可以口服攝取包含本發(fā)明的促進劑或抗皺劑的飲食品。
將本發(fā)明的膠原產(chǎn)生促進劑、透明質酸產(chǎn)生促進劑、成纖維細胞增殖促進劑及抗皺劑配合于飲食品時，促進劑或抗皺劑的配合量(干燥質量)可以根據(jù)它們的種類、目的、形態(tài)、使用方法等來適當決定。例如，配合量在飲食品總量中優(yōu)選為0.0001 50質量％左右。特別是配合于特定保健用食品時，優(yōu)選以能充分發(fā)揮出效果的量配合本發(fā)明的促進劑或抗皺劑。
作為飲食品的形態(tài)，可以任意地成形為例如顆粒狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、液體狀坐寸ο
飲食品中可以適當含有已確認能配合于飲食品等中的公知的各種物質，例如粘合齊 、崩解劑、增稠劑、分散劑、重吸收促進劑、矯味劑、緩沖劑、表面活性劑、增溶劑、保存劑、乳化劑、等滲劑、穩(wěn)定劑和pH調整劑等賦形劑。實施例
下面例舉實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述，但本發(fā)明不受這些實施例的任何限定。如無特別記載，配合量以質量％表示。
首先，本發(fā)明人通過下述制備方法制備了柏科側柏屬植物(側柏)種子的有機溶劑提取物及其處理物(A)。接著，針對提取物及其處理物的成纖維細胞增殖促進效果以及成纖維細胞的I型膠原產(chǎn)生促進效果，進行了如下所示的試驗。
將不添加提取物及其處理物的情況設為100，結果示于表I。
側柏種子的有機溶劑提取物的制備方法 將側柏的種子(未粉碎)分別浸潰于5倍量(v/w)的有機溶劑(丙酮)，在室溫下進行10天的提取。預先用尼龍網(wǎng)(100目)除去殘渣，再用濾紙過濾。用旋轉蒸發(fā)器從濾液中除去溶劑。由此得到提取物。
側柏種子的有機溶劑提取物的處理物的制備方法A 一邊用攪拌葉片攪拌如上所述得到的提取物，一邊向提取物中添加0.5 15N的NaOH溶液，以純NaOH計在100 300g/L的范圍內(溫度50°C )。一邊以200rpm攪拌，一邊進行5小時的處理。然后，緩慢添加5N的H2SO4, —邊攪拌一邊使pH降至I附近，回收分離出的液狀(油狀)物質。在回收的液狀(油狀)物質中添加等容量的水進行水洗，除去雜質、鹽和過量的酸。將液狀(油狀)物質減壓干燥，得到液狀的處理物(A)。
<細胞活化試驗> 將來源于人新生兒的成纖維細胞HFOK接種于含10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克改良伊格爾MEM培養(yǎng)基(DMEM、日水公司(二 〃 ^ ^社)制)中，接著接種于24孔板，在37°C、二氧化碳濃度5體積％的氣氛中靜置。細胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含低濃度血清(0.5%)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)一晝夜。然后，添加樣本配制液并混合，使得提取物及其處理物相對于培養(yǎng)基達到 0、0.5 X 10' I X 10'2 X 10'3 X I(T4 體積 %。在培養(yǎng)第 3 天，用 Hoechst 33342 (同仁化學株式會社制)測定并求出在各樣本配制液中生長發(fā)育的成纖維細胞的細胞數(shù)，以不添加提取物或其處理物的情況作為對照，評價細胞活化程度。
收集細胞培養(yǎng) 上清，評價I型膠原產(chǎn)生量。
〈I型膠原產(chǎn)生的測定> 關于收集的細胞培養(yǎng)上清中的I型膠原，使用I型前膠原C末端肽(Procollagen TypeI C-p印tide (PIP)) EIA試劑盒(寶公司(TAKARA社)制)，按照試劑盒附帶的操作手冊來測定培養(yǎng)基上清中的I型膠原C末端肽，作為I型膠原產(chǎn)生量的指標。以DNA量計，用Hoechst 33342求出每I個孔的細胞量，以每單位細胞的形式來評價在提取物或其處理物的作用下促進合成的I型膠原量。
[表 I]
權利要求
1.膠原產(chǎn)生促進劑，其特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬(Platycladus)的植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
2.透明質酸產(chǎn)生促進劑，其特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科iCupressaceae)側柏屬iPlatycladus)的植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
3.成纖維細胞增殖促進劑,其特征在于,用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae)側柏屬iPlatycladus)的植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
4.抗皺劑，其特征在于，用有機溶劑提取屬于柏科{Cupressaceae、側柏屬(Platycladus)的植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5 15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
5.權利要求1 4中任一項所述的促進劑或抗皺劑，其特征在于，添加的純堿量為100 300g/L提取物。
6.權利要求1 5中任一項所述的促進劑或抗皺劑，其特征在于，屬于柏科側柏屬的植物是側柏(Platycladus oriental is)。
7.膠原產(chǎn)生促進方法，其特征在于，涂敷權利要求1所述的膠原產(chǎn)生促進劑。
8.透明質酸產(chǎn)生促進方法，其特征在于，涂敷權利要求2所述的透明質酸產(chǎn)生促進劑。
9.成纖維細胞增殖促進方法，其特征在于，涂敷權利要求3所述的成纖維細胞增殖促進劑。
10.皺紋改善方法，其特征在于，涂敷權利要求4所述的抗皺劑。
全文摘要
本發(fā)明提供提供膠原產(chǎn)生促進效果、透明質酸產(chǎn)生促進效果、成纖維細胞增殖促進效果和皺紋改善效果優(yōu)異的植物種子的有機溶劑提取物的處理物。本發(fā)明的膠原產(chǎn)生促進劑的特征在于，用有機溶劑提取柏科(Cupressaceae)側柏屬(Platycladus)植物的種子，得到含有油性成分的提取物，將該提取物的溶劑的一部分或全部蒸餾除去后，添加濃度0.5～15N的堿水溶液并混合，接著進行酸處理后，進行水洗而得到。
文檔編號A61P43/00GK103167865SQ201180052029
公開日2013年6月19日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權日2010年10月27日
發(fā)明者常長誠, 飯野雅人, 草苅健 申請人:株式會社資生堂