專利名稱：內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域，具體涉及特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的完全人源性抗體(fullyhuman antibody)。
背景技術(shù)：
黑素瘤是攻擊性的、頻繁轉(zhuǎn)移性腫瘤，其源自黑素細(xì)胞或黑素細(xì)胞相關(guān)的痣細(xì)胞("Cellular and Molecular Immunology"(1991) (eds.) Abbas A. K. , Lechtman, A.H. , Pober, J. S. ;ff. B. Saunders Company, Philadelphia:第 340-341 頁)。黑素瘤占全部皮膚癌癥的大約3%，在全世界婦女中黑素瘤的增加未被除肺癌外的任何其他的新生物所超過("Cellular and Molecular Immunology^(1991)(eds. ) Abbas, A. K. , Lechtiman, A.H. , Pober, J.S. ;ff. B. Saunders Company Philadelphia:第 340-342 頁;Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of0ncology7:1-16)。甚至當(dāng)黑素瘤表面上局限于皮膚時(shí)，也有最高達(dá)30%的患者將發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，大多數(shù)將死亡(Kirkwood andAgarwala(1993)Principles and Practice of 0ncology7:1-16)。治療黑素瘤的經(jīng)典方式包括手術(shù)、輻射和化學(xué)療法。在過去的十年中，免疫療法和其他分子方法已經(jīng)作為新的且有前景的治療黑素瘤方法浮現(xiàn)出來。黑素瘤沉積物存在淋巴細(xì)胞，提供了有力證據(jù)表明在人體中存在癌癥免疫反應(yīng)。當(dāng)被分離后，這些淋巴細(xì)胞能夠以主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-限制方式識別特異性的自身腫瘤抗原和同種異體的黑素瘤(Itoh et al. (1986)，CancerRes. 46:3011-3017;Muul et al. (1987),J.1mmuno1. 138:989-995) ;Topalianet a1. ( 1 9 8 9)J.1mmunol. 142 : 3714-3725;Darrow et a1. ( 1 989)J.1mmunol. 142:3329-3335;Horn et al. (1991)J. Tmmunother. 10:153-164;Kawakami etal. (1992) J.1mmunol. 148:638-643;Horn et al. (1993)J.1mmunother. 13:18-30;0'Neilet al. (1993) J.1mmunol. 151:1410-1418)。轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)在體外可識別共有的抗原，包括黑素細(xì)胞-黑素瘤系特異性組織抗原(Kawakami etal. (1993)J.1mmunother. 14:88-93;Anichini et al. (1993)J. Exp. Med. 177:989-998)。許多黑素瘤患者產(chǎn)生針對這些腫瘤的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)以及黑素瘤表達(dá)MHC抗原和腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的事實(shí)，暗示鑒定和表征額外的黑素瘤抗原對于免疫治療黑素瘤患者將是重要的。但是，還需要新的方式來治療黑素瘤和其他癌癥。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開了特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)的分離的單克隆抗體以及這些抗體的抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中這些抗體是完全人源性抗體。這些抗體對人內(nèi)質(zhì)蛋白有高親和力并可以用于治療和/或診斷癌癥。在一個(gè)實(shí)例中，所述單克隆抗體是scFv。在某些實(shí)施方案中，所公開的抗體可用于檢測表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白的腫瘤，例如黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在其他實(shí)施方案中，所公開的抗體可用于治療腫瘤，例如黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。本文還公開了編碼這些抗體的重組核酸、包括這些核酸的表達(dá)載體和用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞。上述的以及其他的特征和優(yōu)勢通過以下幾個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)描述會更清楚，詳細(xì)描述參照附圖進(jìn)行。


圖1a.用人黑素瘤細(xì)胞系麗1158淘選噬菌體展示scFv文庫。所述噬菌體展示scFv文庫含有大量的有不同特異性的噬菌體展示scFv片段。將所述文庫加入到含有WMl 158黑素瘤細(xì)胞懸液的管中。然后洗滌所述管以移除未結(jié)合的噬菌體，在高PH下洗脫結(jié)合的噬菌體并在細(xì)菌宿主大腸 桿菌TGl中擴(kuò)增。然后進(jìn)行三輪淘選，用培養(yǎng)的人LG2B淋巴樣細(xì)胞吸收所分離的克隆以移除結(jié)合到人黑素瘤細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞共有的抗原(Ag)的噬菌體。然后用WMl 158細(xì)胞通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)對所分離的噬菌體進(jìn)行反應(yīng)性篩選。圖1b.通過用WMl 158細(xì)胞淘選噬菌體展示抗體文庫而分離的scFv W9與所述黑素瘤細(xì)胞系麗1158和所述B淋巴樣細(xì)胞系LG2的差異反應(yīng)性。將麗1158細(xì)胞鋪于96孔板并與scFv W9在室溫孵育2小時(shí)。使用c-myc特異性mAb (單克隆抗體)9E10和HRP-鏈酶親和素檢測scFv的結(jié)合。識別無關(guān)抗原和LG2細(xì)胞的scFvll9被用作陰性對照。scFvW9特異性地與WMl 158細(xì)胞系反應(yīng)。圖2. scFv W9與多種類型人細(xì)胞系的反應(yīng)性。6種黑素瘤細(xì)胞系、4種乳癌細(xì)胞系、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系、3種胰腺癌細(xì)胞系、膀胱癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、上皮癌細(xì)胞系、結(jié)腸癌細(xì)胞系、腎癌細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系被鋪于96孔板并與scFvW9在室溫孵育2小時(shí)。使用c-myc特異性mAb9E10和HRP-鏈酶親和素檢測scFv的結(jié)合。scFv W9與所有黑素瘤細(xì)胞系、2種乳癌細(xì)胞系、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系、胰腺癌細(xì)胞系、膀胱癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、上皮癌細(xì)胞系、腎癌細(xì)胞系、卵巢癌細(xì)胞系和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系都有反應(yīng)。圖3a和3b.內(nèi)質(zhì)蛋白被鑒定為scFv W9識別的抗原。WM1158黑素瘤細(xì)胞裂解物與scFv W9進(jìn)行免疫沉淀。使用I類HLA-特異性mAbTP25. 99和HMW-MAA特異性scFvC21作為對照。在還原性的10%SDS-PAGE上分辨所述沉淀物中的蛋白質(zhì)并用考馬斯藍(lán)染色。94-KDa是所述W9沉淀所特有的(A)。從T24 (膀胱癌)、SUM149 (乳癌)和SLR21 (腎癌)細(xì)胞系的裂解物獲得了相同的結(jié)果。從所述SDS凝膠切離所述特異性條帶并通過質(zhì)譜分析。在94-KDa條帶中鑒別到的人蛋白為內(nèi)質(zhì)蛋白。圖4.碳水化合物在scFv W9識別的決定簇的表達(dá)中的作用。將C0L038細(xì)胞在存在0. 5 ii g/ml衣霉素的情況下培養(yǎng)72小時(shí)。在只加入DMSO的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞并使用所述mAb TP25. 99作為對照。通過ELISA檢驗(yàn)細(xì)胞與scFv W9的結(jié)合。細(xì)胞與scFv W9在4°C孵育2小時(shí)。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗體檢測scFv的結(jié)合。在450nm處讀出吸光度，衣霉素處理誘導(dǎo)了 scFv W9與C0L038細(xì)胞的結(jié)合的強(qiáng)烈下降。因此，碳水化合物在scFv W9識別的決定簇的表達(dá)中起作用。圖5a和5b. scFv W9對重組犬內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)的反應(yīng)性的特異性。將與人內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)在氨基酸序列上顯示98. 5%同源性的重組犬內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)以20 y g/孔固定在96孔板中，并與scFv W9在室溫孵育2小時(shí)。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗體檢測scFv的結(jié)合。在450nm處讀出吸光度。scFvll9和BSA用作陰性對照。scFvW9識別在細(xì)胞I吳上表達(dá)的內(nèi)質(zhì)蛋白決定族。圖6.重組犬內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)對scFv W9與C0L038細(xì)胞結(jié)合的劑量依賴的抑制。兩倍稀釋的重組犬內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)與scFv W9預(yù)孵育。將所述混合物加入到接種有C0L038細(xì)胞的96孔板。使用mAb9E10和HRP-山羊抗小鼠IgG抗體檢測scFv的結(jié)合。在450nm處讀出吸光度。B 2m用作對照。重組犬Grp94特異性抑制scFv W9與C0L038細(xì)胞
的結(jié)合。 圖7a和7b.用內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94) cDNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞對scFv W9結(jié)合的影響。用3u g Grp94HSP90BIcDNA克隆通過電穿孔轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。將細(xì)胞與scFv W9和mAb9E10孵育，然后與FITC-山羊抗小鼠IgG抗體孵育。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。PCMV6-XL4載體被用作對照。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作對照。電穿孔增加了 scFv W9的結(jié)合。被scFv識別的抗原的表達(dá)通過熱休克調(diào)節(jié)。圖8a和8b.用內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94) shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)F0-1細(xì)胞對scFv W9結(jié)合的影響。用內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94) shRNA和對照shRNA(ABCB5)轉(zhuǎn)導(dǎo)FO-1細(xì)胞。將細(xì)胞與scFv W9和mAb9E10孵育，然后與FITC-山羊抗小鼠IgG抗體孵育。然后通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。與對照shRNA相比，內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94) shRNA抑制scFv W9的結(jié)合。圖9.碳水化合物在mAb W9識別的表位的表達(dá)中的作用。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2 (5 X IO5)與或不與 2 y I 的 a -2 (3，6，8. 9)-神經(jīng)氨酸酶在 50 u I RPMI1640 培養(yǎng)基中在5%C02恒溫箱中于37°C下孵育24小時(shí)。然后將所述處理的細(xì)胞用mAb W9染色并通過流式細(xì)胞儀分析。用mAb TP25. 99處理的細(xì)胞作對照。圖10.在人胰臟腺癌MIAPaCa-2癌起始細(xì)胞上被mAb W9識別的細(xì)胞外內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)表位的表達(dá)。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞與ALDEFLU0R孵育以檢測ALDH活性(測試組)并用mAb W9染色。與ALDEFLUOR+DAEB抑制劑孵育并用mAb W9染色的細(xì)胞用作參考(對照)。人Ig(HIg)被用作對照。標(biāo)明了癌起始細(xì)胞一被鑒定為ALDHfcight的細(xì)胞一的百分?jǐn)?shù)。圖11.通過mAb W9對手術(shù)移除的人胰臟腺癌癌灶進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用mAbW9 (I U g/ml)染色手術(shù)移除的人胰臟腺癌癌灶和來自同一患者的正常胰腺組織的冷凍切片。(X200)。圖12.使用mAb W9對人基底型(basal)乳癌MDA_MB_231和人黑素瘤異種移植物MV3上的內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)表達(dá)的IHC染色分析。用mAb W9 (5 u g/ml)染色福爾馬林固定且石蠟包埋的人基底型乳癌MDA-MB-231細(xì)胞、人管腔型(luminal)乳癌MCF-7細(xì)胞和人黑素瘤異種移植物MV3 (X200)。用mAb W9進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色顯示MDA-MB-231細(xì)胞和MV3異種移植物被mAb W9 (5 u g/ml)強(qiáng)烈地染色。在MCF-7細(xì)胞中沒有檢測到染色。圖13. mAb W9顯著地抑制表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)的腫瘤細(xì)胞的生長。將人癌細(xì)胞(I X IO4/孔)接種于96孔板(加入1%FCS的RPMI1640)并用mAb W9 (5 u g/ml)處理72小時(shí)。人Ig(HIg)用作對照。然后通過MTT測定檢驗(yàn)細(xì)胞。結(jié)果表示為生長抑制百分?jǐn)?shù)％。*p 值〈O. 05 ;**p 值〈O. 01。圖14.癌細(xì)胞中mAb W9抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。分別使人MV3 (黑素瘤)細(xì)胞和MIAPaCa-2 (胰臟腺癌)細(xì)胞(4X105/ml)饑餓24小時(shí)和3小時(shí)，然后與mAb W9 (50 u g/ml)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育。6小時(shí)后，調(diào)查細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白V/PI染色的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。人Ig(HIg)用作陰性對照。圖15.在人黑素瘤M21細(xì)胞中mAb W9抗體對裂解的PARP的誘導(dǎo)。將人黑素瘤M21 細(xì)胞(4 X105/ml)與 mAb W9 (5 u g/ml)在含有1. 5%FCS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中孵育 72小時(shí)。通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析檢驗(yàn)細(xì)胞裂解物中的裂解的PARP。P -肌動蛋白用作上樣對照。mAb W9強(qiáng)烈地增加了裂解的PARP的表達(dá)。圖16.在人黑素瘤MV3細(xì)胞中mAb W9抗體對裂解的胱天蛋白酶_3 (caspase-3)的誘導(dǎo)。使人黑素瘤MV3細(xì)胞(4X105/ml)饑餓24小時(shí)，然后與mAb W9 (50 u g/ml)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育。通過Western blot檢驗(yàn)細(xì)胞裂解物中的裂解的胱天蛋白酶-3?！?肌動蛋白用作上樣對照。用IMAGJ 軟件測定結(jié)果條帶的密度，與
肌動蛋白條帶的密度進(jìn)行歸一化，顯示在各自的條帶下面。mAb W9強(qiáng)烈地增加了裂解的胱天蛋白酶-3的表達(dá)。在以HIg處理的細(xì)胞中沒有檢測到效果。圖17.由mAb W9介導(dǎo)的對人黑素瘤MV3細(xì)胞的細(xì)胞依賴性裂解。將人黑素瘤MV3細(xì)胞用50iiCi的51Cr標(biāo)記并以0.4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度重懸，與mAb W9 (50,10,2 u g/ml)在96孔組織培養(yǎng)-U型底-測定板中混合。人Ig(HIg)用作對照。在4°C孵育30分鐘后，加入PBMC (40:1E:T)并在CO2恒溫箱中于37 °C下孵育4小時(shí)。通過在Packard T0PC0UNT Microplate Scintillation Counter微板閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)無細(xì)胞的上清測定51Cr的釋放。圖18.由mAb W9介導(dǎo)的人黑素瘤MV3細(xì)胞的補(bǔ)體依賴的裂解。將人黑素瘤MV3細(xì)胞用50 u Ci的51Cr標(biāo)記并以I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度重懸。將所述靶細(xì)胞與mAb W9 (50、10、2 ii g/ml)在存在人血清補(bǔ)體的情況下孵育。人Ig(HIg)用作對照。在CO2恒溫箱37°C孵育 2 小時(shí)后，通過在 Packard TopCount Microplate Scintillation Counter 微板閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)無細(xì)胞的上清測定51Cr的釋放。圖19.mAb W9對人胰臟腺癌MIAPaCa-2癌起始細(xì)胞體外增殖的抑制。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞與mAb W9 (25 y g/ml)在37°C孵育48小時(shí)。然后收獲細(xì)胞并用AiDFmOR 染色(測試組)。用AO>EFlJJG_ +daeb染色的細(xì)胞用作參考(對照組)。人Ig(HIg)用作對照。標(biāo)明了癌起始細(xì)胞一被 鑒定為ALDHtoight的細(xì)胞一的百分?jǐn)?shù)。圖20. mAb W9對胰腺M(fèi)IAPaCa-2和PANCl細(xì)胞中信號途徑RAS-MEK-ERK和FAK的抑制。將所述人胰腺M(fèi)IAPaCa-2和PANCl細(xì)胞以每孔l.OX IO5個(gè)的濃度接種在6孔板的含5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，與所述W9上清或者所述對照上清或者不作處理在37°C孵育48 小時(shí)。用抗 RAS、C-Raf、磷酸化(p)-ERKI/2、ERKI/2、(p) -FAK(Tyr397)、FAK、P -連環(huán)蛋白、p-AKT(Ser473)和AKT的mAb通過蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)細(xì)胞裂解物。鈣聯(lián)接蛋白和P _肌動蛋白用作上樣對照。圖21. mAb W9對人黑素瘤M21細(xì)胞中信號途徑的抑制。將所述人黑素瘤M21細(xì)胞以每孔1. OX IO5個(gè)細(xì)胞的濃度接種在6孔板的含5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，與mAbW9 (5 u g/ml)孵育72 小時(shí)。用抗磷酸化(p)-AKT、Be1-2、C-Raf、(p)-ERKI/2、PKC a、@ -連環(huán)蛋白mAb通過蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)細(xì)胞裂解物。人Ig(HIg)和PBS用作陰性對照。I丐聯(lián)接蛋白用作上樣對照。圖22. mAb W9對人黑素瘤MV3細(xì)胞中信號途徑的抑制。將人黑素瘤MV3細(xì)胞與mAbW9在37°C在RPMI1640中孵育6小時(shí)。然后制備細(xì)胞裂解物并用抗RAS、Met、p_Met、P -連環(huán)蛋白、Ras、C-RAF、p-AKT和p_ERKl/2、Thr202/Tyr204通過蛋白質(zhì)印跡檢驗(yàn)。P -肌動蛋白用作上樣對照。與HIg孵育的細(xì)胞用作對照。圖23.在用mAb W9處理的小鼠中已建立的肺轉(zhuǎn)移的減少。靜脈注射MV3黑素瘤細(xì)胞(每只小鼠1. 4X IO8個(gè)細(xì)胞)。15天后每48小時(shí)用mAb W9 (每只小鼠100 y g,靜脈注射)處理小鼠。在第25天，處死小鼠，取肺，用福爾馬林固定并用H&E染色以分析腫瘤區(qū)域。所示出的值為每組的平均腫瘤面積。**指示P值〈O. 01。圖24.化學(xué)治療劑對UACC-257黑素瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)表達(dá)的增強(qiáng)。將人黑素瘤 UACC-257 細(xì)胞(2 X105/ml)在含有 10%FCS、5_FU (300 y M)、順鉬(IOuM)和紫杉醇(20nM)的RPMI1640培養(yǎng)基中 孵育48小時(shí)。收獲細(xì)胞，用mAb W9染色并通過流式細(xì)胞儀分析。未處理的細(xì)胞用作對照。示出了染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。圖25a和25b. mAb W9與5-FU和環(huán)巴胺(cyclopamine)的組合對人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞增殖的抑制。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞(每孔2. 5 X IO3個(gè)細(xì)胞)接種在96孔板(加入5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基)，在37°C下和5%C02氣氛中，用mAb W9 (5 u g/ml)與 5-FU(10iiM) (A.)，或mAb W9 (5 u g/ml)與環(huán)巴胺(20 u M) (B.)的組合處理 1、2、3 天。然后通過MTT測定檢驗(yàn)細(xì)胞。540nm處的0. D.值指示活細(xì)胞。圖26. mAb W9與5_FU和環(huán)巴胺的組合對人胰臟腺癌MIAPaCa-2癌起始細(xì)胞體外增殖的抑制。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞與mAb W9 (25 y g/ml)、環(huán)巴胺(20 y M)和5-FU(IOiiM)在37°C孵育48小時(shí)。然后用含或不含DEAB抑制劑的ALDEFLU0R染色細(xì)胞，以鑒定ALDHblright細(xì)胞。抗I類HLA mAb TP25.99用作對照。標(biāo)明了癌起始細(xì)胞——被鑒定為ALDHfcight的細(xì)胞一的百分?jǐn)?shù)。圖27. mAb W9與5_FU和環(huán)巴胺的組合對胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。使人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞(4X105/ml)饑餓3小時(shí)，然后與mAb W9 (10 y g/ml)、環(huán)巴胺(20 u M)和5-FU(10 u M)在含有1. 5%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中孵育。24小時(shí)后，調(diào)查細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白V/PI染色的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。HIg用作陰性對照。圖28a和28b. mAb W9與輻射和環(huán)巴胺的組合對人胰臟腺癌MIAPaCa-2癌起始細(xì)胞體外增殖的抑制。以20Gy的劑量輻射人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞(4X 105/ml)(圖A)，并與mAb W9 (10 u g/ml)和環(huán)巴胺(20 y M)在37°C孵育72小時(shí)。然后用含或不含DEAB抑制劑的ALDEFLUOR染色細(xì)胞，以鑒定ALDHtoight細(xì)胞。未受輻射的細(xì)胞用作對照(圖B)。標(biāo)明了癌起始細(xì)胞一被鑒定為ALDHfcight的細(xì)胞一的百分?jǐn)?shù)。 圖29. mAb W9與輻射和環(huán)巴胺的組合對胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。以20Gy的劑量輻射人胰臟腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞(4X 105/ml)，并與mAb W9 (20 u g/ml)和環(huán)巴胺(20yM)孵育。8小時(shí)后，檢驗(yàn)細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白V/PI染色的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。未受輻射的細(xì)胞和人Ig(HIg)用作對照。圖30. mAb W9與5_FU和環(huán)巴胺的組合對人胰臟腺癌MIAPaCa_2細(xì)胞中信號途徑的抑制。將人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞與mAb W9、環(huán)巴胺(20 y M)和5_FU(10iiM)在37°C孵育2天(圖D)。然后制備細(xì)胞裂解物并用抗RAS、C-Raf、磷酸化(p)-MEK(Ser217/221)、MEK、pERK(Thr202/Tyr204)、ERK、p_AKT(Ser473)、AKT 的 mAb 通過蛋白質(zhì)印跡測試。鈣聯(lián)接蛋白用作上樣對照。用單獨(dú)的mAb W9 (圖A)，用mAb W9和環(huán)巴胺(圖B)以及用mAb W9和5-FU (圖C)孵育的細(xì)胞用作對照。圖31. mAb W9與輻射和環(huán)巴胺的組合對人胰臟腺癌MIAPaCa_2細(xì)胞中信號途徑的抑制。以20Gy的劑量輻射人胰臟腺癌MIAPaCa-2細(xì)胞，并與mAb W9 (10 u g/ml)和環(huán)巴胺(20 u M)在37°C孵育48小時(shí)。然后制備細(xì)胞裂解物并用抗RAS、磷酸化(p)-ERK(Thr202/Tyr204)、ERK、p-AKT(Ser473)、AKT、SHh、GLIl的mAb通過蛋白質(zhì)印跡測試。鈣聯(lián)接蛋白用作上樣對照，鈣聯(lián)接蛋白和￠-肌動蛋白用作上樣對照。序列表在隨附的序列表中使用37C. F. R.1. 822定義的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母代碼示出了核酸和氨基酸序列。每條核酸序列僅示出一條鏈，但是應(yīng)認(rèn)為通過任何對所示鏈的引用而將其互補(bǔ)鏈包括在內(nèi)。所述序列表已作為ASCII文本文件[Sequence_Listing , txt, Junel5, 2011, 19. 4KB]提交，其以引用的方式納入本文。SEQ ID NO:1是特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體重鏈的氨基酸序列。SEQ ID N0:2是特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體輕鏈的氨基酸序列。SEQ ID N0:3是編碼特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體重鏈的核酸序列。SEQ ID N0:4是特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體輕鏈的核酸序列。SEQ ID N0:5是人內(nèi)質(zhì)蛋白的氨基酸序列。SEQ ID N0:6是編碼人內(nèi)質(zhì)蛋白的核酸序列。SEQ ID N0:7和8是內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式I 縮寫5-FU :氟尿嘧啶ADCC :抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性Ag :抗原ALDHbright :醛脫氫酶(bright)膜聯(lián)蛋白V :膜聯(lián)蛋白A5￠-連環(huán)蛋白鈣粘蛋白相關(guān)的蛋白
B-Raf 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶B-RafCDC :補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性⑶R :互補(bǔ)決定區(qū)C-Raf =RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸_蛋白激酶DEAB :4- (二乙氨基)苯甲醛DMEM :達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基ER:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ERKI/2 :細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的激酶1/2FAK :粘著斑激酶 FBS :胎牛血清FR :框架區(qū)GLIl :神經(jīng)膠質(zhì)瘤-相關(guān)的癌基因同系物IGrp :葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白Gy :戈瑞(焦耳/千克)HRP :辣根過氧化物酶Ig:免疫球蛋白mAb :單克隆抗體MEK:促分裂原活化蛋白激酶激酶Met C-Met0. D.:光密度PBS :磷酸緩沖鹽水p-ERKI/2 :磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)的激酶1/2p-FAK :磷酸化的粘著斑激酶P1:碘化丙啶RAS:大鼠肉瘤scFv VH和\兩者的單鏈可變區(qū)SHH :皮卡丘素(Sonic hedgehog homolog)Vh :重鏈可變區(qū)Vl :輕鏈可變區(qū)I1.術(shù)語除非另有說明，根據(jù)慣例用法使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)常見術(shù)語的定義可以見于 Benjamin Lewin, Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of MolecularBiology, published by Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA. Meyers(ed. ), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference, published by VCH Publishers,Inc.，1995 (ISBN1-56081-569-8)。為幫助理解本公開內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案，提供了如下的具體術(shù)語解釋抗體至少包括可特異性識別并特異性結(jié)合抗原(例如內(nèi)質(zhì)蛋白或其片段)表位的輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)域的多肽配體?？贵w由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈和輕鏈每個(gè)均具有可變區(qū)域，稱作重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')。一起地，所述Vh區(qū)和'區(qū)負(fù)責(zé)結(jié)合被抗體識別的抗原?？贵w包括完整免疫球蛋白和變體?？商禺愋越Y(jié)合抗原例如內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體的功能片段(抗原結(jié)合片段)在本領(lǐng)域是已知的，例如可特異性結(jié)合靶抗原的Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)通過接頭結(jié)合，同時(shí)在dsFv中，所述鏈已被突變以引入二硫鍵來穩(wěn)定所述鏈的締合。所述術(shù)語還包括基因工程形式，例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和異綴合抗體(例如雙特異性抗體)。還見于，Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995(Pierce Chemical Co. , Rockford, IL);Kuby, J.
,Immunology, 3rd Ed. , ff. H. Freeman & Co. , New York, 1997。功能性片段還稱為“抗原結(jié)合”片段，因?yàn)樗鼈兲禺愋越Y(jié)合所述靶抗原，例如人內(nèi)質(zhì)蛋白。一般地，天然產(chǎn)生的免疫球蛋白具有通過二硫鍵互相連接的重(H)鏈和輕(L)鏈。有兩種類型的輕鏈，lambda( A )和kappa( k )。有5種決定抗體分子功能活性的主要的重鏈類別(或同種型)IgM, IgD, IgG, IgA和IgE。每個(gè)重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)，(所述區(qū)也稱為“域”)。組合地，所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)特異性結(jié)合抗原。輕鏈和重鏈的可變區(qū)含有被3個(gè)高變區(qū)(也稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”)間隔的“框架”區(qū)?？蚣軈^(qū)和⑶R的范圍已經(jīng)確定(參見，Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Healthand Human Services, 1991,在此以引用的方式納入本文)?，F(xiàn)在Kabat數(shù)據(jù)庫是在線維護(hù)的，⑶R序列可以確定，例如參見IMGT/V-QUEST程序版本3. 2. 18. , March29, 2011，可從因特網(wǎng)和 fcochet，X. et al. , Nucl. Acids Res. 36，W503-508，2008 獲得。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在同一物種例如人內(nèi)是相對保守的?？贵w的框架區(qū)一所述組成的輕鏈和重鏈的結(jié)合框架區(qū)——用于在三維空間中安鉻并排列所述CDR。

⑶R主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原表位。每條鏈的⑶R —般稱為⑶R1XDR2和⑶R3，從N-末端開始順序編號，并且一般還通過所述具體的⑶R所在的鏈來鑒定。因此，VH⑶R3位于具有該結(jié)構(gòu)的抗體的重鏈可變區(qū)，然而' CDRl是來自具有該結(jié)構(gòu)的抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRl。結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體通常具有特異性的Vh區(qū)和\區(qū)序列，因此也具有特異性的⑶R序列。有不同特異性的抗體(即對不同抗原有不同結(jié)合位點(diǎn))具有不同的CDR。雖然抗體與抗體之間的CDR不同，但是在所述CDR內(nèi)只有有限數(shù)量的氨基酸位鉻直接參與抗原結(jié)合。CDR內(nèi)的這些位鉻被稱為特異性決定殘基(SDR)。111”或“^’是指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括？￥、80 ￥、(18 ￥或？&&的可變區(qū)?！鞍恕被颉癡L”是指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可變區(qū)?！皢慰寺】贵w”是由B淋巴細(xì)胞的單個(gè)克隆或其中轉(zhuǎn)染有單個(gè)抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如通過骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合制造雜合的抗體形成細(xì)胞。單克隆抗體包括人源化的單克隆抗體?！扒逗峡贵w”具有來自一個(gè)物種例如人的框架殘基和來自另一物種的CDR (通常賦予抗原結(jié)合)，例如特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的鼠抗體?！叭恕笨贵w(也稱為“完全人源性”抗體)是包括人框架區(qū)和人免疫球蛋白的全部⑶R的抗體。在一個(gè)實(shí)例中，所述框架和所述CDR是源自于相同的人重鏈和/或輕鏈氨基酸序列。但是，可以設(shè)計(jì)來自一個(gè)人抗體的框架以包括來自不同的人抗體的CDR?！叭嗽椿钡拿庖咔虻鞍资前ㄈ丝蚣軈^(qū)和一個(gè)或多個(gè)來自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被稱為“供體”，提供框架的人免疫球蛋白被稱為“受體”。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)人源化免疫球蛋白中，全部CDR均是來自于供體免疫球蛋白。恒定區(qū)不一定存在，但是如果它們存在，則它們必須與人免疫球蛋白恒定區(qū)基本相同，即具有至少約85-90% (例如約95%或更高)的同一性。因此，可能除所述⑶R之外，人源化免疫球蛋白的所有部分均與天然人免疫球蛋白序列的對應(yīng)部分基本相同的?！叭嗽椿笨贵w是包括人源化輕鏈和人源化重鏈免疫球蛋白的抗體。人源化抗體結(jié)合的抗原與提供CDR的供體抗體結(jié)合的抗原相同。人源化免疫球蛋白或抗體的受體框架可能有有限數(shù)量的氨基酸被取自供體框架的氨基酸取代。人源化的或其他的單克隆抗體可以具有對抗原結(jié)合或其他免疫球蛋白功能基本沒有影響的額外的保守性氨基酸取代。人源化免疫球蛋白可以通過基因工程的方式構(gòu)建(例如參見，美國專利No. 5，585，089)?？乖趧游镏锌梢源碳た贵w產(chǎn)生或T細(xì)胞反應(yīng)的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射或吸收到動物內(nèi)的組合物?？乖c特異性體液或細(xì)胞免疫產(chǎn)物反應(yīng)，包括由異源性免疫原誘導(dǎo)的那些。一種示例性的抗原是內(nèi)質(zhì)蛋白。術(shù)語“抗原”包括全部相關(guān)的抗原表位?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”是指與B細(xì)胞和/或T細(xì)胞反應(yīng)的抗原上的位點(diǎn)。表位可以由連續(xù)的氨基酸或由通過蛋白質(zhì)三級折疊緊靠的非連續(xù)的氨基酸而形成。由連續(xù)的氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑時(shí)一般會保留，然而通過三級折疊形成的表位在以變性溶劑處理時(shí)一般會丟失。在單一空間構(gòu)象中表位一般包括至少3個(gè)，更通常至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測定表位空間構(gòu)象的方法包括，例如X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振?？乖梢允墙M 織特異性抗原或疾病特異性抗原。這些術(shù)語不是排他的，因?yàn)榻M織特異性抗原也可以是疾病特異性抗原。組織特異性抗原在有限數(shù)量的組織例如單一組織中表達(dá)。組織特異性抗原的具體非限制性實(shí)例為黑素瘤特異性抗原或神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳、肺、前列腺、腎或膀胱特異性抗原。疾病特異性抗原在疾病過程例如黑素瘤或其他類型的癌癥的同時(shí)表達(dá)。疾病特異性抗原的具體非限制性實(shí)例為其表達(dá)與腫瘤形成相關(guān)或者是腫瘤形成的預(yù)兆的抗原，所述腫瘤例如黑素瘤和/或神經(jīng)膠質(zhì)瘤和/或其他類型的癌癥(例如內(nèi)質(zhì)蛋白)。疾病特異性抗原可以是被T細(xì)胞或B細(xì)胞識別的抗原。擴(kuò)增核酸分子(例如DNA或RNA分子)的擴(kuò)增是指可增加樣本內(nèi)核酸分子拷貝數(shù)的技術(shù)的使用。擴(kuò)增的一個(gè)實(shí)例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在其中從受試者收集的生物樣品與一對寡核苷酸引物，在允許所述引物與所述樣品中核酸模板雜交的條件下接觸。所述引物在適合的條件下延伸，從所述模板分離，然后再退火、延伸、分離以增加所述核酸的拷貝數(shù)。所述擴(kuò)增的產(chǎn)物可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過電泳、限制性核酸內(nèi)切酶切割帶型、寡核苷酸雜交或連接、和/或核酸測序來表征，擴(kuò)增的其他實(shí)例包括美國專利No. 5，744，311公開的鏈鉻換擴(kuò)增；美國專利No. 6，033，881公開的無轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增；W090/01069公開的修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增；EP-A-320308公開的連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；美國專利No. 5，427，930公開的填隙連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；和美國專利No. 6，025，134公開的NASBA RNA無轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。動物活的多細(xì)胞脊椎生物，一個(gè)包括例如哺乳動物和鳥類的種類。術(shù)語哺乳動物包括人和非人哺乳動物，包括非人的靈長類。類似地，術(shù)語“受試者”包括人以及獸醫(yī)的受試者。結(jié)合親和力抗體對抗原的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和力是通過由Frankelet al. , Mol.1mmunol. , 16:101-106, 1979描述的Scatchard方法的修改方法來計(jì)算的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力是通過抗原/抗體離解速率測量的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，高的結(jié)合親和力是通過競爭性放射免疫測定來測量的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合親和力是通過ELISA測量的?？贵w以高親和力“特異性結(jié)合”抗原例如內(nèi)質(zhì)蛋白，并且不會明顯地結(jié)合其他無關(guān)抗原。乳癌乳房組織的良性或惡性瘤病癥。乳癌最常見的類型是導(dǎo)管癌。原位導(dǎo)管癌是導(dǎo)管的非侵襲性的瘤病癥。小葉癌不是侵襲性的疾病，但其是可能發(fā)展癌的指示。乳房的浸潤癌(惡性)可分為幾個(gè)階段(1、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV)?；瘜W(xué)治療劑在可由異常細(xì)胞生長表征的疾病治療中有治療用途的任何化學(xué)試劑。這樣的疾病包括腫瘤、瘤(neoplasm)和癌癥以及通過增生性生長而表征的疾病例如銀屑病。在某些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是用于治療乳癌、黑素瘤和/或神經(jīng)膠質(zhì)瘤的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是放射性化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定可用的化學(xué)治療劑(例如參見Slapak and Kufe, Principles ofCancer Therapy, Chapter86in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14thedition;Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17in Abeloff, Clinical 0ncology2nded. , 0 2000Churchill Livingstone, Inc;Baltzer L,Berkery R(eds): OncologyPocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed.St.Louis, Mosby-Year Book,1995;FischerDS,Knobf MF, Durivage HJ(eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed.St.Louis, Mosby-Year Book, 1993)。聯(lián)合化療是給予受試者多于一種試劑以治療癌癥，例如將特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的抗體與放射性或化學(xué)化合物聯(lián)合給予受試者。嵌合抗體包括源于兩種不同抗體一一般屬于不同物種一的序列的抗體。最典型地，嵌合抗體包括人和鼠抗體結(jié)構(gòu)域，通常人恒定區(qū)和鼠可變區(qū)、鼠CDR和/或鼠SDR。

cDNA (互補(bǔ)DNA):缺少內(nèi)部的非編碼部分(內(nèi)含子)以及決定轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列的一段DNA。實(shí)驗(yàn)室中通過從細(xì)胞中提取的信使RNA的反轉(zhuǎn)錄來合成cDNA?；瘜W(xué)治療劑在可由異常細(xì)胞生長表征的疾病治療中有治療用途的試劑(例如抗瘤試劑)。這樣的疾病包括腫瘤、瘤和癌癥以及通過增生性生長而表征的疾病例如銀屑病。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是用于治療瘤例如實(shí)體瘤的試劑。化學(xué)治療劑可以是蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)試劑，例如小分子藥物、抗體、肽、蛋白質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑是放射性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定化學(xué)治療劑(例如參見 Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter86in Harrison'sPrinciples of Internal Medicine, 14th edition;Perry et al. , Chemotherapy, Ch. 17inAbeloff,Clinical Oncology2nd ed. , 2000Churchill Livingstone, Inc;BaltzerL,Berkery R(eds) : Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St.Louis,Mosby-Year Book, 1995;Fischer DS,Knobf MF, Durivage HJ(eds):The CancerChemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993)。保守性變體“保守性”氨基酸取代是基本不影響或降低抗體特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的親和力的那些取代。例如，特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的人抗體可以包括最多約I個(gè)、最多約2個(gè)、最多約5個(gè)、最多約10個(gè)或最多約15個(gè)的保守性取代并且特異性結(jié)合原始的內(nèi)質(zhì)蛋白多肽。術(shù)語保守性變化還包括取代的氨基酸代替未被取代的原來的氨基酸的用途，條件是抗體特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白。非保守性取代是那些減少結(jié)合到內(nèi)質(zhì)蛋白的活性的取代。提供功能相似的氨基酸的保守性氨基酸取代表是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。如下6組是被認(rèn)為互相是保守性取代的氨基酸的實(shí)例1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR):共同限定天然Ig結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。Ig的輕鏈和重鏈各有3個(gè)⑶R，分別命名為L-⑶Rl、L-⑶R2、L-⑶R3和H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3。接觸以直接物理聯(lián)系放鉻；包括固體和液體形式。細(xì)胞毒性分子例如免疫毒素對意在被靶向的細(xì)胞的毒性，與生物體的其余細(xì)胞相反。相反地，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“毒性”是指免疫毒素對意圖被所述免疫毒素的靶向部分打靶的那些細(xì)胞除外的細(xì)胞的毒性，術(shù)語“動物毒性”是指免疫毒素對動物的毒性，這是通過免疫毒素對意圖被免疫毒素打靶的細(xì)胞除外的細(xì)胞的毒性而實(shí)現(xiàn)的。簡并變體編碼內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的多核苷酸,其包括由于遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的序列。有20種天然氨基酸，其大多數(shù)被多于一個(gè)密碼子編碼。因此，所有簡并核酸序列被包括在本公開內(nèi)容內(nèi)，只要由所述核酸序列編碼的內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的氨基酸序列沒有改變。診斷鑒定病理狀況例如但不限于黑素瘤、卵巢癌、乳癌或神經(jīng)膠質(zhì)瘤的存在或性質(zhì)。診斷方法在其靈敏度和特異性上不同。診斷測定的“靈敏度”是測試呈陽性的患病個(gè)體的百分?jǐn)?shù)(真陽性的百分?jǐn)?shù))。診斷測定的“特異性”是1減去假陽性率，其中假陽性率定義為測試呈陽性但沒有疾病的那些個(gè)體的比例。雖然某一具體的診斷方法可能不能提供對病癥的明確診斷，如果所述方法提供有助于診斷的陽性指示就足夠了。“預(yù)后性癥狀”是病理狀況例如癌癥或轉(zhuǎn)移發(fā)展(例如嚴(yán)重度)的可能性。效應(yīng)分子意在對嵌合分子靶向的細(xì)胞產(chǎn)生合乎需要的效果的嵌合分子的部分。效應(yīng)分子也稱為效應(yīng)部分(EM)、治療性試劑或診斷試劑或類似的術(shù)語。治療性試劑包括化合物例如核酸、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸或衍生物、糖蛋白、放射性同位素、脂質(zhì)、碳水化合物或重組病毒。核酸治療性和診斷的部分包括反義核酸、與單鏈或雙鏈DNA共價(jià)交聯(lián)的衍生寡核苷酸、和三鏈形成寡核苷酸?；蛘?，連接到靶向部分例如抗內(nèi)質(zhì)蛋白抗體的的分子可以是包裹系統(tǒng)例如脂質(zhì)體或微團(tuán)，所述脂質(zhì)體或微團(tuán)含有治療性組合物例如藥物、核酸(例如反義核酸)或可以被保護(hù)以免直接暴露于循環(huán)系統(tǒng)的另一個(gè)治療性部分。制備附著于抗體的脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如參見美國專利No. 4，957，735 ;和 Connor etal.，Pharm. Ther. 28:341-365，1985)。診斷試劑或部分包括放射性同位素和其他可檢測標(biāo)記?？捎糜诖四康牡目蓹z測標(biāo)記也是本領(lǐng)域已知的，包括放射性同位素例如 35S、nC、13N、150、18F、19F、99mTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、99Tc、mIn 和 1251、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光試劑和酶。表位抗原決定簇。這些是分子上具體的化學(xué)基團(tuán)或肽序列，其具有抗原性，即其能誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)?？贵w特異性結(jié)合多肽上具體的抗原表位。表位可以從連續(xù)的氨基酸或從通過蛋白質(zhì)三級折疊緊靠的非連續(xù)的氨基酸而形成。由連續(xù)的氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑時(shí)一般會保留，然而通過三級折疊形成的表位在以變性溶劑處理時(shí)一般會丟失。在單一空間構(gòu)象中表位一般包括至少3個(gè)，更通常至少5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸。測定表位空間構(gòu)象的方法包括，例如X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振。參見,例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)。表位可以是糖基化的。因此，抗體可以特異性結(jié)合糖基化形式(或非糖基化形式)的蛋白質(zhì)。內(nèi)質(zhì)蛋白一種還被稱為葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白(Grp)94(Grp94)的蛋白質(zhì)，其是熱休克蛋白90(Hsp90)家族的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留成員。在體內(nèi)，hsp90和內(nèi)質(zhì)蛋白與客戶蛋白質(zhì)相互作用，并發(fā)揮作用以保護(hù)它們免遭泛素依賴性蛋白酶體降解。雖然所述內(nèi)質(zhì)蛋白在所有細(xì)胞類型中組成型表達(dá)，但是在包括低葡萄糖水平、低細(xì)胞外pH、突變蛋白表達(dá)和病毒感染在內(nèi)的多種應(yīng)激條件下，其表達(dá)被上調(diào)。熱休克蛋白具有細(xì)胞保護(hù)功能，并直接或間接地調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。已經(jīng)證實(shí)在包括肝細(xì)胞癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)增加，并且內(nèi)質(zhì)蛋白對某些腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡效果。此外，當(dāng)慢性乙肝病毒(HBV)感染進(jìn)展到肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)時(shí)，觀察到內(nèi)質(zhì)蛋白的水平增加。已經(jīng)研究了Hsp90和內(nèi)質(zhì)蛋白的抑制劑(例如格爾德霉素(GA)和其低毒衍生物17-AAG)在癌癥治療中的效力。示例性的編碼內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)的核酸包括但不限于GENBANK 登錄號No. NM_003299、No. BC066656(智人)；No. NM_011631 (小鼠)；No. NM_001045763:(熱帶非洲爪蟾(Silurana)) ;No. NM_214103 (野豬)；No. NM_98210 (斑馬魚)；No. NM_001012197 (褐鼠);No.NM_001134101:蘇門答 臘猩猩；No. NM_001003327 (家犬)熱休克蛋白9OkDa ^ (GrpM) ；No. NM_204289 (原雞)。表達(dá)調(diào)控序列調(diào)節(jié)與其可操作地連接的異源核酸序列表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)調(diào)控序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄(對其翻譯的控制和調(diào)節(jié)視情況而定)時(shí)，表達(dá)調(diào)控序列與所述核酸序列是可操作地連接的。因此，表達(dá)調(diào)控序列可以包括適當(dāng)?shù)膯幼?、增?qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、在蛋白編碼基因前面的起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子剪接信號、使mRNA正確翻譯的對所述基因正確讀碼框的維護(hù)、以及終止密碼子。術(shù)語“調(diào)控序列”意圖包括其存在可以影響表達(dá)的最少的組分，并且還可以包括其存在有利的額外組分，例如前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。表達(dá)調(diào)控序列可以包括啟動子。啟動子是足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。還包括那些足以使啟動子依賴的基因表達(dá)具有可控的細(xì)胞類型特異性、組織特異性、或者可被外部信號或試劑誘導(dǎo)的啟動子元件，所述元件可以位于所述基因的5’或3’區(qū)域。組成型的和可誘導(dǎo)的啟動子都包括在內(nèi)(參見例如 Bitter et al. , Methods in Enzymologyl53:516-544，1987)。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用可誘導(dǎo)的啟動子例如細(xì)菌曬菌體\的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac雜合啟動子)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用源自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列；腺病毒后期啟動子；牛痘病毒7. 5K啟動子)。通過重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子也可以用于使核酸序列轉(zhuǎn)錄。表達(dá)調(diào)控序列調(diào)節(jié)與其可操作地連接的異源核酸序列表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)調(diào)控序列控制并調(diào)節(jié)核酸序列的轉(zhuǎn)錄(對其翻譯的控制和調(diào)節(jié)視情況而定)時(shí)，表達(dá)調(diào)控序列與所述核酸序列是可操作地連接的。因此，表達(dá)調(diào)控序列可以包括適當(dāng)?shù)膯幼?、增?qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、在蛋白編碼基因前面的起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子剪接信號、使mRNA正確翻譯的對所述基因正確讀碼框的維護(hù)以及終止密碼子。術(shù)語“調(diào)控序列”意圖包括其存在可以影響表達(dá)的最少的組分，并且還可以包括其存在有利的額外組分，例如前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。表達(dá)調(diào)控序列可以包括啟動子。啟動子是足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。還包括那些足以使啟動子依賴的基因表達(dá)具有可控的細(xì)胞類型特異性、組織特異性、或者可被外部信號或試劑誘導(dǎo)的啟動子元件，所述元件可以位于所述基因的5’或3’區(qū)域。組成型的和可誘導(dǎo)的啟動子都包括在內(nèi)(參見例如 Bitter et al. , Methods in Enzymologyl53:516-544，1987)。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用可誘導(dǎo)的啟動子例如細(xì)菌曬菌體\的pL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac雜合啟動子)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用源自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列；腺病毒后期啟動子；牛痘病毒7. 5K啟動子)。通過重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子也可以用于使核酸序列轉(zhuǎn)錄。表達(dá)由核酸到蛋白質(zhì)的翻譯。蛋白質(zhì)可以表達(dá)并留在細(xì)胞內(nèi)，稱為細(xì)胞表面I吳的組分，或者被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)或介質(zhì)中?？蚣軈^(qū)插入⑶R之間的氨基酸序列?？蚣軈^(qū)包括輕鏈可變框架區(qū)和重鏈可變框架區(qū)。框架區(qū)用來使CDR保持適當(dāng)?shù)姆较蛞越Y(jié)合抗原。神經(jīng)膠質(zhì)瘤在任何發(fā)育階段都由神經(jīng)膠質(zhì)組成的腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括腦和脊髓的所有內(nèi)在的瘤，例 如星形細(xì)胞瘤、室管膜瘤和少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤?！暗图墑e”神經(jīng)膠質(zhì)瘤是分化良好的(非退行發(fā)育);這些是良性的，意味著患者有更好的預(yù)后。“高級別”神經(jīng)膠質(zhì)瘤是未分化的或退行發(fā)育的；這些是惡性的，有更壞的預(yù)后。糖基化碳水化合物共價(jià)附著到蛋白質(zhì)例如抗原。糖基化包括N-連接的糖基化、0-連接的糖基化和C-連接的糖基化。HAMA (人抗鼠抗體)反應(yīng)人受試者中對已經(jīng)給予其的鼠抗體可變區(qū)和恒定區(qū)的免疫反應(yīng)。重復(fù)的抗體給藥可能導(dǎo)致所述抗體從患者血清中清除的速率增加，還可能引起患者的過敏反應(yīng)。宿主細(xì)胞載體可在其中增殖并表達(dá)其DNA的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核的或真核的。該術(shù)語還包括任何受試者宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)該理解不是所有子代都與親代細(xì)胞相同，因?yàn)樵趶?fù)制期間可能有突變發(fā)生。但是，當(dāng)使用術(shù)語“宿主細(xì)胞”時(shí)，這樣的子代被包括在內(nèi)。免疫反應(yīng)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞例如B細(xì)胞、T細(xì)胞或單核細(xì)胞對刺激的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)對具體抗原是特異性的(“抗原特異性反應(yīng)”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)是T細(xì)胞反應(yīng),例如CD4+反應(yīng)或CD8+反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是B細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致特異性抗體的產(chǎn)生。
免疫綴合物效應(yīng)分子與特異性結(jié)合目標(biāo)抗原(例如人內(nèi)質(zhì)蛋白)的抗體或其功能片段的共價(jià)連接。所述效應(yīng)分子可以是可檢測標(biāo)記、免疫毒素、細(xì)胞因子或趨化因子。毒素的具體非限制性實(shí)例包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒桿菌毒素或其修飾的毒素，或其他直接或間接抑制細(xì)胞生長或殺死細(xì)胞的有毒試劑。例如，PE和DT是高毒化合物，一般通過肝臟毒性引起死亡。但是，通過移除所述PE和DT毒素的天然靶向組分(例如PE的域Ia和DT的B鏈)并將其用另外的靶向組分例如抗體代替，所述PE和DT可以被修飾為可用作免疫毒素的形式?！扒逗戏肿印笔蔷Y合(偶聯(lián))到效應(yīng)分子的靶向部分例如配體或抗體。所述術(shù)語“綴合”或“連接”是指使兩個(gè)多肽成為一個(gè)連續(xù)的多肽分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體被接合到效應(yīng)分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接合到效應(yīng)分子的抗體進(jìn)一步被接合到脂質(zhì)或其他分子形成蛋白質(zhì)或肽以增加其在體內(nèi)的半衰期。所述連接可以通過化學(xué)或重組的方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接是化學(xué)的，其中所述抗體部分和所述效應(yīng)分子之間的反應(yīng)產(chǎn)生在所述兩個(gè)分子之間形成的共價(jià)鍵以形成一個(gè)分子。肽接頭(短肽序列)可以可選地被包括在所述抗體和所述效應(yīng)分子之間。因?yàn)槊庖呔Y合物起初是由兩個(gè)有獨(dú)立功能的分子例如抗體和效應(yīng)分子制備的，所以它們有時(shí)也稱為“嵌合分子”。本文使用的所述術(shù)語“嵌合分子”因此是指綴合(偶聯(lián))到效應(yīng)分子的靶向部分例如配體或抗體。免疫原性肽一種肽， 其包括等位基因特異性基序或其他序列例如N-末端重復(fù)以使得所述肽可結(jié)合MHC分子并誘導(dǎo)針對抗原(所述免疫原性肽從其中得到)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(“CTL”)反應(yīng)或B細(xì)胞反應(yīng)(例如抗體產(chǎn)生)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的序列基序或其他方法例如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或多項(xiàng)式測定來鑒定免疫原性肽。一般地，使用算法來確定肽的“結(jié)合閾值”以選擇那些具有某些分?jǐn)?shù)的肽，所述分?jǐn)?shù)給予其以特定親和力結(jié)合的高概率并且在該分?jǐn)?shù)時(shí)其是免疫原性的。所述算法基于具體位鉻的具體氨基酸對MHC結(jié)合的影響、具體位鉻的具體氨基酸對抗體結(jié)合的影響或在含有基序的肽中具體的取代對結(jié)合的影響。在免疫原性肽的序列中，“保守性殘基”是在肽中的具體位鉻以顯著高于隨機(jī)分布預(yù)期的頻率出現(xiàn)的殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，保守性殘基是所述MHC結(jié)構(gòu)可以提供與所述免疫原性肽接觸的點(diǎn)的地方。在一個(gè)具體非限制性實(shí)例中，免疫原性多肽包括內(nèi)質(zhì)蛋白的區(qū)域或其片段，其中所述多肽在表達(dá)所述全長內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的宿主細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)。免疫原性組合物一種包括多肽例如內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的組合物，其可誘導(dǎo)針對表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的細(xì)胞的可測量CTL反應(yīng)，或誘導(dǎo)針對內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的可測量的B細(xì)胞反應(yīng)(例如抗體的產(chǎn)生)。免疫原性組合物還可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生。其還指分離的編碼內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的核酸，其可用于表達(dá)所述內(nèi)質(zhì)蛋白多肽(因此可用于激發(fā)針對該多肽的免疫反應(yīng))。對體外使用，免疫原性組合物可由所分離的蛋白質(zhì)或肽表位組成。對體內(nèi)使用，所述免疫原性組合物一般包括在可藥用載體和/或其他試劑中的所述蛋白質(zhì)或免疫原性肽。通過本領(lǐng)域認(rèn)可的測定，可以容易地測試任何具體的肽例如內(nèi)質(zhì)蛋白多肽或編碼所述多肽的核酸誘導(dǎo)CTL或B細(xì)胞反應(yīng)的能力。免疫原性組合物可以包括佐劑，其對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。免疫反應(yīng)條件包括參考的條件，該條件允許針對具體表位產(chǎn)生的抗體結(jié)合到那個(gè)表位的程度可檢測地比結(jié)合到基本上全部其他表位的程度更大，和/或基本上排除結(jié)合全部其他表位。免疫反應(yīng)條件依賴于所述抗體結(jié)合反應(yīng)的形式，一般是在免疫測定方法中使用或體內(nèi)遇到的那些條件。參見Harlow & Lane (見上文)，對免疫測定形式和條件的描述。所述方法中采用的免疫反應(yīng)條件是“生理?xiàng)l件”，其包括參考的條件(例如溫度、滲透性和PH)，該條件在活的哺乳動物或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)是典型的。雖然應(yīng)該承認(rèn)某些器官處在極端條件下，但生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境正常地為PH7左右(即從pH6. 0到pH8. 0，更典型地PH6. 5-7. 5)，含有水作為主要溶劑，并且以0°C以上50°C以下的溫度存在。滲透性在可支持細(xì)胞生活和增殖的范圍內(nèi)。分離的“分離的”生物組分，例如核酸、蛋白質(zhì)(包括抗體)或細(xì)胞器，已經(jīng)與所述組分天然存在的環(huán)境(例如細(xì)胞)中的其他生物組分(即其他染色體和額外染色體DNA以及RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)基本分開或被純化。已經(jīng)“分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包含通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸。標(biāo)記直接或間接綴合到另一分子(例如抗體或蛋白質(zhì))以幫助檢測該分子的可檢測的化合物或組合物。標(biāo)記的具體非限制性實(shí)例包括熒光標(biāo)簽、酶的連接和放射性同位素。在一個(gè)實(shí)例中，“標(biāo)記的抗體”是指另一分子摻入到所述抗體。例如，所述標(biāo)記是可檢測的標(biāo)示物，例如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸或附著到可通過標(biāo)記的抗生物素蛋白檢測的生物素基多肽(例如可以通過光學(xué)或比色方法檢測的含有熒光標(biāo)示物或酶活性的鏈霉親和素)。標(biāo)記多肽和糖蛋白的多種方法在本領(lǐng)域是已知的并可以被使用?？捎糜诙嚯牡臉?biāo)記的實(shí)例包括但不限于放射性同位素或放射性核苷酸(例如35S、nC、13N、150、18F、19F、99mTc、1311、3H、14C、15N、9°Y、99Tc、mIn和1251)、熒光標(biāo)記物(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、稀土熒光體(lanthanide phosphor))、酶標(biāo)記物(例如辣根過氧化物酶、P _半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)示物、生物素基團(tuán)、被二級指示劑識別的預(yù)定的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合域、表位標(biāo)簽)或磁性試劑例如釓螯合物。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記被多種長度的間隔臂附著以減少可能的空間位阻。接頭在某些情況中，接頭是在抗體結(jié)合片段(例如Fv片段)內(nèi)的肽，其用于間接地使重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連結(jié)起來 ?！敖宇^”還可以是指用于將靶向部分例如抗體連接到效應(yīng)分子例如細(xì)胞毒素或可檢測標(biāo)記的肽。術(shù)語“綴合”、“接合”、“鍵合”或“連接”是指使兩個(gè)多肽成為一個(gè)連續(xù)的多肽分子，或?qū)⒎派湫院怂鼗蚱渌肿庸矁r(jià)地附著到多肽例如scFv。在具體上下文中，該術(shù)語包括參考將配體例如抗體部分接合到效應(yīng)分子。所述連接可以通過化學(xué)或重組的方式。“化學(xué)方式”是指所述抗體部分和所述效應(yīng)分子之間的反應(yīng)使得在所述兩個(gè)分子之間形成共價(jià)鍵以形成一個(gè)分子。哺乳動物該術(shù)語包括人和非人哺乳動物。類似地，術(shù)語“受試者”包括人以及獸醫(yī)的受試者。主要組織相容性復(fù)合體(MHC):—般指定的意思包含在不同物種中描述的組織相容性抗原系統(tǒng)，包括人白細(xì)胞抗原(“HLA”)。術(shù)語“基序”是指具有確定長度(通常約8到約11個(gè)氨基酸)的肽內(nèi)的殘基結(jié)構(gòu)，，其被具體的MHC等位基因識別。對應(yīng)于每個(gè)MHC等位基因的妝基序一般不同，并且其在聞度保守性殘基和負(fù)結(jié)合殘基的結(jié)構(gòu)內(nèi)有差別。黑素瘤起源于黑素細(xì)胞(產(chǎn)生黑素的細(xì)胞)的癌癥形式。黑素細(xì)胞主要在皮膚被發(fā)現(xiàn)，但還存在于腸和眼睛。皮膚中的黑素瘤包括淺表擴(kuò)散性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、肢端黑素瘤和惡性雀斑樣痣(黑素瘤)。如上所述的任何類型可以產(chǎn)生黑素或可以是無黑色素的。類似地，任何亞型可以顯示粘連形成(向神經(jīng)性的稠密纖維反應(yīng))，所述粘連形成是攻擊行為且具有局部復(fù)發(fā)趨勢的標(biāo)示物。其他黑素瘤包括明細(xì)胞肉瘤、粘膜黑素瘤和葡萄膜黑素瘤。影響預(yù)后的特征是以毫米為單位的腫瘤厚度(Breslow深度)、皮膚結(jié)構(gòu)相關(guān)的深度(Clark水平)、黑素瘤類型、潰瘍存在度、淋巴/神經(jīng)浸潤存在度、腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞存在度(如果存在，預(yù)后更好)、病灶位鉻、衛(wèi)星病灶存在度以及局部或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移存在度。當(dāng)黑素瘤已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)，最重要的因素之一是有惡性腫瘤的結(jié)的數(shù)量。一個(gè)結(jié)內(nèi)的惡性腫瘤的程度也是重要的；微小轉(zhuǎn)移中惡性腫瘤僅是微觀的，其具有比大轉(zhuǎn)移更有利的預(yù)后。當(dāng)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移時(shí)，5年存活率低于10% ;生存中值是6-12個(gè)月。到皮膚和肺的轉(zhuǎn)移有更好的預(yù)后。到腦、骨和肝的轉(zhuǎn)移與更壞的預(yù)后相關(guān)。黑素瘤可分為如下階段階段0 :原位黑素瘤(Clark水平I)，100%存活階段I/I1:侵襲性黑素瘤，85-95%存活Tla :原發(fā)瘤小于1. OOmm,無潰瘍，Clark水平I1-1IITlb :原發(fā)瘤小于1. 00mm，有潰瘍或Clark水平IN-NT2a :原發(fā)瘤1. 00-2. OOmm,無潰瘍階段I1:高風(fēng)險(xiǎn)黑素瘤，40-85%存活T2b :原發(fā)瘤1. 00-2. 00mm，有潰瘍T3a :原發(fā)瘤 2. 00-4. OOmm,無潰瘍T3b :原發(fā)瘤 2. 00-4. OOmm,有潰瘍T4a :原發(fā)瘤4. OOmm或更大,無潰瘍T4b :原發(fā)瘤4. OOmm或更大,有潰瘍階段II1:局部轉(zhuǎn)移，25-60%存活N1:單個(gè)陽性淋巴結(jié)N2 :2-3個(gè)陽性淋巴結(jié)或局部皮膚/中途轉(zhuǎn)移N3 4個(gè)陽性淋巴結(jié)或淋巴結(jié)和局部皮膚/中途轉(zhuǎn)移階段IV:遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，9-15%存活Mla :遠(yuǎn)端皮膚轉(zhuǎn)移，正常乳酸脫氫酶(LDH) Mlb :肺轉(zhuǎn)移，正常LDHMlc :其他遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或任何有升高的LDH的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移單克隆抗體由B淋巴細(xì)胞的單克隆、其中轉(zhuǎn)染有單個(gè)抗體輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞或通過抗體文庫中具體的噬菌體產(chǎn)生的抗體，使得所述單克隆抗體包括確定組的CDR并特異性結(jié)合目標(biāo)靶抗原。單克隆抗體通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如(但不限于)通過從骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合制造雜交的抗體形成細(xì)胞或從抗體序列的噬菌體展示文庫選擇。單克隆抗體包括人源化和完全人源性單克隆抗體。本文中，單克隆抗體的功能片段包括特異性結(jié)合所述單克隆抗體的靶蛋白(抗原結(jié)合)的抗體片段，例如但不限于scFv、Fv、dsRv或Fab。單克隆抗體特異性結(jié)合抗原表位,例如糖基化表位。單克隆抗體包括雙功能抗體，其中一組或多組⑶R特異性結(jié)合靶抗原例如內(nèi)質(zhì)蛋白和效應(yīng)子功能增強(qiáng)的Fe和其他乙二醇修飾的抗體。瘤形成、惡性腫瘤、癌癥或腫瘤細(xì)胞異常及不受控制地生長的結(jié)果。瘤形成、惡性腫瘤、癌癥或腫瘤經(jīng)?？苫Q地使用。個(gè)體中腫瘤的量為“腫瘤負(fù)荷”，其可以按照所述腫瘤的數(shù)量、體積或重量來測量。不會轉(zhuǎn)移的腫瘤稱為“良性”。侵襲周圍組織和/或可以轉(zhuǎn)移的腫瘤稱為“惡性”。血液腫瘤的實(shí)例包括白血病，其包括急性白血病(例如llq23陽性急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病和成髓細(xì)胞的、前髓細(xì)胞性、骨髓單核細(xì)胞性、單核細(xì)胞的白血病和紅白血病)、慢性白血病(例如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金淋巴瘤(無痛和高級別形式)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、重鏈病、骨髓增生異常綜合征、多毛細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良。實(shí)體瘤例如肉瘤和癌的實(shí)例包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳癌(包括基底型乳癌、導(dǎo)管癌和小葉乳癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸瘤、精原細(xì)胞瘤、膀胱癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、頡神經(jīng)膠質(zhì)瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(menangioma)、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。在幾個(gè)實(shí)例中，腫瘤是黑素瘤、乳癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或鱗狀細(xì)胞癌，例如頭頸 癌。核酸由核苷酸單元(核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體及其合成的非天然存在的類似物)通過磷酸二酯鍵組成的聚合物、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變體及其合成的非天然存在的類似物。因此，該術(shù)語包括核苷酸聚合物，其中所述核苷酸及它們之間的鍵包括非天然存在的合成類似物，例如，舉例但非限制地，磷硫酰、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。這樣的多核苷酸可以被合成，例如使用自動DNA合成儀。術(shù)語“寡核苷酸”一般是指短的多核苷酸，通常不大于約50個(gè)核苷酸。應(yīng)該理解，當(dāng)核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示時(shí)，這也包括其中〃U〃代替T的RNA序列(即A、U、G、C)。本文使用常規(guī)的符號描述核苷酸序列單鏈核苷酸序列的左手末端為5’末端；雙鏈核苷酸序列的左手方向稱為5’方向。向初生RNA轉(zhuǎn)錄本添加核苷酸的5’到3’方向稱為轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈稱為“編碼鏈”;所述DNA鏈上與從該DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA具有相同序列的、位于所述RNA轉(zhuǎn)錄本5’末端的5’外側(cè)的序列稱為“上游序列”；所述DNA鏈上與所述RNA具有相同序列的、在所述編碼RNA轉(zhuǎn)錄本3’末端的3’外側(cè)的序列稱為“下游序列”?！癱DNA”是指與mRNA互補(bǔ)或相同的單鏈或雙鏈形式的DNA是?！熬幋a”是指多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中核苷酸具體序列在生物過程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有性質(zhì)，所述其他聚合物和大分子有確定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或確定的氨基酸序列及由此產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)。因此，如果由基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生了蛋白，那么所述基因編碼所述蛋白?；蚧騝DNA的編碼鏈一其核苷酸序列與mRNA序列相同并通常在序列表中提供——和用作轉(zhuǎn)錄模板的非編碼鏈都可以被稱為編碼所述基因或cDNA的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物。除非另有指定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為簡并版本且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列和RNA可以包括內(nèi)含子?！爸亟M核酸”是指具有沒有天然連接在一起的核苷酸序列的核酸。這包括核酸載體，其含有可用于轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞的擴(kuò)增或裝配的核酸。包括所述重組核酸的宿主細(xì)胞被稱為“重組宿主細(xì)胞”。然后所述基因在所述重組宿主細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生例如“重組多肽”。重組核酸也可以用作非編碼功能(例如啟動子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。如果序列為第一序列的多核苷酸特異性地與序列為第二序列的多核苷酸雜交，那么所述第一序列相對應(yīng)第二序列為“反義的”。用于描述兩個(gè)或更多核苷酸序列或氨基酸序列之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“參考序列”、“選自”、“比較窗□”、“相同”、“序列同一性百分?jǐn)?shù)”、“基本相同”、“互補(bǔ)”和“基本互補(bǔ)”。對于核酸序列的序列比較，一般一個(gè)序列作為參考序列，測試序列與之相比。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，如果必要可指定子序列坐標(biāo)并指定序列算法程序參數(shù)。使用默認(rèn)程序參數(shù)。用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域是已知的?？梢赃M(jìn)行最佳的用于比較的序列比對，例如通過Smith & Waterman, Adv. App1.Math. 2:482, 1981 的局部同源算法，通過 Needleman & ffunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970白勺同源性比對算法，通過 Pearson&Lipman, Proc. Nat，1. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988 的搜索相似性方法，通過這些算法(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA, Genetics Co mputer Group, 575Science Dr.，Madison, WI)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行，或通過人工比對和目視檢查(參見例如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal.,edsl995supplement) X可用算法的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP 使用 Feng&Doolittle, J. Mol.Evo1. 35:351-360, 1987的漸進(jìn)比對方法的簡化方法。所使用的方法與Higgins&Sharp，CABI0S5:151-153, 1989描述的方法相似。使用PILEUP，將參考序列與其他測試序列比較以測定序列同一性關(guān)系的百分?jǐn)?shù)，使用如下參數(shù)默認(rèn)空隙加權(quán)(3. 00)、默認(rèn)空隙長度加權(quán)(0.10)和加權(quán)的末端空隙。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包獲得，例如7.0版本(Devereaux et al. , Nuc. Acids Res. 12:387-395，1984)。另一個(gè)適合于測定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性的算法實(shí)例為BLAST和BLAST2. 0 算法，其描述見于 Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 和 Altschulet al. ,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1977。公眾可以通過美國國立生物技術(shù)信息中心得到執(zhí)行BLAST分析的軟件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認(rèn)字符長度(W)為11，比對(B)為50，期望(E)為10，M=5, N=-4，并且兩條鏈都比較。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用的默認(rèn)字符長度(W)為3，期望(E)為 10，并使用 BL0SUM62 記分矩陣(參見 see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sc1.USA89:10915, 1989)。
寡核苷酸長度最高約100個(gè)核苷酸堿基的線性多核苷酸序列。開放讀碼框(ORF):不含任何終止密碼子的編碼氨基酸的一系列核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。這些序列通常被翻譯為肽?？刹僮鞯剡B接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列以有功能關(guān)系的方式放鉻時(shí)，所述第一核酸序列與第二核酸序列是可操作地連接的。例如，如果啟動子例如異源性啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，那么所述啟動子與所述編碼序列是可操作地連接的。當(dāng)需要將兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域連接時(shí)，所述可操作地連接的DNA序列通常是連續(xù)的并且位于相同的讀碼框中。藥劑當(dāng)正確地給予受試者或細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)需要的治療或預(yù)防效果的化學(xué)化合物或組合物?？伤幱幂d體可用的可 藥用載體是常規(guī)的。Remington’ sPharmaceuticalSciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 15th Edition, 1975 中描述了適合藥學(xué)遞送本文公開的融合蛋白的的組合物和制劑。通常，所述載體的性質(zhì)依賴于所采用的具體的給予模式。例如，腸胃外給予的制劑通常包括可注射液體，其包括藥學(xué)和生理學(xué)可接受的液體例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作為賦形劑。對于固體組合物(例如粉劑、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規(guī)的無毒固體載體可以包括例如藥用級甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除生物中性載體夕卜，要給予的藥物組合物可以含有最小量的無毒輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩沖試劑等，例如乙酸鈉或去水山梨糖醇單月桂酸酯。多核苷酸術(shù)語多核苷酸或核酸序列是指至少10個(gè)堿基長度的聚合形式的核苷酸。重組多核苷酸包括沒有與在其來源的生物體天然存在的基因組中與其直接連續(xù)的兩個(gè)編碼序列(一個(gè)在其5’末端，一個(gè)在其3’末端)直接連續(xù)的多核苷酸。因此該術(shù)語包括例如插入到載體、插入到自主復(fù)制質(zhì)粒或病毒、或插入到原核生物或真核生物基因組DNA中的重組DNA，或作為獨(dú)立于其他序列的單獨(dú)分子(例如cDNA)存在的重組DNA。所述核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或兩種核苷酸的修飾形式。該術(shù)語包括單鏈形式和雙鏈形式的DNA。多肽不管其長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)的任何氨基酸鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是內(nèi)質(zhì)蛋白多肽。“殘基”是指通過酰胺鍵或類酰胺鍵插入多肽中的氨基酸或氨基酸類似物。多肽具有氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)。預(yù)防、治療或改善疾病“預(yù)防”疾病是指抑制疾病的全面發(fā)展?！爸委煛笔侵冈诩膊』虿±頎顩r開始發(fā)展后改善其征象或癥狀的治療性介入，例如腫瘤負(fù)荷減少或轉(zhuǎn)移的數(shù)量尺寸的降低?！案纳啤笔侵讣膊±绨┌Y的征象或癥狀的數(shù)量或嚴(yán)重度的減少。探針和引物探針包括附著到可檢測標(biāo)記或報(bào)告分子上的分離的核酸。引物是短的核酸，優(yōu)選DNA寡核苷酸，長度為15個(gè)核苷酸或更多。引物可以通過核酸雜交退火結(jié)合到互補(bǔ)的靶DNA鏈以形成所述引物與所述靶DNA鏈之間的雜合，然后通過DNA聚合酶沿所述靶DNA鏈延伸。引物對可用于核酸序列的擴(kuò)增，例如通過本領(lǐng)域已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他核酸擴(kuò)增方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解具體探針或引物的特異性隨其長度而增加。因此，例如，包括20個(gè)連續(xù)核苷酸的引物將比只有15個(gè)核苷酸的對應(yīng)引物以更高的特異性退火結(jié)合到靶上。因此，為了獲得更高的特異性，可以選擇包括20、25、30、35、40、50或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的探針和引物。啟動子啟動子是指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列的陣列。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必要核酸序列，例如聚合酶II型啟動子中的TATA元件。啟動子還可任選地包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制元件，其位鉻離所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可以多達(dá)幾千堿基對。組成型和可誘導(dǎo)的啟動子都包括在內(nèi)(參見例如Bitter et al. , Methods inEnzymologyl53:516-544, 1987)?？梢允褂玫膯幼拥木唧w非限制性實(shí)例包括源自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列；腺病毒后期啟動子；牛痘病毒7. 5K啟動子)。還可以使用由重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子?？蓪⒍嗪塑账岵迦氲胶袉幼有蛄械谋磉_(dá)載體，其中所述啟動子序列可幫助所述宿主中插入的遺傳序列有效地表達(dá)。所述表達(dá)載體一般含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、以及允許對所轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表型選擇的具體核酸序列。純化術(shù)語純化不需要絕對的純；而是意圖作為相對的術(shù)語。因此，例如，純化的核酸是比其在細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境中更濃縮的核酸。類似地，純化的肽制劑是比其在細(xì)胞內(nèi)天然環(huán)境中更濃縮的肽或蛋白質(zhì)?；炯兓硎緩钠渌鞍踪|(zhì)或細(xì)胞組分純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，純化(或分離)制劑使得所述蛋白質(zhì)或肽占所述制劑中總的肽或蛋白質(zhì)含量的至少50% (例如但不限于70%、80%、90%、95%、98%或99%)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知方法純化(和/或合成)本文所公開的內(nèi)質(zhì)蛋白多肽(參見例如Guide to Protein Purification, ed.Deutscher，Meth. Enzymol. 185，Academic Press,San Diego,1990;and Scopes,ProteinPurification!Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982)。重組重組核酸是具有非天然存在的序列或者具有通過人工組合兩種本來分離的序列片段而制造的序列的核酸。這種人工組合經(jīng)常是通過化學(xué)合成，或更通常地通過核酸分離片段的人工操作例如通過基因工程技術(shù)來完成。重組毒素其中 細(xì)胞靶向部分融合到毒素上的嵌合蛋白質(zhì)(Pastan etal.，Science, 254:1173-1177，1991)。如果所述細(xì)胞靶向部分是抗體的Fv部分，那么所述分子被稱為重組免疫毒素(Chaudhary et al. , Nature, 339:394-397，1989)。所述毒素部分被遺傳改造以使其不能結(jié)合存在于大多數(shù)正常細(xì)胞上的毒素受體。重組免疫毒素選擇性殺死被所述抗原結(jié)合域識別的細(xì)胞。這些重組毒素和免疫毒素可以用于治療癌癥例如其中內(nèi)質(zhì)蛋白被表達(dá)的癌癥。選擇性雜交在排除無關(guān)核苷酸序列的中度或高度嚴(yán)格條件下的雜交。在核酸雜交反應(yīng)中，達(dá)到特定水平的嚴(yán)格性所使用的條件依賴于要雜交的核酸的性質(zhì)而不同。例如，在選擇雜交條件時(shí)可以考慮所述核酸雜交區(qū)域的長度、互補(bǔ)程度、核苷酸序列組成(例如GC含量比AT含量)和核苷酸類型(例如RNA對DNA)。另外要考慮所述核酸之一是否是固定化的，例如固定化到濾器上。漸進(jìn)升高嚴(yán)格性的條件的具體非限制性實(shí)例如下在約室溫下2XSSC/0. 1%SDS(雜交條件);在約室溫下0. 2XSSC/0. 1%SDS (低嚴(yán)格性條件);在約42°C 0. 2x SSC/0. 1%SDS(中度嚴(yán)格性條件)；在約68°C 0.1x SSC (高嚴(yán)格性條件)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定這些條件的變化(例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded.，vol. 1-3, ed. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989)。洗滌可以使用這些條件中僅僅一個(gè)(例如高嚴(yán)格性條件)或可以使用所述條件的每個(gè)(例如以如上列出的順序每個(gè)10-15分鐘)，可重復(fù)所列出的任何步驟或全部。但是，如上所提到的，最佳條件會依據(jù)具體涉及的雜交反應(yīng)而不同，并可以憑經(jīng)驗(yàn)確定。序列同一性氨基酸序列之間的相似性可表述為序列之間的相似性，或者可表述為序列同一性。常常以同一性(或相似性或同源性)百分?jǐn)?shù)的形式測量序列同一性；百分?jǐn)?shù)越高，兩個(gè)序列越相似。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法比對時(shí)，內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的同系物或變體會擁有相對高程度的序列同一性。用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域是已知的。多種程序和比對算法描述于Smith and Waterman, Adv. App1.Math.2:482, 1981;Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol. 48:443, 1970;Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988;Higginsand Sharp, Gene73:237，1988;Higgins and Sharp, CABI0S5:151,1989;Corpet etal. , Nucleic Acids Researchl6:10881, 1988;以及 Pearson and Lipman, Proc. Natl.Acad. Sc1. USA85:2444, 1988. Altschul et al. , Nature Genet. 6:119，1994 中提供了序列比對方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)思路。所述NCBI 基礎(chǔ)局部比對搜索工具(BLAST) (Altschul et al.，J. Mol.Biol. 215:403, 19 90)可以從幾個(gè)來源得到，包括美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, Bethesda, MD)和因特網(wǎng)，用于鏈接序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。如何使用所述程序確定序列同一性的描述可以從因特網(wǎng)上的NCBI網(wǎng)站得到。通過全長比對計(jì)算(使用NCBI Blast2. O、空隙blastp設(shè)定為默認(rèn)參數(shù))，內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的同系物和變體一般具有與內(nèi)質(zhì)蛋白氨基酸序列至少75%例如至少80%的序列同一性。對于大于約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列比較，兩個(gè)序列Blast功能的采用默認(rèn)的BL0SUM62矩陣并使用默認(rèn)參數(shù)(空隙存在值為11，每個(gè)殘基空隙值為I)完成。當(dāng)比對短肽時(shí)(少于約30個(gè)氨基酸)，所述比對應(yīng)使用兩個(gè)序列Blast功能采用PAM30矩陣并使用默認(rèn)參數(shù)(開放空隙9，延伸空隙I罰分)完成。當(dāng)通過這種方法評估時(shí)，與所述參考序列有甚至更大相似性的蛋白質(zhì)會顯示增加的同一性百分?jǐn)?shù)，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。當(dāng)不完整的序列用于序列同一性比較時(shí)，同系物和變體中10-20個(gè)氨基酸的短窗口一般具有與所述參考序列至少80%的序列同一丨丨生,并且可具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。測定這種短窗口中序列同一性的方法可以在因特網(wǎng)上NCBI網(wǎng)站獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些序列同一性范圍僅為指導(dǎo)的目的而提供；獲得具有落在所提供范圍外的非常高的序列同一性的同系物是完全可能的。特異性結(jié)合試劑基本僅結(jié)合到所確定的靶點(diǎn)的試劑。因此內(nèi)質(zhì)蛋白特異性結(jié)合試劑是基本僅結(jié)合到內(nèi)質(zhì)蛋白多肽的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述特異性結(jié)合試劑是特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的單克隆或多克隆抗體。鱗狀細(xì)胞癌起源于形成皮膚、眼睛、多種內(nèi)臟器官和中空器官的內(nèi)層以及某些腺體導(dǎo)管的表面的鱗狀細(xì)胞、薄扁平細(xì)胞的一類癌癥。鱗狀細(xì)胞癌還指表皮樣癌。一類鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌包括鼻腔、竇、唇、口、唾液腺、咽和喉的癌癥。HNSCC可分為如下階段階段0 :沒有腫瘤存在的證據(jù)。
階段1:腫瘤最大尺寸小于2cm或更少；沒有局部淋巴結(jié)牽連或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的證據(jù)。階段I1:腫瘤大于2cm，但不大于4cm ;沒有局部淋巴結(jié)牽連或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的證據(jù)。階段II1:腫瘤大于4cm ;在某些情況中，腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)；沒有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的證據(jù)。階段IV :腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)；在某些情況中，存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。受試者活的多細(xì)胞有脊椎生物體，一個(gè)包括人和獸醫(yī)的受試者的類別，其包括人和非人哺乳動物。T細(xì)胞對免疫反應(yīng)關(guān)鍵的白細(xì)胞。T細(xì)胞包括但不限于⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞是在其表面攜帶稱為“分化簇4” (CD4)標(biāo)示物的免疫細(xì)胞。這些細(xì)胞常稱為“輔助”T細(xì)胞，其幫助協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)包括抗體反應(yīng)以及殺傷性T細(xì)胞反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞攜帶“分化簇8”(CD8)標(biāo)示物。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD8T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CD8細(xì)胞是抑制性T細(xì)胞。治療有效量在治療的受試者中足以達(dá)到需要效果的具體物質(zhì)的量。例如，這可以是抑制或遏制腫瘤生長所必需的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量是清除腫瘤或降低轉(zhuǎn)移的數(shù)量或尺寸必需的量。當(dāng)給予受試者時(shí)，通常使用會達(dá)到靶組織(例如在腫瘤中)濃度的劑量，其中所述靶組織濃度已被證實(shí)可達(dá)到需要的體外效果。毒素對細(xì)胞呈細(xì)胞毒性的分子。毒素包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin, PE)、白喉毒素(DT)、肉毒桿菌毒素、阜草素、局限曲菌素或白樹毒素，或其修飾的毒素。例如，PE和DT是高毒化合物,一般通過肝臟毒性引起死亡。但是，通過移除所述PE和DT毒素的 天然靶向組分(例如PE的域Ia或DT的B鏈)并將其用不同的靶向部分例如抗體代替，所述PE和DT可以被修飾為可用作免疫毒素的形式。轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是已經(jīng)通過分子生物學(xué)技術(shù)引入核酸分子的細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語轉(zhuǎn)導(dǎo)包括可以將核酸分子引入所述細(xì)胞的所有技術(shù)，包括用病毒載體轉(zhuǎn)染，用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，以及通過電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子槍加速進(jìn)行的裸露DNA的引入。載體被引入到宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的核酸分子。載體可以包括允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包括本領(lǐng)域已知的一種或多種選擇標(biāo)示物基因以及其他遺傳元件。除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。除非上下文另有明確的指示，單數(shù)形式的術(shù)語“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)的指示對象。類似地，除非上下文另有明確指示，單詞“或者”意圖包括“和”。還應(yīng)該理解，為核酸或多肽給出的所有堿基尺寸或氨基酸尺寸以及所有分子重量或分子質(zhì)量值是近似值，被提供用以描述。雖然與本文描述的方法和材料相似或等價(jià)的方法和材料可以用于本公開內(nèi)容的實(shí)施或測試，適合的方法和材料如下所述。術(shù)語“包括(comprise) ”意為“包含(include) ”。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他文獻(xiàn)，其全文以引用的方式納入本文。如果有沖突，那么以本說明書(包括術(shù)語解釋)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)例僅是說明性的，并非意圖進(jìn)行限制。II1.特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的人單克隆抗體已經(jīng)生產(chǎn)了特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白(Grp94)的抗體，包括單克隆抗體例如完全人源性單克隆抗體。這些抗體和/或其抗原結(jié)合片段可以用于分離內(nèi)質(zhì)蛋白，并可用于檢測和/或治療表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白的腫瘤，例如但不限于黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌或胰腺癌。這些抗體可以與可檢測標(biāo)記或效應(yīng)分子綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體特異性結(jié)合糖基化內(nèi)質(zhì)蛋白。因此，在該實(shí)施方案中，所述抗體沒有特異性結(jié)合非糖基化內(nèi)質(zhì)蛋白或無關(guān)抗原。本文公開了特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的人單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)例中，人內(nèi)質(zhì)蛋白具有如下所述的氨基酸序列MRALWVLGLCCVLLTFGSVRADDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQREEEAIQLDGLNASQIRELREKSEKFAFQAEVNRMMKLIINSLYKNKEIFLRELISNASDALDKIRLISLTDEMALSGNEELTVKIKCDKEKMLLHVTDTGVGMTREELVKNLGTIAKSGTSEFLNKMTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYSAFLVADKVIVTSKHNNDTQHIWESDSNEFSVIADPRGNTLGRGTTITLVLKEEASDYLELDTIKNLVKKYSQFINFPIYVWSSKTETVEEPMEEEEAAKEEKEESDDEAAVEEEEEEKKPKTKKVEKTVWDWELMNDIKPIWQRPSKEVEEDEYKAFYKSFSKESDDPMAYIHFTAEGEVTFKSILFVPTSAPRGLFDEYGSKKSDYIKLYVRRVFITDDFHDMMPKYLNFVKGVVDSDDLPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKYNDTFWKEFGTNIKLGVIEDHSNRTRLAKLLRFQSSHHPTDITSLDQYVERMKEKQDKIYFMAGSSRKEAESSPFVERLLKKGYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKRFQNVAKEGVKFDESEKTKESREAVEKEFEPLLNWMKDKALKDKIEKAVVSQRLTESPCALVASQYGWSGNMERIMKAQAYQTGKDISTNYYASQKKTFEINPRHPLIRDMLWRIKEDEDDKTVLDLAVVLFETATLRSGYLLPDTKAYGDRIERMLRLSLNIDPDAKVEEEPEEEPEETAEDTTEDTEQDEDEEMDVGTDEEEETAKESTAEKDELSEQ ID N0:5,還見于2010年6月16日可以獲得的GENBANK 登錄號No. NM_003299，其在此以引用的方式納入本文。在另一個(gè)實(shí)例中，所述內(nèi)質(zhì)蛋白被如下核酸序列編碼gtgggcggac cgcgcggctg gaggtgtgag gatccgaacc caggggtggggggtggaggcggctcctgcg atcgaagggg acttgagact caccggccgc acgccatgagggccctgtgggtgctggg cc tctgctgcgt cctgetgacc ttcgggtcgg tcagagctgacgatgaagttgatgtggatg gtacagtaga agaggatctg ggtaaaagta gagaaggatcaaggacggatgatgaagtag tacagagaga ggaagaagct attcagttgg atggattaaatgcatcacaaataagagaac ttagagagaa gtcggaaaag tttgccttcc aagccgaagttaacagaatgatgaaactta tcatcaattc attgtataaa aataaagaga ttttcctgagagaactgatttcaaatgctt ctgatgcttt agataagata aggctaatat cactgactgatgaaaatgctctttctggaa atgaggaact aacagtcaaa attaagtgtg ataaggagaagaacctgctgcatgtcacag acaccggtgt aggaatgacc agagaagagt tggttaaaaaccttggtaccatagccaaat ctgggacaag cgagttttta aacaaaatga ctgaagcacaggaagatggccagtcaactt ctgaattgat tggccagttt ggtgtcggtt tctattccgccttccttgtagcagataagg ttattgtcac ttcaaaacac aacaacgata cccagcacatctgggagtctgactccaatg aattttctgt aattgctgac ccaagaggaa acactctaggacggggaacgacaattaccc ttgtcttaaa agaagaagca tctgattacc ttgaattggatacaattaaaaatctcgtca aaaaatattc acagttcata aactttccta tttatgtatggagcagcaagactgaaactg ttgaggagcc catggaggaa gaagaagcag ccaaagaagagaaagaagaatctgatgatg aagctgcagt agaggaagaa gaagaagaaa agaaaccaaagactaaaaaagttgaaaaaa ctgtctggga ctgggaactt atgaatgata tcaaaccaat
權(quán)利要求
1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包括SEQ ID NO:1的氨基酸 26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸 51-58 (CDR2)、SEQ ID NO:1 的氨基酸97-103 (CDR3)，或其兩者或三者的組合，并且其中所述抗體特異性結(jié)合人內(nèi)質(zhì)蛋白。
2.權(quán)利要求1所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包括SEQIDNO: 2 的氨基酸 27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸89-97 (⑶R3)，或其兩者或三者的組合。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體的重鏈可變域包括SEQ ID NO:1 的氨基酸26-33 (CDRl)、SEQ ID NO:1 的氨基酸51-58 (CDR2)、SEQID NO:1的氨基酸97-103 (CDR3)，并且所述抗體的輕鏈可變域包括SEQ ID NO:2的氨基酸27-32 (CDRl)、SEQ ID NO: 2 的氨基酸 50-52 (CDR2)和 SEQ ID NO: 2 的氨基酸 89-97 (CDR3)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體的重鏈包括 SEQ ID NO:1。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體的輕鏈包括 SEQ ID NO:2。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體的重鏈包括SEQ ID NO:1，并且所述抗體的輕鏈包括SEQ ID NO:2。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白(scFv)或二硫化物穩(wěn)定的Fv蛋白(dsFv)。
8.權(quán)利要求7所述分離的人單克隆抗體抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是scFv。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是IgG0
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體是經(jīng)標(biāo)記的。
11.權(quán)利要求10所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記物、酶標(biāo)記物或放射性標(biāo)記物。
12.—種組合物，包括權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述分離的抗體或抗原結(jié)合片段和可藥用載體。
13.一種分離的免疫綴合物，包括連接到效應(yīng)分子的權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。
14.權(quán)利要求13所述分離的免疫綴合物，其中所述效應(yīng)分子是假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)或者其變體或片段。
15.一種組合物，其包括權(quán)利要求14所述分離的免疫綴合物和可藥用載體。
16.一種治療被診斷為患有表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白的癌癥的受試者的方法，包括 給予所述受試者治療有效量的權(quán)利要求12或15的組合物， 從而治療所述受試者中所述表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白的癌癥。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中所述癌癥為黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、膀胱癌或胰臟腺癌。
18.權(quán)利要求17所述方法，其中治療所述受試者包括減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量或尺寸。
19.一種檢測受試者中癌癥或確認(rèn)所述癌癥的診斷的方法，包括 將來自所述受試者的樣品與權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段接觸；并且 檢測所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段與所述樣品的結(jié)合， 其中與所述分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與對照樣品的結(jié)合相比，所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段與所述樣品的結(jié)合增加，則檢測到所述受試者中癌癥或確認(rèn)了所述受試者中癌癥的診斷。
20.權(quán)利要求19所述方法，其中所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段是直接經(jīng)標(biāo)記的。
21.權(quán)利要求19或20所述方法,還包括 將特異性結(jié)合所述分離的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段的第二抗體與所述樣品接觸， 檢測所述第二抗體的結(jié)合， 其中與所述第二抗體與對照樣品的結(jié)合相比，所述第二抗體與所述樣品的結(jié)合增加，則檢測到所述受試者中癌癥或確認(rèn)了所述受試者中癌癥的診斷。
22.權(quán)利要求19-21任一項(xiàng)所述方法，其中所述癌癥為黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。
23.權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)所述方法，其中所述對照樣品是來自未患癌癥的受試者的樣品。
24.權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)所述方法，其中所述樣品為血液樣品、尿樣品、活檢樣品、血清樣品、痰樣品、血漿樣品或腦脊髓液樣品。
25.權(quán)利要求19-24任一項(xiàng)所述方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
26.一種分離的或重組的核酸分子，編碼權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。
27.權(quán)利要求26所述分離的或重組的核酸分子，其中所述人單克隆抗體的Vh域包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其簡并變體。
28.權(quán)利要求26或27所述分離的或重組的核酸分子，其中所述人單克隆抗體的\域包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列或其簡并變體。
29.權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)所述分離的或重組的核酸分子，其可操作地連接到異源啟動子。
30.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述分離的或重組的核酸分子。
31.一種分離的宿主細(xì)胞，其是用權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)所述核酸分子或權(quán)利要求30所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的。
32.權(quán)利要求16所述方法，還包括給予所述受試者治療有效量的化學(xué)治療劑。
33.權(quán)利要求32所述方法，其中所述化學(xué)治療劑為5-氟尿嘧啶、環(huán)巴胺、放射物或其組入口 o
34.權(quán)利要求13所述免疫綴合物，其中所述效應(yīng)分子為細(xì)胞因子、趨化因子、化學(xué)治療劑或放射性核苷酸。
35.權(quán)利要求34所述免疫綴合物，其中所述效應(yīng)分子為細(xì)胞因子或趨化因子。
全文摘要
本文公開了特異性結(jié)合內(nèi)質(zhì)蛋白的分離的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，這些抗體是完全人源性的。本文還公開了編碼這些抗體的重組核酸、包括這些核酸的表達(dá)載體和用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞。在幾個(gè)實(shí)施方案中，所公開的抗體可用于檢測和/或治療表達(dá)內(nèi)質(zhì)蛋白的腫瘤，例如黑素瘤、乳癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、卵巢癌或胰腺癌。在一個(gè)實(shí)例中，所述腫瘤是黑素瘤。
文檔編號A61K39/395GK103068851SQ201180039600
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月16日
發(fā)明者S·費(fèi)龍, X·王, T·P·康拉茨, E·菲沃伊諾, B·胡德 申請人:高等教育聯(lián)邦系統(tǒng)-匹茲堡大學(xué)