專利名稱：一種限制急性心肌缺血后微血管損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定與心臟微血管功能相關(guān)的配體-受體系統(tǒng)，以及通過操控該系統(tǒng)預(yù)防或限制急性心肌缺血后微血管的功能異?；驌p傷，從而促進(jìn)心肌的恢復(fù)。
背景技術(shù)：
對急性心肌缺血的治療主要集中于限制缺血持續(xù)時間和使用血管成形術(shù)或血栓溶解以建立再灌注。然而，即使使大血管再通，還是有很大一部分患者表現(xiàn)出梗死組織的微血管損傷，其導(dǎo)致組織纖維化、心臟收縮力受損、并且最終導(dǎo)致死亡率升高(Eltzschig etal.，Brit.Med.Bulletin, 70:71-86 (2004))。到目前為止，在心臟缺血后介導(dǎo)微血管障礙或凋亡的特定促炎性細(xì)胞因子還是未知的，對這些局部產(chǎn)生的因子進(jìn)行鑒定將為限制微血管障礙，以及促進(jìn)再灌注后的心肌恢復(fù)提供重要的潛在治療靶點(diǎn)。在嚙齒動物心臟缺血再灌注后迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)生長因子(NGF)的mRNA(Hiltunen et al., Journal of Pathology, 194(2):247-253(2001);Hasan et al., BrainResearch, 1124 (I): 142-154 (2006))。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的原型成員NGF還包括衍生自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (NT-3)，其與受體酪氨酸激酶TrkA結(jié)合，以介導(dǎo)細(xì)胞存活和分化(Reichardt, Philos Trans R Soc Lond B Biol Science, 361(1473):1545-1564(2006))。神經(jīng)營養(yǎng)因子最初作為前體或神經(jīng)生長因子前體而被合成，其可以被蛋白水解裂解以釋放C-末端結(jié)構(gòu)域，或成熟的神經(jīng)生長因子。最近的研究顯示，proNGF并不是無活性前體，而是不同于其成熟形式的用于介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡的信號配體(Lee, Science, 294:1945-48 (2001),以及 Hempstead 的綜述，NeurotoxicityResearch, 16:255-60(2009) )。ProNGF的促凋亡作用要求表達(dá)編碼細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域的特定受體 P75NTR 和共受體分揀蛋白(Nykjaer et al., Nature, 427 (6977):843-848(2004) ; Jansen et al., Nat Neuroscience, 10(11):1449-1457(2007))。在心血管系統(tǒng)中，已建立相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NT-3在促進(jìn)血管完整性和調(diào)節(jié)心臟隔膜方面的功能(Donovan et al., Nat Genet, 14 (2): 210-213 (1996) ; Donovan etal., American Journal of Pathology, 147 (2): 09-324 (1995);以及Caporali et al.的綜述，Physiol Review, 89(1): 279-308 (2009))。但是，尚未很好地鑒定出心臟NGF的作用。NGF由心肌細(xì)胞和心臟血管平滑肌細(xì)胞合成,其促進(jìn)交感神經(jīng)的支配作用(Glenbova andGinty, J.Neurosci24:7 43 (2004))。此外，衍生自肌細(xì)胞的NGF能夠部分地通過改變神經(jīng)元的放電性質(zhì)(Luther et al., Journal of Neurophysiology, 96 (2): 946-958 (2006))而敏銳地調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元和心臟肌細(xì)胞之間的突觸傳遞(Lockhart et al., Journal of Neuroscience, 17(24): 9573-9582 (1997))。確實(shí)，NGF缺陷型(NGF+)小鼠在圍產(chǎn)期的死亡是由于假定的神經(jīng)分布缺陷造成的，而非明顯的心血管系統(tǒng)畸形(見Caporali et al.的綜述，Physiol Review, 89(I):279-308(2009))。在大多數(shù)成年組織中，ProNGF和p75NTR的表達(dá)量低至不可檢測水平，但在急性損傷和凋亡啟動后被迅速誘導(dǎo)，其在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的研究最好(見Hempstead 的綜述，Neurotox Research, 16(3): 255-260 (2009))。盡管還沒有研究對心臟缺血后proNGF的水平進(jìn)行評估，但是在心臟缺血/再灌注后數(shù)小時內(nèi)，NGF mRNA的水平升高，且升高的蛋白水平在回落至基線值前維持?jǐn)?shù)天(Hiltunen et al.，Journalof Pathology, 194(2):247-253 (2001))。此外，急性主動脈損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中p75NTR的局部表達(dá)增加(Donovan et al., American Journal ofPathology, 147(2):09-324 (1995))，并且p75NTR活化促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡(Wanget al., Am J Pathologyl57:1247-58，2000)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(Kim et al., Journal ofBiological Chemistry, 279(32): 33538-33546 (2004) )。p75NTR 缺陷型導(dǎo)致頸主動脈損傷后的血管平滑肌細(xì)胞凋亡減少，提示局部產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子在調(diào)控該血管應(yīng)答方面具有一定作用(Kraemer，Circ Res, 91 (6):494-500(2002))。到目前為止，還沒有研究對脈管系統(tǒng)中的分揀蛋白，或分揀蛋白家族的其他成員包括SorCSl、SorCS2、SorCS3進(jìn)行考察。在血管發(fā)育過程中，內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞形成復(fù)合物和相互作用，以及在成熟血管中周細(xì)胞維持微血管的結(jié)構(gòu)和功能(見Gaengel et al.的綜述，Arterioscler ThrombVasc Biol, 29:630-638(2008))。破壞內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞之間的聯(lián)系會導(dǎo)致血管出血和胚胎死亡，最好的例子是Pdgfb或Pdgfrb缺陷型小鼠，其無法將周細(xì)胞募集至特定的血管床(Lindahl et al., Science, 277(5323):242-245(1997);Hellstrom et al., Developmentl26:3047-55 (1999))。在成年小鼠中，TGF0和骨形態(tài)蛋白在維持周細(xì)胞存活和促進(jìn)微血管完整性方面起重要作用，在平滑肌細(xì)胞中Bmpla的遺傳缺陷導(dǎo)致在缺氧條件下的心臟機(jī)能障礙，以及TGFii阻斷導(dǎo)致血管通透性異常(El-Bizri et al., CircResl02 (3):380 -388(2008) ; Walshe et al., PLoS 0ne4 (4): 1-16 (2009))?？傊?，在心臟微血管成熟過程中，內(nèi)皮細(xì)胞:周細(xì)胞聯(lián)系的失調(diào)將在隨后生命過程中導(dǎo)致心臟機(jī)能障礙。發(fā)明概述本發(fā)明鑒定了一種新的配體-受體系統(tǒng)，proNGF和p75NTR/SorCS2，其與心臟的微血管功能相關(guān)。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種基于給予該新鑒定的系統(tǒng)的拮抗劑限制急性心肌缺血后微血管損傷的方法，從而促進(jìn)心肌的恢復(fù)。本發(fā)明的一個方面涉及一種在對象急性心肌缺血后通過給予proNGF拮抗劑以限制微血管損傷的方法。proNGF拮抗劑可以包括與proNGF特異性結(jié)合的中和抗體、適體、寡肽、小分子化合物、或例如降低proNGF mRNA水平或活性的核酸分子。本發(fā)明的另一個方面涉及一種在急性心肌缺血后通過給予SorCS2拮抗劑以降低微血管障礙及其相關(guān)損傷的方法。SorCS2拮抗劑可以包括抗體、適體、寡肽、小分子化合物、或降低SorCS2mRNA水平或活性的核酸分子。在急性心肌缺血(AMI)發(fā)生后可以盡快給予對象拮抗劑或拮抗劑混合物。在某些實(shí)施方式中，拮抗劑或拮抗劑混合物在48小時內(nèi)給予對象。在特定實(shí)施方式中，在AMI2-6小時內(nèi)給藥。拮抗劑或拮抗劑混合物可以與用于給藥的藥學(xué)上可接受的載體組合，并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)途徑給予對象，所述標(biāo)準(zhǔn)途徑包括攝食、通過靜脈、腹腔、皮下注射、透皮、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、或舌下途徑，或在經(jīng)皮介入時、或在開心手術(shù)過程中通過導(dǎo)管遞送。附圖簡述

圖1。帶有非-弗林蛋白酶突變Ngf-HA等位基因的Ngf靶基因示意圖。插圖，Southern 印記。圖2。在缺血-再灌注損傷后，proNGF及其受體p75NTR的表達(dá)上調(diào)。(a)來自未梗死的LV (左圖)和缺血-再灌注wtNGF-ΗΑ/+小鼠梗死周圍區(qū)域(右圖)的H&E染色切片。值得注意的是，與對照切片相比，損傷心肌中的浸潤細(xì)胞數(shù)量增加。(b)抗-HA免疫組化顯示，在心肌細(xì)胞和浸潤細(xì)胞中，NGF-HA的反應(yīng)性增加(插圖)。(c) ProNGF-特異性抗體的使用確證了 HA抗體的結(jié)果，并且進(jìn)一步顯示，在損傷的心肌和浸潤細(xì)胞(箭頭所示)中增加的NGF種類為proNGF，而非成熟的NGF。(d)分揀蛋白在小動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，其在Ι/R后不會上調(diào)。(e) p75NTR和TH雙免疫熒光顯示，與在對照未損傷切片中的正常組織相t匕，在Ι/R損傷心臟中交感神經(jīng)營養(yǎng)不良。(f)p75NTR在Ι/R-損傷心臟的梗死周圍區(qū)域的PDGFR^ +周細(xì)胞中表達(dá)，但是其不在未損傷心肌的周細(xì)胞中表達(dá)。(g) SorCS2在小動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。(h)SorCS2在梗死周圍區(qū)域的TOGFRii +周細(xì)胞子集中表達(dá)。比例尺:Ca)和(b), 100 μ m ； (c) 40 μ m ； (d) - (g), 20 μ m。圖3。(a)來自293T細(xì)胞的IP-WB顯示，proNGF與分揀蛋白和SorCS2之間發(fā)生了相互作用。值得注意的是，proNGF與分揀蛋白和SorCS2免疫共沉淀。(b)proNGF或NGF表達(dá)的免疫共沉淀-Westerm印記分析。左圖，PONGF+/+和proNGF-HA/+心臟的裂解物(每條泳道為三個心臟的混合物)顯示，在proNGF-HA/+而非NGF+/+心臟中存在proNGF_HAΓ321Λ)而非成熟NGF ri3kD)。右圖，成體腦裂解物顯示，在wtNGF-HA/+腦提取物中檢測到成熟NGF-HA，而非proNGF-HA，然而在proNGF-HA/+腦提取物中proNGF-HA是豐度最高的同型物。圖LProngf-HA基因祀向示意圖。DT,白喉毒素表達(dá)盒。黑線表示Southern印記探針序列和預(yù)計(jì)產(chǎn)物的尺寸。插圖，替換的Prongf-HA等位基因陽性的胚胎細(xì)胞的Southern印記分析。圖5。更年長的proNGF-HA/+心臟表現(xiàn)出心肌變薄和擴(kuò)張、纖維化、和組織細(xì)胞浸潤。(a-f) 8mo NGF+/+ (a, d)、NGF+ (b, e)、和 proNGF-HA/+ (c, f)心臟的 H&E 染色切片。(g-l)8mo NGF+/+ (g)、NGF+〃(h)、和 proNGF-HA/+ (i)心臟的 Masson 三色染色分析。紅色，心肌。黑色，核。藍(lán)色，膠原基質(zhì)。值得注意的是，在大部分細(xì)動脈周圍觀察到的藍(lán)色膠原沉積是正常的。但是，在proNGF-HA/+心臟中，藍(lán)色膠原廣泛沉積于肌細(xì)胞組織。6mo NGF+/+(j)、NGF+/_ (k)、和proNGF-HA/+ (I)心臟的⑶68免疫熒光分析顯示，組織細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤增加。比例尺，(a-c),2mm ;(d-l),100ym。圖6。41110 NGF+/+、NGF+/'和proNGF-HA/+心臟的 TEM成像。這一階段的proNGF-HA/+心肌出現(xiàn)了很多的壞死區(qū)域，這可能是由于血管的小梗死造成的。然而，NGF+/+和NGF+/_心肌組織仍表現(xiàn)為正常。箭頭，正常內(nèi)皮細(xì)胞。箭號，帶有細(xì)胞膜碎片的被破壞的內(nèi)皮細(xì)胞。比例尺，2 μ m。圖7。NGF+/+、proNGF-HA/+、和 p75+;proNGF-HA/+小鼠的超聲心動圖分析。(a)2mo (左)和 4mo (右)NGF+/+ (上圖)、proNGF_HA/+ (中圖)、和 p75+;proNGF_HA/+ (下圖)心臟的M-型痕跡舉例。(b)與正常NGF+/+ (藍(lán)色菱形)小鼠相比，在proNGF-HA/+小鼠(實(shí)心紅色方塊)中出現(xiàn)了進(jìn)行性心臟機(jī)能障礙。***，P〈0.005，t-檢驗(yàn)。在P75+ ；proNGF-HA/+小鼠中，proNGF受體p75的遺傳刪除挽救了心臟缺陷(空心紅色方塊)。NS,與NGF+/+小鼠相比無顯著性差異。分揀蛋白刪除不能挽救擴(kuò)張的心肌病表型(實(shí)心綠色三角)。#，與NGF+/+相比，種類+ ；proNGF-HA/+P<0.05，t_檢驗(yàn)。％FS，短軸縮短率(見正文)。藍(lán)色和紅色實(shí)線，以及紅色和綠色虛線為各表型隨時間變化的線性回歸曲線。N (NeF+/+)=18。N(proNeF_HA/+)=31。N(p75-/iMNGF-HA/+)=10。乂如+取‘卜謂=^)。(c) NGF+/+ 和 proNGF-HA/+ 小鼠隨小鼠年齡變化的Kaplan-Meier存活曲線圖。圖8。年輕的proNGF-HA/+心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為活化的表型。(a_c) ImoNGF+/+ (a)、NGF+ (b)、和 proNGF_HA/+ (c)心臟的 H&E 組織學(xué)。(d_f) Imo NGF+/+ (d)、NGF+/_ (e)、和proNGF-HA/+ (f)心臟的透射電子顯微鏡檢測結(jié)果顯示，在proNGF-HA/+心臟微血管中存在活化的內(nèi)皮細(xì)胞。箭頭，帶有包蓋了血漿或紅細(xì)胞的光滑細(xì)胞膜的正常內(nèi)皮細(xì)胞。箭號，帶有含多個空泡的增厚的和絲狀細(xì)胞膜的活化的內(nèi)皮細(xì)胞。在proNGF-HA/+心肌膜中，發(fā)現(xiàn)了廣泛(已檢查血管的飛0%)活化的微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及水腫性區(qū)域，在此處血管沒有與相鄰的心肌接觸(星號；與圖(e)所示的切片對應(yīng))。值得注意的是，在該時間點(diǎn)，所有表型心肌的外觀均正常和健康。比例尺，(a-c),100ym；(d-f),2ymo圖9。在NGF+/pro小鼠心臟血管的成熟過程中出現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和異常的血小板沉積。(a-c)對血小板/巨核細(xì)胞標(biāo)記物⑶41的檢測發(fā)現(xiàn)，與P9心肌中的NGF+/+(a)相比，proNGF-HA/+ (b)心臟中出現(xiàn)大量血小板聚集。p75+ ;proNGF-HA/+血管并不捕獲血小板(c)。(d-f)在 P9中ICAM-1上調(diào)表明在proNGF-HA/+ (e)血管中內(nèi)皮活化，而NGF+/+ (d)或 p75+;proNGF-HA/+ (f)血管中未出現(xiàn)這一現(xiàn)象。(g_i)p75_ 喪失(i)挽救了proNGF-HA/+心肌(h)中的FITC-葡聚糖(70kD)蓄積和外滲，F(xiàn)ITC-葡聚糖(70kD)蓄積表明血管清除大分子的能力喪失，外滲表明微血管水腫和完整性喪失。(j-k)⑶41和ICAM-1的免疫熒光定量。比例尺，100 μ m。圖10。在導(dǎo)致最終心臟微血管障礙的發(fā)育過程中，proNGF受體的表達(dá)。分析E17.5或PO胚胎的P75NTR和SorCS2的免疫反應(yīng)性。同工凝集素B4+內(nèi)皮細(xì)胞(a)不表達(dá)p75NTR，但是TOGFRP +周細(xì)胞(b)亞群表達(dá)。(C)TOGFRP -免疫陽性周細(xì)胞的小亞群表達(dá)SorCS2。(d)僅少量E20周細(xì)胞共表達(dá)P75NTR和SorCS2。比例尺，10 μ m。圖11。人心臟左心室壁或心肌梗死死亡3天內(nèi)個體的梗死周圍區(qū)域的解剖切片。通過紅棕色反應(yīng)產(chǎn)物檢測與指示抗體的免疫反應(yīng)性。該圖顯示，在死于心臟病發(fā)作的患者的解剖標(biāo)本中，proNGF明顯上調(diào)，但死于其他原因的患者中未見這一現(xiàn)象。此外，小動脈周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中的P75上調(diào)。圖12。來自相關(guān)動物模型的proNGF原結(jié)構(gòu)域:人(SEQ ID N0:1)、獼猴(SEQ IDN0:2)、豬(SEQ ID N0:3)、犬(SEQ ID N0:4)、大鼠(SEQ ID NO:5)、和小鼠(SEQ ID N0:6)。圖13。人神經(jīng)營養(yǎng)因子原結(jié)構(gòu)域。人proNGF、proBDNF、proNT-3和proNT4的原結(jié)構(gòu)域分別見SEQ ID NO:1、7、8和9所示。
發(fā)明詳述
本發(fā)明鑒定了一種與心臟微血管功能相關(guān)的新配體-受體系統(tǒng)，其可以用于在急性心肌缺血后阻止缺血心臟的微血管障礙或限制微血管損傷，從而促進(jìn)心肌的恢復(fù)。更特別地，發(fā)明人確定了在梗死的小鼠心臟中誘導(dǎo)proNGF配體及其受體p75NTR和分揀蛋白家族成員SorCS2。發(fā)明人制備了敲入小鼠，其具有一個在內(nèi)源性Ngf啟動子的調(diào)控下表達(dá)抗裂解形式proNGF的等位基因，以及另一個表達(dá)NGF的非靶向等位基因(稱為proNGF-HA/+小鼠)。這些小鼠是能夠存活的，但其在早期成年期發(fā)展成擴(kuò)張性心肌病，導(dǎo)致其在6至8月齡死亡。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的晚期階段，包圍了周細(xì)胞的心臟微血管表達(dá)p75NTR和SorCS2，但不表達(dá)分揀蛋白。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，表達(dá)proNGF且缺乏p75NTR的動物不會發(fā)展成心肌病，而表達(dá)proNGF且缺乏分揀蛋白的動物無法從該表型中被挽救。此外，發(fā)明人證實(shí)在proNGF-HA/+小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞被活化，導(dǎo)致血管通透性增加。無意于被任何特定理論所限制，相信在proNGF-HA/+小鼠的心臟中誘導(dǎo)proNGF和P75NTR，其作用于周細(xì)胞以促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)皮活化和后續(xù)的心肌?。徊⑶遗cProMGF結(jié)合的SorCS2作為p75NTR的共受體以改變周細(xì)胞的功能。依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，發(fā)明人新鑒定的配體-受體系統(tǒng)(proNGF_p75NTR/SorCS2)可以用于降低、限制或阻止急性心肌缺血后的心臟微血管障礙和微血管損傷。微血管障礙和損傷急性心肌缺血(或AMI)通常稱為心臟病發(fā)作，當(dāng)心臟中一部分的血液供應(yīng)中斷時，發(fā)生此病。如果一段時間未經(jīng)治療，由此產(chǎn)生的氧氣不足可能導(dǎo)致心肌組織損傷或死亡(或“梗死”)。在本發(fā)明以前，對急性心肌梗死的治療主要集中在冠狀動脈血液流動的重建。然而，即使使大血管再通，還是有很大一部分患者表現(xiàn)出梗死組織的微血管損傷，其導(dǎo)致慢性心臟功能損傷和殘疾，以及死亡率升高(Eltzschig et al.，Brit.Med.Bulletin, 70:71-86 (2004))。然而，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以通過使用proNGF_p75NTR/SorCS2系統(tǒng)的拮抗劑阻止或限制微血管障礙或損傷以改善再灌注后心肌的恢復(fù)。本申請使用的術(shù)語“微血管”指小血管，如微動脈、毛細(xì)血管和微靜脈。此類小血管通常包括兩類細(xì)胞:內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞形成內(nèi)血管壁，周細(xì)胞形成內(nèi)皮管周圍的外層(Gaengel et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol29:630-638，2009)。術(shù)語“微血管障礙”指小血管的結(jié)構(gòu)和/或功能異常?？梢酝ㄟ^分析血管收縮性、血管通透性、微血管電鏡，以及分析內(nèi)皮和周細(xì)胞標(biāo)記物(如⑶-31、同工凝集素B4、PDGFR^和NG2)的水平等等對微血管障礙進(jìn)行評估和測定。術(shù)語“微血管損傷”指由于微血管障礙而導(dǎo)致小血管的結(jié)構(gòu)完整性和/或功能喪失或損害。proNGF-p75NTR/SorCS2配體-等體系統(tǒng)的桔杭劑如本申請所公開的，給予proNGF-p75NTR/SorCS2配體-受體系統(tǒng)的拮抗劑可以減少或限制、或甚至完全阻止急性心肌缺血后的微血管障礙及相關(guān)損傷。本申請所使用的術(shù)語“拮抗劑”指抑制周細(xì)胞中proNGF-p75NTR/SorCS2配體-受體系統(tǒng)中組分的表達(dá)水平的分子(“表達(dá)拮抗劑”)；或者，抑制周細(xì)胞中表達(dá)的proNGF-p75NTR/SorCS2配體-受體系統(tǒng)中組分之間的相互作用或結(jié)合(“結(jié)合拮抗劑”)，從而降低該配體-受體系統(tǒng)的量、形成、功能、和/或其下游信號。
如果某分子導(dǎo)致組分的表達(dá)顯著降低(轉(zhuǎn)錄或翻譯水平)，則認(rèn)為該分子抑制proNGF-p75NTR/SorCS2系統(tǒng)組分的表達(dá)水平。類似地，如果某些分子導(dǎo)致組分與形成的配體-受體復(fù)合物之間的結(jié)合顯著減少，其導(dǎo)致通過配體-受體系統(tǒng)介導(dǎo)的下游信號和功能顯著減少，例如內(nèi)皮細(xì)胞活化和血管通透性增加，則認(rèn)為該分子抑制proNGF-p75NTR/SorCS2配體-受體系統(tǒng)成分之間的結(jié)合。例如，如果減少至少約25%、以及在某些實(shí)施方式中至少約50%、以及在其他實(shí)施方式中至少約90%，則認(rèn)為減少具有顯著性。結(jié)合拮抗劑能夠以兩種方式發(fā)揮作用。結(jié)合拮抗劑能夠與配體proNGF競爭受體，從而干擾、阻斷或防止proNGF與p75NTR和/或SorCS2結(jié)合。此類型的拮抗劑，其與受體結(jié)合但不觸發(fā)預(yù)計(jì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也稱為“競爭性拮抗劑”，其可以包括，例如基于proNGF序列設(shè)計(jì)的寡肽，或針對SorCS2的抗體?；蛘撸Y(jié)合拮抗劑能夠結(jié)合至并隔離配體proNGF,其與配體具有足夠的親和性和特異性，基本上能夠干擾、阻斷或防止proNGF與p75NTR和/或SorCS2結(jié)合。此類型的拮抗劑也稱為“中和拮抗劑”，其可以包括，例如針對proNGF的抗體或適體，其與proNGF特異性結(jié)合。還可以基于拮抗劑擬拮抗的祀分子確定拮抗劑的特征。例如,proNGF拮抗劑指抑制或減少proNGF表達(dá)；或干擾、阻斷或防止proNGF與p75NTR和/或SorCS2相互作用或結(jié)合的分子。另一方面，SorCS2拮抗劑指抑制或減少SorCS2表達(dá)；或干擾、阻斷或防止SorCS2與proNGF和/或p75NTR相互作用的分子。ProNGF 括抗劑在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種通過給予proNGF拮抗劑減輕急性心肌缺血后微血管障礙及相關(guān)損傷的方法。如本申請所公開的，proNGF拮抗劑可以是proNGF的特異性中和抗體、適體、寡肽、小分子化合物、或例如能夠 降低proNGF mRNA的水平或活性的核酸分子。在一個特定實(shí)施方式中，proNGF拮抗劑是proNGF的特異性中和抗體。在本申請中，proNGF的特異性分子(如抗體或適體)是指與成熟NGF和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子原相比，與proNGF的結(jié)合基本上具有較高親和性，以及在某些實(shí)施方式中，與proNGF的結(jié)合幾乎具有排他性的分子。“基本上具有較高親和性”指分子與proNGF的結(jié)合親和性(Kd)為分子與成熟NGF或其他神經(jīng)營養(yǎng)因子原的結(jié)合親和性的至少5倍、10倍、50倍、100倍、或1000倍或以上。在一個特定實(shí)施方式中，proNGF的特異性抗體指指向proNGF原結(jié)構(gòu)域的抗體。ProNGF的原結(jié)構(gòu)域與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子的原結(jié)構(gòu)域完全不同(圖13)，使得指向proNGF原結(jié)構(gòu)域的抗體不可能與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子或成熟NGF發(fā)生交叉反應(yīng)。在適宜的情況下，可以采用本領(lǐng)域公知的檢測方法確定抗-proNGF抗體的特異性，包括在下文的實(shí)施例中更加詳細(xì)描述的那些方法。ProNGF的原結(jié)構(gòu)域在各種屬之間高度保守。如圖12所示，在人、獼猴、豬、犬、大鼠、和小鼠的NGF原結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在顯著一致的區(qū)域，使得能夠產(chǎn)生指向原結(jié)構(gòu)域的不同區(qū)域、基序、三級結(jié)構(gòu)、或表位的原結(jié)構(gòu)域的抗體譜。在一些實(shí)施方式中，proNGF特異性抗體特異性地指向原結(jié)構(gòu)域內(nèi)的基序或表位，包括在如圖12所示的各種屬之間高度保守的原結(jié)構(gòu)域內(nèi)連續(xù)的氨基酸序列。本申請所使用的術(shù)語“抗體”包括完整的免疫球蛋白分子，以及包括與目的抗原特異性結(jié)合的抗體高可變區(qū)的分子，其具有或不具有抗體恒定區(qū)。高可變區(qū)可以包括完整的抗體可變區(qū)。因此，包括抗體高可變區(qū)的抗體分子可以是完整的抗體分子、保留完整抗體抗原結(jié)合特異性的抗體片段(包括單鏈抗體)、以及嵌合和人源化抗體?？贵w可以是多克隆的或單克隆的，并且可以是任何種類的免疫球蛋白，如:IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亞類?？梢栽诜侨瞬溉閯游镏猩a(chǎn)適宜的抗體，包括例如，家兔、大鼠、小鼠、馬、山羊、駱駝、或靈長類?？梢酝ㄟ^下述本領(lǐng)域公知的技術(shù)對在非人哺乳動物中生產(chǎn)的單克隆抗體進(jìn)行人源化以減少供人使用時的免疫原性。例如，為了將在小鼠中產(chǎn)生的單克隆抗體人源化，一種方法是制備小鼠-人嵌合抗體，其具有鼠源性HiAb的原始可變區(qū)，并與人免疫球蛋白的恒定區(qū)相連接。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域的公知常識。參見，例如 Cabilly et al.，歐洲專利申請 125023 (公開于 1984 年 11 月 14 日)；Taniguchi etal.，歐洲專利申請171496 (公開于1985年2月19曰)；Morrison et al.，歐洲專利申請 173494 (公開于 1986 年 3 月 5 日)；Neuberger et al.，PCT 申請 W086/01533，(公開于1986年3月13日)；其全部內(nèi)容通過引用并入本申請?；蛘?，可以通過包括人免疫球蛋白的恒定區(qū)，以及使用相應(yīng)的人框架殘基取代非人抗體可變區(qū)的框架殘基制備人源化抗體，其可以使非人CDR基本保持完整，或甚至使用衍生自人基因組的序列取代CDR。參見，例如 Maeda et al., Hum.Antibod.Hybridomas2:124-134, 1991,和 Padlan，Mol.1mmunol.28 :489-498，1991。作為另外一種選擇，可以由轉(zhuǎn)基因動物(例如，轉(zhuǎn)基因小鼠)生產(chǎn)人抗體，已改變了這些轉(zhuǎn)基因動物的免疫系統(tǒng)以便與人免疫系統(tǒng)相對應(yīng)。此類小鼠的一個例子被稱為 XenoMouse (Abgenix, Freemont, Calif.),如Green, "Antibody Engineeringvia Genetic Engineering of the Mouse:XenoMouse Stains are a Vehicle for theFacile Generation of Therapeutic Human Monoclonal Antibodies, 〃J.Tmmunol.MethodslO; 231 (1-2):11-23(1999)所描述的。在另一個特定實(shí)施方式中，proNGF拮抗劑是與proNGF特異性結(jié)合的適體。適體是與特異性靶分子結(jié)合的核酸或肽分子。核酸適體通常是短鏈DNA或RNA，其通過稱為SELEX (指數(shù)式富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))的體外選擇結(jié)合至不同分子靶點(diǎn)的重復(fù)循環(huán)設(shè)計(jì)?？梢允褂貌煌到y(tǒng)選擇肽適體，最常用的是通過酵母雙雜交系統(tǒng)。肽適體一般由可變肽環(huán)(一般包括十至二十個氨基酸)組成，其連接在蛋白支架的兩個末端。該雙結(jié)構(gòu)限制極大地增加了肽適體的結(jié)合親和性，使其水平與抗體相當(dāng)。在另一個特定實(shí)施方式中,proNGF拮抗劑是寡肽或小分子化合物,其與proNGF受體(即，p75受體和/或SorCS2)結(jié)合，從而阻斷proNGF與其受體的結(jié)合，但是通過proNGF與p75NTR/SorCS2的結(jié)合不會觸發(fā)下游信號或生物活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法發(fā)現(xiàn)此類小分子和寡肽。一般地，發(fā)現(xiàn)此類小分子的過程涉及提供表達(dá)P75NTR和/或SorCS2的細(xì)胞，提供擬檢測的小分子或寡肽，以及確定擬檢測的小分子或寡肽是否與P75NTR和/或SorCS2結(jié)合，以及任選地，獲得由proNGF與p75NTR/SorCS2結(jié)合引起的生物活性。如果分子與p75NTR和/或SorCS2結(jié)合的親和性較高，則其為本方法用于限制微血管損傷的候選物。如果分子與P75NTR和/或SorCS2結(jié)合的親和性較高且阻斷proNGF與p75NTR/SorCS2的結(jié)合，則其為更強(qiáng)的候選物。如果除了阻斷結(jié)合以外，分子還不會導(dǎo)致p75NTR/SorCS2活化預(yù)期的生物活性，例如，活化內(nèi)皮細(xì)胞，則該分子是臨床前或臨床試驗(yàn)的候選物。
寡肽具有至少約四個氨基酸殘基，并且在某些實(shí)施方式中具有至少約五個氨基酸殘基，并且在其他實(shí)施方式中具有至少約六個氨基酸殘基。氨基酸殘基的最大數(shù)量并不重要，只要寡肽具有上文所述的所需性質(zhì)。寡肽可以是線性的或環(huán)狀的。寡肽的某些例子包括:S/T-P/S-R-V-(Z)z(SEQ ID NO:10)S/T-P/S-R-V-L/M/V-(Z)z(SEQ ID NO:11)S/T-P/S-R-V-L/M/V-F/L-(Z)z(SEQ ID NO:12)S/T-P/S-R-V-L/M/V-F/L-S-(Z)z(SEQ ID NO:13)其中Z表示任何α氨基酸，并且ζ表示O至約20之間的任何數(shù)值，優(yōu)選地表示O至約10、更優(yōu)選地表示O至約5。這些寡肽中的任何一個可以是環(huán)狀的。小分子包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、有機(jī)和有機(jī)金屬化合物的鹽、糖、氨基酸、和核苷酸。小分子的分子量一般低于約1000道爾頓,在某些實(shí)施方式中低于800道爾頓。小分子包括在自然界中發(fā)現(xiàn)的化合物和合成化合物。在另一個特定實(shí)施方式中，給予的proNGF拮抗劑是降低proNGF mRNA的水平或活性的核酸分子。此類核酸分子包括反義RNA、siRNA、miRNA (或“微型RNA”)或轉(zhuǎn)基因，其在受體的靶組織中編碼并能夠表達(dá)任何的此類RNA分子。反義RNA指與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)并通過與內(nèi)源性mRNA形成雙螺旋而阻止內(nèi)源性mRNA翻譯的RNA分子。siRNA是小雙鏈RNA (其長度一般為20- 25個核苷酸)，已知其涉及RNA干擾通路并且干擾特定基因的表達(dá)。當(dāng)靶基因序列確定后，可以設(shè)計(jì)siRNA，并通過合成或在內(nèi)源性引入載體(例如，質(zhì)粒)的細(xì)胞中制備，以達(dá)到對所關(guān)注基因的表達(dá)的抑制。與siRNA類似，miRNA也是調(diào)控基因表達(dá)的小RNA分子(一般約21-22個核苷酸)。miRNAs由轉(zhuǎn)錄自非蛋白編碼基因的長前體加工得至IJ，并且通過與靶mRNA不精確的堿基配對使翻譯中斷?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)設(shè)計(jì)miRNA并將其導(dǎo)入細(xì)胞或組織，以靶向性抑制所關(guān)注基因(proNGF、SorCS2或p75NTR)的表達(dá)?？梢酝ㄟ^病毒介導(dǎo)的pro-miRNA或decoymiR的遞送或在血衆(zhòng)中的遞送完成miRNA的調(diào)變(例如，Cordes KR, et al, Nature460:705 (2009) ; Caporali A, et al., Circulationl23:282，(2011) ; Castoldi1M, J., Clin Invest.121:1386 (2011) ; Vickers, KC et al., Nat CellBioll3:423(2011))。SorCS2 桔杭劑在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種通過給予SorCS2拮抗劑減輕急性心肌缺血后的微血管障礙及相關(guān)損傷的方法。如本申請所公開的，SorCS2拮抗劑可以是抗體、適體、寡肽、小分子化合物、或能夠降低SorCS2mRNA的水平或活性的核酸分子。在一個特定實(shí)施方式中，SorCS2拮抗劑是與SorCS2特異性結(jié)合并且抑制SorCS2與proNGF和/或P75NTR相互作用的抗體。SorCS2特異性抗體是指與分揀蛋白家族的其他成員如分揀蛋白相比，與SorCS2的結(jié)合基本上具有較高親和性，并且在某些實(shí)施方式中，與SorCS2的結(jié)合幾乎具有排他性的分子?！盎旧暇哂休^高親和性”指抗體與SorCS2的結(jié)合親和性為抗體與分揀蛋白家族其他成員結(jié)合親和性的至少5倍、10倍、50倍、100倍、或1000倍或以上。在一個特定實(shí)施方式中，SorCS2特異性抗體指向SorCS2的胞外結(jié)構(gòu)域(人SorCS2的氨基酸20-1078)。在一些實(shí)施方式中，SorCS2特異性抗體特異性地指向胞外結(jié)構(gòu)域的特定基序或表位，如富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(人SorCS2的氨基酸殘基611-750)，或10個葉片螺旋槳結(jié)構(gòu)域(氨基酸45-610)。人SorCS2的氨基酸序列見SEQ ID NO: 14 (登錄號NP_065828)。與上文所述的proNGF拮抗劑類似,SorCS2拮抗劑不僅限于抗體,還包括與SorCS2特異性結(jié)合并抑制其與ProNGF和/或p75NTR相互作用的核酸或肽適體、阻斷SorCS2與proNGF和/或p75NTR相互作用的寡肽或小分子化合物、以及降低SorCS2mRNA水平或活性的核酸分子(如反義、siRNA、或miRNA)。拮抗劑混合物本申請還提供了一種以上拮抗劑分子的混合物，其也適于給藥?；旌衔锟梢岳绨ㄒ环N或多種抗體分子、一種或多種適體分子、一種或多種寡肽或小分子、或其不同組合。混合物還可以包括一種或多種proNGF拮抗劑與一種或多種SorCS2拮抗劑的組合。給藥在急性心肌缺血(AMI)發(fā)生后盡快給予對象拮抗劑或拮抗劑的混合物。但是，在AMI發(fā)生最遲48h內(nèi)給予拮抗劑仍有效。在一些實(shí)施方式中，在AMI發(fā)生后24小時、18小時、12小時、6小時甚至2小時內(nèi)給予對象拮抗劑。在一個特定實(shí)施方式中，在AMI發(fā)生后2-6小時內(nèi)開始給予拮抗劑。重復(fù)給藥或給藥的適宜劑量可以由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師確定?？梢酝ㄟ^任何適宜的和可實(shí)施的方法將拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體組合，如通過混合、溶解、混懸、乳化、包封、吸收等等，并且可以將其制成適宜于注射、植入、吸入、攝食等的如片劑、膠囊、粉劑、糖衆(zhòng)、混懸液等制劑。如本申請所使用的，藥學(xué)上可接受的載體包括任何及全部溶劑、分散介質(zhì)、等張劑等等。除對受體或本申請包含 活性劑的效果有害的那些以外，本申請公開的方法可以使用任何常規(guī)的介質(zhì)、試劑、稀釋劑或載體。載體可以是液體、半固體例如糊劑、或固體載體。載體的例子包括油、水、鹽溶液、醇、糖、凝膠、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、樹脂、多孔性材料、粘合劑、填充劑、包衣劑、防腐劑等等、或其組合。拮抗劑在制劑中的濃度范圍可以為以重量計(jì)最低約0.1%至最高15或20%，可以基于所使用的特定拮抗劑的性質(zhì)和選定的給藥模式在其他備選方案中對其進(jìn)行選擇。這樣，典型的注射用制劑可以制備成至多含ImL磷酸緩沖鹽無菌緩沖液和Ι-lOOOmg，可能為IO-1OOmg的拮抗劑，例如基于抗體的拮抗劑。根據(jù)拮抗劑的性質(zhì)或AMI情況，可以通過標(biāo)準(zhǔn)途徑給予對象含有拮抗劑的藥物制齊U，包括攝食、靜脈注射、腹腔、皮下、透皮、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、或舌下途徑給藥，或在經(jīng)皮介入治療或在開心手術(shù)時通過導(dǎo)管遞送。一般而言，基于抗體或適體拮抗劑可以靜脈遞送。可以將基于RNA的拮抗劑直接遞送至心臟，例如在經(jīng)皮介入治療，或如果需要進(jìn)行動脈搭橋術(shù)治療開心手術(shù)時通過導(dǎo)管遞送。依據(jù)患者的狀況(例如，年齡、體重和健康狀況)、AMI發(fā)生后的時間間隔、和拮抗劑的性質(zhì)確定給予拮抗劑的有效量。有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師可以確定拮抗劑的精確有效量。
實(shí)施例通過下述實(shí)施例對本說明書進(jìn)行進(jìn)一步解釋，在任何情況下不應(yīng)將其解釋為對本發(fā)明的限定。所有引用的參考文獻(xiàn)(包括本申請中引用的文獻(xiàn)、授權(quán)專利、和公開的專利申請)的內(nèi)容均明確地通過引用并入本申請。實(shí)施例-1。本實(shí)施例描述了實(shí)施例2所述實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。錯表達(dá)proNGF的誘導(dǎo)性敲入小鼠的產(chǎn)生。使用標(biāo)準(zhǔn)的斑點(diǎn)印跡技術(shù)((Osoegawa et al., GenomeResearch, 10(1):116-128(2000))從購自 UK HGMP MRC Geneservice (Cambridge, UK)的129/SvevTACfBR雌性脾文庫中鑒定基因組PAC克隆RPCI21-494-C12。通過在終止密碼子前框內(nèi)的定點(diǎn)突變加入血凝素(HA)表位標(biāo)簽。通過定點(diǎn)突變(Stratagene)將弗林蛋白酶識別位點(diǎn)由KR突變?yōu)锳A。將經(jīng)修飾的新霉素抗性表達(dá)盒，由frt-loxp-engrailed剪接受體-pGK-neo1.終止密碼子-frt-loxp序列組成(5’至3’),插入起始密碼子上游350bp處。使用白喉毒素表達(dá)盒進(jìn)行陽性選擇。靶向效率為約4%。將三個獨(dú)立來源的表達(dá)Prongf-HA(在本申請中稱為pr0NGF-HA/+)的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并顯微注射至C57B1/6小鼠的胚胎。通過該方法獲得三個獨(dú)立品系的proNGF-HA小鼠。采用相同方法產(chǎn)生兩個品系的Ngf-HA敲入小鼠(稱為wtNGF-HA/+)，在該構(gòu)建中未對弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)進(jìn)行突變。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行Southern印跡分析。使用PCR通過擴(kuò)增HA表位標(biāo)簽:5’ -TGA AGC CCA CTG GAC TAAACT T-3’ (SEQ ID NO: 15)和 5，-AAT CTG GAA CAT CGT ATG GG-3’ (SEQ ID NO: 16)將敲入等位基因從野生型等位基因中鑒定出來。使用另外一對PCR引物:5’-GAG ATC CAC TAGTTC TAG CCT CGA G_3’ (SEQ ID NO: 17)和 5’-CCC ACA CAC TGA CAC TGT CAC AC-3’ (SEQID NO: 18)確定是否存在新霉素抗性表達(dá)盒。小鼠繁育和組織處理。所有方法均經(jīng)過威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院IA⑶C批準(zhǔn)。使用β -肌動蛋白-ere刪除品系以除去neo-抗性表達(dá)盒并且能夠使敲入的等位基因表達(dá)。使用下述引物對來鑒定是否存在 ere-重組酶等位基因:5' -TTA TAA CAC CCT GTT ACG TAT AGC C-3’ (SEQ ID NO: 19)和 5’-TAT CTC TGA CCA GAG TCA TCC TTA G_3’ (SEQ ID NO:20)。p75NTR+小鼠購自Jackson Laboratories,在進(jìn)行proNGF-HA/+遺傳搶救性繁殖前,其已在C57B1/6背景下回交〉G8。其他對照品系包括 NGF+/_ (Crowley et al.，Cell, 76 (6): 1001-1011 (1994))和分揀蛋白 + (Jansen et al., Nat Neuroscience, 10 (11): 1449-1457 (2007))小鼠。供免疫組化分析時，將胚胎干和成熟心臟在0CT: 30%蔗糖(1:1; Sakura)中速凍。供蛋白和RNA分析時，在處理前將心臟在-80° C保存。將FITC-葡聚糖(70kDa; Sigma)通過尾靜脈注射至3月齡小鼠(CamelIeri 1983)。灌注10分鐘后,處死動物、收集并處理心臟以供免疫熒光分析。免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)。將冰凍切片立即在丙酮或4%PFA中固定。進(jìn)行IHC時，將切片在-20° C條件下在0.1%H202/甲醇中放置15min后，使用PBS洗滌切片、封閉(5%二抗血清/0.l%Triton χ-100/PBS)，并使用一抗在4° C條件下孵育過夜。使用的一抗為:HA(Sigma，l:400)、p75NTR(ECD:R&D, l:1000;ICD:Promega，1:500)、分揀蛋白(R&D, 1:400)、SorCS2 (ICD:通過使用偶聯(lián)至KLH的huSorCS2aal 138-1159 免疫家 兔制備，1:1000 ;*ECD:R&D, 1:100)、活化的 caspase-3(Cell Signaling, 1:200)、酪氨酸輕化酶(Jackson Immunological, 1:100)、憐酸化-cjun(Cell Signaling;1:100)、CD31(BD Biosciences, 1:100)、CD41(BD Biosciences, 1:100),纖維蛋白(原)(偶聯(lián)-FITC, Dako, 1:250)、CD68 (偶聯(lián)-TRITC, Serotec, 1:100)、Ibal(Wako，l:400)、ICAM(eBioscience，1:100)。生物素化的二抗偶聯(lián)至 ABC 試劑，使用 VIP 試劑盒對其進(jìn)行檢測(Vector Labs)ο按照基本上如上文所述的方法進(jìn)行IF。使用偶聯(lián)Alexa的二抗(Invitrogen)檢測一抗。使用ZeissLSM510或LSM700激光掃描顯微鏡進(jìn)行共聚焦顯微鏡分析。免疫沉淀/Western印跡。在裂解液(0.1M Tris pH7.4/l%Triton χ-100/0.1%ΝΡ-40/0.05%SDS/10%甘油/蛋白酶抑制劑混合物[Sigma])中將冷凍的心臟和腦勻漿。在4° C條件下使用抗-HA抗體(Sigma)沉淀HA-標(biāo)記的蛋白。加入蛋白A-瓊脂糖(Sigma-Aldrich)捕獲免疫復(fù)合物,充分洗滌，在SDS-PAGE上樣緩沖液中將其煮沸。使用HA.11單克隆抗體(Covance)檢測蛋白斑點(diǎn)，使用ECL (Amersham)顯色。見圖3b。使用相同方法對轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀和Western-印跡分析。見圖3a。使用兔-抗_myc抗體(Covance)對myc_標(biāo)記的分揀蛋白或SorCS2蛋白進(jìn)行檢測。RT-PCR0采用標(biāo)準(zhǔn)方法和試劑(Invitrogen)進(jìn)行RT-PCR。使用上文所述的HA引物以及β-肌動蛋白:5’-AAA GAG AAG CTG TGC TAT GTT GCT C_3’ (SEQ ID NO:21)和 5’-GCATAG AGG TCT TTA CGG ATG TCA A_3’ (SEQ ID NO: 22)進(jìn)行 PCR 檢測。ELISAo按照生產(chǎn)廠商的說明，使用NGF Emax試劑盒(Promega)進(jìn)行所有的ELISA檢測。經(jīng)胸廓軺聲心動圖。
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本研究使用配有14Hz探頭的Accuson Sequoia臨床超聲設(shè)備(K.Hajjar, CUWMC惠贈)。使用阿佛丁將各只小鼠麻醉，將其置于設(shè)定為較低溫度的熱板上至少20分鐘使其恢復(fù)至基線心率，并備皮。將探頭頭部應(yīng)用于小鼠胸部的超聲凝膠層，使用Icm凝膠補(bǔ)償擴(kuò)大其范圍，通過左心室乳頭肌定位對心臟中線進(jìn)行檢測。一旦確定中線，將探頭延心臟的尾部-頭部軸上下掃過，以確保在左心室最寬的部分觀察，然后使探頭保持穩(wěn)定lmin，在VHS紙帶上記錄。進(jìn)行M模式的輸出，以便于使用下述公式計(jì)算短軸縮短率(％FS):%FS=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]xlOO其中LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑，以及LVESD=左心室收縮末期內(nèi)徑。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用Student’s t_檢驗(yàn)。缺血-再灌灃研究。通過吸入4%異氟烷并持續(xù)給予2%異氟烷誘導(dǎo)麻醉。然后對小鼠進(jìn)行插管和機(jī)械通氣。使用直腸探針監(jiān)測核心體溫并將其維持在37° C，使用導(dǎo)聯(lián)II配置和PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)在整個手術(shù)過程中監(jiān)測ECG。在第4肋間隙進(jìn)行左側(cè)開胸手術(shù)并將心包剪開。使用8-0號縫合線將冠狀動脈左前降支(LAD)雙向結(jié)扎40分鐘，然后通過解開結(jié)扎進(jìn)行再灌注。通過ECG的ST段升高、局部發(fā)紺、和室壁運(yùn)動異常確認(rèn)阻塞。通過結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌顏色恢復(fù)和ST升高消失確認(rèn)再灌注。將縫合線留在傷口處以確定結(jié)扎位置，逐層關(guān)閉胸腔和皮膚。手術(shù)后，將動物送回各籠，在處死和收集組織前給予常規(guī)食水48h。根據(jù)需要給予BuprenexC0.lmg/kg)以確保動物在手術(shù)過程中舒適。所有手術(shù)過程均在無菌條件下進(jìn)行。
電子顯微鏡檢杳法。所有試劑均購自Electron Microscopy Sciences。從小鼠中取下心臟，使用冷PBS充分洗滌，并在Karnovsky固定液(含2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、0.02%苦味酸的0.1MPBS)中浸泡過夜。將Icm小塊在1%四氧化鋨/1.5%鐵氰化鉀中后固定，使用1.5%的乙酸鈾酰染色，并使用乙醇逐級脫水。在Spurr樹脂中包埋后，在RMC MT-7000超薄切片機(jī)上使用Diatome金剛石刀將其切成55_60nm厚的切片。使用檸檬酸鉛將切片顯影并于80kV條件下將其置于JSM100CX-1I電子顯微鏡下觀察。在Kodak4489電子成像膠片上記錄圖像，然后在900dpi下將其數(shù)字化輸出。實(shí)施例-2。本實(shí)施例描述的實(shí)驗(yàn)證明了在小鼠心臟缺血/再灌注損傷后能夠迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生proNGF和p75NTR。本實(shí)施例還描述了 proNGF敲入小鼠的產(chǎn)生，并顯示了 proNGF作用于表達(dá)P75NTR的周細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，使血管通透性增強(qiáng)和微血管損傷，其使得成年proNGF敲入小鼠出現(xiàn)致死性的擴(kuò)張性心肌病。此外，本實(shí)施例描述了證明在晚期胚胎發(fā)生過程中插入心臟微血管的周細(xì)胞表達(dá)P75NTR和SorCS2而非分揀蛋白，確立了與proNGF結(jié)合的SorCS2的功能為與P75NTR—并改變周細(xì)胞功能的共受體。心肌缺血再灌灃誘導(dǎo)proNGF和D75NTR的表汰。產(chǎn)生的敲入小鼠的Ngf編碼外顯子被C-末端添加血凝素(HA)標(biāo)簽的等位基因取代，以便于將所有形式的NGF刪除(wtNGF-HA/+小鼠)。這種策略增強(qiáng)了對NGF蛋白的刪除，使其在心臟中表達(dá)的濃度在納摩以下。對wtNGF-HA/+小鼠進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)其表達(dá)敲入等位基因的方式無法與內(nèi)源性等位基因相區(qū)分(見下文和圖1)。將成年wtNGF-HA/+小鼠的冠狀動脈左前降支夾閉處理40分鐘(圖2a)，再灌注48小時后(I/R損傷)對損傷或假手術(shù)心臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生proNGF或成熟NGF的情況進(jìn)行評估。在未損傷心臟的切片中，在心臟的肌細(xì)胞中檢測到彌散性存在的水平較低的總NGFJS proNGF的免疫反應(yīng)性低于檢測敏感性(分別使用HA或proNGF-特異性抗體；圖2b和C，左圖)。但是，在再灌注48小時后，在梗死周圍區(qū)域的心肌細(xì)胞和浸潤細(xì)胞中觀察到I/R損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生HA免疫反應(yīng)性(圖2b和C，右圖)。在這種損傷類型中，最可能上調(diào)的NGF種類為proNGF，因?yàn)槭褂冕槍roNGF結(jié)構(gòu)域原的特異性抗血清時，梗死區(qū)域的肌細(xì)胞顯示出免疫反應(yīng)性(Harrington et al., 2004 ；圖2c)。此外，被I/R損傷募集至梗死周圍區(qū)域的細(xì)胞對proNGF為免疫陽性(圖2b和C，右圖，箭頭)。為評估是否協(xié)同誘導(dǎo)了 proNGF受體，我們采用免疫熒光法對正常和I/R損傷的心臟中P75NTR、分揀蛋白、和亦與proNGF結(jié)合的分揀蛋白家族成員SorCS2的表達(dá)(圖3)進(jìn)行評估。在α-平滑肌肌動蛋白陽性血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的分揀蛋白在未損傷和I/R損傷心臟中相當(dāng)(圖2d)。與此前的研究結(jié)果一致，在未損傷的心肌中，交感神經(jīng)纖維排他性地表達(dá)P75NTR，其對酪氨酸羥化酶具有免疫反應(yīng)性(圖2e，左圖)。但是，在I/R損傷心臟的梗死周圍區(qū)域中，P75NTR在營養(yǎng)不良的軸突(圖2e，右圖)以及浸潤細(xì)胞亞群(數(shù)據(jù)未列出)表達(dá)。令人驚訝的是，在梗死周圍區(qū)域的TOGFRi1-陽性周細(xì)胞中也誘導(dǎo)p75NTR表達(dá)(占周細(xì)胞群的 10%;圖2f，插圖)，但是在內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)(數(shù)據(jù)未列出)。下面評估在分揀蛋白和SorCS2中的表達(dá)。未損傷心肌大部分小動脈中的血管平滑肌細(xì)胞(圖2g)以及造血細(xì)胞亞群(數(shù)據(jù)未列出)中也表達(dá)SorCS2。在I/R損傷心臟中，梗死周圍的平滑肌細(xì)胞保持了SorCS2免疫反應(yīng)性(圖2)， 其在定居巨噬細(xì)胞和浸潤細(xì)胞中也可以檢測到(數(shù)據(jù)未列出)。最后，在梗死周圍區(qū)域roGFRi1-免疫陽性周細(xì)胞亞群中誘導(dǎo)產(chǎn)生SorCS2 (占所有周細(xì)胞的 10-20% ;圖2h)?？偠灾?，這些結(jié)果表明在缺血-再灌注損傷后，協(xié)同誘導(dǎo)產(chǎn)生了 proNGF及其受體P75NTR。proNGF在體內(nèi)的表汰增加。為闡明proNGF在心臟中的病理生理作用，制備Ngf編碼外顯子被突變等位基因取代使弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)受損的敲入小鼠(aa-K120R121突變?yōu)锳A)。此外，在C-末端加入血凝素(HA)表位標(biāo)簽以便于刪除(Prongf-ha)(圖4)。鑒定表達(dá)一個等位基因Prongf-ha和一個內(nèi)源性等位基因的三個獨(dú)立產(chǎn)生的小鼠品系(proNGF-HA/+小鼠)，以及表達(dá)一個等位基因Ngf-ha和一個內(nèi)源性等位基因的兩個獨(dú)立產(chǎn)生的小鼠品系(wtNGF-HA/+小鼠)。wtNGF-HA/+小鼠可存活、能夠繁殖并且與其NGF+/+野生型同窩小鼠無法通過肉眼辨另O。盡管在混合背景(129+C57B1/6) proNGF-HA/+幼崽中觀察到的胚胎致死率為30_50%，在完全C57B1/6背景的小鼠中，存活的幼崽能夠發(fā)育成熟并在成年后具有繁殖能力。因?yàn)閣tNGF-HA/+和proNGF-HA/+小鼠均表達(dá)一個內(nèi)源性等位基因Ngf，對單體型機(jī)能不全NGF+/_小鼠(CroWleyl994)進(jìn)行平行分析，并將其作為評估proNGF獲得功能表型的對照。對胚胎或新生動物心臟組織進(jìn)行RT-PCR檢測，對Prongf-ha mRNA和Ngf-hamRNA的表達(dá)進(jìn)行確證。由于在包括心臟在內(nèi)的靶器官內(nèi)NGF的表達(dá)在納摩水平以下(Lommatzsch2005),因而發(fā)明人無法在未受損的新生或成年心臟切片中檢測HA的免疫反應(yīng)性(proNGF-HA或wtNGF-HA)(數(shù)據(jù)未列出和見圖2)。但是，在wtNGF-HA/+腦中檢測到了 HA的免疫反應(yīng)性，其中NGF的水平比心臟約高2倍，且NGF的表達(dá)集中在神經(jīng)元亞集中。使用檢測成熟結(jié)構(gòu)域以及proNGF和成熟NGF的抗體進(jìn)行ELISA分析，結(jié)果表明，在proNGF-HA/+小鼠中總NGF蛋白的表達(dá)水平與其NGF+/+同窩接近(NGF+/+腦:141.0+/-8.16ng/g[平均值 +/-SEM] ；proNGF-HA/+ 腦:152.5+/-3.8ng/g ；NGF+/+ 心臟:85.2+/-1.8ng/g ；proNGF-HA/+ 心臟:84.5+/-5.3ng/g)。為了 分別確證在 proNGF-HA/+ 或wtNGF-HA/+小鼠中proNGF或成熟NGF的表達(dá)情況，使用HA表位標(biāo)簽對心臟或腦裂解物中所有的NGF亞型進(jìn)行免疫沉淀。在wtNGF-HA/+小鼠的腦裂解物中僅觀察到了成熟的NGF-HA( 14kDa= 13.5kDa成熟NGF+ 0.7kDa HA)。盡管可檢測到某些裂解為成熟的NGF (約占總水平的 10%)，但是 ProNGF-HA ( 35kDA= 34kDa proNGF+ 0.7kDa HA)仍為在 proNGF-HA/+腦裂解物中觀察到的豐度最高的表達(dá)形式。在proNGF-HA/+心臟裂解物中，在PO時僅可以檢測到proNGF。見圖3b。這些結(jié)果證實(shí)了成熟NGF是在wtNGF-HA/+小鼠的細(xì)胞中以及由細(xì)胞分泌的最主要的亞型，而在proNGF-HA/+小鼠中引入抗裂解proNGF外顯子顯著消除proNGF裂解為成熟的NGF。成年期的ProNGF-HA/+小鼠表現(xiàn)出心室擴(kuò)張。為分析proNGF在心臟中表達(dá)的作用，對成年proNGF-HA/+小鼠進(jìn)行檢查。與年齡匹配小鼠的NGF+/+心臟相比，在8月齡(mo)的proNGF-HA/+小鼠中觀察到了明顯的心臟兩心室擴(kuò)張(圖5a，c)。NGF+/_ (圖5b)和wtNGF-HA/+ (數(shù)據(jù)未列出)小鼠的心腔還是正常的，提示該表型反映了 proNGF的表達(dá)，而非成熟NGF的單體型機(jī)能不全或靶向該等位基因的無意識后果。在更高的放大倍數(shù)下(圖5d-f)，觀察到了浸潤細(xì)胞和肌原纖維脫落病灶增加，其主要出現(xiàn)在proNGF-HA/+而非NGF+/+或NGF+/_心肌的心內(nèi)膜下方區(qū)域。這些浸潤細(xì)胞表達(dá)組織細(xì)胞標(biāo)記物⑶68+ (圖5g-1)或，不太常見地，將其與肥大細(xì)胞標(biāo)記物FITC-親和素共標(biāo)記(數(shù)據(jù)未列出)。Masson三色染色評估發(fā)現(xiàn)，在8月齡時，pioNGF-HA/+小鼠的心內(nèi)膜下方區(qū)域出現(xiàn)了廣泛的纖維化區(qū)域，而其未見于對照動物中(圖5j-l)。該表型是心肌炎和擴(kuò)張性心肌病(DCM ;見綜述Chihakova2008)患者中可見的陳舊性損傷。為了確證在proNGF-HA/+小鼠中的心臟纖維化，使用透射電鏡顯微鏡檢查法對4月齡小鼠心臟的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查(圖6)。NGF+/+和NGF+/_心臟的外觀是健康的，其心臟的肌細(xì)胞表現(xiàn)為Z線完整、線粒體形態(tài)正常、和具有脂滴。而相反地，proNGF-HA/+小鼠出現(xiàn)了肌原纖維損傷和帶有異常嵴的腫脹線粒體，以及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)減少同時偶見明顯破裂且處于管腔外的紅細(xì)胞。這些觀察結(jié)果確證了利用光學(xué)顯微觀察到的組織學(xué)結(jié)果，并且證實(shí)了在proNGF-HA/+心肌的早期成年期出現(xiàn)血管表型。P75NTR的遺傳刪除挽救DroNGF介導(dǎo)的心肌病。為確定在proNGF-HA/+小鼠中功能性損傷的時程,從2月齡(mo)開始對一組小鼠進(jìn)行經(jīng)胸廓的超聲心動圖檢查。與NGF+/+同窩和wtNGF-HA/+敲入小鼠相比，proNGF-HA/+小鼠在生命的早期階段即可觀察到功能性心臟損傷(圖7a為典型軌跡)?？v向分析表明，與NGF+/+和NGF+/_動物相比，在2月齡時proNGF-HA/+小鼠的收縮功能就明顯受損且其表現(xiàn)為進(jìn)行性的(圖7b，將NGF+/+[實(shí)心藍(lán)色菱形]與proNGF-HA[實(shí)心紅色方塊]比較)。在所有已分析的年齡中，與NGF+/+小鼠相比，proNGF-HA/+小鼠的短軸縮短率明顯受損(P〈0.005，Student t-檢驗(yàn))。例如，在 2月齡時，proNGF-HA小鼠的短軸縮短率(FS)為44.0%(+/_11.6，平均值+/_SEM，n=31)，而相比之下 NGF+/+小鼠為 66.2% (+/_5.3，η=18 ;Ρ〈0.002，Studentt-檢驗(yàn))。5月齡時，proNGF-HA/+小鼠的短軸縮短率為29.9% (+/-2.9，n=15)，而NGF+/+小鼠為 56.9%(+/-3.4，η=14 ;Ρ〈0.002，Student t_ 檢驗(yàn))。還觀察到 proNGF-HA/+ 小鼠在 4-8月齡時死亡。實(shí)際上，Kaplan-Meier分析顯示與NGF+/+小鼠相比，proNGF_HA/+小鼠顯著損失，在4月齡時其死亡率為50% (圖7c)。這樣，通過后期在proNGF-HA/+小鼠中的短軸縮短率異?？赡艿凸佬募〔〉膰?yán)重程度，因?yàn)榇蟛糠謕roNGF-HA/+動物在8月齡以前死亡。為確定在proNGF-HA/+小鼠中觀察到的心肌病是否是由已確立的proNGF受體、P75NTR和分揀蛋白活化導(dǎo)致的，發(fā)明人對p75NTR (p75NTR^ ；proNGF-HA/+ ；n=14)或分揀蛋白(sort+ ；proNGF-HA/+ ；n=15)缺陷的proNF-HA/+小鼠進(jìn)行了評估。假定如果觀察到的擴(kuò)張性心肌病由proNGF與p75NTR和/或分揀蛋白的結(jié)合導(dǎo)致，則刪除針對proNGF的這兩個受體之一就可以阻止該表型。的確，超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，P75刪除可以挽救心臟收縮性過低(圖7a，典型軌跡，b空心紅色方塊)。即使在8月齡時，p75+ ；proNGF-HA/+的壁動分?jǐn)?shù)仍與NGF+/+心臟相當(dāng)(與NGF+/+小鼠比較P>0.05，Student t_檢驗(yàn))。伴隨著功能上的挽救，與proNGF-HA/+動物相比(數(shù)據(jù)未列出)，p75NTR^ ；proNGF-HA/+心臟的生存期更佳(與NGF+/+小鼠相同)并且其具有正常的組織學(xué)外觀。令人驚訝的是，分揀蛋白缺乏不會挽救proNGF-HA/+小鼠在短軸縮短率或兩心室擴(kuò)張和心臟纖維化的組織學(xué)證據(jù)方面的缺陷(圖7b，實(shí)心綠色三角，數(shù)據(jù)未列出)。Kaplan-Meier存活分析顯示,50%的sort+ ；proNGF-HA/+小鼠在4月齡時死亡，其余小鼠中>90%在8月齡時死亡(數(shù)據(jù)未列出)，這與在proNGF-HA/+小鼠中得到的數(shù)據(jù)一致(圖7c)。這些結(jié)果表明，單獨(dú)的P75NTR就足以介導(dǎo)proNGF-誘導(dǎo)的心臟障礙，或者另一個分揀蛋白家族成員是該系統(tǒng)的共受體。通過對雜細(xì)胞中表達(dá)的蛋白進(jìn)行免疫共沉淀評估后發(fā)現(xiàn)，proNGF與分揀蛋白和SorCS2的結(jié)合程度相當(dāng)，這表明在鼠源性心臟中SorCS2是P75NTR的共受體(圖3)。對wtNGF-HA/+、sort+、NGF+/'和p75NTR+小鼠進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，在這些小鼠中心臟壁動無明顯異常。因而，proNGF的表達(dá)而非成熟NGF缺乏介導(dǎo)了所觀察到的心肌病。心臟障礙開始于微血管內(nèi)皮細(xì)胞早期。為鑒定proNGF介導(dǎo)的心臟障礙的機(jī)制,對來自于年輕NGF+/+和proNGF_HA/+小鼠的心臟進(jìn)行分析(圖8)。在I月齡時，NGF+/+、NGF+/_、和proNGF_HA/+心臟之間組織學(xué)類似(圖8a-c)，其具有完整的肌原纖維以及正常的動脈和靜脈(數(shù)據(jù)未列出)。隨后進(jìn)行投射電子顯微鏡檢查(TEM)以便對心臟的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。I月齡NGF+/+、NGF+/'和proNGF_HA/+小鼠的心臟表現(xiàn)為正常心肌細(xì)胞形態(tài)，其具有健康的肌原纖維和線粒體。但是，與NGF+/+和NGF+/_小鼠的心臟不同，proNGF-HA/+心臟表現(xiàn)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，其特征為可見大量細(xì)胞質(zhì)空泡和深入管腔的膜片(圖8f，箭頭)。在對proNGF-HA/+小鼠(N=2)的評估中發(fā)現(xiàn)，左心室已檢查的 40/75個微血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出這些活化指征中的一個或多個。而相反地，在平行分析的NGF+/+ (N=2)或NGF+ (n=2)心臟的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這些異常的為5%以下。此外，我們在proNGF-HA/+血管的管腔中觀察到纖維狀的、高電子密度沉積其形態(tài)與纖維蛋白鏈類似，并且在這些心臟中我們觀察到纖維蛋白(原)的免疫反應(yīng)性增加。最后，在proNGF-HA/+心臟的若干微血管中出現(xiàn)了血管周圍水腫同時伴有內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)的緊密排列喪失(已檢查的血管中為3/16 ;例如，見圖8f，星號)。這些結(jié)果表明在PioNGF-ΗΑ/+小鼠生命的早期階段其心臟微血管的內(nèi)皮即出現(xiàn)異常，這可能導(dǎo)致其在晚期出現(xiàn)心臟纖維化和擴(kuò)張性心肌病。微血管血柃和完糖件喪失導(dǎo)致在proNGF-HA/+小鼠中出現(xiàn)擴(kuò)張件心肌病。為評估在年輕proNGF-HA/+小鼠中導(dǎo)致其微血管損傷的組織學(xué)和電子顯微鏡檢查證據(jù)的潛在機(jī)制，使用三個參數(shù)對微血管的完整性進(jìn)行評估。為了評估在proNGF-HA/+動物中是否是內(nèi)皮細(xì)胞活化導(dǎo)致了血小板捕獲和纖維蛋白(原)沉積，對CD41 (檢測血小板)和纖維蛋白(原)的免疫反應(yīng)性進(jìn)行評估。與野生型同窩相比，在proNGF-ΗΑ/+小鼠的微血管中觀察到⑶41的免疫反應(yīng)性增加(圖9a和b)和纖維蛋白沉積增加。而相反地，P75NTR+ ；proNGF-HA/+動物未顯示出血小板(圖9c)或纖維蛋白(原)(數(shù)據(jù)未列出)的免疫反應(yīng)性增力口，表明所觀察到的表型依賴于P75NTR的表達(dá)。其次，對proNGF-HA/+心臟誘導(dǎo)的作為內(nèi)皮細(xì)胞活化指示的ICAM免疫反應(yīng)性與NGF+/+心臟進(jìn)行比較(圖9d和e)，通過p75NTR丟失可以再次對其進(jìn)行挽救(圖9f)，通過半定量分析證明了上述結(jié)果(圖9j和k)。最后，為了評估在proNGF-HA/+心臟中是否微血管的通透性改變，使用FITC-葡聚糖(70kD)在3月齡小鼠中進(jìn)行了灌注研究。在proNGF-HA/+心臟中FITC-葡聚糖大分子的外滲增加，而相比之下在NGF+/+和P75NTR+ ;proNGF-HA/+心臟中的水平較低(圖9g_i)?？傊?，這些結(jié)果表明proNGF利用p75NTR誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和微血栓。為了更好地理解在表達(dá)proNGF-HA的動物中proNGF: p75NTR信號是如何導(dǎo)致微血管損傷的，在發(fā)育和成熟心臟中對proNGF受體進(jìn)行了定位。在延伸至成熟NGF+/+和proNGF-HA/+心臟的酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)交感過程中易于對p75NTR受體進(jìn)行檢測(圖2d和數(shù)據(jù)未列出)。在E17.5胚胎中，當(dāng)發(fā)育心臟的交感侵襲最小時，我們在心臟血管中觀察到了 p75NTR的表達(dá)。在wtNGF-HA/+和proNGF-HA/+心臟中，在微血管中使用周細(xì)胞標(biāo)記物TOGFRii對P75NTR的免疫反應(yīng)性進(jìn)行共定位(占周細(xì)胞群的 10%;圖10b)，但是其不能與異亮氨酸B4-免疫陽性內(nèi)皮共定位(圖10和數(shù)據(jù)未列出)。在新生兒(數(shù)據(jù)未列出)和成年心臟(圖2f)中，分揀蛋白被單獨(dú)免疫定位至小動脈和動脈的平滑肌細(xì)胞，而非微血管周細(xì)胞。在新生兒血管周圍細(xì)胞的亞群中檢測到了亦與proNGF結(jié)合的SorCS2，在PO時其與PDGFR^-陽性周細(xì)胞亞群共定位(占周細(xì)胞的 10% ;圖10c)，但是使用異亮氨酸B4檢測時未見其與內(nèi)皮細(xì)胞共定位(數(shù)據(jù)未列出)。盡管周細(xì)胞群表達(dá)P75NTR和SorCS2，但在PO時僅少數(shù)周細(xì)胞共表達(dá)這兩個受體(圖10d，插圖)。在成年心臟中，SorCS2特異性定位于小動脈的平滑肌細(xì)胞上(圖2g)?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明在晚期胚胎發(fā)育階段，周細(xì)胞亞群表達(dá)P75NTR或SorCS2，以及心臟肌細(xì)胞表達(dá)的proNGF誘導(dǎo)周細(xì)胞障礙，進(jìn)而導(dǎo)致微血管損傷。這些結(jié)果支持了一個模型，即在妊娠晚期和出生后早期支持微血管內(nèi)皮的周細(xì)胞損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化、微血管血栓形成和血管完整性喪失。這些效應(yīng)在微血管缺血和心臟纖維化中達(dá)到頂點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致致死性的擴(kuò)張性心肌病。討論為了揭示proNGF的其他作用，我們制備了在內(nèi)源性ngf啟動子的作用下誤表達(dá)弗林蛋白酶抗性proNGF等位基因的敲入小鼠，以闡述多個器官的病理生理學(xué)后果。已鑒定proNGF-HA/+小鼠的心臟收縮性會出現(xiàn)逐漸加重的進(jìn)行性不足，其反映了proNGF的功能獲得作用，而非成熟NGF減少的功能喪失作用，其已被NGF單體型機(jī)能不全動物的表型缺乏所證實(shí)。組織學(xué)和超微分析表明微血管內(nèi)皮的活化引發(fā)了心臟收縮性過低和纖維化，這導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加和隨后形成瘢痕以及促炎性細(xì)胞因子浸潤。在該組織損傷級聯(lián)中proNGF:p75NTR活化的病理學(xué)作用已被在P75NTR+小鼠中心臟表型的遺傳挽救所確證。這樣，與外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣，心臟利用P75NTR作為proNGF受體復(fù)合物的信號組分。有趣的是，P75NTR和proNGF介導(dǎo)神經(jīng)元作用的共受體分揀蛋白在該表型中不發(fā)揮作用，因?yàn)閟ort-/- ;proNGF-HA/+基因型對該表型無挽救作用。分揀蛋白家族的另一個成員SorCS2，已在本申請中鑒定為介導(dǎo)本申請中所觀察到的心臟表型的P75NTR的共受體。已鑒定在胚胎心臟發(fā)育過程中P75NTR+周細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞在年輕成年小鼠的proNGF介導(dǎo)的心肌病中提供 了令人驚訝的機(jī)制。本申請假定由心臟肌細(xì)胞分泌的proNGF局部地作用于P75NTR+周細(xì)胞以誘導(dǎo)周細(xì)胞障礙，進(jìn)而導(dǎo)致微血管內(nèi)皮缺乏營養(yǎng)支持。實(shí)施例-3。本實(shí)施例說明了如何開發(fā)和鑒定針對proNGF結(jié)構(gòu)域原的人抗體，以及證明抗體對proNGF而非相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子具有特異性。本實(shí)施例還給出了臨床前模型，以顯示抗-proNGF抗體阻止proNGF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，以及在心肌缺血動物模型中促進(jìn)心臟保護(hù)作用。本實(shí)施例進(jìn)一步描述了在急性心肌梗死患者中設(shè)計(jì)的一項(xiàng)小型臨床研究，以確立抗-proNGF抗體的遞送限制梗死尺寸和促進(jìn)心臟恢復(fù)。臨床前研究可以通過重組方法生產(chǎn)ProNGF及其結(jié)構(gòu)域原?？梢詫⒅亟M結(jié)構(gòu)域原作為免疫原，以生產(chǎn)對該結(jié)構(gòu)域原具有特異性和對proNGF具有特異性的抗體?？梢詫贵w中和重組proNGF活性的效力進(jìn)行分析?？梢陨a(chǎn)和鑒定特異性針對結(jié)構(gòu)域原不同區(qū)域的高親和性單克隆抗體。NGF的結(jié)構(gòu)域原和成熟結(jié)構(gòu)域在各種屬間高度保守。如圖12所示，在人和小鼠的NGF結(jié)構(gòu)域原內(nèi)存在顯著一致的區(qū)域，使產(chǎn)生指向結(jié)構(gòu)域原不同區(qū)域、基序或三級結(jié)構(gòu)的抗體譜成為可能。
已證明特異性針對proNGF結(jié)構(gòu)域原的抗體，不識別其他人神經(jīng)營養(yǎng)因子原的結(jié)構(gòu)域原或成熟結(jié)構(gòu)域。ProNGF的結(jié)構(gòu)域原與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子原的那些明確不同(圖13)，使針對ProNGF結(jié)構(gòu)域原產(chǎn)生的抗體不可能與其他家族成員或成熟NGF發(fā)生交叉反應(yīng)。盡管如此，可以通過(i)修訂的雙位點(diǎn)ELISA (ii)免疫共沉淀和(iii)攝取試驗(yàn)對抗-proNGF抗體的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。ELISA -鑒定僅與proNGF發(fā)生相互作用而不與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子原或已知在心血管細(xì)胞中發(fā)揮作用的其他生長因子發(fā)生相互作用的proNGF抗體，對商品化的用于NGF、BDNF、NT-3、NT-4、FGFJP VEGF的ELISA試劑盒進(jìn)行改良，使用抗-proNGF代替這些三明治ELISA檢測中的包被抗體。該方法是可變的，其適于對候選proNGF抗體的范圍進(jìn)行確定性鑒定以及排除與其他生長因子之間的交叉反應(yīng)性。免疫共沉淀-可以對抗-proNGF單克隆抗體識別人、小鼠、可能是豬或靈長類proNGF的能力進(jìn)行評估，以確證其在臨床前模型中的作用?？梢允褂帽磉_(dá)其他種屬proNGF細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行該檢測，并與候選單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀分析。攝取試驗(yàn)-在對一系列抗-proNGF抗體進(jìn)行鑒別后，使用共表達(dá)ρ75.和分揀蛋白或SorCS2的HT1080細(xì)胞評估抗體阻斷proNGF結(jié)合和內(nèi)化的能力?？梢允褂肁lexa-594標(biāo)記重組的proNGF并根據(jù)此前的描述進(jìn)行攝取試驗(yàn)(Feng et al.，J MolBiol.396:967，2010)。在proNGF加入前30min，在培養(yǎng)基中加入抗-proNGF抗體。依文獻(xiàn)中的記載(Feng et al.，J Mol Biol.396:967，2010)采用半定量熒光顯微鏡法于24小時后對內(nèi)化的Alexa-偶聯(lián)proNGF的量進(jìn)行定量。已將該檢測開發(fā)為高通量篩選。作為對照，使用Alexa-偶聯(lián)成熟NGF進(jìn)行比較研究。抗-結(jié)構(gòu)域原抗體應(yīng)將proNGF免疫耗竭,而成熟NGF則不能。細(xì)胞死亡試驗(yàn)-一旦已鑒別抗-proNGF抗體阻斷proNGF的攝取，則可以使用共表達(dá)P75和分揀蛋白或SorCS2的HT-1080細(xì)胞以及原代頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)神經(jīng)元驗(yàn)證其阻斷proNGF誘 導(dǎo)的細(xì)胞死亡的作用。后面的模型已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)營養(yǎng)因子原促凋亡性質(zhì)的文獻(xiàn)中(參見，例如 Lee, Science, 294:1945-48 (2001) ; Teng et al., JNeurosci,25:5455 (2005);Yano et al., J Neurosc1.，29:14790(2009))。擬實(shí)施的抗體優(yōu)化包括親和性突變和半衰期延長。對抗-NGF的效能進(jìn)行臨床前分析。在嚙齒類動物的心臟缺血/再灌注模型中對抗-proNGF的潛在生物治療作用進(jìn)行研究，隨后擴(kuò)展至豬/犬或靈長類模型中。將目前使用的多克隆抗-proNGF抗體作為對照。簡而言之，對動物插管，通過夾閉冠狀動脈左前降支使冠狀動脈缺血40分鐘，隨后進(jìn)行再灌注。再灌注后2至6小時開始遞送抗-proNGF (與在人體內(nèi)的遞送次數(shù)一致)。每日對動物給藥一次(或依據(jù)基于藥理學(xué)研究的最佳方案)。在嚙齒類動物中正在進(jìn)行在缺血/再灌注損傷后1、3、7、10天對proNGF的水平進(jìn)行定量的研究，其能夠指導(dǎo)治療的持續(xù)時間。使用三種方法確定效能。第一種，在3或10天處死一組動物，分析血液和心臟組織中的proNGF水平(通過ELISA和Western印記)、p75和分揀蛋白/SorCS2脫落的外結(jié)構(gòu)域(配體結(jié)合和受體活化的標(biāo)記物)、以及微血管標(biāo)記物(Western印記)。第二種，在3或10天處死一組嚙齒類動物，對心臟進(jìn)行組織學(xué)檢查。其能夠檢查梗死尺寸，以及微血管的保護(hù)(形態(tài)學(xué)評估)。最后一種，在第3天和第10天缺血再灌注后使用多普勒血流超聲心動圖對一組嚙齒類動物進(jìn)行成像，以評估遞送至壁動異常區(qū)域的抗-proNGF的功能性效應(yīng)(與濃度相等的同型匹配的非免疫性IgG進(jìn)行比較)。在更大的哺乳動物(豬)中進(jìn)行比較研究，其一般用于心臟保護(hù)研究。作為附加的分析，在proNGF “敲入”小鼠模型中進(jìn)行了研究。ProNGF的免疫中和將阻止在該動物中觀察到的進(jìn)行性心肌病。在這些研究中，使用抗-proNGF抗體對一組表達(dá)proNGF的小鼠(2-4個月齡)進(jìn)行兩個月的治療，進(jìn)行多普勒成像以記錄心臟功能的改善情況，進(jìn)行組織學(xué)分析以記錄微血管的保護(hù)和proNGF表達(dá)的減少。轉(zhuǎn)化研究:評估心肌缺血后人血漿中proNGF的水平。對人血漿中總NGF的水平進(jìn)行檢測，其與此前的報(bào)道一致。利用貯存標(biāo)本或在威爾醫(yī)療中心進(jìn)行一項(xiàng)前瞻性研究，使用抗-結(jié)構(gòu)域原抗體開發(fā)一種定量ELISA，以確定人MI后誘導(dǎo)產(chǎn)生proNGE的程度。在急診室中收集血液，在支架/擴(kuò)張后立即收集，然后連續(xù)4天每24小時收集一次，然后隨訪I至2周?？梢詫⒃摲治鰯U(kuò)展至“生物標(biāo)記物組”以評估P75脫落的結(jié)構(gòu)域水平，將其作為臨床試驗(yàn)的直接終點(diǎn)，以及對心臟損傷進(jìn)行常規(guī)評估(肌鈣蛋白)。應(yīng)注意，P75外結(jié)構(gòu)域在人血漿中的存在水平較低。在臨床前模型中，配體結(jié)合后脫落的外結(jié)構(gòu)域增加。臨床方法:患者選擇。僅考慮此前無心肌梗死史的患者(無既往病史，或既往壓力測試或心臟成像正常)，以及無其他顯著的合并癥，且陽性癥狀出現(xiàn)/持續(xù)時間少于6小時(允許范圍為2-6小時)。必須對患者進(jìn)行心臟插管評估，并且患者同意安裝支架或擴(kuò)張(無禁忌癥)。患者評估和藥物遞送。利用心臟導(dǎo)管插入術(shù)，必須證明患者的射血分?jǐn)?shù)減少至少15%，并伴有可辨識的冠狀動脈損傷，局部壁動異常，無持續(xù)性的房性和室性心動過速，以及安裝支架/擴(kuò)張后血流恢復(fù)。理想的，在再灌注后4-8小時內(nèi)給予藥物(抗-proNGF)或?qū)φ?。PK/ro研究。在24小時內(nèi)每6小時評估一次生物標(biāo)記物，隨后連續(xù)4天每日一次，然后在遞送后1-2周一次。其包括對血漿中的proNGF (ELISA)和p75的脫落外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(ELI SA)。效能分析。 使用心臟MRI，用于評估功能性壁動異常的超聲心動圖對患者進(jìn)行評估，在遞送2至4周后功能恢復(fù)。
權(quán)利要求
1.一種限制對象急性心肌缺血后微血管損傷的方法，包括給予對象ProNGF拮抗劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ProNGF拮抗劑是proNGF的特異性抗體，其抑制proNGF與p75NTK和/或SorCS2的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗體為指向proNGF的pro-結(jié)構(gòu)域的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述proNGF拮抗劑是核酸或肽適體,其與proNGF特異性結(jié)合并抑制ProNGF與p75N 和/或SorCS2的結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述proNGF拮抗劑是寡肽或小分子，其抑制proNGF 與 p75N 和 / 或 SorCS2 的結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述核酸分子是反義分子或SiRNA，其降低proNGFmRNA的水平或活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述proNGF拮抗劑在急性心肌缺血48小時內(nèi)給予對象。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述proNGF拮抗劑通過攝食、注射、經(jīng)皮介入的導(dǎo)管遞送、或在開心手術(shù)中直接給予心臟的方式給予對象。
9.一種限制對象急性心肌缺血后微血管損傷的方法，包括給予對象SorCS2拮抗劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述SorCS2拮抗劑是指向SorCS2的抗體，其阻止proNGF與SorCS2的結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗體是指向SorCS2外功能區(qū)結(jié)構(gòu)域的抗 體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述SorCS2拮抗劑是核酸或肽適體，其與SorCS2結(jié)合并阻止proNGF與SorCS2的結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述SorCS2拮抗劑是寡肽或小分子化合物，其抑制SorCS2與proNGF和/或p75NTR的相互作用。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述SorCS2拮抗劑是反義分子或siRNA，其降低SorCS2mRNA的水平或活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述SorCS2拮抗劑在急性心肌缺血48小時內(nèi)給予對象。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中SorCS2拮抗劑通過攝食、注射、經(jīng)皮介入的導(dǎo)管遞送、或在開心手術(shù)中直接給予心臟的方式給予對象。
全文摘要
本發(fā)明鑒定了一種新的配體-受體系統(tǒng)，proNGF和p75NTR/SorCS2，已發(fā)現(xiàn)其與心臟的微血管功能有關(guān)。本發(fā)明提供了一種基于給予該新鑒定的系統(tǒng)的拮抗劑限制急性心肌缺血后微血管損傷的方法，從而促進(jìn)心肌的恢復(fù)。
文檔編號A61K31/7088GK103228295SQ201180039533
公開日2013年7月31日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月15日
發(fā)明者B·亨普斯特德, 蕭家珍 申請人:康奈爾大學(xué)