鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用，實驗結(jié)果表明，鳶尾素能夠減小缺血再灌注引起的心肌梗死面積和降低缺血再灌注引起的乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白（cTnI）、肌酸激酶（CK）等心肌酶標志物的含量增加，同時降低心肌缺血再灌注引起的炎性反應，心肌細胞凋亡和氧化應激反應，并促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ核移位和抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核移位，從而減弱缺血再灌注引起的心肌結(jié)構(gòu)損傷和負荷增加，因此能夠用于預防和減弱心肌再灌注損傷，對治療心肌缺血具有重要的臨床意義。
【專利說明】鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]缺血心肌病是全球致死率最主要的疾病之一，嚴重危害著人們的健康。缺血性心肌病是由于冠狀動脈硬化或者血栓造成的血管堵塞，血流循環(huán)受阻或中斷使得心肌氧和能量供應平衡被打破，心肌能量代謝紊亂，從而導致心肌梗塞、心衰等組織病理損害。目前克服缺血最有效的治療方法是重新疏通血流、恢復血液供應，包括球囊擴張、動靜脈溶栓、體外循環(huán)、冠脈搭橋等，即再灌注。但是，自從I960年第一次提出了心肌缺血再灌注損傷之后，這一難題就一直困擾著醫(yī)學工作者，大量動物實驗和臨床結(jié)果表明，再灌注雖然極大地改善了心肌供血的問題，但是由于大量富含氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)的血液進入缺血區(qū)，反而會導致缺血時產(chǎn)生的組織損傷進一步加劇，引起心律失常、心臟破裂、心衰等并發(fā)癥。臨床研究顯示，心肌缺血再灌注損傷在心血管外科手術(shù)中非常常見，其在冠脈搭橋早期死亡、心肌梗死、心臟移植失敗等情況中占著很大的比例。因此，如何預防和減弱心肌再灌注損傷已成為重大的臨床課題。
[0003]心肌缺血再灌注損傷的具體機制仍然不是很清楚。心肌缺血時導致能量代謝不足，ATP耗竭，再灌注過程中細胞內(nèi)鈣超載、產(chǎn)生大量氧自由基，直接或間接破壞膜磷脂、蛋白質(zhì)、DNA;同時，中性粒細胞等炎癥細胞的趨化、浸潤以及炎癥因子的產(chǎn)生和分泌在心肌再灌注損傷中也起著重要 作用，這些炎癥反應不僅直接損傷心肌組織，還會造成免疫性血管損傷。但是，通過清除自由氧(超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽等)、改善缺血組織代謝(如護心通、萬爽力等)、添加免疫抑制劑等防治心肌再灌注損傷在臨床中應用的效果并不佳。因此，亟需一種有效而副作用小的治療方法或藥劑來實現(xiàn)預防和治療心肌缺血再灌注損傷。
[0004]過氧化物增殖激活受體協(xié)同激活子(PGC-1 a )是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，介導了很多能量代謝有關(guān)的生物過程，尤其是在多種細胞進行的調(diào)節(jié)線粒體生物合成和氧化代謝。2012年，Bostr6m發(fā)現(xiàn)運動促使骨骼肌表達PGC-1 a增強，而PGC-1 a又使纖維連結(jié)蛋白III型域包含蛋白5 (FNDC5)水平上升，F(xiàn)NDC5是一種全長196氨基酸的纖維連結(jié)蛋白III型域包含蛋白的跨膜蛋白，是一種強有力的誘導棕色脂肪形成的誘導劑，其水解片段可分泌入血進入血液循環(huán)，F(xiàn)NDC5在心肌的含量很豐富，其對心臟的功能影響目前尚不清楚，并且臨床研究發(fā)現(xiàn)在心衰患者中FNDC5表達有所下降。FNDC5切除N端信號肽后在GLU142處被裂解形成約110個氨基酸的多肽，該多肽被命名為鳶尾素(Irisin)。鳶尾素是否對心肌缺血再灌注損傷有影響目前仍然未知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供如下技術(shù)方案:
[0007]鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用。其中鳶尾素的氨基酸序列如下SEQ ID N0.1所示，具體為:
[0008]AspSer Pro Ser Ala ProValAsnValThrValThrValArgHisLeuLysAlaAsnSerAlaVal Val Ser TrpAspValLeuGluAsp GluValValIleGlyPheAlaIleSerGlnGlnLysLys Asp ValArgMetLeuArgPheIleGlnGluValAsnThrThrArgSer CysAlaLeu TrpAsp LeuGluGluAspThrGlu TyrIleValHisValGluAlaIleSerIleGlnGly Glu SerProAlaSerGluProValLeuPheLysThrProArgGluAlaGlu LysMetAla Ser Lys AsnLysAspGluValThrMetLysGlu[0009] 進一步，鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌梗死的藥物中的應用。
[0010]進一步，鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌酶標志物升高的藥物中的應用。
[0011]更進一步，所述心肌酶標志物為乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白或肌酸激酶。
[0012]進一步，鳶尾素在制備預防肌缺血再灌注引起炎性反應的藥物中的應用。
[0013]進一步，鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起氧化應激的藥物中的應用。
[0014]進一步，鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌細胞凋亡的藥物中的應用。
[0015]進一步，鳶尾素在制備促進過氧化物酶體增殖物激活受體Y核移位的藥物中的應用。
[0016]進一步，鳶尾素在制備抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B核移位的藥物中的應用。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用，通過構(gòu)建SD大鼠心肌缺血再灌注模型，探究鳶尾素對缺血再灌注引起的心臟功能障礙的作用影響，通過實驗證明了外源性鳶尾素能夠明顯減弱缺血再灌注引起的心肌梗死面積擴大和心肌酶譜標志物(cTnl、LDH和CK)的釋放，抑制缺血再灌注引起的左心室射血分數(shù)的下降和收縮、舒張末期容積的上升，因此鳶尾素能夠減弱缺血再灌注引起的心肌結(jié)構(gòu)損傷和負荷增加；此外，鳶尾素明顯降低了缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡、炎癥因子合成和釋放、炎癥細胞浸潤以及氧化應激，進一步證明了鳶尾素抵抗心肌缺血再灌注損傷的作用；本發(fā)明還通過體外H9C2心肌細胞實驗(包括缺/復氧和H2O2處理)，模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注，探討鳶尾素對心肌細胞缺/復氧損傷的作用和影響，體外實驗與體內(nèi)實驗結(jié)果相似，即外源性的鳶尾素有效抑制缺/復氧引起的心肌細胞活力下降，減少缺/復氧引起的心肌細胞LDH的釋放，并且呈劑量依賴的關(guān)系；通過免疫熒光實驗表明，當心肌細胞缺/復氧時，進入心肌細胞胞漿的鳶尾素增多，加入過量外源性的鳶尾素后，心肌細胞的DNA凝集現(xiàn)象明顯減弱；鳶尾素對H2O2處理的心肌細胞的影響與前者相似；這些結(jié)果證明了鳶尾素確實具有抵抗心肌細胞缺/復氧損傷的作用。
[0018]本發(fā)明還對鳶尾素抵抗缺血再灌注損傷的部分信號機制作了研究，結(jié)果表明在缺血再灌注的心肌細胞中，鳶尾素促進PPARy從胞漿向胞核的轉(zhuǎn)位而抑制NF-κ B從胞漿向胞核的轉(zhuǎn)位；從而證實了鳶尾素部分通過PPAR Y發(fā)揮抵抗心肌細胞損傷的作用；同時本發(fā)明對鳶尾素在心肌細胞中是怎么影響PPARy的轉(zhuǎn)位也做了研究，當加入過量Nystatin后，鳶尾素抵抗心肌缺氧損傷的作用明顯下降，鳶尾素可能部分通過脂筏進入細胞內(nèi)調(diào)節(jié)PPARy及NF-K B而發(fā)揮作用；而脂筏的主要構(gòu)成成分為小窩蛋白I,是一種重要的支架蛋白，因此鳶尾素可能會引起的小窩蛋白I上調(diào)，鳶尾素可能部分通過小窩蛋白I促進PPAR Y的核轉(zhuǎn)位抑制NF- K B核轉(zhuǎn)位，從而發(fā)揮保護作用。
[0019]本發(fā)明第一次發(fā)現(xiàn)鳶尾素可以用于預防和治療心肌缺血再灌注損傷(心梗面積擴大，心肌標志物釋放增加，心肌負荷增加，炎癥反應、氧化應激和凋亡增加)，抑制炎性反應可以通過以下的機制解釋:通過促進PPARs向核移位而抑制了 NF-κ B相關(guān)的炎性因子表達，減少了炎癥細胞對組織的浸潤，明顯降低了再灌注后的炎性反應。本發(fā)明首次提出并證明了鳶尾素具有抵抗組織器官缺血再灌注損傷的作用，不僅僅拓寬了鳶尾素的研究和應用，同時也為預防和治療缺血再灌注損傷提供了新的靶點和視野。由于鳶尾素是人體自身的分泌蛋白，其所帶來的副作用相對較小，因此可應用于藥品和保健品之中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明的進一步特點在下面的圖示中進行了更加全面的描述:
[0021]圖1為TTC染色法測量心肌缺血再灌注梗死面積的結(jié)果(*表示與對照組比較，#表示與I/R組比較，P〈0.05，n=12)。
[0022]圖2為心肌缺血再灌注心肌酶譜表達結(jié)果(A:cTnI表達結(jié)果；B:LDH表達結(jié)果；C:CK表達結(jié)果，*表示與對照組比較，#表示與I/R組比較，P〈0.05，n=12)。
[0023]圖3為irisin對心肌缺血再灌注的影響(A:irisin對心肌缺血再灌注的超聲圖片；B:為左心室射血分數(shù)測量結(jié)果，C:左心室舒張末容積；D:左心室收縮末容積；*表示與對照組比較，#表示與I/R組比較，P〈0.05，n=12)。
[0024]圖4為不同濃度鳶尾素對心肌缺血再灌注心肌酶譜表達結(jié)果(A:cTnI表達結(jié)果；B:LDH表達結(jié)果；C:CK表達結(jié)果，*表示與對照組比較，#表示與I/R組比較，P〈0.05，n=12)。
[0025]圖5為左心室射血分數(shù)測量結(jié)果。
[0026]圖6為缺血前(30min)和缺血后使用鳶尾素對心肌缺血再灌注損傷的影響(A:cTnl表達結(jié)果；B:LDH表達結(jié)果；C:CK表達結(jié)果；*表示與對照組(control)比較，#表示與 I/R 組比較，P〈0.05，n=13)。
[0027]圖7為TUNEL染色法測量心肌凋亡的結(jié)果。
[0028]圖8為凋亡蛋白Bcl_2、Bax和caspase-3的表達結(jié)果。
[0029]圖9為凋亡蛋白caspase-3活性檢測結(jié)果。
[0030]圖10為缺血再灌注后的氧化應激指示檢測結(jié)果(A =MPO檢測結(jié)果；B:MDA檢測結(jié)果；C:S0D檢測結(jié)果)。
[0031]圖11為血漿炎性因子生成的測量結(jié)果(A:TNF-a檢測結(jié)果；B:1L_6檢測結(jié)果)。
[0032]圖12為心肌組織炎性因子含量的測量結(jié)果(A:TNF-a檢測結(jié)果；B:1L_6檢測結(jié)果)。
[0033]圖13為免疫熒光技術(shù)測定鳶尾素對H9C2心肌細胞缺/復氧的影響。
[0034]圖14為Irisin對H9C2心肌細胞HR后細胞活力和LDH測量結(jié)果(A:細胞活力；B:LDH測量結(jié)果)。
[0035]圖15為(A:免疫熒光技術(shù)測定鳶尾素及鳶尾素與網(wǎng)格蛋白抑制劑介導胞吞途徑CPZ、脂筏介導胞吞途徑抑制劑Nystatin或巨胞吞抑制劑DMA組合物對缺/復氧H9C2心肌細胞的影響；B:細胞活力；C:LDH測量結(jié)果)。
[0036]圖16為Irisin對H2O2處理的H9C2心肌細胞的影響(A =LDH測量結(jié)果；B:細胞活力)。
[0037]圖17為免疫熒光技術(shù)結(jié)果圖(A:鳶尾素對PPARy核移位的影響；B:鳶尾素對NF-K B核移位的影響)。
[0038]圖18為蛋白質(zhì)印跡法測量PPAR Y > NF- K B核移位的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0039]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0040]實驗所用的動物是由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供的重250-260g的SD大鼠，實驗過程中的手術(shù)操作符合大坪醫(yī)院實驗動物協(xié)會的規(guī)定。
[0041]以下實施例采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)以“均值土標準差”表示，采用ANOVA (單因素方差分析)組間兩兩對比分析差異，P〈0.05具有顯著統(tǒng)計學意義。
[0042]一、鳶尾素有效改善心肌缺血再灌注引起的心功能障礙
[0043]將SD大鼠隨機分為五組，分別為對照組(假手術(shù)處理)；缺血再灌注(IR)組；缺血再灌注+鳶尾素組(IR+Irisi n);缺血再灌注+鳶尾素和抗體復合物(1:5)組(IR+Irisin/Ab);缺血再灌注+高溫失活處理的鳶尾素組(IR+Irisin (HI))。將缺血再灌注+鳶尾素組；缺血再灌注+鳶尾素和抗體復合物(1:5)組；缺血再灌注+高溫失活處理的鳶尾素組手術(shù)前30分鐘分別注射5 μ g/kg鳶尾素，5 μ g/kg鳶尾素和抗體復合物(質(zhì)量濃度比為1:5)和5 μ g/kg高溫失活處理的鳶尾素，然后對所有實驗SD大鼠腹腔內(nèi)注射50mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，并對SD大鼠做左側(cè)胸廓切開術(shù)，結(jié)扎冠狀動脈的左前降支30分鐘，之后松開結(jié)扎處進行缺血再灌注，同時對缺血再灌注+鳶尾素組；缺血再灌注+鳶尾素和抗體復合物(1: 5)組；缺血再灌注+高溫失活處理的SD大鼠分別注射5 μ g/kg鳶尾素，5 μ g/kg鳶尾素和抗體復合物(質(zhì)量濃度比為1:5)和5μ g/kg高溫失活處理的鳶尾素。手術(shù)期間，大鼠一直被放置在保溫板上保持體溫(37°c)。手術(shù)之后，切口被縫合，提供足夠的能量和水以便大鼠恢復?；謴凸嘧?4小時之后，收集血液和心肌組織測量心肌梗死面積和心肌酶譜表達，從而了解鳶尾素對心肌缺血再灌注引起的心功能障礙的作用及影響。
[0044]梗死面積測量:首先取實驗SD大鼠心臟，然后用生理鹽水溶液沖洗掉冠狀動脈的血液，之后將左前降支結(jié)扎并從頸靜脈處注射1%的伊凡斯蘭。再將心臟橫切成5片，將這些橫切片在37°C環(huán)境中用1%TTC溶液染色15分鐘，通過Image J測定梗死面積，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，缺血再灌注+鳶尾素組的梗死面積明顯小于其它實驗組，表明鳶尾素可能具有降低缺血再灌注損傷的效果。
[0045]心肌酶譜測量:收集實驗SD大鼠血液，在轉(zhuǎn)速為3000g條件下離心10分鐘，收集血清然后置于冰浴中以供使用。分別使用Beckman Coulter AU臨床生化試劑盒和免疫檢測試劑盒測定樣品中乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白(cTnl)、肌酸激酶(CK)含量，檢測方法按試劑盒說明書進行，檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，與對照組相比，IR組的LDH、cTnI和CK的表達明顯增高，而注射鳶尾素后極大地降低了 LDH、cTnI和CK的表達量。當使用的是鳶尾素與其抗體的復合物或者是高溫失活處理的鳶尾素時，其對心肌的保護作用幾乎消失。
[0046]心臟B超的檢測心功能:將實驗SD大鼠麻醉后固定于操作板上，使用760MHz的超聲探頭，測定左室長軸切面情況，然后根據(jù)超聲檢測結(jié)果計算左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室舒張末容積(LVEDV)、左心室收縮末容積(LVESV)，每只大鼠分別測定3次，取其平均值并計算標準差，其結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示再灌注后左心室射血分數(shù)顯著下降，而舒張末和收縮末的容積顯著升高，但使用鳶尾素后這些變化有了明顯的減小；使用鳶尾素與其抗體復合物(1:5)或高溫失活處理的鳶尾素時該作用幾乎消失。由此可見，適當濃度的鳶尾素可以有效改善心肌缺血再灌注引起的心功能障礙，而且發(fā)揮作用的是鳶尾素的功能成分而不是結(jié)構(gòu)成分。
[0047]按照與缺血再灌注+鳶尾素組相同的方法進行操作，區(qū)別在于分別注射0.1 μ g/kg、0.5 μ g/kg、1μ g/kg和5 μ g/kg鳶尾素,然后使用與上述相同的方法測定實驗SD大鼠LDH、cTnI和CK含量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，灌注鳶尾素后能夠降低缺血再灌注SD大鼠LDH、cTnl和CK含量，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，鳶尾素濃度越高，改善作用越明顯，5 μ g/kg鳶尾素作用最強。
[0048]將實驗SD大鼠制備心肌缺血模型，并于手術(shù)前30分鐘(pro)或手術(shù)后(post)注射5μ g/kg鳶尾素，同時以假手術(shù)模型為對照，然后測定左心室射血分數(shù)和心肌酶譜。左心室射血分數(shù)測量結(jié)果如圖5所示，心肌酶譜結(jié)果如圖6所示。由圖5和圖6可知，缺血前(30min)和缺血后使用鳶尾素都可以較明顯地降低缺血再灌注引起的心肌梗死面積、乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白、肌酸激酶的上升，其中缺血前施藥效果更加明顯，證明了鳶尾素既可用于預防也可用于治療再灌注損傷。
[0049]二、鳶尾素降低心肌缺血再灌注引起的炎性反應、氧化應激和凋亡
[0050]TUNEL染色法測定心肌調(diào)亡，具體為:利用原位細胞死亡探測盒(購自羅氏生物科技有限公司)分別對對照組(假手術(shù)處理)，缺血再灌注(IR)組和缺血再灌注+鳶尾素組(IR+Irisin)實驗SD大鼠的心臟切片，然后將組織切片置于65°C環(huán)境中加熱水化，之后用二甲苯清洗浸泡脫蠟，再依次用體積分數(shù)為100%，95%，80%，70%的酒精進行再水化，然后將切片置于含有20 μ g/mL蛋白激酶K的溶液中，在37°C條件下處理60分鐘后將切片置于質(zhì)量分數(shù)為1%的三硝基甲苯X-100中處理8分鐘，然后將切片用PBS溶液沖洗兩次，最后加入50 μ L的TUNEL反應混合物，將切片在37°C避光的水浴箱中孵育60分鐘，核用DAPI染色，其結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，與對照組相比，IR組在200X的視野中測得的TUNEL陽性細胞數(shù)顯著升高，但是使用了鳶尾素之后下降非常明顯，表明鳶尾素具有抑制細胞凋亡的作用。
[0051]利用蛋白質(zhì)印跡檢測凋亡蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達量,具體為:分別收集對照組(假手術(shù)處理)，缺血再灌注(I/R)組和缺血再灌注+鳶尾素組實驗SD大鼠的梗死的心肌組織，勻漿后分離上清，取50mg的樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并在含有5% (體積百分比)無脂牛奶的TBS溶液中封閉1小時，然后將PVDF膜分別在稀釋濃度為1:500的Bcl-2抗體、1:500的Bax抗體、1: 500的caspase-3抗體或1:1000的β肌動蛋白抗體中4°C過夜培養(yǎng)，然后用TBS溶液將PVDF膜沖洗三次，最后將膜置于稀釋濃度為1:10000的羊抗兔IgG 二抗中室溫培養(yǎng)I小時，染色觀察，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，與對照組相比，IR組caspase-3和BAX凋亡蛋白表達量明顯上升，Bcl_2表達量下降，但是使用了鳶尾素之后caspase-3和BAX表達量明顯下降，但Bcl_2表達量反而升高，上述結(jié)果表明了鳶尾素具有明顯的抑制凋亡的作用。
[0052]檢測凋亡蛋白caspase-3的活性，具體為:按照每IOmg組織加入100 μ L裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿，然后將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，冰浴裂解5分鐘，然后在4°C、16，OOOg條件下離心10分鐘，離心后將上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中。取樣品用Bradford法測定蛋白濃度，使每10 μ L待測樣品中含有10 μ g蛋白，樣本測定加入待測緩沖液、樣本蛋白和Ac-DEVD-pNA(2mM)加入37°C孵育60分鐘；空白對照加入待測緩沖液和Ac-DEVD-pNA (2mM)，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定405nm條件下的吸光度。樣品A4tl5扣除空白對照的A4tl5,即為樣品中caspase3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度，計算結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，與對照組相比，IR組caspase-3活性升高,但使用鳶尾素后caspase-3明顯降低，此結(jié)果同樣表明了鳶尾素具有明顯的抑制凋亡的作用。
[0053]ELISA實驗檢測缺血再灌注后的氧化應激指標(過氧化物酶ΜΡ0、丙二醛MDA和超氧化物歧化酶S0D)，具體為:分別取對照組(假手術(shù)處理)，缺血再灌注(I/R)組和缺血再灌注+鳶尾素組SD大鼠的心臟組織，在預冷的組織裂解緩沖液中用研磨器混勻，然后在4°C、1600g條件下離心10分鐘，取上清液用于檢測MPO，MDA和SOD含量(檢測試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供)，檢測結(jié)果如圖10所示。按照上述準備組織樣品，用R&D Systems公司的ELISA試劑盒檢測血漿和心肌組織中炎性因子含量，血漿中炎性因子檢測結(jié)果如圖11所示，心肌組織中炎性因子檢測結(jié)果如圖12所示。
[0054]由圖10~12可知，MPO、IL-6和TNF-α的測量結(jié)果中，IR組炎性因子水平明顯比對照組要高得多，而使用鳶尾素后有效地降低了氧化應激指標和炎性因子的水平；反映了鳶尾素對抑制炎性和氧化應激反應的作用。MDA測量結(jié)果和前面的相似，而SOD測量結(jié)果中，IR組的水平明顯下降，使用鳶尾素后則大幅度的升高。這些結(jié)果同樣表明了鳶尾素可以明顯抑制再灌注引起的炎性反應和氧化應激反應。
[0055]三、鳶尾素減少缺/復氧和H2O2引起的心肌細胞損傷
[0056]H9C2心肌細胞系放置于DMEM溶液中，其中含有體積分別為10%的高溫滅活的FBS, 100U/mL青霉素G，100mg/mL鏈霉素和2mM的L-谷氨酰胺。將培養(yǎng)細胞分為3組:一組為對照組，不做任何處理，第二組為HR組(通入N2),第三組為HR+irisin組(通入N2,并在通入N2處理前30分鐘加入不同濃度的鳶尾素于細胞培養(yǎng)液中)。將H9C2心肌細胞培養(yǎng)板置于缺/復氧模型盒中，盒蓋上有兩個孔，一孔接通空氣，另一孔通入過量N2使模型盒內(nèi)排盡空氣后，立即密閉兩孔；將模型盒放到37°C缺氧環(huán)境中進行缺復16小時復氧3小時從而形成缺氧復氧模型。然后用免疫熒光技術(shù)測定對照組和缺/復氧組鳶尾素對H9C2心肌細胞缺/復氧的影響，結(jié)果如圖13所示。由圖13可知，缺/復氧時心肌細胞的染色質(zhì)凝集明顯要強得多，且有更多的鳶尾素會向胞漿聚集，這一現(xiàn)象說明了鳶尾素在心肌細胞缺/復氧時可能參與細胞修復，也解釋了心肌缺血再灌注后血液中鳶尾素的含量會下降這一現(xiàn)象。
[0057]將上述3組的實驗H9C2心肌細胞用MTT法測定細胞活力，具體方法為:將細胞混合液去上清，用PBS溶液清洗細胞3次，在細胞培養(yǎng)板各孔加入200 μ L5%的噻唑蘭溶液培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)結(jié)束后，小心移去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，再各加入150 μ L的DMSO溶液，輕微震蕩10分鐘，最后將該孔板用酶標儀在490nm波長處進行檢測光密度值，結(jié)果如圖14A所示。同時利用試劑盒測量LDH含量，結(jié)果如圖14B所示。結(jié)果表明，當心肌細胞在正常的培養(yǎng)條件下，鳶尾素對細胞活力并沒有明顯的影響；而在缺/復氧的情況下，可看到OD值明顯減小，但使用鳶尾素后能夠某種程度恢復OD值，并且該作用與鳶尾素呈劑量依賴關(guān)系，當鳶尾素的劑量超過500ng/mL后，其能力最強，OD值與細胞活力近似成正比，因此，說明鳶尾素可以增強心肌細胞活力，抵抗缺/復氧引起的細胞活力減退。由于心肌缺/復氧時，胞內(nèi)的LDH釋放到保外，引起LDH濃度增高；從14B可以看出，HR組的LDH濃度遠遠高于對照組，而使用了鳶尾素后LDH濃度降低，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，使用500ng/mL鳶尾素時效果最明顯。
[0058]將HR+irisin 組再分為 4 個亞組:一組為 HR+irisin,第二組為 HR+irisin+CPZ(網(wǎng)格蛋白抑制劑)，第三組為HR+irisin+Nystatin(脂筏抑制劑)，第四組為HR+irisin+DMA(巨胞吞抑制劑)，并利用免疫熒光技術(shù)測定鳶尾素對H9C2心肌細胞缺/復氧的影響(圖15A)，LDH含量(圖15B)和490nm波長處的光密度值(圖15C)。由結(jié)果可見，HR組的OD值與對照組相比明顯減低了，使用鳶尾素之后OD值水平明顯上調(diào)，加入CPZ和DMA后對鳶尾素抑制OD值下調(diào)的作用無明顯影響，而加入Nystatin之后幾乎完全阻斷了鳶尾素抑制OD值下調(diào)的能力。在LDH濃度水平測定結(jié)果中，同樣CPZ和DMA對鳶尾素抑制缺/復氧引起的LDH濃度升高的能力無明顯作用，而Nystatin則很大程度地抑制了鳶尾素的作用。鳶尾素對H2O2處理的心肌細胞的影響與缺/復氧結(jié)果相似。這兩部分的結(jié)果說明鳶尾素抵抗缺/復氧損傷的作用部分由脂筏介導的。
[0059]按照與上述相同的方法培養(yǎng)H9C2心肌細胞，然后分為3組，一組為對照組，不做任何處理，第二組為H2O2組(將H9C2心肌細胞加入H2O2至終濃度為100 μ Μ，然后于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時)，第三組為H202+irisin組(向H9C2心肌細胞中加入鳶尾素，30分鐘后加入H2O2至終濃度為100 μ Μ，然后于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時)，將模型盒放到37°C缺氧環(huán)境中進行缺復16小時復氧3小時從而形成缺氧復氧模型，然后利用試劑盒測定LDH含量，并在·490nm波長處檢測光密度值，結(jié)果如圖16所示。由圖16可知，鳶尾素對H2O2處理的心肌細胞的影響與缺/復氧結(jié)果相似。從OD值和LDH濃度這兩方面來看，鳶尾素具有明顯的抵抗心肌細胞缺/復氧損傷的能力。
[0060]四、鳶尾素促進缺/復氧后PPAR Y的核移位而抑制NF- κ B的核移位，發(fā)揮抑制I/R心肌炎癥、氧化應激作用
[0061]將上述對照組、HR組和HR+irisin組的H9C2心肌細胞采用免疫熒光染色檢測，具體為:吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌I次，加入固定液，固定30分鐘，移去固定液，PBS洗滌3次,用0.3%的甲醇處理后，免疫染色封閉液室溫封閉一小時，移去封閉液，按1:50加入PPAR- Y —抗，4°C孵育過夜，之后PBS洗滌3次，再加入TRITC標記二抗(羊抗兔)，37 °C孵育40min ;再用DAPI顯色，PBS洗后常規(guī)脫水，甘油封片，激光共聚焦觀察。吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌I次，加入固定液，固定15分鐘；PBS洗滌3次，加入免疫染色封閉液，室溫封閉一小時；移除封閉液，加入NF-κ B p65抗體，4°C孵育過夜，PBS洗滌3次；加入抗兔Cy3，室溫孵育I小時，PBS洗滌2次；加入DAPI，室溫染色5分鐘，PBS洗滌3次；滴加適當量的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片后熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖17可知。由圖可知，對照組中PPAR-Y主要位于細胞質(zhì)中，胞漿NF-κ B的含量較高，而胞核NF-κ B的含量較少；HR組中PPAR-Y在胞漿和胞核均有表達，胞漿I κ B的含量大幅度減少，胞核NF-κ B的含量增高；HR+irisin組中(與HR組相比)，PPAR- Y主要分布在細胞核，胞漿小窩蛋白I和NF-κ B表達增加，胞核NF-κ B的含量降低。
[0062]同時用蛋白質(zhì)印跡法測量對照組、HR組和HR+ ir i s iη組中細胞核和細胞質(zhì)中PPARy和NF-κ B表達情況，結(jié)果如圖18所示。PPAR-Y正常情況下主要分布于細胞質(zhì)，發(fā)生缺/復氧時，由于小窩蛋白I表達下降，使得PPAR-Y不能有效轉(zhuǎn)位于細胞核抑制NF-κ B活性；NF- κ B正常情況下在胞漿中與NF- κ B結(jié)合成復合體，由于缺/復氧使得NF- κ B含量下降，從而導致NF- κ B向核轉(zhuǎn)位增加。表明鳶尾素上調(diào)小窩蛋白I表達從而促進PPAR- Y向核轉(zhuǎn)位，PPAR- Y在細胞核內(nèi)與NF-κ B結(jié)合抑制其與炎性因子相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性；同時鳶尾素上調(diào)IkB,使得NF- κ B向核轉(zhuǎn)位減少。
[0063]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種 各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌梗死的藥物中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌酶標志物升高的藥物中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于:所述心肌酶標志物為乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白或肌酸激酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備預防肌缺血再灌注引起炎性反應的藥物中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起氧化應激的藥物中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備預防心肌缺血再灌注引起心肌細胞凋亡的藥物中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備促進過氧化物酶體增殖物激活受體Y核移位的藥物中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的應用，其特征在于:鳶尾素在制備抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-K B核移位的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/10GK103585620SQ201310572068
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月16日
【發(fā)明者】曾春雨, 韓愈, 王震, 陳墾, 李郁 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院