專利名稱：作為抗癌化合物載體的線粒體穿透肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及定位至線粒體的可穿透細(xì)胞的肽和它們作為抗癌化合物載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
線粒體的產(chǎn)能能力取決于限制離子或其他小分子透過的屏障的保存。線粒體內(nèi)膜的高疏水性、緊密堆積結(jié)構(gòu)對大多數(shù)分子種類是不可透過的一對于指導(dǎo)氧化磷酸化的質(zhì)子泵送關(guān)鍵的性質(zhì)^內(nèi)膜的不透過性已阻礙了可以靶向線粒體的其他重要生物學(xué)功能(凋亡觸發(fā))的藥物分子的遞送2?？紤]到已在多種癌細(xì)胞中觀察到了耐凋亡性3，能夠通過將凋亡因子靶向線粒體來干涉可以使得新的抗癌劑策略能夠發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)一個方面，提供了包含連接至抗癌化合物的線粒體穿透肽(MPP)的化合物。根據(jù)另外的方面，提供了本文中描述的用于治療癌癥的化合物。根據(jù)另外的方面，提供了包括在本文中描述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。根據(jù)另外的方面，提供了包括在本文中描述的多種化合物的化合物庫。根據(jù)另外的方面，提供了治療癌癥的方法，包括給予受試者治療有效量的本文中描述的組合物。根據(jù)另外的方面，提供了在本文中描述的化合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)另外的方面，提供了在本文中描述的組合物用于治療癌癥的應(yīng)用。根據(jù)另外的方面，提供了在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括給予治療有效量的本文中描述的組合物。


參照以下描述和附圖可以很好地理解本發(fā)明的實(shí)施方式。在描述和附圖中，類似的數(shù)字指的是類似的結(jié)構(gòu)或過程。在附圖中:圖1示出了 mt-Cbl的線粒體定位和毒性。(A)用于研究線粒體藥物定位的熒光標(biāo)記的mt-Cbl結(jié)合物的結(jié)構(gòu)。在所有其他測定中，乙酰基在肽N端取代噻唑橙(to)熒光基團(tuán)。(B)如通過分離的線粒體的免疫金染色法和TEM成像觀測的，MPP在線粒體基質(zhì)中的定位。在分離的小鼠線粒體內(nèi)觀測到相應(yīng)于生物素化肽的定位的金納米顆粒(注意電子密集、較暗區(qū)表示在用于染色的條件下的線粒體基質(zhì))。(C)IOOs線粒體的結(jié)果的定量為主要的基質(zhì)定位提供了定量證據(jù)。(D)與Mitotracker633相比，tont-Cbl在活的海拉細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)定位。(E)在溫育24小時之后mt-Cbl對海拉細(xì)胞的毒性。(F)用在海拉細(xì)胞中Cbl靶向線粒體觀察的 提增加水平的超氧化物。MitoSOX染色以及通過流式細(xì)胞儀的評估與提高的超氧化物一致。(G)Cbl的線粒體遞送使海拉細(xì)胞中的線粒體膜去極化。通過JC-1染色的流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體膜電勢。繪制平均值，n=3，誤差棒是平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。雙尾t-檢驗(yàn)用于確定P值。圖2示出了 Cbl和mt-Cbl在不同的細(xì)胞器中引起DNA損傷。相對擴(kuò)增17.7kb的核DNA區(qū)段，和8.9kb的線粒體DNA區(qū)段。在PCR分析之前用Cbl (150 μ M )或mt-Cbl(3 μ Μ)處理HL60細(xì)胞2小時。損傷/IOkb值包含在圖示的條棒之上。 圖3示出了響應(yīng)于由Cbl和mt-Cbl造成的DNA損傷不同的基因表達(dá)曲線。(A)涉及檢測DNA損傷和誘導(dǎo)凋亡的基因的定量PCR陣列用于評估用LC25劑量的Cbl或mt-Cbl處理2或24小時的HL60細(xì)胞的RNA表達(dá)曲線。為了評估連接酶III的表達(dá)，用LC50劑量的Cbl或mt-Cbl處理細(xì)胞I小時。從mt-Cbl結(jié)果中減去*MPP表達(dá)改變。繪制平均值，n=3，誤差棒等于SEM。(B)具有大于彡4倍表達(dá)改變的定量PCR陣列高亮擊中(hit)的結(jié)果。(C)定量PCR擊中的蛋白表達(dá)水平。在用免疫印跡法評估蛋白水平之前用LC25劑量的Cbl (17μ M)或mt-Cbl (3 μ M )處理HL60細(xì)胞。除了 DDIT3水平以外，在2小時處理之后進(jìn)行所有印跡，它們是在Cbl溫浴24小時之后評估的。β -肌動蛋白用作加載對照。(D)涉及mt-Cbl毒性的GADD45G途徑效應(yīng)物蛋白的表達(dá)水平。用Cbl、MPP、或mt-Cbl處理HL60細(xì)胞，并且使用免疫印跡法來評估蛋白水平。β-肌動蛋白用作加載對照。GADD45G途徑的下游蛋白，JNK和ρ38,顯示當(dāng)Cbl和mt-Cbl處理時是上調(diào)的。此外，當(dāng)mt-Cbl活化JNK時，Cbl似乎活化p38。圖4示出了 MPP-Cbl活性的評估和初級CLL細(xì)胞的治療窗。(A)在LC25和LC50下，在血紅細(xì)胞(RBC)(健康供體)、外周血干細(xì)胞(PBSC)(健康供體)、單核細(xì)胞(健康供體)和CLL患者細(xì)胞中評估的Cbl和MPP-Cbl活性。與來源于健康供體的那些細(xì)胞相比較，Cbl和MPP-Cbl兩者對于CLL患者樣品細(xì)胞具有較高選擇性毒性。通過膜聯(lián)蛋白V/塞特克思紅(Sytox red)細(xì)胞染色來測定活力百分比。發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中使用的濃度下,含有Cbl和MPP-Cbl的RBC的溶血活性是最小的。繪制平均值，n>5，誤差棒是平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。雙尾t-檢驗(yàn)用于確定P值。(B)外周血細(xì)胞、單核細(xì)胞、和CLL患者細(xì)胞的MPP吸收以及線粒體膜電勢。通過流式細(xì)胞術(shù)測定的噻唑橙(to)-MPP的吸收顯示了 CLL細(xì)胞中較高水平的肽吸收。如通過JC-1染色的FACS分析測定的線粒體膜電勢(降低的JC-1比表示較低的線粒體膜電勢)表明與來自健康供體的PBSC和單核細(xì)胞相比，CLL患者細(xì)胞較高的線粒體膜電勢。繪制平均值，n=3,誤差棒是平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5示出了在顯示耐藥性和耐凋亡的細(xì)胞系中MPP-Cbl的毒性。(A) MPP-Cbl對白血病細(xì)胞系組(M2、K562、HL60、和U937)的毒性。繪制平均值，n>3，誤差棒是平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差。插圖:用6 μ M的MPP-Cbl處理后HL60膜聯(lián)蛋白V-FITC (A-FITC)/塞特克思紅(Sytox Red) (SR)細(xì)胞染色的FACS分析。示出了在各象限中的群體(population)百分?jǐn)?shù)(A-FITC-/SR-:活的；FITC+/SR-:凋亡;A_FITC-/SR+:壞死;A_FITC+/SR+:死亡)。(B) Cbl對白血病細(xì)胞系的毒性示出了兩種不同的群體，HL60和U937對Cbl敏感，K562和M2耐Cbl。插圖與部分(a)相同，但是使用34μ M的Cbl。(C)在耐Cbl細(xì)胞系中的耐凋亡性。如通過膜聯(lián)蛋白V/塞特克思紅染色的細(xì)胞(黑色棒)的FACS分析測定的白血病細(xì)胞系對星狀孢子素的響應(yīng)。圖示了活細(xì)胞的百分率。與HL60和U937相比較，在K562和M2細(xì)胞系中星狀孢子素處理誘導(dǎo)較少的細(xì)胞死亡。K562和M2細(xì)胞系顯示較高水平的Bcl-XL表達(dá)(白色棒)(針對蛋白質(zhì)印跡參見圖6)。(D)在WT或耐Cbl細(xì)胞(CblR)中MPP-Cbl的毒性。細(xì)胞與(A)中的相同。單獨(dú)的Cbl沒有顯示CblR中凋亡細(xì)胞群體的增加，然而，對于WT和CblR細(xì)胞系兩者都檢測到了用MPP-Cbl處理的凋亡響應(yīng)。圖6示出了在白血病細(xì)胞系中BclxjP β-肌動蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡。如上文描述的進(jìn)行蛋白印跡分析。通過BCA測定法來測定總蛋白水平，并且如用β-肌動蛋白加載對照所看到的，將相等的蛋白加入各孔中。圖7示出了 Cbl和MPP-Cbl之間在Α2780野生型細(xì)胞中LC50的比較。如上所述，用Cbl (右側(cè)曲線)和MPP-Cbl (左側(cè)曲線)來處理Α2780野生型細(xì)胞。用CCK8測定法來分
析毒性。圖8示出了通過mt-Cbl的DNA烷基化。(A)在細(xì)胞固定之后Cbl保持線粒體中的MPP0用活的海拉細(xì)胞溫育熒光標(biāo)記的mt-Cbl和對照肽(MPP)，并在未固定的細(xì)胞中觀察線粒體定位。在固定和穿透條件下，mt-Cbl保持線粒體定位而MPP擴(kuò)散至細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。此后，用脫氧核糖核酸酶(10單位)溫育細(xì)胞以催化DNA的裂解。用脫氧核糖核酸酶處理致使mt-Cbl定位的擴(kuò)散。(B)mt-Cbl的烷基化活性。當(dāng)用Cbl烷基化時通過測定4-(4-硝基芐基)吡啶的吸光度來監(jiān)測烷基化活性。與單獨(dú)的Cbl相比，連接靶向線粒體的肽使結(jié)合的苯丁酸氮芥的烷基化能力降低了約2倍。(C)通過mt-Cbl和Cbl交聯(lián)分離的DNA。用不同濃度的mt-Cbl或Cbl (2-200 μ M )處理DNA致使?jié)舛纫蕾囆越宦?lián)形成(左)。通過mt-Cbl和Cbl (右)的時間依賴性DNA交聯(lián)(從5-60min改變)。
具體實(shí)施例方式在以下描述中，給出了許多詳細(xì)描述以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，應(yīng)理解的是可以在沒有這些具體描述的情況下實(shí)施本發(fā)明。難以進(jìn)入線粒體基質(zhì)已限制了抗癌劑的治療靶向該細(xì)胞器。在此，我們報道了使用合成肽載體將烷化劑苯丁酸氮芥成功遞送至線粒體。該藥劑的線粒體靶向性顯著增強(qiáng)了其活性，并且促使多種癌細(xì)胞系以及具有保留活性的患者樣品，甚至具有耐藥性或不能觸發(fā)凋亡的細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞死亡。根據(jù)一個方面，提供了包含連接至抗癌化合 物上的線粒體穿透肽(MPP)的化合物?！翱拱┗衔铩卑ㄓ糜谥委煱┌Y所給予的任何物質(zhì)。典型地，大多數(shù)化學(xué)治療藥物可以分為烷化劑、抗代謝物、蒽環(huán)類、植物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、和其他抗腫瘤劑。根據(jù)公開的方面以及與MPP結(jié)合使用的優(yōu)選抗癌劑包括以下。

權(quán)利要求
1.一種包含連接至抗癌化合物的線粒體穿透肽(MPP)的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA嵌入劑、烷化劑、轉(zhuǎn)錄抑制劑、DNA酶抑制劑、DNA合成抑制劑、或酶抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA嵌入劑異喹啉生物堿、吖啶、蒽環(huán)類或呋喃并香豆素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA嵌入劑黃連素、原黃素、道諾霉素、阿霉素、沙利度胺、補(bǔ)骨脂素或溴化乙錠。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是烷化劑氮芥、亞硝基脲、硫芥或鉬化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是烷化劑美法侖、苯達(dá)莫司汀、卡莫司汀、二(2-氯乙基硫醚)、硫半芥、順鉬、賽特鉬、絲裂霉素、達(dá)卡巴嗪、苯丁酸氮芥、米托唑胺或替莫唑胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是轉(zhuǎn)錄抑制劑，優(yōu)選多肽抗生素，優(yōu)選放線菌素D。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA酶抑制劑，優(yōu)選拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，優(yōu)選依托泊苷、米托蒽醌、安吖啶、替尼泊苷或依列替康。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是DNA合成抑制劑，優(yōu)選DNA類似物，優(yōu)選氟達(dá)拉濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁、克拉屈濱或氟尿苷。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中所述抗癌化合物是酶抑制劑，優(yōu)選谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑或ATP合酶抑制劑，優(yōu)選依他尼酸或寡霉素。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP具有親脂性和陽離子性兩者。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP可以穿過所述線粒體的內(nèi)膜。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的化合物，其中所述MPP以電勢依賴方式穿過所述膜。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP包含帶電荷的氨基酸和疏水氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中所述帶電荷的氨基酸選自賴氨酸和精氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求14和15中任一項(xiàng)所述的化合物,其中所述疏水氨基酸選自苯丙氨酸(F)、環(huán)己基丙氨酸(Fx)、氨基八精氨酸(Hex)、二苯基丙氨酸(F2)、和(1-萘基)-L-丙氨酸(Nap)ο
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP包含改性以提供細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性的氨基酸殘基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述MPP包括d-立體異構(gòu)體。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中所述MPP包含酰胺端。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP包含+3的電荷，并且1gP值為至少約-1.7。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP包含+5的電荷，并且1gP值為至少約-2.5。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述MPP是SEQID N0:l_7中的任一種。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的化合物，其中所述抗癌化合物連接至所述MPP的C端。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，是Fxr3-Cbl。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的化合物，用于治療癌癥。
26.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
27.一種化合物庫，包括多種根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的化合物。
28.一種治療癌癥的方法，包括給予受試者治療有效量的權(quán)利要求23所述的組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物用于治療癌癥的應(yīng)用。
31.一種在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括給予治療有效量的權(quán)利要求23所述的組合物。
32.一種由SEQ ID NO:7組成的肽。
全文摘要
在發(fā)明描述了包含連接至抗癌化合物的線粒體穿透肽(MPP)的化合物，以及它們的使用方法。
文檔編號A61P35/00GK103097397SQ201180037346
公開日2013年5月8日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月30日
發(fā)明者莎娜·凱莉, 馬克·佩雷拉, 索納莉·豐塞卡 申請人:多倫多大學(xué)管理委員會