一種合成肽疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種口蹄疫合成肽疫苗。具體涉及用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法，所述多肽具有SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列。本發(fā)明通過大量動物試驗(yàn)對這些候選多肽抗原進(jìn)行篩選，根據(jù)篩選結(jié)果對口蹄疫病毒抗原位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化，并有效組合了T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，增強(qiáng)了多肽抗原的免疫效果。該O型口蹄疫合成肽疫苗可以有效應(yīng)對口蹄疫病毒的抗原變異，生物安全性好，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種合成肽疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法，具體涉及一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫(foot and mouth disease,簡稱FMD)是一種發(fā)生于偶蹄動物的急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。由于其傳染性高，傳播迅速，感染豬、牛、羊等牲畜導(dǎo)致幼畜死亡，成年動物生產(chǎn)能力急劇下降，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和肉食及其畜產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)。同時(shí)會使動物及動物產(chǎn)品的市場流通和國際貿(mào)易受到極大的封鎖和限制，給流行國家和地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？谔阋呤怯煽谔阋卟《?FMDV)感染引起的，口蹄疫病毒屬細(xì)小核糖核酸病毒，具有多型性、易變性等特點(diǎn)。目前，已知全世界有7種血清型的口蹄疫病毒:A、O、C、Satl (南非I型)、Sat2 (南非II型)、Sat3 (南非III型)和Asia I (亞洲I型)。而每種主型又分若干亞型，目前發(fā)現(xiàn)的亞型已有70多種。血清型A、O、C和Asia I型最為常見，其中血清型A病毒的變種最多，具有超過30種亞型。研究結(jié)果表明:口蹄疫病毒的衣殼蛋白是由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成的，每種各60個(gè)。VP1-VP3組成衣殼蛋白亞單位，位于衣殼蛋白的外側(cè)，而VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部。VPl是主要的保護(hù)性抗原，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)O型口蹄疫有3個(gè)主要的抗原位點(diǎn)位于VPl上，其中133-160和200-213位構(gòu)成了 VPl上最重要且最容易變異的保護(hù)性抗原位點(diǎn)。
[0003]當(dāng)前在我國主要流行的口蹄疫是O型和Asia I型口蹄疫?？谔阋卟《靖餍椭g的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫。而且，在同一種血清型中抗原差異的程度也很大，以至于能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對同一血清型中的另一種亞型沒有保護(hù)性。此外，口蹄疫毒株的抗原性還在不斷發(fā)生變化，隨著時(shí)間的推移，原有疫苗的效力減弱甚至消失，因此給口蹄疫`的防治工作帶來了很大的困難。
[0004]目前，我國對口蹄疫實(shí)行強(qiáng)制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我國現(xiàn)行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒滅活疫苗，其存在著生物安全性差、副反應(yīng)大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。目前世界上很多國家已經(jīng)停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國家進(jìn)口畜產(chǎn)品。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亞單位疫苗、口蹄疫病毒載體疫苗、口蹄疫基因工程修飾疫苗的研究報(bào)道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在著諸多問題，影響了這些新型疫苗的使用。此外，這些疫苗對于當(dāng)前已經(jīng)發(fā)生變異的流行毒株往往效果較差，不能有效地保護(hù)動物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗，特別是用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗。[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述多肽以及上述疫苗的制備方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0008]一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID N0.USEQ IDN0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
[0009]上述氨基酸序列中一個(gè)或者兩個(gè)以上纈氨酸可以被正纈氨酸替代；和/或一個(gè)或者兩個(gè)以上亮氨酸可以被正亮氨酸替代。優(yōu)選地，上述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。
[0010]上述氨基酸序列中的任意兩個(gè)半胱氨酸的巰基可以經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵。
[0011]上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間可以反應(yīng)形成共價(jià)連接。具體來說，上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
[0012]一種口蹄疫合成肽疫苗，其中包括一種或兩種以上的上述多肽或其多肽聚合物。例如:具有SEQ ID N0.USEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的多肽或其多肽聚合物，或者他們的任意兩種或者兩種以上的組合。上述疫苗還可以包含佐劑。
[0013]本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟:
[0014](I)以氨基樹脂為起始原料，以9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸，每步縮合反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的氨基端；
[0015](2)合成完畢后加入裂解試劑裂解多肽；
[0016](3)使用乙醚收集、沉淀多肽；
[0017](4)超濾純化多肽后進(jìn)行無菌處理。
[0018]在上述制備方法中，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸(TFA):三異丙基硅烷(TIS):苯酚:H20=85:8:6:1 ;所述裂解時(shí)間為1-4小時(shí)。
[0019]在上述的制備方法中，所述步驟(1)具體包括以下步驟:
[0020](a)脫保護(hù)反應(yīng):將氨基樹脂置于體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘脫除氨基樹脂上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)；
[0021](b)洗滌:氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；
[0022](C)縮合反應(yīng):加入1-羥基苯丙三唑(Η0ΒΤ)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸在20-28°C條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)；
[0023](d)洗滌:氮?dú)獯蹈桑琋-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；
[0024]Ce)封閉反應(yīng):加入重量體積百分比為1.5-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28°C條件下反應(yīng)20-40分鐘。
[0025]在上述制備方法中，所述步驟(4)具體包括以下步驟:
[0026](a)使用切向過濾膜包在20_28°C條件下超濾制得的多肽，除去小分子雜質(zhì)；
[0027](b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。
[0028]本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟:
[0029](1)用注射用水將上述多肽或其多肽聚合物稀釋到50μ g/ml制得抗原水相；
[0030](2)將佐劑經(jīng)121°C、30分鐘滅菌備用；
[0031](3)在20-28°C條件下，按照抗原水相與佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌20-30分鐘，再高速8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝后即得。
[0032]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制備治療和/或預(yù)防O型口蹄疫的藥物中的用途。其中，所述O型口蹄疫優(yōu)選為豬O型口蹄疫。
[0033]本發(fā)明通過對國內(nèi)口蹄疫新近流行毒株的序列測定并結(jié)合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和0ZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位點(diǎn)的變異情況，針對主要變異的氨基酸位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)其變異的頻率，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助進(jìn)行口蹄疫抗原位點(diǎn)的分析預(yù)測，對可能的抗原位點(diǎn)肽段進(jìn)行化學(xué)合成，即針對易變異位點(diǎn)根據(jù)統(tǒng)計(jì)的變異頻率，在這些位點(diǎn)使用不同的氨基酸，得到涵蓋當(dāng)前所有可能變異位點(diǎn)的多種候選多肽抗原。進(jìn)而通過大量的動物試驗(yàn)對這些候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應(yīng)，而且免疫反應(yīng)水平高，能夠很好的保護(hù)動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。本發(fā)明根據(jù)篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果對口蹄疫病毒抗原位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化，并有效組合了 T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，增強(qiáng)了多肽抗原的免疫效果。該口蹄疫O型合成肽疫苗可以有效應(yīng)對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0035]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0036]實(shí)施例1、實(shí)施例1 口蹄疫合成肽抗原的固相合成
[0037]本發(fā)明通過對國內(nèi)口蹄疫新近流行毒株的序列測定并結(jié)合口蹄疫疫苗毒株MYA/98和0ZK/93序列，研究口蹄疫主要抗原位點(diǎn)的變異情況，針對主要變異的氨基酸位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)其變異的頻率，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助進(jìn)行口蹄疫抗原位點(diǎn)的分析預(yù)測，對可能的抗原位點(diǎn)肽段進(jìn)行化學(xué)合成，即針`對易變異位點(diǎn)根據(jù)統(tǒng)計(jì)的變異頻率，在這些位點(diǎn)使用不同的氨基酸，得到涵蓋當(dāng)前所有可能變異位點(diǎn)的多種候選多肽抗原。進(jìn)而通過大量的動物試驗(yàn)對這些候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應(yīng)，而且免疫反應(yīng)水平高，能夠很好的保護(hù)動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。
[0038]本發(fā)明的多肽抗原可以使用全自動多肽合成儀,利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了 9-荷甲氧羰基(Fmoc)修飾的氨基酸，固相載體為Rink Amide MBHA樹脂。生產(chǎn)過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。
[0039]1、多肽抗原的固相合成
[0040]I)合成原料準(zhǔn)備
[0041]合成多肽抗原的序列分別如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
[0042]依據(jù)抗原的序列以及合成規(guī)模為1mmol準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應(yīng)的氨基酸小瓶中。同樣按要求稱量Rink Amide MBHA樹脂，放入反應(yīng)腔中，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱、批號、反應(yīng)腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙酰咪唑(AM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相對應(yīng)的試劑瓶中。
[0043]2)合成儀狀態(tài)檢測
[0044]檢查多肽合成儀是否正常運(yùn)行。開機(jī)后，運(yùn)行Run Self Test程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查N2是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進(jìn)行測定。發(fā)送Flow Ratel-18到合成儀，選擇MainMenu—Module Test一按 Prer 或 next 找 Module A、ModuleD、Module1、Module1、ModuleA—按Start—按more進(jìn)行測量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力，直至達(dá)到要求。
[0045]3)多肽抗原的合成開始
[0046]在合成儀的程序中將合成需要的方法Std Fmocl.0Sol DIC90發(fā)送到合成儀上。File-New-Sequence-編輯合成妝的序列，保存。File-New-Run,檢查 Chemistry ；Sequence是否為所存名字；設(shè)定Cycles ;保存。最后發(fā)送到合成儀上。
[0047]Main Menu—Cycle Monitor—begin,開始運(yùn)行。
[0048]4)多肽抗原的合成
[0049]如上述的多肽序列，合成的時(shí)候是從C端開始至N端，依照給定的順序，依次不斷地重復(fù)如下合成步驟:
[0050](I)脫保護(hù)反應(yīng):將上述氨基樹脂置于體積百分比為15%_30%的六氫吡啶的NMP溶液中，在20-28°C條件下反應(yīng)25-40分鐘脫除氨基樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；
[0051](2)洗滌:氮?dú)獯蹈桑琋MP洗滌氨基樹脂；
[0052](3 )縮合反應(yīng):加入HOBT、DCC與Fmoc保護(hù)的氨基酸在20_28 °C條件下反應(yīng)
0.5-2.5 小時(shí)；
[0053](4 )洗滌:氮?dú)獯蹈桑琋MP洗滌氨基樹脂；
[0054](5)封閉反應(yīng):加入重量體積百分比為1.5%_4%的乙酰咪唑的NMP溶液，在20-28 °C條件下反應(yīng)20-40分鐘。
[0055]5)多肽抗原合成結(jié)束
[0056]抗原合成結(jié)束后合成儀將自動停止。然后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用100%甲醇洗滌多肽樹脂3次，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，將多肽樹脂轉(zhuǎn)移至棕色瓶內(nèi)，放入-20°C冰箱內(nèi)，封口膜密封備用。
[0057]2、多肽抗原的裂解及鑒定
[0058]I)多肽抗原的裂解
[0059]按照體積比例(TFA/TIS/苯酚/H20=85/8/6/l)配制裂解液，然后從冰箱內(nèi)取出合成的多肽樹脂，放入圓底燒瓶內(nèi)，在通風(fēng)櫥內(nèi)向燒瓶內(nèi)加入配制好的裂解液和磁攪拌子，然后穩(wěn)定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌I小時(shí)直至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)30至120分鐘除去粗產(chǎn)品中的TFA。接著使用乙醚收集、沉淀多肽，然后用二甲基甲酰胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂芯漏斗過濾出來，即得到多肽抗原。
[0060]2)合成抗原的鑒定
[0061]多肽抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行定性定量分析。
[0062]3)多肽抗原的構(gòu)象形成
[0063]用15% DMSO將多肽抗原配制成濃度為2mg/ml的多肽溶液，然后用0.1N NaOH或
0.1N HCl調(diào)整初步分離多肽溶液的pH值=8.5，在25°C的環(huán)境下在轉(zhuǎn)速為IlOrpm的搖床上放置48小時(shí)，使形成二硫鍵。[0064]進(jìn)而進(jìn)行首尾環(huán)化，首尾的“-COOH”與“-NH2”環(huán)化方法見Mengfen等P印tideProtein Reserchl996.48:229-239;首尾的“-C00H”與“-OH”進(jìn)行反應(yīng)而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)見Mmenhofer等Chem.Socl970.92:3771_3777。即可得到能夠模擬病毒粒子天然構(gòu)象的多肽環(huán)化結(jié)構(gòu)。
[0065]4)多肽抗原的純化除菌
[0066]多肽抗原使用循環(huán)式切向過濾膜包在20_28°C條件下進(jìn)行超濾(Tangential FlowDevice循環(huán)式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動泵)，多肽抗原是大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及后期環(huán)化反應(yīng)形成或引進(jìn)的小分子雜質(zhì)則可以通過濾膜。然后再通過孔徑為0.2μπι在線過濾器除菌，將最后得到的溶液分裝到無菌塑料瓶內(nèi)，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件，分裝后，儲存于-20 V或-40 V備用。
[0067]為了便于運(yùn)輸和長期保存的需要，將多肽抗原進(jìn)行冷凍干燥以得到固體狀態(tài)的多肽。將預(yù)先凍好的多肽抗原取出，在Labconco冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥，得到固體狀態(tài)的多肽抗原。同時(shí)貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件。
[0068]實(shí)施例2、合成肽疫苗的配制
[0069]1、抗原水相的配制
[0070]首先，分別稱取依照上述實(shí)施例1合成的三種多肽抗原；然后，用滅菌注射用水將合成肽抗原濃度稀釋至50 μ g/ml ;將抗原溶液經(jīng)孔徑為0.2 μ m的過濾器過濾，除菌。
[0071]2、油相佐劑制備
[0072]將油相佐劑ISA50`V經(jīng)121°C、30分鐘滅菌，備用。
[0073]3、合成肽疫苗的乳化
[0074]用滅菌的蒸餾水2000ml清洗IKA乳化設(shè)備(購自IKA公司，貨號200603) 3次，然后在20-28°C條件下按油相佐劑和抗原水相為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)以90~150r/m慢速轉(zhuǎn)動攪拌2分鐘后，同時(shí)緩慢加入水相抗原，加完后攪拌30分鐘，再以10000r/m高速攪拌20分鐘，靜置5分鐘，使疫苗乳化成油包水的單相疫苗。
[0075]實(shí)施例3、合成肽疫苗的效力試驗(yàn)
[0076]一、材料與方法
[0077]1、合成肽疫苗
[0078]按照上述實(shí)施例1合成具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3序列的多肽抗原，這些多肽兩個(gè)半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。這些然后按照實(shí)施例2的方法分別配制與之對應(yīng)的批號為:ZM433A01、ZM433A02、ZM433A03的口蹄疫O型合成肽疫苗。
[0079]此外，將SEQ ID NO:1中氨基酸序列中全部纈氨酸用正纈氨酸替代；全部亮氨酸用正亮氨酸替代，依據(jù)上述實(shí)施例提供的方法進(jìn)行抗原合成，該抗原中同樣兩個(gè)半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接，將按照實(shí)施例2的方法配制疫苗批號為:ZM433A04。
[0080]依據(jù)SEQ ID NO:1序列使用實(shí)施例1所述的常規(guī)合成肽技術(shù)合成該序列的二聚體抗原，其中，組成二聚體中每條多肽兩個(gè)半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵，并且首尾氨基酸羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接，按照實(shí)施例2的方法配制疫苗，得到批號為:ZM433A05的合成肽疫苗。
[0081]2、試驗(yàn)動物
[0082]挑選品種相同，4月齡、體重40Kg左右，口蹄疫中和抗體呈陰性的健康架子豬27頭(二元雜交，蘭州白銀豬場)。
[0083]3、毒種 0R/80MF8
[0084]將0R/80MF8 (蘭州生物藥廠提供)經(jīng)乳鼠測毒合格后置于_20°C冷凍保存，備用。
[0085]4、試驗(yàn)方法
[0086]針對每組疫苗采用體重40kg左右的健康易感架子豬(經(jīng)乳鼠中和試驗(yàn)測定無口蹄疫中和抗體)5頭。將待檢的各批次合成肽疫苗分別于耳根后肌肉注射2ml。接種28日后，連同條件相同的對照豬2頭，每頭豬耳根后肌肉注射1000個(gè)ID5tl的口蹄疫O型病毒強(qiáng)毒0R/80MF8，連續(xù)觀察10日。對照豬均至少一蹄出現(xiàn)水泡病變。免疫豬出現(xiàn)任何口蹄疫癥狀即判為不保護(hù)。
[0087]5、結(jié)果判定
[0088]豬一蹄以上或口鼻部出現(xiàn)口蹄疫典型水泡，則判為發(fā)病。而豬任何部位無口蹄疫典型水泡出現(xiàn)則判為保護(hù)。
[0089]二、試驗(yàn)結(jié)果與討論
[0090]1、試驗(yàn)結(jié)果
[0091]免疫28天后，用1000個(gè)ID5tl/頭份的0R/80強(qiáng)毒攻擊10天后，結(jié)果詳見表1。
[0092]表1 口蹄疫合成肽疫苗效力試驗(yàn)
[0093]
【權(quán)利要求】
1.一種用于O型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID N0.K SEQ IDN0.2或SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于:所述多肽的氨基酸序列中一個(gè)或者多個(gè)纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或一個(gè)或者多個(gè)亮氨酸被正亮氨酸替代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列中的任意兩個(gè)半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于:所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價(jià)連接。
7.—種口蹄疫合成肽疫苗,其中包括一種或兩種以上選自權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽或其多肽聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽的制備方法，其中包括以下步驟: (O以氨基樹脂為起始原料，以9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸為單體，按照所述氨基酸序列依次縮合接上氨基酸，每步縮合反應(yīng)后用乙酰咪唑封閉未反應(yīng)的氨基端；· (2)合成完畢后加入裂解試劑裂解多肽； (3)使用乙醚收集、沉淀多肽； (4)超濾純化多肽后進(jìn)行無菌處理。
10.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多肽或其多肽聚合物、權(quán)利要求7或8所述的疫苗在制備治療和/或預(yù)防O型口蹄疫的藥物中的用途；所述O型口蹄疫優(yōu)選為豬O型口蹄疫。
【文檔編號】A61P31/14GK103848902SQ201410081709
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】巴利民, 肖進(jìn), 齊鵬, 宋芳, 王楠, 栗利芳, 趙洪濤, 張蕾, 周強(qiáng), 鄭應(yīng)華 申請人:中牧實(shí)業(yè)股份有限公司