一種基于J亞群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術領域】，提供了一種基于J亞群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重組干擾載體，該載體利用env基因對于ALV的重要意義，利用該基因設計合成siRNA，構建形成siRNA的發(fā)卡結構，進一步獲得退火雙鏈DNA后，將其與載體連接構建重組干擾載體，將該干擾載體與病毒共轉染細胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細胞及活雞體內J亞群禽白血病病毒的轉錄與復制，為J亞群禽白血病的防治提供科學基礎和技術支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經濟損失。
【專利說明】—種基于J亞群禽白血病病毒env基因保守序列的s i RNA重組干擾載體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術領域】，提供了一種基于J亞群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法和其在干擾J亞群禽白血病病毒在體外細胞及活雞體內轉錄與復制的應用。
【背景技術】
[0002]J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一種腫瘤性疾病。ALV-J是具有囊膜的反轉錄病毒，禽臨床感染主要表現(xiàn)為髓細胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生長遲緩。1997~1998年間，ALV — J呈全球性爆發(fā)，對世界肉種雞業(yè)造成了毀滅性打擊。ALV-J感染除引起髓細胞瘤外，成紅細胞瘤、血管瘤、腎瘤和肉瘤常在感染后期伴隨發(fā)生，通常死亡率為1%~5%，高峰期可達50%。研究證實，ALV-J對免疫應答具有持久損害作用，使生產力低下，繼發(fā)感染和混合感染頻發(fā)，J亞群禽白血病嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。國外通過凈化控制本病的發(fā)生，由于凈化周期長、成本高，在我國目前還未能有效實施，只能通過淘汰感染雞只進行大群凈化，這種方法由于不及時不徹底而無法控制ALV-J的感染，同時，不科學、不合理的凈化措施，還會加速病毒的突變和進化，使疾病愈加復雜；ALV - J為囊膜病毒，病毒囊膜決定了病毒的抗原性，而抗原性又不斷變動，這成為禽白血病常規(guī)疫苗研制無法逾越的瓶頸；
[0003]ALV為雙RNA病毒，其基因組全長約7.6-7.8kb。ALV-J的前病毒基因組主要含有3個結構基因，分別編碼病毒結構蛋白、RNA依賴的DNA聚合酶(反轉錄酶)和囊膜糖蛋白。從5’端至3’端其排列順序依次為LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR。env基因含有表面膜蛋白合成的遺傳信息，編碼病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亞單位gp85和跨膜蛋白亞單位@ρ37<^ρ85蛋白是病毒的主要抗原，病毒中和反應的作用位點，含有病毒-受體決定簇，主要起病毒粘附于易感動物細胞的作用，同時也能誘導有免疫力的雞群產生要特異性抗體，稱為表面膜蛋白SU ；gp37包含有與細胞膜融合的兩個重要的疏水區(qū)，介導病毒與細胞的融合過程，稱為跨膜蛋白TM ；
[0004]同時ALV - J為囊膜病毒，病毒囊膜決定了病毒的抗原性，而抗原性又不斷變動，這成為禽白血病常規(guī)疫苗研制無法逾越的瓶頸?；诖?，研制抗J亞群禽白血病生物制劑成為目前J亞群禽白血病防控的焦點和熱點，如何將該基因用于J亞群禽白血病防控成為亟待解決的問題。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術的情況，特別是env基因對于ALV的重要意義，利用該基因設計合成siRNA干擾載體，并將該干擾載體與病毒共轉染細胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細胞及活雞體內J亞群禽白血病病毒轉錄與復制，為J亞群禽白血病的防治提供科學基礎和技術支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經濟損失。
[0006]發(fā)明人首先基于env基因保守序列設計合成了 siRNA，堿基序列為GTACAGCGATGGMTTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所不;
[0007]該段序列與靶基因的一段序列相同，是利用siRNA在線設計軟件篩選得到；
[0008]設計可以形成siRNA的發(fā)卡結構，并反轉錄得到ds oligo DNA,連接進干擾載體，載體轉染進細胞后，可以轉錄出其中的編碼鏈，并在細胞內形成發(fā)卡結構(鏈內斜體部分堿基互補，可以形成發(fā)卡結構)，在細胞內酶切得到siRNA，siRNA解旋，其反義鏈與靶基因互補，從而與靶基因結合，使靶基因降解。其作用過程如圖1所示；
[0009]進而發(fā)明人利用上述方法將ds oligo DNA連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中，最終獲得本發(fā)明所述的這種干擾載體，
[0010]其中所述的干擾載體購自invitrogen公司；
[0011]同時發(fā)明人還公開了上述干擾載體的具體制備方法，如下:
[0012]基于env基因保守區(qū)域設計合成siRNA ;
[0013]其具體操作為:對ALV不同亞群及J亞群不同的毒株進行同源性分析，其同源性最高的env基因中較保守區(qū)域片段作為篩選siRNA的序列片段，利用siRNA在線設計軟件，得到siRNA，堿基序列為GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
[0014]其中發(fā)明人所選 取的毒株包括:NX0101(ALV-J, DQl 15805)、MQNCSU(ALV-A，DQ365814)、SDAU09E3(ALV-B JF826241)、RSV-Prague(ALV-C, J02342)、RSV-Schmidt-RuppinD (ALV-D,D10652)、SDO50 I (ALV-E, EM467 236)、HPRS103 (ALV-J, Z46390) andAD0L-7501(ALV-J, AY027920)。
[0015]設計合成含上述目的片段的發(fā)卡結構，如圖3中top strand DNA,其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示,和與之對應的bottom strand DNA,其基因序列如序列表SEQ IDNO:3所示，將其退火形成雙鏈后連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中，連接產物轉化到感受態(tài)細胞DH5a，涂LB平板(含50 μ g/ml壯觀霉素)后，37°C孵育；
[0016]轉化平板分別挑取3個克隆，搖菌抽提質粒后進行測序，以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的寡聚單鏈DNA(也就是top strand DNA和與之對應的bottom strandDNA)序列一致；
[0017]通過常規(guī)方法的驗證發(fā)現(xiàn)本發(fā)明做獲得重組載體，重組克隆中插入片段序列與設計的寡聚單鏈DNA序列一致，
[0018]進一步發(fā)明人通過體內和體外檢測的方式，證實該重組干擾載體可以有效地干擾體外細胞及活雞體內J亞群禽白血病病毒轉錄與復制，一般干擾效率達到85%以上，較之現(xiàn)有的防治手法有著極大的進步，其中所采用的體外檢測方法如下:
[0019]培養(yǎng)DF-1細胞，12h后接毒(ALV-J NX0101毒株)，待細胞狀態(tài)良好，細胞豐度達到70%-80%時，將DF-1細胞傳到24孔板上；
[0020]待細胞豐度達到70%時(大約8h_12h，)，進行重組質粒的轉染，72h后通過Real-time PCR檢測病毒基因的表達水平、間接免疫熒光檢測ALV-J活病毒囊膜蛋白的表達水平、Western blot檢測重組質粒轉染DF-1細胞后病毒囊膜蛋白的表達水平以驗證干擾效果，蛋白表達結果顯示，經干擾后，ALV-J蛋白表達及mRNA轉錄水平明顯降低，干擾效率達到85.3% ；[0021 ] 同樣的，體內試驗檢測:
[0022]重組干擾質粒與病毒同時接種6日齡雞胚，同時設ALV-J感染陽性對照組及陰性對照組。
[0023]雛雞出殼后，飼養(yǎng)至7周齡，全部剖殺，期間每周進行血液學、組織病理學觀察以及病毒學檢測抗病毒效果；
[0024]結果顯示重組質粒干擾組雞生長正常，血液各類白細胞未見明顯變化，ALV-J抗原/抗體陰性，無排毒現(xiàn)象，病理組織學檢測未見組織損傷及炎癥反應。而ALV-J陽性對照組出現(xiàn)嚴重的病毒血癥，排毒，肝臟及心臟等重要器官出現(xiàn)明顯的損傷和炎癥。實驗證明RNA干擾重組載體可達到顯著的抗病毒效果。
[0025]綜上所述，本發(fā)明利用env基因非常保守這一情況且對于ALV的重要意義，利用該基因設計合成siRNA干擾載體，并將該干擾載體與病毒共轉染細胞，最終發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的這種干擾載體可有效地干擾體外細胞及活雞體內J亞群禽白血病病毒轉錄與復制，為J亞群禽白血病的防治提供科學基礎和技術支撐，降低養(yǎng)禽業(yè)因ALV-J感染造成的經濟損 失。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明所涉及的干擾原理圖；
[0027]圖2為本發(fā)明所涉及的干擾載體圖譜；
[0028]圖3為本發(fā)明所設計的top strand DNA和bottom strand DNA的不意圖；
[0029]圖中可見top strand中的斜體字體所示序列與靶基因上的一段序列相同，另一端斜體字體序列與其互補，bottom strand中與其設計思路相同；
[0030]圖4為本發(fā)明構建載體質粒電泳結果示意圖，
[0031]其中電泳圖左側為DNA marker右側為質粒的條帶，
[0032]由于質粒存在的螺旋結構不同，電泳時會形成多條條帶，從上到下依次為松弛開環(huán)的OC構型、松弛線性的L構型(5700bp)和超螺旋的SC構型；圖5為本發(fā)明所得干擾載體病毒熒光的干擾效果圖，
[0033]圖中p-s1-env 為干擾組、Null-vector control 為空載體對照組、ALV-J infectedcontrol為病毒感染未干擾對照組、normal cells control為正常細胞未接毒未干擾對照組圖中干擾組與陽性對照組相比，熒光細胞數(shù)大大減少，證明本實驗所用的干擾質粒有較好的干擾效果；
[0034]圖6為本發(fā)明RT-PCR檢測病毒表達的相對定量比較結果，
[0035]圖可知干擾組與的陽性對照相對比，其病毒基因的表達水平顯著降低。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例中進一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領域現(xiàn)有技術，所采用的試劑也均為現(xiàn)有試劑；
[0037]實施例1雙鏈DNA的制備[0038]靶向env基因保守區(qū)域，起始位點為6146，結束位點為6165，設計合成siRNA，其堿基序列為GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；
[0039]設計合成含上述目的片段的發(fā)卡結構，其中top strand DNA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示；和與之對應的bottom strand DNA其基因序列如序列表SEQ ID NO:3所示；用ddH20溶解成100 μ Μ，互補單鏈各取5-10 μ I兩兩混合，按表一給出體系進行退火。將混合物在95°C加熱5~10分鐘，然后放置室溫20分鐘，形成雙鏈DNA。
[0040]表一、oligoDNA 退火體系
[0041]
【權利要求】
1.一種基于J亞群禽白血病病毒env基因保守序列的SiRNA重組干擾載體，其特征在于:該載體是利用所設計的siRNA，構建其發(fā)卡結構，退火后將形成的雙鏈DNA連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中獲得的，其中siRNA其基因序列如序列表SEQ ID NO:I所示。
2.權利要求1所述的重組干擾載體的制備方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)基于env基因保守區(qū)域設計合成siRNA;其具體操作為:對ALV不同亞群及J亞群不同的毒株進行同源性分析，其同源性最高的env基因中較保守區(qū)域片段作為篩選siRNA的序列片段，利用siRNA在線設計軟件，得到siRNA，堿基序列為GTACAGCGATGGAATTATT，其基因序列如序列表SEQ ID NO: I所不； (2)設計合成含上述目的片段的發(fā)卡結構,其中topstrand DNA,其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示，bottom strand DNA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:3所示，將其退火形成雙鏈后連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體中即得。
3.如權利要求1所述載體在干擾J亞群禽白血病病毒在體外細胞及活雞體內轉錄與復制的應 用。
【文檔編號】A61P31/14GK103805635SQ201410081491
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權日:2014年3月7日
【發(fā)明者】成子強, 魏戎蓉 申請人:山東農業(yè)大學