專利名稱：穩(wěn)定的因子viii變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的凝血因子。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及與半衰期延長(zhǎng)部分綴合的穩(wěn)定的因子VIII分子。本發(fā)明還涉及這類分子的用途。
背景技術(shù)：
A型血友病是因凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障礙所引起的一種遺傳性出血性疾病。臨床表現(xiàn)不在于最初的止血，即血塊形成正常發(fā)生，而是血塊因后繼凝血酶形成不足而不穩(wěn)定。通過(guò)靜脈內(nèi)注射從血液中分離的或重組產(chǎn)生的凝血因子FVIII來(lái)治療該病。目前的治療建議從傳統(tǒng)的按需治療轉(zhuǎn)向預(yù)防。與馮維勒布蘭德因 子(von WillebrandtFactor)結(jié)合的內(nèi)源FVIII的循環(huán)半衰期是12-14小時(shí)，因此預(yù)防性治療應(yīng)一周進(jìn)行數(shù)次，以使患者獲得幾乎無(wú)癥狀的生活。對(duì)于許多人，尤其是兒童和年輕人而言，IV給藥伴隨明顯的不便和/或疼痛。在具有顯著延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期的因子VIII變體的開(kāi)發(fā)中已經(jīng)采用了多種方法。很多這類方法都涉及將因子VIII與親水聚合物例如PEG (聚乙二醇)綴合在一起。W003031464公開(kāi)了酶促方法，其中PEG基團(tuán)可與存在于多肽上的聚糖連接。Blood-2009-11-254755公開(kāi)了 PEG基團(tuán)可與之特異性綴合的表面暴露的Cys殘基的引入。從W002103024得知FVIII分子的二硫鍵的引入。然而，包含二硫鍵的這類FVIII變體卻的確不引起體內(nèi)循環(huán)半衰期延長(zhǎng)。因此本領(lǐng)域需要具有因子VIII活性和顯著延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期的FVIII變體。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及具有FVIII活性的重組FVIII變體，其中FVIII變體與半衰期延長(zhǎng)部分綴合，且其中在FVIII變體中引入氨基酸變化，以提高變體的體外穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及這類分子在治療中的用途。與wt因子VIII相比，本發(fā)明的分子具有顯著延長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期。附圖
簡(jiǎn)述
圖I.在不同濃度的野生型FVIII和變體中獲得的凝血酶活性的最高水平。數(shù)據(jù)是得自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值和SEM，其每個(gè)數(shù)據(jù)均歸一化至由2. 7 nM野生型FVIII得到的速率。發(fā)明詳述 定義
馮維勒布蘭德因子(vWF) vffF是存在于血漿中并在內(nèi)皮(在懷布爾-帕拉德體中)、巨核細(xì)胞(血小板a-顆粒)和內(nèi)皮下結(jié)締組織中組成型產(chǎn)生的一種大的單聚/多聚糖蛋白。其主要功能是與其它蛋白質(zhì)、特別是與因子VIII結(jié)合，并且它對(duì)血小板粘附于受傷部位是重要的。因子VIII與vWF結(jié)合的同時(shí)在循環(huán)中失活；因子VIII當(dāng)未與vWF結(jié)合時(shí)快速降解或被清除。由此斷定，降低或消除FVIII的vWF結(jié)合能力可被認(rèn)為是在獲取具有延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期的因子FVIII變體中極不理想的方法。然而如果該分子與半衰期延長(zhǎng)部分綴合，則可能通過(guò)位點(diǎn)定向誘變降低或消除vWF。因子VIII中負(fù)責(zé)與vWF結(jié)合的區(qū)域是如EP0319315中公開(kāi)的跨越殘基1670-1684的區(qū)域。預(yù)期涉及該區(qū)域的因子VIII點(diǎn)突變體和/或缺失突變體可改變與vWF結(jié)合的能力。本發(fā)明特別優(yōu)選的點(diǎn)突變的實(shí)例包括包含一個(gè)或多個(gè)下列點(diǎn)突變的變體Y1680F、Y1680R、Y1680N、E1682T和Y1680C。因子VIII分子FVIII/因子VIII是主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的一種大而復(fù)雜糖蛋白。FVIII由2351個(gè)氨基酸組成，包括信號(hào)肽，并含有由同源性限定的若干不同結(jié)構(gòu)域。有3個(gè)A結(jié)構(gòu)域、I個(gè)獨(dú)特的B結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域的順序可列為NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血漿內(nèi)作為在B-A3邊界處被分隔的2條鏈而循環(huán)。這兩條鏈通過(guò)二價(jià)金屬離子結(jié)合而連接。A1-A2-B鏈稱為重鏈(HC)，而A3-C1-C2稱為輕鏈(LC)。本文所用“因子VIII”或“FVIII”是指作為內(nèi)在凝血途徑的成員并對(duì)凝血是至關(guān)重要的人血漿糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. I (氨基酸1-2332)所示的全長(zhǎng)人FVIII分子。B結(jié)構(gòu)域跨越SEQ ID NO I中的氨基酸741-1648。SEQ ID NO I (WtAFVIII) ATRRYYLGWELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKEMGPMASDPLCLirYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLf AVf DEGKSWHSETKNSLMODRDAASARAWPKIVfHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVlGMGITPEVHSlFLEGHTFLVRNHRQASLEISRTFLTAaTLLMDLGQFLLFCHiSSHQHD 義 EAWKVDSCPEEPOl 剛 KMWEEAEDYDDOITDSEWWVRFDDDNSPSF1QIRSVAKKHFKTWVHTIAAEEEDWOYAPLVLAPDDRSYKSQYLMNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESG1LGPLLYGEVGDTLL1IFKNQASRPTMIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPIIPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCURYYSSFVNMERDLASGUGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSIMGYVFOSLQLSVCLHEVAYWYILSiGAQTD-FlSVFFSGYTFKHKMVTEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWlLGCHMSDFRNRGMTALLKVSSCDKfSlTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTtPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDiLMLLRQSFTWGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMWRPQLHHSGDMWTPESGLQLRLNEKLGTTAAm 眺 DFKVSSTSNNUS 了 PSDNLMGTONTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPITESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMMSQESSWGK_SSTCSGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSiSLLKTNKTSNNSATJMRKTHIDGPSLLlENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKfSIATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVWGKGEFTKDVGLKEMWPSS 剛 LFLTNLDNLHENNTHNOEK^OEEIEICKETltOENVVLPOIHTVTCmNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTORTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGMQTKQiVEKYACTTRISPNTSOCWFVTOFISKRALKCIFRLPLEETrELEKRHVDDTSTaWSKNMKHLTPSTLTQlDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQA.NRSPLPIAKVSSFPSfRPiYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKK_LSUMlTLEI\rrGDQREW3SLGTSAJMSVTYKK/EMTVtPKPDLPKTSGKVELLPKVHSYQKDLfPTETSNGSPGHLDlVEGSlLQGTEGAlKWNEANRPGKVPFlRWTESSAKTPSKllDPLAWOWWGTOIPKEEWKSCIEKSPEKmFKKKDinLSLNACESNHAWWNEGQNKPBEVTWAKQGRTERLCSQNPPVIKRHQREITRTTLQSDQEE 靈 D
權(quán)利要求
1.具有FVIII活性和增加的體外穩(wěn)定性的重組FVIII變體，其中所述FVIII變體與半衰期延長(zhǎng)部分綴合，且其中已將導(dǎo)致體外穩(wěn)定性增加的氨基酸變化引入所述FVIII變體中。
2.權(quán)利要求I中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體包含二硫鍵。
3.權(quán)利要求2的重組FVIII變體，其中所述二硫鍵與FVIII變體的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接。
4.權(quán)利要求2的重組FVIII變體，其中所述二硫鍵將重鏈與輕鏈連接在一起。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述FVIII變體包含用疏水氨基酸殘基進(jìn)行的氨基酸取代，且其中所引入的疏水氨基酸殘基提高疏水相互作用和FVIII變體 的體外穩(wěn)定性。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體包含呈帶正電荷和帶負(fù)電荷的氨基酸殘基形式的氨基酸取代，且其中所引入的帶電荷殘基提高靜電相互作用和FVIII變體的體外穩(wěn)定性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體是B結(jié)構(gòu)域截短的變體。
8.權(quán)利要求7的重組FVIII變體，其中側(cè)基與位于截短的B結(jié)構(gòu)域中的O-聚糖連接，且其中所述側(cè)基在所述FVIII變體激活時(shí)被去除。
9.權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中在所述FVIII中，其中B結(jié)構(gòu)域的序列如SEQ ID NO 2所示。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述半衰期延長(zhǎng)部分選自親水聚合物、抗體或其抗原結(jié)合片段、Fe結(jié)構(gòu)域、多肽和脂肪酸或脂肪酸衍生物。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體包含SEQID NO 3的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體包含以下取代S149C和E1969C。
13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的重組FVIII變體，其中所述變體包含以下取代D666C和S1788C。
14.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的FVIII變體。
15.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的FVIII變體或權(quán)利要求14的組合物用于治療血友病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾的凝血因子。具體來(lái)講，本發(fā)明涉及與半衰期延長(zhǎng)部分綴合的穩(wěn)定的因子VIII分子以及所述分子的用途。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102971006SQ201180034829
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者H.奧斯特加爾德, M.克賈爾克, O.H.奧爾森, L.蒂姆, H.R.施滕尼克 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克有限公司