專利名稱：能夠識(shí)別血凝素干區(qū)上的雜亞型中和表位的IgG同種型全長(zhǎng)免疫球蛋白和其作為抗-流感 ...的制作方法
能夠識(shí)別血凝素干區(qū)上的雜亞型中和表位的IgG同種型全長(zhǎng)免疫球蛋白和其作為抗-流感藥物的應(yīng)用本發(fā)明總體屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及能夠結(jié)合并中和A型流感病毒的全長(zhǎng)免疫球蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)中已知針對(duì)A型流感病毒的抗體。國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB2009/051068描述了能夠結(jié)合多個(gè)不同A型流感亞型(雜亞型免疫性(heterosubtypic immunity))的單克隆抗體,優(yōu)選為Fab片段,這種抗體進(jìn)一步被賦予重要的中和活性。以上提到的國(guó)際專利申請(qǐng)中描述的優(yōu)選抗體是Fab 28片段，特征在于其包括含氨基酸序列SEQ ID NO: I的重鏈可變區(qū)和含氨基酸序列SEQ ID NO: 2的輕鏈可變區(qū)。在PCT/IB2009/051068中也描述了各自的編碼核苷酸序列，即SEQ ID NO:3 (重鏈可變區(qū))和SEQ ID NO:4 (輕鏈可變區(qū))。在該說明書中，將抗體片段Fab 28指定為“Fab·PN-SIA28”。在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB2009/051068中，作者提到發(fā)明的抗體對(duì)象可以可替換地作為與Fab片段相對(duì)的全長(zhǎng)免疫球蛋白提供。已知，人的免疫球蛋白分為重鏈類型不同的5個(gè)主要類別IgG、IgA、IgM、IgD和IgE0但是，在PCT/IB2009/051068中，未單獨(dú)鑒別特定免疫球蛋白類型，并且未提供如允許本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇特定免疫球蛋白類型的關(guān)于重鏈類型的建議。此外，在PCT/IB2009/051068中，未提供關(guān)于PN-SIA28用作全長(zhǎng)免疫球蛋白時(shí)的中和效果的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。驚人地，本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)PCT/IB2009/051068中所述的由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列表征的單克隆抗體，尤其作為全長(zhǎng)IgG類免疫球蛋白提供，與相應(yīng)Fab片段相比，在能力和作用范圍兩方面，表現(xiàn)出對(duì)甲型流感病毒顯著增加的中和活性。已知，IgG由一對(duì)輕鏈(L)和一對(duì)重鏈(C)組成。每條輕鏈包含兩個(gè)免疫球蛋白域，一個(gè)可變(VL)域一個(gè)恒定(CL)域。重鏈為Y型且每條重鏈包含一個(gè)可變免疫球蛋白域(VH或\^)和三個(gè)恒定域(011/2/3)。Y鏈又可分為四個(gè)不同的亞型，分別指定為Y1、Y 2> Y 3 和 Y 4。在PCT/IB2009/051068中所述的由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列表征的作為全長(zhǎng)IgG的單克隆抗體在下文中指定為“IgG PN-SIA28”。表I示意性地示出了由本發(fā)明的發(fā)明人獲得的以對(duì)比表達(dá)的關(guān)于IgGPN_SIA28的中和活性的結(jié)果。對(duì)H3N2亞型的不同株存在顯著的高中和活性的證據(jù)，而其在相應(yīng)的Fab片段的情況中較低。此外，即使在極低的濃度，全長(zhǎng)IgG對(duì)HlNl亞型的不同株表現(xiàn)出非常強(qiáng)的中和活性，高于相應(yīng)Fab片段對(duì)相同的HlNl株。本發(fā)明的發(fā)明人還進(jìn)行了允許評(píng)估IgG PN-SIA28也結(jié)合屬于亞型H2、H5和H9的重組血凝素能力的初步實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)部分中詳細(xì)地描述的獲得的結(jié)果允許認(rèn)為IgG PN-SIA28的中和活性至少擴(kuò)展至H2、H5和H9亞型，當(dāng)涉及相應(yīng)的Fab片段時(shí)以前沒有描述該中和活性。
給定IgG PN-SIA28特別的中和性，本發(fā)明的發(fā)明人還進(jìn)行了允許它們鑒別構(gòu)成尤其由中和抗體IgG PN-SIA28識(shí)別的表位的血凝素區(qū)的特別復(fù)雜的研究和實(shí)驗(yàn)(在下文中詳細(xì)說明)。由IgG PN-SIA28識(shí)別的中和表位的鑒別是非常有用和重要的，使得可以進(jìn)一步鑒別針對(duì)相同表位和賦予與IgG PN-SIA28實(shí)質(zhì)可比的特別的中和性質(zhì)的人單克隆抗體。因此，本發(fā)明的一個(gè)第一目的是全長(zhǎng)IgG形式的，尤其 針對(duì)A型流感病毒血紅素抗原和能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型和H3亞型的多種A型流感病毒亞型的人單克隆抗體，其特征在于抗體識(shí)別位于血凝素干區(qū)(stem region)的保守表位,所述表位包含HAl血凝素多肽的氨基酸殘基His25、His45、Thr315和Asn336以及HA2血凝素多肽的氨基酸殘基 Thr358、Met360、Ile361 或 Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384, Thr392、Val395、Glu400，氨基酸殘基的編號(hào)是基于可在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的在登錄號(hào)EF467821. I的和在序列表中指定為SEQ ID NO:5的HlNl血凝素氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為本發(fā)明的對(duì)象的全長(zhǎng)IgG形式的人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型以及H5、H2和H9中的至少一個(gè)的多種甲型流感病毒亞型。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為本發(fā)明的對(duì)象的全長(zhǎng)IgG形式的人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型以及H5、H2和H9亞型中的至少兩個(gè)的多種甲型流
感病毒亞型。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為本發(fā)明的對(duì)象的全長(zhǎng)IgG形式的人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H2亞型和H9亞型的多種甲型流感病毒亞型。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，作為本發(fā)明的對(duì)象的全長(zhǎng)IgG形式的人單克隆抗體為IgG PN-SIA28，其特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID NO: I的重鏈可變區(qū)和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)。導(dǎo)致由IgG PN-SIA28抗體識(shí)別的表位的定義的研究在隨后的實(shí)驗(yàn)部分中詳細(xì)地描述。也描述了參考由現(xiàn)有技術(shù)的抗-流感單克隆抗體C179、CR6261和FlO識(shí)別的表位進(jìn)行的對(duì)比研究。由于進(jìn)行的對(duì)比研究，本發(fā)明的發(fā)明人可證實(shí)代表一些最已知和廣泛的抗-流感抗體的以上提到的現(xiàn)有技術(shù)抗體，可有效識(shí)別與由IgG PN-SIA28識(shí)別的表位不同的表位。以下實(shí)驗(yàn)部分還說明了 IgG PN-SIA28的生產(chǎn)和進(jìn)行的具有相關(guān)結(jié)果的中和實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的全長(zhǎng)IgG對(duì)象，優(yōu)選地，但不限于，IgG PN-SIA28，以游離的形式或以與載體結(jié)合的形式制造和使用。載體是設(shè)計(jì)成與抗體結(jié)合并修飾其藥代動(dòng)力學(xué)特征的任何分子或化學(xué)或生物實(shí)體，使其具有免疫原性或提高其免疫原性。載體的非限制性實(shí)例是如KLH (“鑰孔帽貝血藍(lán)蛋白”)、麻仁球蛋白、甲狀腺球蛋白的蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)的清蛋白，如綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)、破傷風(fēng)類毒素、霍亂類毒素的紅細(xì)胞，諸如例如聚(D-賴氨酸D-谷氨酸)的聚氨基酸等。為了協(xié)助抗體到載體的結(jié)合，可以修飾抗體的C-末端或N-末端，例如通過引入額外的氨基酸殘基，例如能夠形成二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基。由于本發(fā)明的全長(zhǎng)IgG對(duì)象的尤其參考IgG PN-SIA28在下面的實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)說明的性質(zhì)，本發(fā)明的全長(zhǎng)IgG對(duì)象尤其適合用于醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用中，特別是用于生產(chǎn)A型流感病毒感染的廣譜的預(yù)防性或治療性治療的藥物。
因此，本發(fā)明的IgG，優(yōu)選地，但不限于，IgG PN-SIA28用于制造由A型流感病毒感染引起的病癥的預(yù)防性或治療性治療的藥物，諸如例如流行性感冒綜合征的應(yīng)用落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在以下實(shí)驗(yàn)部分中進(jìn)行和顯示的中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果認(rèn)為，在給予這樣的IgG的對(duì)象中IgG PN-SIA28在賦予對(duì)A型流感病毒的被動(dòng)免疫中極為有效，并且結(jié)果其在由A型流感病毒感染引起的病癥的廣譜預(yù)防性或治療性治療中是特別有用的，諸如例如流感綜合癥，尤其在人體中。任何其它識(shí)別相同的被IgG PN-SIA28識(shí)別的血凝素表位的全長(zhǎng)IgG具有與IgGPN-SIA28基本相同的中和能力。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含有效量的本發(fā)明的IgG，優(yōu)選地，但不限于，IgGPN-SIA28作為活性組分以及藥物賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物。IgG的有效量是設(shè)計(jì)成在給予組合物的對(duì)象中實(shí)現(xiàn)良好效果的量，例如通過影響其復(fù)制循環(huán)階段來中和A型流感病毒?！ぴ谠摫尘爸?，術(shù)語“對(duì)象”是指任何給予組合物并實(shí)現(xiàn)其保護(hù)效果的動(dòng)物宿主，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。用于本發(fā)明的藥物組合物的藥用載體或稀釋劑的非限制性實(shí)例包括如SPGAJ^A化合物(例如，山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)的穩(wěn)定劑，如白蛋白或酪蛋白的蛋白質(zhì)，含有如牛血清或脫脂乳的蛋白質(zhì)的藥劑，和緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)。本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28，也可以有利地用作在體外方法中在先前由患者獲得的生物樣品中(諸如例如血清、血漿、血液樣品或任何其它合適的生物材料，其從患者獲得，優(yōu)選從人獲得)檢測(cè)對(duì)A型流感病毒具有雜亞型(heteiOsubtype)交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗體的診斷試劑。這些抗體可在從患者獲得的生物樣品中發(fā)現(xiàn)，例如由于先前暴露于A型流感病毒，或由于本發(fā)明的單克隆抗體先前已經(jīng)為治療或預(yù)防或研究目的給予給患者。因此，用于在來自患者的生物樣品中檢測(cè)具有雜亞型交叉-中和活性的抗-A型流感病毒抗體存在的檢測(cè)方法落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述方法包括用本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28，作為特定檢測(cè)試劑接觸所述生物樣品。測(cè)定可以是定性或定量的。具有雜亞型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗體的檢測(cè)和/或定量可以例如通過如競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定實(shí)現(xiàn)，例如競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，其中評(píng)估了先前自患者獲得的生物樣品取代本發(fā)明的IgG結(jié)合血凝素的能力。競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的一般特征通常對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且不需要在此詳述。因此，包括本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28，作為特定試劑的診斷試劑盒也落入本發(fā)明的范圍，特別設(shè)計(jì)所述試劑盒以用于在先前從患者獲得的生物樣品中，對(duì)A型流感病毒具有雜亞型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗體的檢測(cè)和/或定量。類似地，本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28，在先前制備的免疫原或疫苗組合物中，可在檢測(cè)和/或定量能夠喚醒與本發(fā)明的IgG具有相同或類似的中和活性的抗A型流感病毒抗體的表位的測(cè)定方法中用作特定試劑，該中和性是對(duì)A型流感病毒的雜亞型交叉中和活性，在已經(jīng)給予這樣的組合物的對(duì)象中。預(yù)期這種方法可用于任何可用作疫苗或免疫原制劑的評(píng)估，如通過本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別是存在的指示，在免疫原性制劑和/或疫苗中，一種或多種能夠刺激能識(shí)別有利的表位的抗體克隆的產(chǎn)生的表位，諸如例如能夠喚醒針對(duì)例如由本發(fā)明的發(fā)明人鑒定的并在本專利說明書中詳述的A型流感病毒的雜亞型免疫的表位。最后，本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28，可用于制備模擬表位，諸如例如抗-獨(dú)特型抗體、多肽、截短或人造或其它形式的血凝素，賦予喚醒類IgG PN-SIA28抗體的能力。其中，優(yōu)選抗-獨(dú)特型抗體。抗-獨(dú)特型抗體是特定地針對(duì)用于其生產(chǎn)的廣譜中和抗體的獨(dú)特型的抗體，并且因此能夠模擬它們所識(shí)別的主要表位?？?獨(dú)特型抗體的制備通過本身已知的不需要在此處進(jìn)一步詳細(xì)解釋的方法來實(shí)現(xiàn)。以實(shí)例的方式提及相同發(fā)明人發(fā)表的論文((Burioni et al. (2008)PLoS ONE 3 (10) : e3423, related tothe manufacture of an anti-idiotype antibody capable of mimicking a criticalepitope of the human immunodeficiency virus (HIV)gp 120)。因此，針對(duì)本發(fā)明的IgG，優(yōu)選但不限于IgG PN-SIA28的模擬表位，優(yōu)選抗-獨(dú)特 型抗體，落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。完全以說明而不是限制如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明范圍的方式提供以下實(shí)驗(yàn)部分。實(shí)驗(yàn)部分I. IgG PN-SIA28的制備以及其中和能力的特性通過使用桿狀病毒來生產(chǎn)代表本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的IgG PN-SIA28。Sf_9細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和高效價(jià)病毒原料的隨后生產(chǎn)，而高五細(xì)胞系(H5)用于生產(chǎn)重組蛋白。通過分別使用Sf-900II SFM培養(yǎng)基和Express-Five SFM(Gibco)，將兩者都保持在無血清條件下。細(xì)胞在27°C下溫育并保持在約IO6細(xì)胞/ml的濃度的懸浮液中。重組桿狀病毒的制備開始于Fab片段的全長(zhǎng)IgG的生產(chǎn)通過將用于重和輕鏈的基因克隆到包含與AcNPV桿狀病毒基因組(用于啟動(dòng)子PlO和多角體蛋白的基因)同源的區(qū)域的轉(zhuǎn)移載體中來實(shí)現(xiàn)。桿狀病毒DNA (BD Biosciences Pharmingen)包含致死缺失，因此一旦轉(zhuǎn)移到昆蟲細(xì)胞中，它不能影響生產(chǎn)性感染。當(dāng)桿狀病毒線性基因組由互補(bǔ)轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染到Sf-9細(xì)胞中時(shí)，同源區(qū)之間的重組導(dǎo)致產(chǎn)生重組桿狀病毒，再次存活并也能夠表達(dá)異種蛋白。尤其是，為了產(chǎn)生表達(dá)人全長(zhǎng)抗體的重組桿狀病毒，使用了轉(zhuǎn)移載體pAc-k-Fc (PROGEN)，該轉(zhuǎn)移載體包括人IgG免疫球蛋白的Fe部分并且其中已克隆了用于Fab PN-SIA28的輕鏈和重鏈的基因。通過使用限制性位點(diǎn)SacI，EcoRV將用于輕鏈的基因克隆到轉(zhuǎn)移載體pAc-k-Fc中，而重鏈通過使用限制性位點(diǎn)Xhol，Spel。圖I示出了轉(zhuǎn)移載體(Progen)的示意圖，其中顯示了用于重鏈和輕鏈的克隆位點(diǎn)。因此按照制造商(BD Bioscences)推薦的方案,使通過消化和序列測(cè)定檢驗(yàn)的轉(zhuǎn)移載體與5 μ g的桿狀病毒DNA (BD)共轉(zhuǎn)染。在約6-7天后收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基并用ELISA測(cè)定分析人免疫球蛋白的存在。該第一上清液指定為“步驟O”(SO)。為了獲得純重組桿狀病毒種群，進(jìn)行噬斑檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說，將2xl06Sf_9細(xì)胞接種到6孔平板中，并且制備上清液SO的連續(xù)稀釋(從10_4至10_7)。每孔加入Iml的每一稀釋，并在I小時(shí)后在27°C下除去接種物，并向每個(gè)孔中加入半固態(tài)培養(yǎng)基(1%瓊脂糖溶液)。將平板在27°C下溫育約一周，直到在顯微鏡下出現(xiàn)可檢測(cè)的溶解噬斑。將一些噬斑分別轉(zhuǎn)移到含105Sf-9細(xì)胞的24孔平板的孔中。在約一周后，對(duì)于分泌到培養(yǎng)基中的IgG的存在，用ELISA測(cè)定測(cè)試每一上清液。此外，再次通過ELISA測(cè)定來檢驗(yàn)抗體維持其對(duì)抗原的結(jié)合特異性。尤其是，通過常規(guī)捕獲ELISA測(cè)定來檢查分泌到培養(yǎng)基中的重組IgG PN-SIA28抗體，通過使用能夠結(jié)合人Fab片段的多克隆(polyclonal,多克隆抗體),作為捕獲試劑,和能夠結(jié)合人Fe片段的辣根過氧化物酶結(jié)合的多克隆(多克隆抗體)，用于檢測(cè)。為了判斷重組抗體的特異性，通過使用以前被作為Fab片段的單克隆識(shí)別的流感疫苗Inflexal V (season2007-08)作為抗原進(jìn)行ELISA測(cè)定。
重組桿狀病毒的擴(kuò)增一旦通過噬斑測(cè)定獲得重組桿狀病毒的純種群，將其擴(kuò)增以獲得高效價(jià)病毒貯液(約109PFU/ml)。進(jìn)行了四個(gè)體外擴(kuò)增步驟，前三個(gè)(SI、S2、S3)在粘附Sf_9細(xì)胞中，而最后步驟(S4)在懸浮細(xì)胞中。然后將S4在96孔平板中通過終點(diǎn)稀釋測(cè)定進(jìn)行滴定并且用Reed-Muench公式計(jì)算效價(jià)。重組抗體的表達(dá)為了確定最佳表達(dá)條件，以幾種感染多態(tài)性(M0I1、5和10)來感染懸浮的H5細(xì)胞，并且在不同天(感染后3、4、5、6天)收集培養(yǎng)基。為了建立最佳感染條件和檢驗(yàn)產(chǎn)生的分子的整合性，用Western Blot測(cè)試不同等分部分。產(chǎn)生的重組免疫球蛋白用能夠結(jié)合人Fe片段的辣根過氧化物酶結(jié)合的多克隆進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定在變性和非還原條件(SDS 10%)下進(jìn)行。重鉬PN~SIA28IgG的鈍化和定量在以IO6細(xì)胞/ml的濃度已侵染IL的H5細(xì)胞(M0I5)后，通過臺(tái)盼藍(lán)染色每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活力。約4天后(約70-80%死亡率)，收集、離心培養(yǎng)基并用O. 2μπι過濾器(Millipore)過濾培養(yǎng)基。然后使用G蛋白通過親和由培養(yǎng)液上清液純化重組抗體。以IOml的洗提緩沖液(O. IM朽1檬酸，ρΗ3)洗提抗體并通過用Amicon Ultra-15 (Millipore)超濾濃縮。通過聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)確定純化抗體的濃度和純度和隨后用庫瑪西藍(lán)(Coomassie Blue)染色，通過參考BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，通過參考來自人的商用IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線用ELISA評(píng)估重組蛋白的量。微量中和測(cè)定將MDCK細(xì)胞(4x104每孔)接種到96孔平板中。使Fab PN-SIA28的連續(xù)稀釋(20 μ g/ml-0. 078 μ g/ml)和 IgG PN-SIA28 (10 μ g/ml-O. 039 μ g/ml)與每一 HlNl 或 H3N2病毒的100 TCID50 一起溫育。在37°C下I小時(shí)后，向每個(gè)孔中加入100 μ I不同濃度的病毒Fab或病毒-IgG混合物(為了侵染控制，混合物僅由病毒構(gòu)成)。在37°C下I小時(shí)后，移除100 μ I的混合物并向每孔中加入100 μ I的MEM TPCK-胰蛋白酶。在37°C下約7小時(shí)后，固定細(xì)胞單層并在室溫下用冷乙醇溶液滲透10分鐘。然后在37°C下在潮濕室中用以熒光素異氰酸酯(FITC)-結(jié)合的抗體檢測(cè)的抗A型流感單克隆抗體(Argene)溫育細(xì)胞30分鐘。最后，用核染料Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞染色。通過計(jì)算與對(duì)照病毒相比侵染的細(xì)胞數(shù)量減少來確定抗體的中和活性，對(duì)照病毒是沒有與感興趣的抗體預(yù)溫育的病毒。在實(shí)驗(yàn)中，總是包括陰性對(duì)照(病毒+對(duì)流感病毒非特異性的抗體)，非侵染細(xì)胞和所用抗體的毒性對(duì)照。各孔中陽性細(xì)胞核的數(shù)目通過自動(dòng)GE Healthcare的IN Cell分析系統(tǒng)來計(jì)算。結(jié)果通過桿狀病毒牛產(chǎn)全長(zhǎng)抗體
全長(zhǎng)免疫球蛋白通過將用于Fab PN-SIA28重鏈和輕鏈的基因克隆到含F(xiàn)e部分的轉(zhuǎn)移載體pAc-k-Fc (Progen)中而獲得。在用載體pAc-k-Fc和桿狀病毒線性DNA共轉(zhuǎn)染Sf_9細(xì)胞后，發(fā)明人證實(shí)了轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基包括人IgG。此外，對(duì)于結(jié)合特異的維持，測(cè)試了分泌到培養(yǎng)基中的IgG。為此，分別使用能結(jié)合人Fab片段的多聚和流感疫苗Inflexal VCseason 2007-08)作為抗原，通過ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基。在兩個(gè)情況中，通過能夠結(jié)合人Fe片段的辣根過氧化物酶-結(jié)合的多克隆(多克隆抗體)來檢測(cè)單克隆抗體IgG PN-SIA28。1%BSA用作陰性對(duì)照抗原。平行地，恰當(dāng)適合的免疫球蛋白測(cè)定也使用Fab PN-SIA28進(jìn)行。ELISA結(jié)果表明新產(chǎn)生的IgG在轉(zhuǎn)染后分泌到培養(yǎng)基中，并維持了它們的能夠結(jié)合流感疫苗以及源于此的Fab片段的結(jié)合特異性。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基用于進(jìn)行噬斑測(cè)定，以便獲得純重組桿狀病毒的純種群。通過ELISA測(cè)試來自幾個(gè)獨(dú)立噬斑的上清液以便評(píng)估分泌到培養(yǎng)基中的IgG的存在。不是所有結(jié)果為陽性的上清液代表在培養(yǎng)基中存在免疫球蛋白，并因此將其丟棄。 在獲得高-效價(jià)病毒貯液(IO8-IO9 pfu/ml)后，發(fā)明人通過使用不同的MOI和不同的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)了 IgG PN-SIA28的表達(dá)。對(duì)于表達(dá)測(cè)試，使用了 H5細(xì)胞系并用WesternBlot在變性和非還原條件下測(cè)試在侵染后3、4、5和6天收集的幾種培養(yǎng)基等分部分?；讷@得的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，發(fā)明人選擇MOI 5并收集侵染后第四天的培養(yǎng)基以在H5細(xì)胞生
產(chǎn)重組蛋白。體外牛物活件的特件微量中和測(cè)定在96孔平板中以屬于HlNl和H3N2亞型的幾種病毒株進(jìn)行微量中和檢測(cè)，以便評(píng)估抗體的中和活性。通過使用Fab PN-SIA28和IgG PN-SIA28兩者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。微量中和測(cè)定的結(jié)果在以下表I中示出?？贵w的中和活性以IC5tl表示，IC5tl是能夠中和50%個(gè)體病毒株侵染的抗體濃度(表不為μ g/ml)表I
Fab 28IgG PN-SIA28__
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A/Port Chal mers/1/7313.19_. 1.8
—>VWisconsin/67/2005>20——~~~[ ND**ND :未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定單克隆導(dǎo)致能夠中和，作為Fab片段(Fab PN-SIA28)和作為全長(zhǎng)免疫球蛋白(IgG PN-SIA28)，所有測(cè)試的分離體屬于HlNl亞型(參照ATCC菌株和2009流行的HlNl株)。但是，全長(zhǎng)IgG形式的重組蛋白顯示出遠(yuǎn)高于Fab的中和活性。與Fab PN-SIA28相t匕，全長(zhǎng)免疫球蛋白IgG PN-SIA28也對(duì)所有測(cè)試的H3N2亞型分離體呈現(xiàn)出重要的中和活性。因此，整體上，全長(zhǎng)免疫球蛋白IgG PN-SIA28確切呈現(xiàn)出比Fab低的IC5(I。2.表位物質(zhì)的鑒定和方法在Fab PN-SIA 28詵擇壓力下能夠洮逸杭體反應(yīng)(杭體洮逸突奪體)的突奪體的詵擇和特性實(shí)驗(yàn)在90%匯合的MDCK細(xì)胞上進(jìn)行，其在T25燒瓶中生長(zhǎng)在補(bǔ)充有10%FBS (胎兒牛血清)的MEM中。使用了 Fab PN-SIA 28和e509抗-E2/HCV，后者用作陰性對(duì)照(模擬對(duì)照)，在I. 5ml的補(bǔ)充有TPCK胰島素(2 μ g/ml)的MEM培養(yǎng)基中將它們稀釋以獲得2 μ g/ml、10 μ g/ml和20 μ g/ml的最終抗體濃度。在I. 5ml的相同培養(yǎng)基中制備了 A/PR/8/34(ATCC號(hào)VR-1469TM)的IOOTCID5cit5將含F(xiàn)ab和病毒的兩種溶液混合以獲得在3ml的最終體積中的I μ g/ml、5 μ g/ml和10 μ g/ml最終濃度的Fab。然后在37°C下溫育混合物I小時(shí)。也·包括侵染陽性對(duì)照(沒有PN-SIA28的病毒)，以及未侵染細(xì)胞。用無菌IX PBS洗滌兩次后，將Iml的每個(gè)中和混合物加入到含MDCK細(xì)胞的燒瓶中，并且侵染在5%C02的存在下在34°C下進(jìn)行I小時(shí)。在吸收后，去除培養(yǎng)基并用無菌PBS洗滌單層兩次。將3毫升的補(bǔ)充有胰島素(2 μ g/ml)的MEM培養(yǎng)基加入到侵染陽性對(duì)照和非-侵染細(xì)胞中。將抗體PN-SIA28和e509加入到預(yù)先處理的侵染細(xì)胞中，維持在侵染步驟期間使用的濃度。將細(xì)胞在34°C下與5%C02溫育并有規(guī)律檢查致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的存在48小時(shí)，將侵染陽性對(duì)照與處理的侵染細(xì)胞進(jìn)行比較。然后收集、離心(2000rcf 10分鐘)并在-80°C下保存上清液。滴定所有病毒貯液并用于侵染新的細(xì)胞制品，提高那里可能的Fab濃度。在10次傳代后，將侵染陽性對(duì)照和陰性對(duì)照(模擬對(duì)照)細(xì)胞與在PN-SIA28選擇壓力下的侵染細(xì)胞進(jìn)行比較。當(dāng)強(qiáng)的致細(xì)胞病變效應(yīng)在陽性和陰性(模擬)對(duì)照中明顯時(shí)，評(píng)估了 PN-SIA28-處理的侵染細(xì)胞中CPE的存在或不存在。收集、離心、儲(chǔ)存所有上清液并用于流感病毒的編碼病毒HA(血凝素)的染色體片段4的全長(zhǎng)DNA的測(cè)序。HA的克降和突變使用以下PCR寡核苷擴(kuò)增A/PR/8/34 (HlNl)的血凝素(HA)APR834_s :5’ -CACCATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTG-3’ (SEQ ID NO 6)；APR834_as :5’ -TCAGATGCATATTCTGCACTGCAAAGATCCATTAGA-3’ (SEQ ID NO 7).將PCR 產(chǎn)物克隆到載體 pcDNA 3. lD/V5-His_T0P0(Invitrogen)中。隨后，通過使用Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen)生成用于HlNl血凝素(HA)和H3N2 HA的突變體?？偣伯a(chǎn)生20個(gè)用于HlNl的HA突變體和4個(gè)用于H3N2的HA突變體。FACS結(jié)合測(cè)定通過使用野生型和由如以上描述克隆的突變?nèi)L(zhǎng)HA蛋白評(píng)估PN-SIA28的結(jié)合活性。簡(jiǎn)言之，用4μ g的含HA核酸序列的載體pcDNA3. lD/V5-His-T0P0轉(zhuǎn)染人上皮腎(HEK)細(xì)胞293T。之后離心并以4%低聚甲醛固定，轉(zhuǎn)染細(xì)胞與IgG PN-SIA28 (10 μ g/ml)或與鼠抗-Hl或抗-H3 (I μ g/ml)在室溫下溫育30分鐘。然后洗滌細(xì)胞并在室溫下與人或鼠FITC-結(jié)合的單克隆抗-Fab抗體溫育30分鐘。此后，洗滌細(xì)胞并用FACS分析。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中也包括未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。使用針對(duì)線性表位的單克隆抗-鼠Hl或H3亞型抗體評(píng)估每個(gè)HA的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS分析，其中減去從這些僅用第二抗體染色的細(xì)胞獲得的信號(hào)。PN-SIA28與不同突變的結(jié)合表示為與野生型相比的結(jié)合百分比。軟件以下軟件用于序列的分析SeqScape(Applied Biosystems)、ClustalX (TobyGibson)、Bio Edit (Tom Hall, Ibis Therapeutics)和 Treeview (GubuSoft)0 RasMol(Roger Sayle)、Jmol (Jmol: a Java open-source viewer for 3D chemical structures.http://www. jmol. org/)> Cn3D (United States National Library of Medicine, NLM)、Pepitope server (Pepitope:mapping of epitopes from affinity-selected peptides.Bioinfrmatics 2007 23 (23) :3244-3246. )、Mimox (BMC Bioinformatics 2006,7:451doi:10. 1186/1471-2105-7-451)用于可視化和再現(xiàn)分子。最后，GraphPad Prism用于數(shù)據(jù)的分析和繪圖編輯。 MM由單克隆抗體識(shí)別的HlNl病毒血■凝素表位的特性在Fab PN-SIA 28選擇壓力下能夠逃逸抗體反應(yīng)的突變體的選擇和特性在使細(xì)胞經(jīng)歷在方法中描述的許多步驟之后，以野生型A/PR/8/34HIN1病毒侵染的細(xì)胞在不存在抗體PN-SIA28和存在用作陰性對(duì)照的抗體e509抗-E2/HCV的情況下呈現(xiàn)出強(qiáng)的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。用野生型病毒侵染的細(xì)胞在存在10 μ g/ml濃度的PN-SIA28的情況下表現(xiàn)出不顯著的CPE。相反，用所選的變異病毒侵染的細(xì)胞不論是否存在10 μ g/ml濃度的PN-SIA28都表現(xiàn)出強(qiáng)的CPE。能夠逃逸抗體反應(yīng)的產(chǎn)生的變體的測(cè)序顯示出兩個(gè)不同的突變體，與野生型病毒的氨基酸序列相比，每一突變體在血凝素干區(qū)的HA2亞單位中具有單氨基酸突變。兩個(gè)突變是Ile361Thr和Asp362Gly (編號(hào)參考線性A/PR/8/34(HlNl) HA氨基酸序列，NCBI登錄號(hào)EF467821. 1，序列表中的SEQ ID N0:5)。在不同亞型的不同株的361位自然存在異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)。如隨后描述，I361V變異不影響PN-SIA28與HA的結(jié)合。不存在在361位具有Thr或在362位具有Gly的自然分離體。結(jié)合mAb PN-SIA28的HA區(qū)的鑒別抗體PN-SIA28對(duì)A型流感病毒具有強(qiáng)的中和活性。尤其是，PN-SIA28對(duì)分別屬于組I和組2的Hl-(如HlNl)和H3-(如H3N2)亞型病毒具有雜亞型中和活性。在血凝素抑制測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，PN-SIA28不抑制病毒引起的紅細(xì)胞凝集。Western blot分析表明PN-SIA28僅識(shí)別了未成熟形式的HA (HAO)基本上，由抗體逃逸突變體的產(chǎn)生、血凝素抑制測(cè)定和Western blot分析獲得的數(shù)據(jù)表明由中和抗體識(shí)別的區(qū)并不位于HA球狀區(qū)而是位于干區(qū)。在這些觀察的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)包含可阻止以上提到的抗體結(jié)合的氨基酸取代的HA分子以便鑒別由PN-SIA28識(shí)別的表位。在以下描述中，氨基酸殘基基于線性A/PR/8/34(HlNl)HA序列、NCBI登錄號(hào)EF467821. I、序列表中的SEQ ID N0:5進(jìn)行編號(hào)。首先，發(fā)明人認(rèn)為在PN-SIA28選擇壓力下，產(chǎn)生了兩個(gè)不同的A/PR/8/34 (HlNl)HA2抗體逃逸突變體，在一個(gè)突變體中殘基Ile361突變?yōu)門hr，并且在另一個(gè)突變體中殘基Asp362突變?yōu)镚ly。這兩個(gè)突變體不再被PN-SIA28識(shí)別?；谶@些結(jié)果，產(chǎn)生在361位具有丙氨酸(取代Ile361Ala)或在362位具有丙氨酸/甘氨酸(取代Asp362Ala、Asp362Gly)的HA突變體并通過FACS分析評(píng)估了 PN-SIA28結(jié)合突變體的能力。PN-SIA28僅可以微弱地結(jié)合至突變的HAs(Ile361Ala、Asp362Ala、Asp362Gly)，說明這兩個(gè)殘基包括在由該抗體識(shí)別的表位中。重要的是要注意氨基酸殘基Ile361和Asp362在許多血凝素亞型(HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H10、H14、H15)中是高度保守的。為了詳細(xì)表征PN-SIA28HA的表位設(shè)計(jì)了具有靶向被該IgG識(shí)別的可能區(qū)的突變的第二組突變體。共產(chǎn)生了在幾個(gè)氨基酸位置，包括Ile361Ala和Asp362Ala含取代丙氨酸的20種突變體，參見表2。表 2
ΗΛ1Ii Λ 2·
I,His25 (Hisl8F10|HCR6261)I. Trp357
II,His45(His38F10和CR6261)Thr358
III.Thr315 (Thr3l8)IIL g1Y359
IV.Asn3361V' Met360
v lle337V. Ile36I (Vail8 F10)
VI. Pro33gVI. Asp362(Aspi9F10_079)
VII. Gly363{Gly20F10_C179)
VIII. Trp364 (Trp21 F10, CR6261, C179)
IX.Thr384(Thr4l FIO和CR626I)
X.Ile388 (Ile45 F10|f1CR6261)
XL Thr392 (Thr49 F10, CR6261|HC179)XII. Val395 (Val 52F10, CR626I_C179)
XIII,Asn396(Asn53n0_Ci79)
XIV.Glu400{GIu57C179)在表2中，編號(hào)基于線性A/PR/8/34(HlNl)HA序列、NCBI登錄號(hào)EF467821. I、序列表中的SEQ ID N0:5。在括號(hào)中提供了基于已經(jīng)描述的抗體F10、CR6261和C179的原始公開的編號(hào)。由IgG PN-SIA28識(shí)別的血凝素區(qū)的氨基酸殘基FACS分析表明抗體PN-SIA28的結(jié)合在以下突變體中降低-11、-III和-IV ;HA2-II、-IV、-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、-XI、XII 和 XIV(參看表 2)。這些結(jié)果表明殘基 His25、His45、Thr315、Asn336、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384、Thr392、Val395和Glu400對(duì)PN-SIA28和HA之間的相互作用是關(guān)鍵的。因此，這些殘基參與抗體到HA干區(qū)的結(jié)合。表2中顯示的所有其它突變體不導(dǎo)致PN-SIA28與HA的結(jié)合的降低。
對(duì)于位置HA2_Ile361產(chǎn)生了額外的HA突變體，其中原始?xì)埢優(yōu)槔i氨酸。在相同的亞型中，在位置362中包括自然序列，異亮氨酸殘基或纈氨酸殘基。當(dāng)測(cè)試PN-SIA28與突變體HA Ile361Val的相互作用時(shí)，未觀察到相互作用的降低。這些結(jié)果表明抗體PN-SIA28能夠結(jié)合兩種病毒變體，在位置361具有異亮氨酸的病毒變體和在相同位置具有纈氨酸的病毒變體兩者。這表明PN-SIA28能夠結(jié)合并中和所有病毒株，不管在位置361處是否存在兩個(gè)殘基。由IgGPN_SIA28和由抗體C179識(shí)別的表位之間的差異現(xiàn)有技術(shù)中描述的鼠單克隆抗體C179能夠結(jié)合HA的干區(qū)中的由亞型Hl、H2和H5的HA共享的共用表位?？贵wC179與該區(qū)域的結(jié)合抑制HA的融合活性并因此導(dǎo)致病毒的中和。由C179識(shí)別的表位由兩個(gè)不同的位點(diǎn)構(gòu)成，一個(gè)位于HAl亞單位并由殘基318-322限定，并且另一個(gè)位于HA2亞單位并由殘基47-58限定。 由于兩個(gè)位點(diǎn)在HA分子的干區(qū)中央位于一起，C179表現(xiàn)共同識(shí)別這些位點(diǎn)。能夠逃逸抗體反應(yīng)的突變體病毒，包含帶有在HAl亞單位的位置318中一個(gè)Thr到Lys取代或在HA2亞單位的位置52中一個(gè)Val到Glu取代的HA，不再被C179識(shí)別和中和。比較由PN-SIA28識(shí)別的表位與由Cl79識(shí)別的表位。來自FACS 分析的結(jié)果表明氨基酸 His25、His45、Thr315、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384 和 Val395 (對(duì)應(yīng)于突變體 HA1-I、-II、和-III ;HA2-II、-IV、-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、和-XII，參見表 2)對(duì)于 PN-SIA28 與 HA 的結(jié)合是重要的。對(duì)C179與HA的結(jié)合這些殘基沒有被描述為關(guān)鍵殘基。此外，Asn336、Thr392、Val395和Glu400 (對(duì)應(yīng)于突變體HAl-IV ;HA2_XI、-XII和-XIV)對(duì)于HA與PN-SIA28的相互作用是關(guān)鍵殘基，以及對(duì)C179。另外，殘基Asn396 (對(duì)應(yīng)于突變體HA2-XIII)涉及C179和HA之間的相互作用，而其不涉及PN-SIA28和HA之間的相互作用?？傊蒔N-SIA28抗體識(shí)別的表位和由C179抗體識(shí)別的表位不同。由IgG PN-SIA28識(shí)別的和由抗體CR6261識(shí)別的表位之間的差異現(xiàn)有技術(shù)中描述的抗體CR6261針對(duì)A型流感病毒H1、H2、H5、H6、H8和H9亞型具有雜亞型中和活性。對(duì)CR6261-A/South Carolina/1/1918相互作用進(jìn)行的結(jié)晶研究表明抗體識(shí)別在位于接近HAl (殘基18、38、40、42、292)和HA2 (殘基21、41、45、49、52、56)的膜的干區(qū)中的高度保守螺旋區(qū)?？贵w通過阻止構(gòu)象重排聯(lián)合膜融合來中和病毒。比較由PN-SIA28識(shí)別的表位與由CR6261識(shí)別的表位。殘基Thr315、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364 和 Thr384 (對(duì)應(yīng)于突變體 HAl-III ；HA2-I I、-IV、-V、-VI、-VII、-VI11 和 IX、參見表 2)對(duì)于 PN-SIA28 與 HA的結(jié)合是重要的，但對(duì)CR6261與HA的結(jié)合沒有被描述為關(guān)鍵殘基。殘基His25、His45 (對(duì)應(yīng)于突變體HAl-I和II，參見表2)、Thr392和Val395 (對(duì)應(yīng)于突變體HA2-XII和XII，參見表2)對(duì)HA與PN-SIA28和CR6261的相互反應(yīng)是關(guān)鍵殘基。殘基Ile388 (對(duì)應(yīng)于HA2-X突變體，參見表2)對(duì)PN-SIA28與HA的結(jié)合沒有顯示重要性，而此殘基顯示與抗體CR6261直接接觸。總之，由PN-SIA28和CR6261識(shí)別的表位不同。由IgG PN-SIA28識(shí)別的和由抗體FlO識(shí)別的表位之間的差異
現(xiàn)有技術(shù)中描述的抗體FlO是針對(duì)血凝素的高度親和中和抗體，針對(duì)H5N1和HlNl病毒的高致病性亞型極為有效。在通過識(shí)別位于血凝素干區(qū)的高度保守表位的連接后，該抗體抑制融合過程。確定了 FlO與來自A/Vietnam/1203/04株H5復(fù)合的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。由FlO識(shí)別的表位包括由位于一側(cè)的與HAl殘基旁側(cè)的HA2融合多肽和位于另一側(cè)的HA2 a A螺旋形成的疏水袋。被FlO識(shí)別的HAl區(qū)包括殘基18和38，而ΗΑ2包括殘基18_21、41、45、49、52、53、56。由突變體實(shí)現(xiàn)的研究表明在ΗΑ2 a A中的段內(nèi)的與FlO進(jìn)行重要相互作用的殘基Val52、Asn53和Ile56強(qiáng)烈減少或完全消除抗體的結(jié)合。比較由PN-SIA28識(shí)別的表位與由FlO識(shí)別的表位。對(duì)PN-SIA28 的結(jié)合重要的殘基 His25、His45、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384、Thr392 和 Val395 (對(duì)應(yīng)于突變體 HA1-I 和-II ;HA2-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、-XI和XII，參見表2)被描述為FlO與HA結(jié)合的關(guān)鍵殘基。相反，殘基Thr315、Asn336、Thr358、Met360 和 Glu400 (對(duì)應(yīng)于突變體 HA1-III、_IV ;HA2-II、-IV 和-XIV，表 2)對(duì)于 PN-SIA28 與HA的相互作用是關(guān)鍵殘基但對(duì)FlO不是。另外，Ile388和Asn396 (對(duì)應(yīng)于突變體HA2-X、-XIII，參見表2)對(duì)PN-SIA28與HA的結(jié)合沒有顯示重要性，而此殘基顯示與FlO直接接觸?？傊?，由PN-SIA28和FlO識(shí)別的表位不同。在與HA結(jié)合中IgG和Fab PN-SIA28之間的不同當(dāng)HA原有殘基Thr315、Asn336、Pro338、Thr392、Glu400變異為丙氨酸時(shí)，其最終僅被IgG PN-SIA28識(shí)別。相反，F(xiàn)ab PN-SIA28仍可與這些突變體強(qiáng)烈結(jié)合。本發(fā)明的發(fā)明人假設(shè)結(jié)合特性的不同可能是由由于IgGs比Fab片段有更大尺寸的空間位阻引起的。由人單克降抗體PN-SIA28識(shí)別的H3N2病毒血凝素表位的特件為了評(píng)估是否HlNlHA上的被PN-SIA28識(shí)別的表位也被H3N2HA共享，創(chuàng)建了基于H3N2HA (A/Aichi/2/68)的第二組HA突變體被，參見表3。表3HAlHA2His34(His25HlNl)Ile363(Ile361HlNl)Asn54(His45HlNl)Asp364(Asp362HlNl)編號(hào)基于線性H3N2HA序列，NCBI登錄號(hào)EF614251. I、序列表中的SEQ ID N0:8。由PN-SIA28識(shí)別的H3N2HA氨基酸殘基FACS 分析表明在突變體 HAl-I 和-II ;HA2-I、-II，參見表 3 中 PN-SIA28 與 H3N2HA的結(jié)合減少。這些結(jié)果說明殘基His34、Asn54、Ile363和Asp364對(duì)于PN-SIA28與HA之間的相互作用是關(guān)鍵的，因此它們是被抗體識(shí)別的表位的一部分并位于HA的干區(qū)。對(duì)H3N2HA進(jìn)行的關(guān)于突變體的研究證實(shí)不管在兩種蛋白質(zhì)的線性序列中發(fā)現(xiàn)的許多氨基酸不同被PN-SIA28識(shí)別的表位被HlNl和H3N2血凝素共享。涉及抗體PN-SIA28與HA相互作用的殘基在大多數(shù)A型流感病毒亞型中位于高度保守區(qū)。3. IgG PN-SIA28針對(duì)另外的A型流感病毒亞型的中和活件對(duì)于抗體IgG PN-SIA28和其識(shí)別的區(qū)發(fā)現(xiàn)的中和活性允許考慮關(guān)于該單克隆也對(duì)其它流感病毒亞型的中和活性。在該情況，有利的是記住到現(xiàn)在16HA亞型已經(jīng)被鑒另|J，在人類有記載的它們中的僅三個(gè)能夠確定廣泛流行(HI、H2和H3)，而它們中的另外三個(gè)(H5、H9和H7)偶爾從人類分離,但到現(xiàn)在不能導(dǎo)致廣泛流行(Fouchier RA, Munster V,Wallensten A, et al. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutininsubtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol 2005;79(5):2814-22)。基于16亞型之間的系統(tǒng)發(fā)生距離(phylogenic distance)(從40%至60%同源)，典型地鑒別了兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)生組HU H2、H5、H6、H8、H9、HlI、H12、H13和H16所屬的組1，和 H3、H4、H7、H10、H14、和 H15 所屬的組 2 (Lambert LC, Fauci AS. Influenza vaccinesfor the future. N Engl J Med 2010;363 (21):2036-44;Nabel GJ, Fauci AS. Inductionof unnatural immunity:prospects for a broadly protective universal influenzavaccine. Nat Med 2010; 16 (12) : 1389-91 )。圖2示出幾種血凝素(H)亞型的系統(tǒng)發(fā)生樹。組I可進(jìn)一步分為3個(gè)群，為類群I (H1、H2、H5、H6)，類群11 (H11、H13和H16)和類群H9(H9、H8和H12)。類似地，組2可分為另兩個(gè)群類群H3 (H3、H4和H14)和類群H7 (H7、HlO 和 H15)。
基于由IgG PN-SIA28表明的寬中和活性(也擴(kuò)展到測(cè)試的3分離體)和不同亞型之間的相互系統(tǒng)發(fā)生距離，其中和活性可能也對(duì)屬于其它亞型的分離體。尤其是，我們可以推論I)中和活性極可能擴(kuò)大到所有作為H2、H5和H6的屬于類群Hl亞型的分離體。2)中和活性很可能擴(kuò)大到作為H9、H8或H12的屬于類群9亞型的分離體。3)中和活性可能擴(kuò)大到作為H11、H13或H12的屬于類群11亞型的分離體。4)對(duì)屬于組2亞型的活性不容易預(yù)測(cè)。在該情況，我們可陳述a. PN-SIA28的活性很可能擴(kuò)大到屬于H3亞型的除這些已經(jīng)考慮的其它分離體。b. PN-SIA28的活性可能擴(kuò)大到作為H4和H14的屬于類群H3亞型的分離體。c. PN-SIA28的活性不太可能擴(kuò)大到作為H7、H10和H15的屬于類群H7亞型的分離體。進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)這些假定，為了評(píng)估IgG PN-SIA28抗體結(jié)合屬于至今已在人物種中分離的亞型的重組蛋白的能力?？紤]被PN-SIA28識(shí)別的區(qū)是高度中和表位，該發(fā)現(xiàn)允許聯(lián)系結(jié)合某亞型的能力與實(shí)際中和它的能力。在該背景中，通過應(yīng)用以前已經(jīng)由本發(fā)明的發(fā)明人使用的實(shí)驗(yàn)方法確定初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，其包括編碼屬于不同亞型的全長(zhǎng)血凝素的人造基因的合成，和隨后在以個(gè)體構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面上的該基因的表達(dá)(Burioni R, Canducci F, Mancini N, etal. Monoclonal antibodies isolated from human B celIs neutralize a broadrange of Hl subtype influenza A viruses including swine-origin Influenzavirus (S-OIV) · Virology 2010;399 (I):144-52;Burioni R，Canducci F，Mancini N，etal. Molecular cloning of the first human monoclonal antibodies neutralizingwith high potency swine-origin influenza A pandemic virus (S-OIV). New Microbiol2009;32(4) :319-24)。因而，編碼來自屬于已影響人的亞型，除Hl和H3外，的分離體的HA的基因序列選自在線數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore ；http://openflu.vitalit. ch/browse, phpftresults)。以下是選擇的分離體
-A/Ann Arbor/6/60(H2N2)-A/Vietnam/1203/2004 clade I(H5N1)-LAIV A/chicken/Hong Kong/G9/97(H9N2)-A/New York/107/2003(H7N2)然后通過熒光免疫檢測(cè)法和FACS用PN-SIA28分析轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并且結(jié)果總結(jié)在表4中?；诓煌瑏喰椭g的系統(tǒng)發(fā)生距離進(jìn)行的假設(shè)被獲得的結(jié)果充分證實(shí)。因此，可以相信PN-SIA28的活性至少可擴(kuò)展到亞型H2N2、H5N1和H9N2。表4. PN-SIA28對(duì)用屬于不同亞型的血凝素轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合能力
系統(tǒng)發(fā)生組 HAME—型分離體_FFACS· 1.12A/Ann Arbor/6/60/(H2N2)++
—.......................................... .........——.—......HSAtVmmmi1203/2004 clade "II5NI、++
H9-樣冊(cè)A/chicken/Hong ICong,G9/97 (I側(cè)2)++
H7-ffH7A/New York/107/2003 (H7N2)--
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權(quán)利要求
1.一種特異性針對(duì)A型流感病毒血凝素抗原并且能夠結(jié)合和中和至少包括Hl亞型和H3亞型的多種A型流感病毒亞型的人單克隆抗體，其特征在于，所述人單克隆抗體為全長(zhǎng)IgG，并且進(jìn)一步的特征在于，所述人單克隆抗體識(shí)別位于血凝素干區(qū)中的保守表位，所述表位包括HAl血凝素亞單位的氨基酸殘基His25、His45、Thr315和Asn336和HA2血凝素亞單位的氨基酸殘基 Thr358、Met360、Ile361 或 Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384、Thr392、Val395和Glu400，所述氨基酸殘基的編號(hào)是基于指定為SEQ ID N0:5的HlNl血凝素氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型和H5亞型的多種A型流感病毒亞型。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型和H2亞型的多種A型流感病毒亞型。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型和H9亞型的多種A型流感病毒亞型。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型、H5亞型和H2亞型的多種A型流感病毒亞型。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型、H5亞型和H9亞型的多種A型流感病毒亞型。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型、H2亞型和H9亞型的多種A型流感病毒亞型。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人單克隆抗體，所述人單克隆抗體能夠結(jié)合并中和至少包括Hl亞型、H3亞型、H5亞型、H2亞型和H9亞型的多種A型流感病毒亞型。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，包括包含氨基酸序列SEQIDNO: I的重鏈可變區(qū)和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，其中，所述重鏈可變區(qū)由核苷酸序列SEQ ID NO:3編碼，并且所述輕鏈可變區(qū)由核苷酸序列SEQ ID N0:4編碼。
11.一種藥物組合物，包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體以及藥用賦形劑和/或稀釋劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的人單克隆抗體，用作針對(duì)直接或間接由A型流感病毒感染引起的病癥的治療性或預(yù)防性藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用的人單克隆抗體，其中，所述由A型流感病毒感染引起的病癥是流行性感冒綜合癥。
14.一種用于在來自患者的生物樣品中檢測(cè)具有雜亞型交叉中和活性的抗流感病毒抗體存在的測(cè)定方法，包括使所述生物樣品與作為特異性測(cè)定試劑的根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的抗體接觸的步驟。
15.一種診斷試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的抗體作為特異性試齊U，所述試劑盒特別用于在來自患者的生物樣品中檢測(cè)或定量具有雜亞型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗體的方法。
16.一種用于在免疫原性或疫苗組合物中檢測(cè)A型流感病毒表位存在的測(cè)定方法，所述A型流感病毒表位在給予其的對(duì)象中能夠誘發(fā)對(duì)A型流感病毒具有雜亞型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗體，所述方法包括使所述組合物與作為特定測(cè)定試劑的根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的抗體接觸的步驟。
17.一種特異性針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的抗體的獨(dú)特型的模擬表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆抗體，該單克隆抗體是全長(zhǎng)IgG-同型免疫球蛋白且其特征在于對(duì)A型流感病毒的高的寬范圍中和活性并且能夠識(shí)別不同A型流感病毒亞型之間的高度保守的特定血凝素表位。此外，描述了本發(fā)明的全長(zhǎng)IgG的治療、預(yù)防和診斷應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/42GK102958539SQ201180015849
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者羅伯托·布廖尼, 馬西莫·克萊門蒂 申請(qǐng)人:潑莫納搜索有限公司