專利名稱：用于禽舍疾病的活疫苗的制作方法
用于禽舍疾病的活疫苗本發(fā)明涉及制備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物用于對禽類病毒性疾病并且尤其是禽類感染性支氣管炎的局部施藥治療。禽類感染性支氣管炎是急性的接觸傳染疾病，其主要通過呼吸癥狀侵襲家禽。禽類感染性支氣管炎病毒(或IBV)是冠狀病毒屬(Coronavirus),冠狀病毒科(Coronaviridae),網(wǎng)巢病毒目(Nidovirales)的成員。此單鏈RNA病毒具有強的進化能力，并且病毒顆?？梢栽谕獠凯h(huán)境中存活一個月的時間。IBV侵襲所有年齡的家禽并且不僅靶向呼吸道。事實上，IBV首先在氣管中復制并且隨后可以蔓延至受侵襲的家禽的全身，侵襲多個內(nèi)部器官。發(fā)病率很高并且死亡率可以根據(jù)養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖條件以及細菌超感染的位點而變化。
臨床體征為下面的類型-呼吸的(咳嗽、氣管羅音、竇腫大、結膜炎等)；-生殖的(產(chǎn)蛋減少，產(chǎn)生薄的、畸形的或有色的殼的蛋)；-腎臟，強烈的干渴，等。IBV尤其通過呼吸途徑或者經(jīng)由氣溶膠傳播。毒性物質(zhì)由鼻排出物和滴下物構成。傳播是水平的、直接的(從患病鳥類到敏感性鳥類)或者間接的(經(jīng)由水、物質(zhì)等)。IBV對于多數(shù)消毒劑敏感，但是最佳的控制手段由聯(lián)合采用生物安全性步驟(凈化步驟、消毒步驟等)的接種疫苗組成。接種疫苗在于用一些量的被殺死的病原體(失活疫苗)或者毒性減小的病原體(減活疫苗)來接種要保護的物種以便引發(fā)宿主的生物應答，在隨后發(fā)生疾病期間對其進行保護?；钜呙缤ǔＪ亲銐蛴行У亩恍枰褂米魟?。疫苗佐劑是放大對其所結合的抗原的生物應答的賦形劑。例如，可提及氫氧化鋁，以及由SEPPIC公司以名稱Montanide 出售的油性佐劑。這些佐劑有多種性質(zhì)。它們也可以僅由脂質(zhì)體組成，由包含至少一種油相和至少一種水相的乳劑組成，由"福氏(Freund)"佐劑型組成，或者更通常地由不可水溶的無機鹽組成。在這些用作疫苗組合物佐劑的無機鹽中，可提及例如，氫氧化鋁、硝酸鈰、硫酸鋅、膠體氫氧化鐵或氯化鈣。氫氧化鋁是最常使用的佐劑。這些用作疫苗組合物佐劑的無機鹽尤其描述于Rajesh K. Gupta等人的文章"Adjuvants,balance between toxicity and adjuvanticity" ,Vaccine,第 11 卷，第
3期，1993，第 293-306 頁。疫苗可以通過注射(皮下或肌肉內(nèi)注射)或局部(例如,通過霧化的大規(guī)模疫苗接種，添加到飲用水中用于與喙和鼻孔以及眼鼻復合體相互接觸)施用。即使已證明通過注射接種疫苗是有效的，但是它具有不適于家禽養(yǎng)殖場的經(jīng)濟環(huán)境(高勞動力成本)的缺點，并且它也造成被處理的家禽的壓力，這在產(chǎn)蛋的情形下，在由注射造成物理創(chuàng)傷后，可以造成產(chǎn)蛋中斷。在疫苗組合物中以及在旨在防止感染性支氣管炎發(fā)生的疫苗組合物中使用有效佐劑使得下述成為可能·增加保護性應答的強度，使得能夠提供給更佳水平的保護；·延長由疫苗劑量所賦予的保護持續(xù)期，為養(yǎng)殖場中的動物提供貫穿其生長的持續(xù)更長的保護； 在沒有這些免疫應答放大劑而需要兩種治療時，以單次治療提供足夠的保護。節(jié)省下來的是待注射的劑量數(shù)(減半)，動物處理(勞動)以及在處理動物期間造成的壓力(也減半)；·具有以較低的抗原劑量獲得與由沒有使用佐劑的完整劑量所賦予的效力相當?shù)男ЯΦ目赡苄?。因此，疫苗生產(chǎn)廠將以相同的生產(chǎn)能力，能夠生產(chǎn)更多的疫苗劑量。同樣，可建議現(xiàn)有的包裝用于對更大量的動物進行疫苗接種。
目前沒有在通過使用活疫苗局部施藥而實施疫苗接種技術期間描述或使用佐劑。需要開發(fā)也具有上述改善免疫應答的佐劑功能的稀釋劑。這些組合物被稱作佐劑稀釋劑(AD)。在開發(fā)AD中遇到的主要困難是所述佐劑稀釋劑(AD)保持活疫苗存活以便維持其免疫原性特性的能力。開發(fā)用于活疫苗的佐劑的重要因素在于當它們在注射前接觸時，佐劑制劑不殺死組成疫苗抗原的活微生物的特異性。AD在市場上可見(例如來自Intervet公司的包括在Diluvac Forte 下的生育酚乙酸酯)并且AD被推薦用于某些活疫苗。此外，活疫苗在法國專利申請FR 2 385 401中是已知的。然而，此活疫苗不是用佐劑物質(zhì)制備的。迄今為止毋庸置疑，例如通過增加病毒含量，或者通過使用更具免疫原性的毒株，用活疫苗可以產(chǎn)生更大的免疫應答。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了用于制備活病毒疫苗的方法，其特征在于，該活疫苗是通過連續(xù)水性相乳劑類型(例如油包水乳劑或微乳劑)的佐劑來制備。出人意料地注意到，水包油(0/W)乳劑作為活疫苗的“稀釋劑”的用途對于被疫苗接種的動物中的血清學和免疫應答有正面作用。在此水包油乳劑中，外部水性相允許疫苗(通常是凍干的)易于溶解。本發(fā)明的另一方面是水包油乳劑作為活疫苗的佐劑稀釋劑的用途造成仍具有母體免疫性的幼小動物中的非常高的血清學應答。此出人意料的作用可由乳劑針對動物中存在的抗體的中和作用的對活病毒的保護性作用造成的。本發(fā)明的一個目的是克服上面指出的現(xiàn)有技術的所有或者一些缺陷。為此目的，本發(fā)明的主題是制備用于對禽類病毒性疾病進行局部施藥治療的疫苗組合物的方法，至少包括下面的步驟a)即時混合包含至少一種選自屬于所述禽類疾病的一種或多株毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐劑稀釋劑(AD)，其特征在于所述佐劑稀釋劑是水包油連續(xù)水性相乳劑或水包油微乳劑。術語“禽類病毒性疾病”旨在意指-呼吸病毒性疾病，例如感染性喉氣管炎、禽類感染性支氣管炎、鴿皰疹病毒感染、火雞鼻氣管炎；-消化病毒性疾病，例如鴨瘟、鴨病毒性肝炎、禽類嗜肝DNA病毒；
-病毒性皮膚疾病，例如禽類痘；-神經(jīng)系統(tǒng)的病毒性疾病，例如禽類腦脊髓炎、東方馬腦炎、西尼羅熱、狂犬病、"跳躍病"；-全身病毒性疾病，例如雞痕(avianpseudo-plague)(新城病(Newcastledisease))、馬立克氏病(Marek’s disease)、古姆博羅病(Gumboro disease)、禽疫、禽類造白細胞組織增生、雞感染性貧血病、Derszy病、卵膜軟化病(soft_egg disease)。術語“稀釋劑”旨在意指為了降低效價、豐富度或其百分比而加入到另一者的物質(zhì)。為了相關，用于局部施用的疫苗的佐劑稀釋劑(ADLAV)將必須
·在重構后，保持疫苗存活達給定的時間段；·允許制備對于粘膜易于噴涂及潤濕(親水性)的制劑(疫苗組合物)以允許有效且容易的治療；·相比于沒有佐劑而使用的抗原，顯著提高抗原的免疫有效性，并且不造成副作用。此外，本發(fā)明的實施方式可包括下面特征中的一種或多種-如上所限定的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒屬于IBV(感染性支氣管炎病毒)的一種或多種毒株；-如上所限定的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒是新城病病毒；-如上所限定的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒屬于IBV(感染性支氣管炎病毒)的一種或多種毒株、新城病病毒或這些病毒的混合物。新城病病毒，也稱作"雞瘟"、"禽類肺腦炎"或拉尼克赫特病(Ranikhetdisease),是由病毒造成的鳥類人畜共患病。根據(jù)毒株的毒性、動物的免疫性和狀況以及其他環(huán)境因素，發(fā)病率和死亡率變化很大。新城病病毒是副粘病毒科(Paramyxoviridae),腿腺炎病毒屬(Rubulavirus)的病毒。其是具有單鏈的RNA病毒(不同于具有8條鏈的流感病毒)，稱作單鏈的。RNA病毒易于且經(jīng)常突變，這會使得制造藥物和疫苗的策略更加復雜困難。被膜直徑為從150至300nm,其具有兩種類型的糖蛋白針狀體(spicule)。其特征在于·ΗΝ糖蛋白，具有使血細胞凝集以及神經(jīng)酰胺酶活性，允許病毒體附著于細胞表面的膜受體以及其釋放；· F糖蛋白，允許病毒被膜和細胞膜之間的融合。病毒易于在含胚的母雞卵中培養(yǎng)或者在體外(在雞胚胎成纖維細胞或在雞腎細胞上)培養(yǎng)。該病毒在環(huán)境溫度下非常具有抗性，其仍舊有感染性·在排泄物中持續(xù)長時間(幾個月)，·在雞舍中地面上持續(xù)2至3個月，·在污染的殼上持續(xù)7至8個月，
·在未烹飪的以及冷凍的尸體中持續(xù)2年及更長時間。對于流感，根據(jù)毒株的毒性對它們分類，區(qū)別是 強毒株(高毒性，誘發(fā)接近或達到100%的死亡率，其攻擊全身或至少攻擊內(nèi)臟，或涉及神經(jīng)系統(tǒng)，可能與呼吸問題相關)，·中等毒力株(中度毒性，產(chǎn)生具有神經(jīng)系統(tǒng)問題的呼吸疾病，幼鳥中死亡率達到50% )， 輕型毒株(弱毒性，非致死的，產(chǎn)生一些呼吸問題，并且有時不誘發(fā)癥狀)。例如，這些是Hitchner BI和La Sota毒株。病毒的來源與病毒所靶向的器官(根據(jù)病毒毒株而改變)，以及受侵襲的鳥類的狀況和免疫史相關聯(lián)，鳥類將病毒表達于 支氣管分泌物和排泄物中，·尸體的所有部分。從孵育開始分泌病毒并且在恢復期期間的可變化的時期中，分泌幾天至兩周，在少數(shù)情形下更長。為了抗擊病毒，現(xiàn)有的可由養(yǎng)殖者實施的預先警戒和預防措施可以由例如隔離被感染的動物、使被感染的動物安樂死、衛(wèi)生措施以及用常規(guī)消毒劑對處所消毒以及有規(guī)律的清潔組成。接種疫苗也構成預防的手段。本發(fā)明的主題也是-如上所限定的方法，其特征在于，佐劑稀釋劑(AD)包含油性佐劑、水性相、至少一種二價無機鹽以及至少一種絡合劑；-如上所限定的方法，其特征在于，在步驟a)前凍干所述活疫苗中含有的病毒?；钜呙缤ǔ龈纱鎯Σ⑶冶仨毤磿r用水性相重懸。由此重構的疫苗必須在添加稀釋劑后幾小時內(nèi)使用。-如上所限定的方法，其特征在于，所述佐劑稀釋劑是水包油乳劑，對于其重量的100%，其包含·從50%至97%的水，更特別地是從70%至97%的水，以及甚至更特別地是從80%至97%的水； 從1%至45%的油性佐劑，更特別地是從1%至30%的油性佐劑，以及甚至更特別地是從2%至10%的油性佐劑； 從O. I %至10%的至少一種二價無機鹽，更特別地是從O. I %至8%，以及甚至更特別地是從O. 2%至3% ; 從O. 1%至10%的至少一種絡合劑，更特別地是從O. I %至8%，以及甚至更特別地是從O. 2%至3%。-如上所限定的方法，其特征在于，所述佐劑稀釋劑是水包油微乳劑，對于其重量的100%，其包含·從50%至97%的水，更特別地是從70%至97%的水，以及甚至更特別地是從80%至97%的水； 從1%至45%的油性佐劑，更特別地是從1%至30%的油性佐劑，以及甚至更特別地是從2%至10%的油性佐劑； 從O. I %至10%的至少一種二價無機鹽，更特別地是從O. I %至8%，以及甚至更特別地是從O. 2%至3% ; 從O. 1%至10%的至少一種絡合劑，更特別地是從O. I %至8%，以及甚至更特別地是從O. 2%至3%。-如上所限定的方法，其特征在于，所述油性佐劑對于其重量的100%包含 從40%至95%的至少一種礦物油，更特別地是從50%至95%的至少一種礦物油，以及甚至更特別地是從50%至90%的至少一種礦物油； 從5%至60%的至少一種表面活性劑，更特別地是從5%至50%的至少一種表面活性劑，以及甚至更特別地是從10%至50%的至少一種表面活性劑。 -如上所限定的方法，其特征在于，所述至少一種二價無機鹽選自葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、天冬氨酸鈣、葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鐵和氯化鈣。-如上所限定的方法，其特征在于，所述至少一種絡合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉀和聚丙烯酸鈉。用于制備油性佐劑的礦物油選自通過蒸餾油以及通過實施后續(xù)加工步驟(例如脫硫作用、脫浙青作用、芳香化合物提取以及蠟提取步驟以及其他精加工步驟)而獲得的烴類礦物油(例如可提及，Marcol 52、MARC0L82、Drakeol 5和Drakeol 6等類型的油)。油性佐劑中存在的表面活性劑是親水性的乳化表面活性劑，其特征為介于8和19之間，更特別地是介于8和15之間的HLB值。此類表面活性劑可由烷基多糖苷或者烷基多糖苷混合物；皂苷類；卵磷脂類 ’聚氧乙烯烷醇類；包含聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段(block)的聚合物；或者通過脂肪酸(有利地在20°C為液體的脂肪酸)和糖、山梨醇、甘露醇或丙三醇縮合而獲得的酯組成。所述糖可由葡萄糖或蔗糖，或優(yōu)選地甘露醇組成。對于優(yōu)選的脂，可提及脂肪酸(例如油酸、硬脂酸、軟脂酸或月桂酸)以及山梨醇或甘露醇的脂，所述脂是通過脂肪酸與山梨醇或甘露醇的酯化，或者通過與在位置1-4或位置2-6環(huán)化的山梨醇或甘露醇的聚羥化鏈的酐化作用獲得的產(chǎn)物酯化，或者通過與山梨醇或甘露醇和與在位置1-4或位置2-6環(huán)化的山梨醇或甘露醇的聚羥化鏈的酐化作用獲得的產(chǎn)物酯化獲得的。作為特別優(yōu)選的甘露醇脂，可提及甘露醇油酸酯、一縮甘露醇油酸酯，包含5mol或IOmol或15mol或20mol的環(huán)氧乙烷的乙氧基化甘露醇油酸酯，以及包含5mol或IOmol或15mol或20mol的環(huán)氧乙烷的乙氧基化一縮甘露醇油酸酯。也可使用聚乙二醇、山梨醇或甘油糖脂衍生物。其他類型的優(yōu)選表面活性劑由乙氧基化植物油(例如具有3mol和40mol之間的環(huán)氧乙烷的乙氧基化玉米油，具有3mol和40mol之間的環(huán)氧乙烷的乙氧基化菜籽油或者具有3mol和60mol之間的環(huán)氧乙烷的乙氧基化蓖麻油)組成。
實施例佐劑配方與凍干疫苗的存活力的相容性是與此佐劑配方的組成以及其所應用的水平相關的。選擇提供良好的實施和佐劑能力的按比例組合的生物相容的組分然后在定量研究方法中評估此選擇。具有佐劑的疫苗的存活力(以及因此制劑與該活疫苗的相容性)對于已經(jīng)證明了比市售參照更高的效力的疫苗必然是良好的。
對于養(yǎng)殖者，通過更好的畜牧學性能水平、更低的治療成本以及節(jié)省的時間來反映效力的改善。局部治療目前并不使用刺激性能的佐劑。A-感染性支氣管炎情形的示范a)研究主題的產(chǎn)品制備的多種佐劑稀釋劑
權利要求
1.制備用于對禽類病毒性疾病進行局部施藥治療的疫苗組合物的方法，至少包括步驟 a)即時混合包含至少一種選自屬于所述禽類疾病的一種或多種毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐劑稀釋劑(AD)，其特征在于所述佐劑稀釋劑是水包油連續(xù)水性相乳劑或水包油微乳劑。
2.如前述權利要求所述的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒屬于IBV(感染性支氣管炎病毒)的一種或多種毒株。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒是新城病病毒。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒屬于IBV(感染性支氣管炎病毒)的一種或多種毒株、新城病病毒，或這些病毒的混合物。
5.如前述權利要求中的一項所述的方法，其特征在于佐劑稀釋劑(AD)包含油性佐劑、水性相、至少一種二價無機鹽和至少一種絡合劑。
6.如前述權利要求中的一項所述的方法，其特征在于在所述活疫苗中含有的病毒在步驟a)之前被凍干。
7.如前述權利要求中的一項所述的方法，其特征在于，所述佐劑稀釋劑是水包油乳劑，對于其重量的100%，其包含 -從50 %至97 %的水，更特別地從70 %至97 %的水，以及甚至更特別地從80 %至97 %的水； -從1%至45%的油性佐劑，更特別地從1%至30%的油性佐劑，以及甚至更特別地從2%至10%的油性佐劑； -從O. I %至10%的至少一種二價無機鹽，更特別地從O. I %至8%，以及甚至更特別地從 O. 2%至 3% ； -從O. 1%至10%的至少一種絡合劑，更特別地從O. 1%至8%，以及甚至更特別地從.O. 2%至 3%。
8.根據(jù)權利要求1-6中的一項所述的方法，其特征在于，所述佐劑稀釋劑是水包油微乳劑，對于其重量的100%，其包含 -從50 %至97 %的水，更特別地從70 %至97 %的水，以及甚至更特別地從80 %至97 %的水； -從1%至45%的油性佐劑，更特別地從1%至30%的油性佐劑，以及甚至更特別地從2%至10%的油性佐劑； -從O. I %至10%的至少一種二價無機鹽，更特別地從O. I %至8%，以及甚至更特別地從 O. 2%至 3% ； -從O. I %至10%的至少一種絡合劑，更特別地從O. 1%至8%，以及甚至更特別地從.O. 2%至 3%。
9.根據(jù)權利要求5-8中的一項所述的方法，其特征在于，所述油性佐劑對于其重量的100%，包含 -從40 %至95 %的至少一種礦物油，更特別地從50 %至95 %的至少一種礦物油，以及甚至更特別地從50%至90%的至少一種礦物油；-從5%至60%的至少一種表面活性劑，更特別地從5%至50%的至少一種表面活性齊U，以及甚至更特別地從10%至50%的至少一種表面活性劑。
10.根據(jù)權利要求5-9中的一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種二價無機鹽選自葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、天冬氨酸鈣、葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鐵和氯化鈣。
11.根據(jù)權利要求5-10中的一項所述的方法，其特征在于，所述至少一種絡合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉀和聚丙烯酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備用于對禽類病毒性疾病實施局部施藥治療的疫苗組合物的方法，至少包括步驟a)即時混合包括至少一種選自屬于所述禽類疾病的一種或多種毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐劑稀釋劑(DA)，其特征在于所述佐劑稀釋劑是水包油連續(xù)水性相乳劑或水包油微乳劑。
文檔編號A61K39/215GK102869380SQ201180015591
公開日2013年1月9日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權日2010年3月24日
發(fā)明者F·貝特朗, S·德維爾, L·迪皮伊 申請人:化工產(chǎn)品開發(fā)公司Seppic