專利名稱：用于細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的Fas(Apo-1，CD95)靶向平臺的制作方法
用于細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的FaS(Apo-1，CD95)靶向平臺
本發(fā)明涉及藥物遞送領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及靶向遞送運(yùn)載體(delivery vehicle)或藥物載體，并涉及其在治療和診斷應(yīng)用中的用途。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的運(yùn)載體或載體對其靶細(xì)胞具有高度特異性并可提供藥學(xué)活性劑或可檢測標(biāo)記的有效的細(xì)胞內(nèi)遞送。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了將藥學(xué)活性劑或可檢測標(biāo)記特異性地遞送至Fas配體表達(dá)細(xì)胞的運(yùn)載體。本發(fā)明延伸到組合物及在治療中特別是在瘤和神經(jīng)障礙的治療或預(yù)防中的用途。
當(dāng)前，大多數(shù)藥物為全身施用。對于大多數(shù)治療劑，大部分藥物通過全身清除從身體中排除，同時僅小部分藥物達(dá)到靶器官或靶組織。而且，健康組織和器官對施用的藥物的全身暴露可導(dǎo)致嚴(yán)重毒性。毒性的危險可被藥物的高劑量和大容量加重，而高劑量和大容量是克服差的生物利用度并在受治療者中提供充足的分布所需要的。相反，靶向藥物遞送設(shè)法將藥物聚集在目標(biāo)組織或器官中，而最小化全身藥物暴露。然而，用于靶向藥物遞送的現(xiàn)有的系統(tǒng)并不理想，且當(dāng)前的藥物治療策略不足以解決與全身藥物暴露相關(guān)的毒性問題。這在癌癥治療領(lǐng)域中尤其如此，癌癥治療中，細(xì)胞毒性抗癌藥物可損害健康組織而引起嚴(yán)重的副作用。因此，對選擇性地將藥物遞送至靶組織或靶器官的靶向藥物遞送策略存在迫切需要。這樣的策略應(yīng)當(dāng)通過增加藥物的治療指數(shù)而同時最小化藥物相關(guān)毒性的危險而改善藥物治療的效力。
此外，增加的基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)和蛋白組學(xué)知識結(jié)合新治療策略諸如RNA 干擾(Mello&Conte，2004 ;Grimm，2009)或基于肽的細(xì)胞內(nèi)調(diào)質(zhì)(Sawyer TK, 2009)改變著治療疾病的潛力。特別地，希望制造能夠?qū)?xì)胞內(nèi)靶標(biāo)起作用的小分子或較大生物藥物，以便例如選擇性地治療單獨(dú)細(xì)胞類型或破壞如癌癥中發(fā)現(xiàn)的異常細(xì)胞。然而，細(xì)胞內(nèi)活性藥物候選者由于其不能穿過細(xì)胞膜以與其細(xì)胞內(nèi)靶分子相互作用而通常未能成為藥學(xué)上有用的。細(xì)胞膜是脂雙層，其通常作為隔離細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞外(或外部)環(huán)境的半滲透屏障。當(dāng)前的用于運(yùn)輸藥物穿過細(xì)胞膜的遞送系統(tǒng)不像其可能的那樣有效和可靠。因此，對有效的細(xì)胞內(nèi)藥物遞送系統(tǒng)存在需求。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了用于將藥學(xué)活性劑或標(biāo)記遞送至細(xì)胞的遞送運(yùn)載體，包括特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分和藥學(xué)活性劑或標(biāo)記的載體。
遞送運(yùn)載體可以是包括特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分和藥物載體的藥物遞送運(yùn)載體。配體結(jié)合部分可將根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體靶向于Fas配體表達(dá)細(xì)胞。因此， 遞送運(yùn)載體可提供藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物的細(xì)胞內(nèi)遞送。藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物優(yōu)選地不是能夠特異性結(jié)合Fas配體的劑。
根據(jù)本發(fā)明的載體可以是微粒、納米顆粒、微膠囊、微球、膠束或脂質(zhì)體。優(yōu)選地， 載體是微粒。微粒可具有達(dá) 0. 01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、0. 2 μ m、0. 5μπ 、1μπ 、2μπ 、5μπ 或 10 μ m的平均直徑。微粒可具有在0. 1 μ m和10 μ m之間的平均直徑，優(yōu)選地在0. 2 μ m和 5 μ m之間，更優(yōu)選地在0. 3 μ m和2 μ m之間，更加優(yōu)選地在0. 4 μ m和1. 5 μ m之間，且最優(yōu)選地在0. 5 μ m和2 μ m之間。微?？砂ㄈ樗?乙醇酸共聚物(PLGA)基質(zhì)。
特異性針對Fas配體的運(yùn)載體的配體結(jié)合部分可包括Fas受體或其衍生物。其還可以是全長Fas蛋白或其片段。配體結(jié)合部分可包括Fas蛋白的胞外域或其片段或由Fas 蛋白的胞外域或其片段組成，且優(yōu)選地包括Fas蛋白的配體結(jié)合域或由Fas蛋白的配體結(jié)合域組成。運(yùn)載體的配體結(jié)合部分可以是肽、蛋白質(zhì)、適體、抗體、抗體片段、融合蛋白或嵌合蛋白質(zhì)。配體結(jié)合部分可以是Fas蛋白或其片段，與免疫球蛋白的可結(jié)晶片段區(qū)(Fe區(qū)) 融合以形成嵌合融合蛋白，即Fas-Fc。優(yōu)選地，免疫球蛋白是人免疫球蛋白，諸如IgGl。運(yùn)載體可包括特異性針對Fas配體的多個配體結(jié)合部分，且所述多個配體結(jié)合部分的每一個可以是前述實(shí)例的任何一個。
配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分可以為任何起源，但優(yōu)選是人類或鼠類或其組I=I O
配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分可通過表面吸收(surfaceabsorption)、吸附、 化學(xué)軛合(chemical conjugation)或基質(zhì)摻入而與載體偶聯(lián)(特別是微粒時)，或共價地或非共價地與載體締合(尤其是當(dāng)載體是微粒時)。配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分可通過連接分子與載體偶聯(lián)。連接分子可以是免疫球蛋白的可結(jié)晶片段區(qū)(Fe)，優(yōu)選人免疫球蛋白，諸如IgGl。
可選擇地，連接系統(tǒng)諸如抗生物素蛋白-生物素可用于將特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分間接地與載體偶聯(lián)。因此，連接分子可以是抗生物素蛋白或生物素。特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分可被生物素化并與抗生物素蛋白包被的載體表面偶聯(lián)。另一個連接分子可以是葡萄球菌蛋白A。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物連接到載體，或容納或包封于載體，優(yōu)選地用于在靶細(xì)胞處或靶細(xì)胞內(nèi)釋放。
在本發(fā)明的第一個方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，遞送運(yùn)載體是含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒，其中微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價或非共價締合。
藥學(xué)活性劑可以是蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、多糖、脂質(zhì)、小分子藥物或任何其它生物活性物質(zhì)。藥學(xué)活性劑可在細(xì)胞內(nèi)起作用，或可特異性針對靶細(xì)胞內(nèi)的組分。藥學(xué)活性劑可以是細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞抑制劑。藥學(xué)活性劑還可包括細(xì)胞毒性放射性核素、化學(xué)毒素或蛋白毒素。優(yōu)選地，藥學(xué)活性劑是抗癌劑，尤其是阿霉素或紫杉醇。
標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記，放射性核素或造影劑。因此，標(biāo)記可以是可檢測標(biāo)記或成像標(biāo)記。
藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物可容納或包封于載體，特別是當(dāng)載體為微粒時?；钚詣?、 標(biāo)記或藥物可通過化學(xué)軛合而被束縛于載體或微?；虮皇`在載體或微粒中，或物理地?fù)饺氲叫纬奢d體的材料的基質(zhì)中。
在第二個方面中，本發(fā)明提供了用于藥物、優(yōu)選地用于治療目的的根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的遞送運(yùn)載體。在此方面中，優(yōu)選的是，藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物連接到載體，或容納或包封于載體。
治療目的可以是治療與瘤或神經(jīng)障礙相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥。
在另外的方面中，本發(fā)明還提供了治療疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，包括向受治療者施用根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的遞送運(yùn)載體，其中遞送運(yùn)載體包括有效量的藥學(xué)活性劑或藥物。
疾病或病癥可以是腦腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜內(nèi)腫瘤、卵巢腫瘤、胃腸道腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)Fas配體的癌癥類型或腫瘤。優(yōu)選地，疾病或病癥是卵巢癌或成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。
疾病或病癥可以是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括運(yùn)動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病、 神經(jīng)性疼痛綜合征和周圍神經(jīng)或脊髓損傷。
根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，提供了用于診斷法中的根據(jù)本發(fā)明的第一個方面的遞送運(yùn)載體，診斷方法包括檢測Fas配體表達(dá)細(xì)胞，其中標(biāo)記連接到載體，或容納或包封于載體。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了診斷方法，診斷方法包括通過向受治療者施用根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體來檢測Fas配體表達(dá)細(xì)胞，其中標(biāo)記連接到載體，或容納或包封于載體。
優(yōu)選地，診斷法或診斷方法是診斷瘤或神經(jīng)障礙的方法。
本發(fā)明還提供了包括根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體和一種或多種生理學(xué)或藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑的藥物組合物。這樣的組合物可應(yīng)用于本文所述的任何用途和方法中。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于制備根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體的方法，包括形成容納或包封藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物的微粒和將特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分連接到所述微粒的步驟。
發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/Fas配體系統(tǒng)可增強(qiáng)微粒的吸收(uptake)。利用此方法，發(fā)明人已表示，藥物可在與Fas偶聯(lián)的微粒中遞送到靶細(xì)胞中。這種分子靶向作用方法增強(qiáng)了 Fas配體表達(dá)細(xì)胞對微粒的細(xì)胞內(nèi)吸收。
在此專利申請中，發(fā)明人首次描述了也稱作Apo-I，⑶95)、Fas的融合蛋白 (例如嵌合融合蛋白與免疫球蛋白的可結(jié)晶片段區(qū)(Fe區(qū))融合的!^s O^asFc)等等)、和 /或能夠復(fù)制Fas的作用的等效部分(例如肽、蛋白質(zhì)、適體等等)在修飾藥物遞送顆粒(例如乳酸-乙醇酸共聚物基質(zhì)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚-ε -己內(nèi)酯(PCL)、聚羥丁酸酯(PHB) 或可生物降解的殼聚糖微球、基于硅的顆粒、聚合電解質(zhì)膠囊、脂質(zhì)體等等)以增強(qiáng)其吸收和對某些細(xì)胞的特異性中的新穎用途，所述細(xì)胞包括神經(jīng)元、癌細(xì)胞和/或一系列Fas配體 (FAsL, AP0-1L, CD95L)表達(dá)細(xì)胞。從本發(fā)明中，發(fā)明人還描述了 Fas (Αρο-l，CD95)、Fas的融合蛋白(例如i^asFc等等)和/或能夠復(fù)制Fas的作用的等效部分(例如肽、蛋白質(zhì)、適體等等)作為用于治療遞送的藥物軛合物(drug conjugate)的潛在用途。因此，本發(fā)明能夠?qū)⑺幬锖推渌镔|(zhì)細(xì)胞內(nèi)遞送至生物細(xì)胞，并可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和治療學(xué)領(lǐng)域。
雖然在非免疫組織中已廣泛研究了 Fas/Fas配體系統(tǒng)的凋亡和各種新興作用，就發(fā)明人的知識所及，現(xiàn)有技術(shù)不存在I^as(Apc)-I, CD95)修飾的藥物負(fù)載微粒(例如PLGA、 PCL、聚合電解質(zhì)膠囊或脂質(zhì)體)或i^s(Apo-l，CD95)軛合的藥物靶向并增加藥物在細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)吸收的用途。而且，本發(fā)明是非顯而易見的，且在向遭受癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)病癥和其它疾病的患者遞送治療制劑時具有相當(dāng)大的工業(yè)適用性，和/或作為生物醫(yī)學(xué)科學(xué)和藥物開發(fā)中的研究工具。
細(xì)胞內(nèi)藥物遞送系統(tǒng)降低了遠(yuǎn)端部位的不希望的副作用，且許多技術(shù)處于考察之中，包括例如靶向納米顆粒(Farokhzad等人，2006 ；Gu等人，2009 ；Faraii等人，2009)。還可能利用微粒進(jìn)行分子內(nèi)藥物遞送，優(yōu)點(diǎn)是更大的負(fù)載容量以增加藥物效力和持續(xù)釋放。
然而，考察利用微粒的藥物遞送的研究是有限的，且其基本上靶向?qū)ｉT的吞噬細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞(Walter等人，2001 Jrandhormeur等人，2009)。發(fā)明人及其他人已研究了非專門的吞噬細(xì)胞(即神經(jīng)元)的吞噬能力，并說明了直徑在半微米以上的生物顆粒和合成顆粒的攝取^sselens等人，2004 ；Bowen等人，2007)。雖然對于神經(jīng)元的這種性質(zhì)沒有被廣泛地認(rèn)知，但是很好地證明了很多非專門的吞噬細(xì)胞能夠攝取相對大的顆粒，包括成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞(Rabinovitch，1995)。進(jìn)一步理解介導(dǎo)非專門吞噬細(xì)胞的吞噬作用的機(jī)制可幫助設(shè)計靶向這些細(xì)胞的藥物遞送顆粒。例如，最近顯示，對于海馬神經(jīng)元可通過特異性細(xì)胞表面受體諸如端腦素(telenc印halin)來調(diào)節(jié)吸收(hselens等人，2004 ；專利公布號 W0/2006/030013 iThe modulation of phagocytosis in neurons (神經(jīng)元吞it作用的調(diào)節(jié))’)。
令發(fā)明人驚奇的是，他們發(fā)現(xiàn)先前未知參與吞噬作用的Fas配體能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吸收Fas和Fas軛合物。在本發(fā)明中，F(xiàn)as (Apo-1, CD95)蛋白被用于基于藥物負(fù)載微粒的修飾的細(xì)胞內(nèi)藥物遞送系統(tǒng)。FaS、FaS的融合蛋白和/或能夠復(fù)制Fas的作用的等效部分對藥物負(fù)載顆粒的表面修飾增強(qiáng)某些細(xì)胞對微粒的內(nèi)化，所述細(xì)胞包括神經(jīng)元、癌細(xì)胞和/ 或一系列Fas配體(FasL、AP0-lL、CD95L)表達(dá)細(xì)胞。
發(fā)明人具有顯示以下的有效數(shù)據(jù)(如實(shí)施例中所說明)與未修飾的顆?；蛴闷渌潴w修飾的那些相比，F(xiàn)as (Apo-1,⑶卯)表面修飾的微粒優(yōu)先地被許多細(xì)胞類型攝取。發(fā)明人還表明開發(fā)成攜帶劑的微粒(agentbearing microparticle)的生物可降解的 Fas (Apo-1,⑶95)表面修飾的基于PLGA的微粒被細(xì)胞吸收并將負(fù)載的劑遞送至研究細(xì)胞內(nèi)。如實(shí)施例中所說明，發(fā)明人已表明微粒通ai^s/Fas配體輔助的吞噬作用的有效細(xì)胞內(nèi)吸收，微粒包括約0. 5-1. 5μπι平均直徑的那些。此外，實(shí)施例顯示了當(dāng)生物細(xì)胞吸收負(fù)載抗癌藥物的微粒時的功能效應(yīng)。因此，實(shí)施例中所列的數(shù)據(jù)說明了基于利用Fas(Ap0-l， ⑶95)的治療平臺的新穎性、創(chuàng)造性和有用性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體可用于顯著地降低施用的藥物的總量，同時增加其靶位處的藥物濃度。因此，遞送運(yùn)載體可用于改善細(xì)胞毒性藥物和其它藥物在許多疾病諸如瘤和神經(jīng)障礙中的作用，潛在地增加藥物效力，同時降低毒性。遞送運(yùn)載體還可提供對目前認(rèn)為不可能開發(fā)的有希望的治療劑的遞送選擇。在這點(diǎn)上，其中藥學(xué)活性劑或藥物被包封于載體或微粒的本發(fā)明的實(shí)施方案是特別有效的，因?yàn)樵搶?shí)施方案降低了直到到達(dá)其靶標(biāo)時才可成為生物學(xué)上可利用的劑或藥物的量。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，F(xiàn)as (也稱作Apo_l，⑶卯)是TNF/NGF受體超家族的成員，并表達(dá)為細(xì)胞膜受體或?yàn)榭扇苄孕问?。人i^s(Apo-l，CD95)基因的全序列和轉(zhuǎn)錄物描述于關(guān)于人類和一些其它活物種的Ensembl數(shù)據(jù)庫中(http://www. ensembl. org/Homo_ sapiens/Gene/Summary ？ g = ENSG00000026103)。鼠 Fas 基因的全長序列和轉(zhuǎn)錄物描述于關(guān)于小鼠基因組(小家鼠(Musmusculus))的Ensembl數(shù)據(jù)庫中(http//www. ensembl. org/Mus_musculus/Gene/Summary ？ db = core ；g = ENSMUSG00000024778)并描述于 Watanabe-Fukunaga等人1992中。Fas在選擇的細(xì)胞中通過與其配體Fas配體(FasL)(也被稱為Apo-IL和CD95L)結(jié)合而介導(dǎo)凋亡的誘導(dǎo)。Fas配體是TNF超家族成員，且在選擇的細(xì)胞中與Fas結(jié)合后誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。關(guān)于凋亡，F(xiàn)as/Fas配體系統(tǒng)已被廣泛地研究 (Nagata, 1997)，配體系統(tǒng)的失調(diào)與免疫穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)(Nagata和Suda，1995 ；Lettau等人，2008)。然而，超越了免疫系統(tǒng)組織中的單一作用，有報告顯示Fas/Fas配體系統(tǒng)在Fas和Fas配體由非免疫細(xì)胞表達(dá)的不同的組織諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用(Choi和 Benveniste，2004)。這包括在例如帕金森病(Landau等人，2005)和阿爾茨海默病^thell 等人，200 、控制神經(jīng)元中分支(^iliani等人，2006)以及脊髓損傷中的神經(jīng)保護(hù)(Ackery 等人，2006)中的新穎的作用。
此外，存在一個有力的例子，在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Choi和Benveniste，2004)、眼睛(Ferguson 和 Griffith，2006)和腫瘤(0，Connell 等人，2001 ；Ryan 等人，2005)的某些組織或器官的細(xì)胞中Fas配體的表達(dá)通過實(shí)現(xiàn)活化的Fas陽性免疫細(xì)胞的殺死而賦予這些組織或器官免疫赦免狀態(tài)(FlUgel等人，2000 ；Green和Ferguson，2001)。表達(dá)Fas配體的腫瘤細(xì)胞包括人肺癌，顯示為能夠在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中殺死T細(xì)胞(Mehans等人，1997)；如果向培養(yǎng)物中加入融合蛋白i^asFc，這種能力被抑制。表達(dá)Fas配體的腫瘤細(xì)胞還包括腦腫瘤諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(Gratas等人，1997, Weller等人，1998)，結(jié)腸癌 (0'Connell等人，1998)，其中體內(nèi)轉(zhuǎn)染引起的Fas配體下調(diào)導(dǎo)致歸因于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量增加的腫瘤尺寸減小(Ryan等人，200 ，和卵巢癌(Abrahams等人2003)，其中Fas配體的誘導(dǎo)增加了 T淋巴細(xì)胞的凋亡(Meng等人，2004)。
載體或微?？砂ㄟx自由以下組成的組的聚合物聚烷撐(polyalkylenes)、聚碳酸酯、聚對二氧雜環(huán)己酮、聚酐、多羥基酸、聚延胡索酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酰胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚原酸酯、聚羥丁酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈(polyphosphazene)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate)、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚芳酯、聚碳酸酯、聚延胡索酸丙烯酯、聚羥基鏈烷酸酯、聚縮酮、聚酰胺酯、聚羥基戊酸酯、聚原碳酸酯(polyorthocarbonate)、聚乙烯吡咯烷酮、聚草酸亞烷酯(polyalkylene oxalate)、 聚琥珀酸亞烷酯(polyalkylene succinate)、聚蘋果酸、聚甲基乙烯醚和聚馬來酸酐。
載體或微粒可包括PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物)基質(zhì)、PLA(聚乳酸)、 PCL(聚-ε-己內(nèi)酯)或PHB(聚羥丁酸酯)或?yàn)榭缮锝到獾臍ぞ厶俏⑶?、硅或基于硅的顆粒、聚合電解質(zhì)膠囊、樹枝狀聚合物或脂質(zhì)體。載體或微?？梢允欠蔷酆系?。優(yōu)選地，微粒包括PLGA基質(zhì)。
可通過在體外與任何合適的培養(yǎng)基孵育來測定或檢查根據(jù)本發(fā)明的微粒的生物可降解性。還可通過例如皮下地或肌肉內(nèi)地胃腸外注射微粒和作為時間的函數(shù)對組織進(jìn)行組織學(xué)檢查來檢查生物可降解性。胃腸外施用后，生物可降解的微?？稍隗w內(nèi)溶解以最終形成內(nèi)源性物質(zhì)，例如乳酸。
可通過例如皮下地或肌肉內(nèi)地胃腸外施用微粒和對組織進(jìn)行組織學(xué)評價來檢查根據(jù)本發(fā)明的微粒的生物相容性。
關(guān)于微粒的大多數(shù)研究考慮了在乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)基質(zhì)中配制的藥物。PLGA是由包括美國FDA(食品與藥品管理局)的管理者批準(zhǔn)用于臨床使用的生物可降解的聚合物，并通常用于矯形外科植入物和全身藥物遞送貯藏系統(tǒng)(例如Trelstar 、 Lupron Depot 、Ri sperdal Consta )。通常在合成過程中將包括生物活性蛋白質(zhì) (Giteau等人，2008)和核酸(Patil和Panyam，2009)的藥物負(fù)載入PLGA微粒。此外，PLGA 藥物載體可用合適的配體來表面官能化以便通過簡單吸附或化學(xué)軛合來增加其靶標(biāo)特異性。Farolchzad及同事Q006)示例了這樣的方法，該方法利用官能化至多西他奇負(fù)載的聚乙二醇PLGA納米顆粒的適體以便靶向前列腺癌細(xì)胞。還可將用于分子內(nèi)遞送的藥物放入其它類型的生物可降解微粒中，包括聚-ε-己內(nèi)酯(Sinha等人，2004)和多種系統(tǒng)諸如聚合電解質(zhì)微膠囊(SuWiorukov等人，2007 ；Mufioz Javier等人，200 或脂質(zhì)體(Huwyler 等人，2008)。
藥學(xué)活性劑可以是抗腫瘤劑、抗生素、抗炎劑、抗組胺劑、鎮(zhèn)靜劑、肌肉松弛劑、抗癲癇藥、抗抑郁劑、抗過敏劑、支氣管擴(kuò)張藥、強(qiáng)心劑、抗心律不齊藥、血管擴(kuò)張劑、抗糖尿病劑、抗凝血劑、止血劑、麻醉劑和類固醇。
藥學(xué)活性劑可以是細(xì)胞毒性藥物、細(xì)胞抑制藥物或其它藥物。細(xì)胞毒性藥物、細(xì)胞抑制藥物或藥物可以是鉬類(衍生物)和紫杉酚類。細(xì)胞抑制劑或藥物可選自由例如順鉬、 沙鉬、奧沙利鉬、卡鉬、奈達(dá)鉬、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、馬法蘭、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、巰基嘌呤、甲氨喋呤(methrexat)、諾龍、氨魯米特、甲羥孕酮、甲地孕酮、丙卡巴胼、多西他奇、紫杉醇、表鬼臼毒素、鬼臼毒素、長春新堿、多西他奇、道諾霉素、阿霉素、米托蒽醌、托泊替康、博來霉素、吉西他濱、氟達(dá)拉濱和5-FUDR組成的組。優(yōu)選地，生物活性劑是抗癌劑，尤其是阿霉素或紫杉醇。
細(xì)胞毒性核素或放射治療同位素可以是^-放射同位素，諸如”1(、211121咕士、 213Bi、212pb、224Ra或223Ra?？蛇x擇地，細(xì)胞毒性放射性核素可以是β-放射同位素，諸如186他、 188MumLiu9°Y、131I、OTCu、64Cu、153Sm或166Ηο。可選擇地，細(xì)胞毒性放射性核素可放射俄歇電子和低能量電子并包括同位素1251、1231或77Br。
合適的可檢測標(biāo)記或成像標(biāo)記包括但不限于熒光分子諸如由Molecular Probes (熒光探針和研究產(chǎn)品手冊)所描述的那些，諸如若丹明、熒光素(諸如異硫氰酸熒光素(FTIC))、德克薩斯紅、吖啶橙、Alexa Fluor (各種)、別藻藍(lán)蛋白、7-氨基放線菌素 D、Β0Β0-Ι、BODIPY(各禾中)、Calcien、Calcium Crimson、Calcium green、Calcium Orange、 6-羧基若丹明 6G、Cascade blue、Cascade yellow、DAP I, DiA、DiD、Dil、DiO、DiR、ELF 97、曙紅、ER Tracker Blue-White、EthD-I、菲啶溴紅、Fluo-3、Fluo4、FMl-43 > FM4-64、 Fura-2、Fura RecUHoechst 33258、Hoechst 33342、7_ 羥基 _4_ 甲基香豆素、Indo-1、 JC-I、JC-9、JOE 染料、麗絲胺若丹明 B、熒光黃 CH、LysoSensor Blue DND-167、LysoSensor Green、LysoSensorYellow/BIu> Lysotracker Green FM> Magnesium Green、Marina Blue、Mitotracker Green FM> MitoTracker Orange CMTMRos> MitoTracker RedCMXRos、 Monobromobimane,NBD胺、NeruoTrace 500/525 green、尼羅紅(Nile red)、Oregon Green, Pacific Blue、POP-I、碘化丙碇(Propidiumiodide)、若丹明 110 (Rhodamine 110)、若丹 BJIiL (Rhodamine Red)、 R-Phycoerythrm> Resorfm、 RH414> Rhod^^^Bj^ (Rhodamine Green)、若丹明 123 (Rhodamine 123)、ROX 染料、Sodium Green、SYTO blue (各種)、SYTO green (各種)、SYTO orange (各種)、SYTOX blue、SYTOXgreen、SYTOX orange、四甲基若丹明 B (Tetramethylrhodamine B)、TOT-I、TOT-3、X-rhod-l、YOYO-I 或 Y0Y0-3。
另外，放射性核素可用作成像劑。合適的放射性核素可包括i^anhFedl)、 Cu(II)、Mg(II)、Ca(II)，和Si(II)、銦、鎵及锝的放射性種類。其它合適的造影劑可包括在順磁Tl加權(quán)或T2加權(quán)的MRI造影劑中通常用于螯合作用的金屬離子，并包括二價和三價陽離子諸如銅、鉻、鐵、釓、錳、鉺、銪、鏑和鈥?？杀或喜⒂糜诜派湫院怂爻上竦慕饘匐x子可包括金屬諸如鎵、鍺、鈷、鈣、銦、銦、銣、釔、釕、釔、锝、錸、鉬、鉈和釤。另外，已知在中子俘獲放射治療中有用的金屬離子包括硼和具有大核截面的其它金屬。合適的也可以是在超聲造影組合物和χ-射線造影組合物中有用的金屬離子。其它合適的造影劑的實(shí)例可包括不透射線的氣體或氣體放射化合物。
可利用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)或檢測技術(shù)檢測Fas配體表達(dá)細(xì)胞。例如，顯微術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、醫(yī)學(xué)超聲波檢查法、放射照相術(shù)(諸如投射放射照相術(shù)和熒光檢查法)、核醫(yī)學(xué)顯像(諸如閃爍照相機(jī))、核磁共振成像(MRI)、光聲成像、數(shù)字紅外成像溫度記錄法或斷層攝影術(shù)。
有很多微膠囊化技術(shù)，其在不同的條件下可產(chǎn)生多種顆粒類型和尺寸。方法通常涉及通過改變溫度、蒸發(fā)溶劑或加入化學(xué)交聯(lián)劑來固化乳化的液態(tài)聚合物小滴。
如果微膠囊化過程未產(chǎn)生具有均勻尺寸范圍的顆粒，那么可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如篩選或過濾來分離顆粒以產(chǎn)生具有希望尺寸范圍的一群顆粒。所有顆粒通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以粒度分布的方式表征，標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如光學(xué)顯微術(shù)、庫爾特計數(shù)儀(Beckman Coulter)、動態(tài)光散射(Malvern Zetasizer)、透射電子顯微術(shù)(TEM)、掃描電子顯微術(shù)(SEM)，和準(zhǔn)彈性光散射(QELS)。本發(fā)明的微粒可具有達(dá) 0.01 μ m、0. 05μπι、0. 1 μ m、0. 2 μ m、0. 5 μ m、1 μ m、2 μ m、 5μπι或10 μ m的平均直徑。
通常的微膠囊化技術(shù)包括界面縮聚、噴霧干燥、熱熔微膠囊化，以及相分離技術(shù) (溶劑去除和溶劑蒸發(fā))。這樣的技術(shù)描述于US2001020011,Mathiowitz和Langer 1987 ； Mathiowitz，等人，1987，1988，1990，1992 ；Benita,等人，1984 中。
界面縮聚可用于以下列方式微膠囊化核心材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)。將一種單體和核心材料溶解于一種溶劑中。將第二單體溶解于與第一溶劑不混溶的第二溶劑(通常是含水的)中。通過攪拌將第一溶液懸浮于第二溶液中而形成乳狀液。乳狀液穩(wěn)定后，向水相中加入引發(fā)劑，在乳狀液的每個小滴的界面處引起界面縮聚。
噴霧干燥通常是用于制備1-10微米尺寸的微球的過程，其中待容納或包封的核心材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)分散于或溶解于聚合物溶液(通常是含水的) 中，通過由壓縮氣體流驅(qū)動的微粉化噴嘴抽吸溶液或分散相，并將得到的氣溶膠懸浮于加熱的空氣氣旋中，使溶劑從微滴中蒸發(fā)。固化的顆粒進(jìn)入第二室并放入收集瓶中。
熱熔微膠囊化是向熔化的聚合物中加入核心材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)的方法。在已加熱至聚合物熔點(diǎn)以上10°c的聚合物的非溶劑(通常是基于油的) 中，這種混合物懸浮為熔化的小滴。通過劇烈攪拌維持乳狀液，同時將非溶劑浴迅速冷卻至聚合物的玻璃轉(zhuǎn)變以下，使熔化的小滴固化并包裹核心材料。由這種技術(shù)產(chǎn)生的微球的直徑尺寸范圍通常從50微米至2毫米。
在溶劑蒸發(fā)微膠囊化時，聚合物通常溶解于與水不混溶的有機(jī)溶劑中，并向聚合物溶液中加入待容納或包封的材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)，所述聚合物溶液為有機(jī)溶劑中的懸浮液或溶液。通過向劇烈攪拌的水(通常含有表面活性劑以穩(wěn)定乳狀液)的燒杯中加入這種懸浮液或溶液而形成乳狀液。蒸發(fā)有機(jī)溶劑，同時繼續(xù)攪拌。蒸發(fā)導(dǎo)致聚合物沉淀，形成含有核心材料的固體微膠囊。
一種可選擇的溶劑蒸發(fā)過程涉及利用微篩(microsieve)。聚合物通常溶解于與水不混溶的有機(jī)溶劑中，并向聚合物溶液中加入待容納或包封的材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)，所述聚合物溶液為有機(jī)溶劑諸如二氯甲烷中的懸浮液或溶液。然后，通過PTFE過濾器過濾此懸浮液或溶液。此后，通過微篩膜(諸如Nanomi BV，荷蘭)使聚合物在含有乳化劑的水溶液中乳化，該微篩膜是沿著表面具有均勻孔隙的微制造膜。使得到的乳狀液在室溫下攪拌至少三小時以蒸發(fā)溶劑。通過過濾濃縮變硬的微球并重復(fù)洗滌。隨后， 將顆粒冷凍干燥并低溫下(例如在-20°C下)存儲直到評價。
在溶劑去除微膠囊化時，聚合物通常溶解于與油混溶的有機(jī)溶劑中，并向聚合物溶液中加入待容納或包封的材料(諸如本發(fā)明的藥學(xué)活性劑或標(biāo)記)，所述聚合物溶液為有機(jī)溶劑中的懸浮液或溶液。通過向劇烈攪拌的油的燒杯中加入這種懸浮液或溶液而形成乳狀液，其中油是聚合物的非溶劑，且聚合物/溶劑溶液在油中不混溶。通過在持續(xù)攪拌下擴(kuò)散到油相中而除去有機(jī)溶劑。溶劑去除導(dǎo)致聚合物沉淀，形成含有核心材料的固體微膠^ ο
藥學(xué)活性劑或標(biāo)記可占運(yùn)載體或微粒的約25% w/w或更多。優(yōu)選地，藥學(xué)活性劑或標(biāo)記占運(yùn)載體或微粒的多達(dá)0. 01%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%或40% (w/W) O
微粒可具有約0. 5-1. 5 μ m的平均直徑，并可由上述任何過程產(chǎn)生。
特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分(例如Fas蛋白、其衍生物或其嵌合蛋白質(zhì)) 優(yōu)選地吸附于或化學(xué)軛合到載體或微粒的表面。其還可摻入到載體或微粒的基質(zhì)中。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該理解，此步驟可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，諸如簡單吸附、化學(xué)軛合技術(shù)，或摻入到微粒的基質(zhì)中。特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分優(yōu)選地與載體(諸如微粒)表面連接或締合。結(jié)合部分可占運(yùn)載體或微粒的多達(dá)約0.01%、0. 1%、1%、5%、10%、15%、 20%、25%或 30% (w/w) ο
因此，本發(fā)明提供了用于制備含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒的方法，其中微粒與i^as、 其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價地或非共價地締合，包括通過表面吸收、吸附、 化學(xué)軛合或通過基質(zhì)摻入將微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子締合。
合適的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑優(yōu)選為無毒性的，并不干擾活性成分的效力或生物活性。藥學(xué)上可接受的載體可以是適合于向人類或其它脊椎動物施用的一種或多種相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的載體可以是天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，活性成分與載體結(jié)合以便于應(yīng)用。
可以常規(guī)的方式利用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體配制藥物組合物，生理學(xué)上可接受的載體包括便于將活性化合物加工成可藥學(xué)上應(yīng)用的制劑的賦形劑和輔助劑。合適的制劑取決于所選擇的施用途徑。用于注射的典型制劑包括載體，諸如無菌鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。也經(jīng)常加入粘度調(diào)節(jié)劑和防腐劑。合適的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物可用作對已知的用于治療、改善或預(yù)防瘤或神經(jīng)障礙的治療的輔助，或與已知的用于治療、改善或預(yù)防瘤或神經(jīng)障礙的治療結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物可結(jié)合到具有許多不同形式的組合物中，不同形式特別地取決于使用組合物的方式。
Fas配體表達(dá)細(xì)胞可存在于腦腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹腔腫瘤、卵巢腫瘤、胃腸道腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌及癌癥類型中。Fas配體表達(dá)細(xì)胞還可存在于與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、運(yùn)動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)性疼痛綜合征和周圍神經(jīng)和脊髓損傷相關(guān)的細(xì)胞中。
受治療者可以是脊椎動物、哺乳動物或家畜。因此，根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物可用于治療任何哺乳動物，例如牲畜(例如馬)、寵物，或可用于其它獸醫(yī)應(yīng)用。最優(yōu)選地，受治療者是人。
本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物的有效量可以是使有效量的藥學(xué)活性劑到達(dá)靶標(biāo)并從而在受治療者中產(chǎn)生治療作用的量。包括藥學(xué)活性劑的遞送運(yùn)載體或組合物的實(shí)際有效量可根據(jù)如下因素而變化，因素包括被利用的特定的劑、物質(zhì)或其組合、特異性針對Fas 配體的配體結(jié)合部分的密度和/或性質(zhì)、被包封的藥學(xué)活性劑的釋放特征、配制的特定的組合物、施用方式，和被治療的受治療者的年齡、體重、狀況，以及施用途徑和疾病或疾患。
根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物可適合于胃腸外施用。胃腸外施用可以是皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、滑膜內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、胸骨內(nèi)的、膜內(nèi)的、肝內(nèi)的、病灶內(nèi)的、瘤內(nèi)的及顱內(nèi)的注射或輸注技術(shù)。如果胃腸外施用，藥物組合物優(yōu)選地皮下施用或靜脈內(nèi)施用。
盡管如此，可通過使有效量的遞送運(yùn)載體或組合物到達(dá)其靶標(biāo)的任何可接受的方法來實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的遞送運(yùn)載體或組合物的施用。所選擇的特定的方式將取決于諸如以下因素特定的制劑、被治療的受治療者的狀況嚴(yán)重度，及誘導(dǎo)有效治療所需的劑量。
本文(包括任何所附權(quán)利要求、摘要和附圖)描述的所有特征和/或如此公開的任何方法或過程的所有步驟可以任何組合與任何以上方面結(jié)合，除了其中這樣的特征和/ 或步驟的至少一些是相互排斥的組合。為了更好地理解本發(fā)明，并表明如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案，現(xiàn)通過實(shí)施例的方式參考附圖，其中
圖1顯示了初級感覺神經(jīng)元中未修飾合成顆粒的吸收。共聚焦顯微術(shù)顯示了 β 3 微管蛋白標(biāo)記的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中合成顆粒(圓形微球)的細(xì)胞內(nèi)吸收(在細(xì)胞中心觀察到細(xì)胞核)。(Α，Β)1μπι聚苯乙烯微球。(C，D)負(fù)載軛合牛血清白蛋白的熒光染料(FITC) 的2 μ m聚合電解質(zhì)膠囊。細(xì)胞體和神經(jīng)炎中均觀察到顆粒；
圖2顯示了初級感覺神經(jīng)元中未修飾合成顆粒的吸收。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的共聚焦顯微術(shù)(取自Bowen等人，2007)。㈧明視野圖像。⑶1 μ m微球(圓形微球)孵育后， 用針對β 3-微管蛋白的抗體染色的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的共聚焦顯微術(shù)。從顯示沿著 XY平面中的白色虛線ζ-組套橫截面的上圖和側(cè)圖可見微球被內(nèi)化。(C，Ε)由白線(C)突出顯示的神經(jīng)元內(nèi)部綠色和紅色通道的熒光強(qiáng)度曲線(E)顯示標(biāo)記在0. 33μπι光學(xué)載玻片內(nèi)的微球和β3-微管蛋白的共區(qū)域化。(D，F(xiàn))由白線⑶突出顯示的神經(jīng)元外部綠色和紅色通道的熒光強(qiáng)度曲線(F)顯示無共區(qū)域化。
圖3顯示了 Daoy髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中未修飾合成顆粒的吸收。(Α-Β)門控Daoy細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)散射圖(左)和門控圖(右)(Α)(右)顯示隨著濃度增加，具有0.5μπι 微粒的細(xì)胞群增加(更大地轉(zhuǎn)移至右上象限)。(左)在較高濃度下散射圖上的側(cè)向散射增加。對照細(xì)胞沒有微粒并用作陰性對照；(B)(右)顯示當(dāng)濃度增加時，具有1.0 μπι微粒的細(xì)胞群相似地增加。這與更大的側(cè)向散射相關(guān)(左)。在相同濃度下，具有1.0 μπι微球的細(xì)胞群比具有0. 5 μ m微粒的細(xì)胞群更明顯。SSC-H側(cè)向散射細(xì)胞；FSC-H =前向散射細(xì)胞 (尺寸)；FLl-H=具有聚苯乙烯Dragon Green微粒的FITC記錄細(xì)胞的通道。(C)圖表說明了不同濃度和尺寸下被ND7/23細(xì)胞吸收的微粒(歸納自流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù))。在每種情況下，在相同濃度下尺寸之間的吸收沒有顯著差異(P > 0. 05) (ns)(不取決于尺寸)。0.5ym 的1 X IO7濃度和1 X IO8濃度之間的吸收無差異，不過1 X IO8濃度和1 X IO9濃度之間的差異顯著(P < 0. 001)***。IX IO7濃度和1X IO8濃度之間LOym微粒的吸收存在顯著差異 (P < 0.05)*，且IX IO8濃度和IX IO9濃度之間的吸收存在顯著差異(ρ<0.001)*#。誤差棒顯示SEM，η = 3 ；
圖4顯示了 ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系中未修飾合成顆粒的吸收。(A_B)ND7/23細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)散射圖(左)和門控圖(右)(Α)(右)顯示隨著濃度增加，具有0.5μπι 微粒的細(xì)胞群增加(更大地轉(zhuǎn)移至右上象限)。(左)在較高濃度下散射圖上的側(cè)向散射增加。對照細(xì)胞沒有微粒并用作陰性對照。(B)(右)顯示當(dāng)濃度增加時，具有Ι.Ομπι微粒的細(xì)胞群相似地增加。這與更大的側(cè)向散射相關(guān)(左)。在相同濃度下，具有Ι.Ομπι微粒的細(xì)胞群(光亮箭頭)比具有0.5μπι微粒的細(xì)胞(黑色箭頭)更明顯。SSC-H=側(cè)向散射細(xì)胞；FSC-H =前向散射細(xì)胞(尺寸)；FLl-H =具有DragonGreen微粒的FITC記錄細(xì)胞的通道。(C)圖表說明了不同濃度和尺寸下被ND7/23細(xì)胞吸收的微粒(歸納自流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù))。在每種情況下，在相同濃度下尺寸之間的吸收沒有顯著差異(P > 0. 05) (ns) (不取決于尺寸)。0.5μπι的IX IO7濃度和IX IO8濃度之間的吸收無差異，但是IX IO8濃度和1 X IO9濃度之間的差異顯著(ρ < 0. 001) #*。IX IO7濃度和1 X IO8濃度之間1. 0 μ m 微粒的吸收存在顯著差異(P < 0. 05) *，且1 X IO8濃度和1 X IO9濃度之間的吸收存在顯著差異(ρ < 0. 001)***。誤差棒顯示SEM，η = 3 ；
圖5顯示了初級皮層神經(jīng)元及其它細(xì)胞類型中未修飾合成顆粒的吸收。該流式細(xì)胞圖表描繪了經(jīng)24h加入聚苯乙烯微粒后，來自小鼠腦的初級皮層培養(yǎng)物的PE (FL2-H) 對FITC(FLl-H)的熒光。在右上象限和左上象限中觀察到⑶90. 2-PE陽性細(xì)胞(皮層神經(jīng)元)，在下部象限中觀察到其它細(xì)胞類型(主要是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)。在右上象限和右下象限中觀察到攝取了微粒的細(xì)胞。圖表顯示，皮層神經(jīng)元和其它細(xì)胞類型還攝取培養(yǎng)物中的未修飾顆粒；
圖6顯示了來自成年大鼠的初級感覺神經(jīng)元對顆粒的吸收及其生存力。(A)向培養(yǎng)物中加入增加的微粒濃度后，DRG神經(jīng)元及其它細(xì)胞類型的數(shù)量未變化。這表明微粒不對細(xì)胞引起毒性。(B)增加的微粒濃度的健康神經(jīng)元的實(shí)例(X200M)；
圖7顯示電子顯微術(shù)研究未顯示在超微結(jié)構(gòu)水平上的毒性。(A-F)利用透射電子顯微術(shù)研究神經(jīng)元中微粒(MP)的選擇標(biāo)準(zhǔn)(A)神經(jīng)元具有特有的長且細(xì)的突起。注意，鄰近的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有較短且較粗的突起(圓圈)。(B)膜束縛MP由白色箭頭表示。B中存在小MP (箭頭)。(C)未被吞噬體膜束縛的MP (箭頭)未被量化。也存在被吞噬體膜束縛的MP (箭頭)。(D)神經(jīng)元突起中的空吞噬體(箭頭)。E，F(xiàn) 被雙膜(箭頭)束縛的空吞噬體(*)的另外的實(shí)例。A中的棒=10 μ m，B-F中的棒=0. 5ym0 (G-L)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中具有或沒有吞噬體膜的微粒的透射電子顯微照片(G)雙膜吞噬體中測量為0. 5 μ m 的微粒(由箭頭表示)。(H，J，K)吞噬體中的Iym微粒。(I，L)未被吞噬體束縛的0. 5 μ m 微粒。棒=0.5 μ m。(M-O)微粒和背根神經(jīng)節(jié)的掃描電子顯微照片(M)神經(jīng)元膜幾乎融合以形成圍繞微粒的小囊泡(箭頭)。(N)圍繞兩個微球的基底的神經(jīng)元膜的投影。(0)微?？杀蝗〕龅目赡艿耐淌尚员?箭頭)成形。棒=Iym;
圖8顯示了由Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系對顆粒的吸收顆粒及其生存力。此圖表顯示了不同實(shí)驗(yàn)組中總的細(xì)胞死亡。X軸上是微粒尺寸和濃度。與0.5μπι微粒相比，Ι.Ομπι 微粒與更多細(xì)胞死亡相關(guān)。在沒有微粒的培養(yǎng)物中也發(fā)生一些細(xì)胞死亡。未包括H2A陽性對照的數(shù)據(jù)。誤差棒顯示SEM，n = 3。數(shù)據(jù)顯示，即使對于很高濃度的顆粒(超過實(shí)際使用)，細(xì)胞毒性被限制于25%以下。
圖9顯示了 ND7/23感覺細(xì)胞系對顆粒的吸收及其生存力。此圖表顯示了不同實(shí)驗(yàn)組中總的細(xì)胞死亡。X軸上是微粒尺寸和濃度。對于此細(xì)胞系在沒有微粒的對照培養(yǎng)物中細(xì)胞死亡已經(jīng)是高的，且通過加入微粒并沒有惡化。此圖表顯示，在不同實(shí)驗(yàn)組之間總的細(xì)胞死亡是相對恒定的。誤差棒顯示SEM，η = 3 ；
圖10顯示了加入初級DRG神經(jīng)元中的FasFc修飾聚苯乙烯顆粒。通過熒光顯微術(shù)研究了 FasFc修飾對DRG神經(jīng)元吸收1 μ m Dragon Green聚苯乙烯微粒的作用。大鼠血清、纖連蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白和FasFc修飾微粒全部以與對照1相同的密度接種(1 X IO5 微粒/孔)。與對照和配體的其它類型相比，F(xiàn)asFc修飾誘導(dǎo)了神經(jīng)元中顯著量的微球吸收。
圖11顯示了以DRG神經(jīng)元進(jìn)行的未修飾顆粒和FasFc修飾顆粒的TEM研究。通過TEM研究了 FasFc修飾對DRG神經(jīng)元吸收1 μ m DragonGreen聚苯乙烯微粒的作用。在 24h期間向培養(yǎng)物中加入未修飾微粒和FasFc修飾微粒QX IO6微粒/孔)?？稍诩?xì)胞質(zhì)中觀察到攝取的微粒具有電子致密(深色)、大約1微米直徑的規(guī)則的球體(箭頭)。與對照相比，F(xiàn)asFc修飾誘導(dǎo)了神經(jīng)元中顯著量的微球吸收。
圖12顯示了加入Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的!^asFc修飾聚苯乙烯顆粒。此圖表顯示了與用于Daoy細(xì)胞的未涂布的微?；蛴闷渌潴w涂布的顆粒相比，F(xiàn)asFc微粒表面修飾對吸收的作用。在未處理的微粒(直接應(yīng)用于培養(yǎng)物)和緩沖液(無配體)中經(jīng)受涂布過程的未涂布微粒之間吸收無顯著差異。對于0. 5 μ m微粒，在未涂布微粒和IgG調(diào)理的微粒之間吸收無顯著差異(P > 0. 05)，但是在纖連蛋白和未涂布微粒之間(ρ < 0. 05)*,以及在!^asFc和未涂布微粒之間(ρ < 0.05)*存在顯著差異。對于1. 0 μ m微粒，在IgG涂布的微粒與未涂布對照的吸收之間(P < 0.05)*，纖連蛋白涂布的與未涂布對照的吸收之間 (P < 0. 001)***，以及i^isFc與未涂布對照的吸收之間(ρ < 0. 001)***存在顯著差異。圖表還顯示尺寸之間吸收的差異。結(jié)果還顯示，富含F(xiàn)c的IgG沒有增加微粒的吸收至與hsFc 涂布的微粒相同的程度，且因此融合蛋白的Fas部分是觀察到的增加的關(guān)鍵。誤差棒顯示 SEM, η = 3。每60mm陪替培養(yǎng)皿加入1 X IO7微粒；
圖13顯示了加入ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系中Wi^tsFc修飾聚苯乙烯顆粒。此圖表顯示了與未涂布微粒相比，F(xiàn)asFc微粒表面修飾對ND7/23細(xì)胞吸收的作用。如右上象限 (Q2)中所示，與未涂布微粒(3.4%)相比，F(xiàn)asFc涂布的0.5μπι微粒被明顯更高百分比的細(xì)胞(18% )吸收。每35mm陪替培養(yǎng)皿加入IX IO5微粒。
圖14顯示了加入Daoy/皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)物中的FasFc修飾聚苯乙烯顆粒。這些圖表顯示了培養(yǎng)M小時后Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和來自小鼠的初級皮層神經(jīng)元之間比較的!^asFc微粒(Ιμπι)表面修飾吸收。Daoy癌癥細(xì)胞比皮層神經(jīng)元及培養(yǎng)物中其它細(xì)胞類型(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等等)攝取更多顆粒。用Ρ7皮層神經(jīng)元(A)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并用Ρ14皮層神經(jīng)元(B)重復(fù)。每60mm陪替培養(yǎng)皿加入IX IO7微粒。
圖15顯示了利用加入DRG初級神經(jīng)元中的i^asFc修飾顆粒的細(xì)胞內(nèi)染料遞送。(A)合并圖像(X630M), (B)Hoechst染色的細(xì)胞核，(C) β III微管蛋白神經(jīng)元標(biāo)記和(D) 負(fù)載乙啡啶同型二聚體的PLGA顆粒(直徑< 1. 2 μ m)，因?yàn)槠淙狈︻w粒而沒有神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)染色，(E)合并圖像(X630M)，(F)Hoechst染色的細(xì)胞核，(G) β III微管蛋白神經(jīng)元標(biāo)記和(H)負(fù)載乙啡啶同型二聚體的PLGA顆粒，48小時后釋放核酸染料并標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)核酸。
圖16顯示了利用加入ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系中的FasFc修飾顆粒的細(xì)胞內(nèi)染料遞送。FasFc修飾顆粒整夜加入ND7/23細(xì)胞培養(yǎng)物并通過FACS分離攝取的負(fù)載阿霉素的顆粒的細(xì)胞之后(左上圖)，在接下來的兩個星期內(nèi)對照細(xì)胞(右上圖像)繼續(xù)正常地增殖(在顯微鏡下觀察)，而攝取負(fù)載阿霉素的顆粒的那些細(xì)胞(在左上圖表上；下部圖像中右下圖像顯示負(fù)載阿霉素的顆粒熒光)完全沒有增殖(分離后在顯微鏡下觀察兩個星期)。 這些觀察顯示了利用本發(fā)明負(fù)載抗有絲分裂藥物阿霉素的ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系中的功能藥物遞送；
圖17顯示了利用加入Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的FasFc修飾顆粒的細(xì)胞內(nèi)藥物遞送。㈧加入1 μ m負(fù)載紫杉醇的PLGA微粒后測量7AAD陽性細(xì)胞的Daoy細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)散射圖(左)。未經(jīng)7AAD處理的對照細(xì)胞未在FL3-H通道(Rl區(qū)域)中高度地記錄。 7AAD測定后，未經(jīng)任何藥物處理的或安慰劑處理的對照細(xì)胞顯示最小的細(xì)胞死亡。7AAD測定后，過氧化氫處理的對照細(xì)胞顯示高百分比的細(xì)胞死亡。在第1&3天時，與負(fù)載安慰劑的 PLGA微粒相比，觀察到負(fù)載紫杉醇的PLGA微粒的功能作用，發(fā)生細(xì)胞死亡并與裸紫杉醇處理相當(dāng)。SSC-H側(cè)向散射；FL3-H =用于7AAD記錄細(xì)胞的通道。(B) 7AAD測定后測量的百分比細(xì)胞死亡(概括自流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù))。數(shù)據(jù)顯示，與安慰劑相比，在第1&3天時對于負(fù)載紫杉醇的顆粒的細(xì)胞死亡增加。此數(shù)據(jù)說明了利用本發(fā)明負(fù)載促凋亡藥物紫杉醇在Daoy 髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的功能藥物遞送；和
圖18顯示FasFc (⑶95_Fc)修飾在體內(nèi)增強(qiáng)了負(fù)載紫杉醇的微粒的效力。實(shí)驗(yàn)使用了未負(fù)載的(安慰劑)或以25% w/w負(fù)載紫杉醇的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)生物可降解微粒(直徑大約1. 5 μ m)。然后將微粒表面涂布⑶95-Fc或假涂布(-⑶95_Fc)。(A) 顯示了關(guān)于侵蝕性生長髓母細(xì)胞瘤皮下異種移植物的腫瘤體積的變化。(B)單一瘤內(nèi)注射之后的第7天，與單獨(dú)紫杉醇相比，對于+CD95PLGA安慰劑、-CD95PLGA紫杉醇和+CD95PLGA 紫杉醇，腫瘤生長被更有效地抑制。平均士SEM，n = 4。(C)在腹膜卵巢癌散布的鼠模型中(IGR0V1螢光素酶表達(dá)癌細(xì)胞)，顯示了與配制為紫杉酚(溶解于聚氧乙烯蓖麻油中) 的紫杉醇的等效劑量相比，+CD95-Fc PLGA紫杉醇的抗腫瘤效力，4周治療施用后腫瘤生物發(fā)光差異> 65倍。平均值+SEM，η = 5。暫停處理后，對于+⑶95_Fc PLGA紫杉醇組，腫瘤再生長相對較慢。由于疾病蔓延的程度，到28天時安慰劑組均不得不被處死；到35天時，-⑶95-Fc PLGA紫杉醇組中的1個動物被處死；到48天時，-⑶95_Fc PLGA紫杉醇組中的另外2個動物、紫杉醇組中的2個動物和+⑶95-Fc PLGA紫杉醇組中的1個動物被處死。 顯示了統(tǒng)計比較(雙尾t檢驗(yàn))，第35天紫杉醇對比+⑶95-Fc PLGA紫杉醇*P = 0. 012 ； 第；35天紫杉醇對比-CD95-Fc PLGA紫杉醇p = ns ;第41天紫杉醇對比+CD95_Fc PLGA 紫杉醇*P = 0. 03 ；第41天紫杉醇對比-⑶95-Fc PLGA紫杉醇P = ns ；第48天紫杉醇對比+CD95-Fc PLGA紫杉醇:**P = 0. 0093 ；第48天紫杉醇對比_CD95_Fc PLGA紫杉醇 *P = 0.02。(D)卵巢癌研究的活體成像(Live imaging)實(shí)例。實(shí)施例
材料和方法
重要材料
FasFc 嵌合體-商品目錄號F8799_50ug ；供應(yīng)商Sigma Aldrich (UK)
聚苯乙烯熒光微粒DragonGreen 0. 5 μ m-目錄號FS03F/5069 ；
Dragon Green 1. Oym-目錄號FS03F/7220 ；供應(yīng)商=Bangs Laboratories(USA)
乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)-目錄號.Resomer RG502H ；供應(yīng)商Alfa Chemicals(UK)
細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物
在37°C和5%C02下，在具有10%胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素(P/S) 的DMEM(含有谷氨酰胺)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Daoy和ND7/23細(xì)胞系。將細(xì)胞鋪板于60mm培養(yǎng)皿中，每個實(shí)驗(yàn)組三個培養(yǎng)皿。在流式細(xì)胞術(shù)之前五天，在培養(yǎng)物中用神經(jīng)生長因子(NGF) 分化ND7/23細(xì)胞系。在沒有NGF并沒有分化所需的額外的生長因子的條件下培養(yǎng)Daoy細(xì)胞。
從成年雄性Wistar大鼠個月，> 180g)中切割背根神經(jīng)節(jié)(DRG)感覺神經(jīng)元。在供應(yīng)商指示的濃度下在含有BSA、N2添加物、NGF和青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)DRG神經(jīng)元。
C57BL/6株的小鼠用于獲得皮層神經(jīng)元(按照內(nèi)政部(Home Office)法規(guī))。從出生后0-3天的小鼠腦中切割皮層神經(jīng)元。在含有馬血清、青霉素-鏈霉素和2% B-27添加物的neurobasal培養(yǎng)基中培養(yǎng)皮層神經(jīng)元。
將微粒加入培養(yǎng)物中并在進(jìn)一步分析之前與細(xì)胞系孵育M、48、72或244小時。
免疫熒光和共聚焦顯微術(shù)分析
利用顯微術(shù)從孔培養(yǎng)載玻片上直接觀察免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的細(xì)胞。Leica DMRD顯微鏡(Leica，UK)僅用于熒光顯微術(shù)，且kiss LSM 510顯微鏡(kiss，UK)用于共聚焦分析。連接到顯微鏡的軟件和AdobePhotoshop 7. O被用于捕獲并呈現(xiàn)圖像。
電子顯微術(shù)
對于透射電子顯微術(shù)，將細(xì)胞在緩沖于磷酸鹽中的4%戊二醛中固定1小時并留于緩沖液中一整夜。將細(xì)胞用四氧化鋨后固定30分鐘。分別在一系列等級的Durcupan 溶液(50、70、90、100和100% ),100% Durcupan和包埋介質(zhì)的混合物及純包埋介質(zhì)中進(jìn)行脫水。在銅載網(wǎng)上收集測量70-80nm的超薄切片并在以SOkV加速電壓檢查之前用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。
對于掃描電子顯微術(shù)，用磷酸鹽緩沖液潤洗蓋玻片上的細(xì)胞并用緩沖于磷酸鹽中的1. 5%戊二醛固定至少2小時。將細(xì)胞用四氧化鋨后固定1小時并在一系列等級的甲醇中脫水。然后將細(xì)胞暴露于六甲基二硅氮烷并留于室溫下干燥一整夜。除去蓋玻片， 在以IOkV電壓觀察之前安裝在鋁頭上并鍍金。
流式細(xì)胞術(shù)
具有細(xì)胞搜索軟件的FACScan流式細(xì)胞儀(Beckton Dixon)用于研究。按照規(guī)定制備來自每個實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)管中用于分析。利用合適的門控和控制器。利用合適的抗體檢測細(xì)胞。為了內(nèi)化研究，聚苯乙烯顆粒在FITC通道中是熒光的。
7AAD細(xì)胞死亡測定
利用7AAD(7_氨基放線菌素D)測定鑒定死亡細(xì)胞群。H202用作陽性對照并在 37°C下于4小時內(nèi)以IOOmM的終濃度加入培養(yǎng)物中。將浮動的細(xì)胞從每個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至 falcon管中并離心準(zhǔn)備細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)。為了 7AAD測定，向每個流量管中加入10 μ 1 7AAD，并分析樣品以評估細(xì)胞死亡。
用！^asFc修飾微粒
通過簡單吸附用纖連蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、大鼠血清、IgG或!^asFc表面修飾微粒。將其以10 μ g/200 μ 1各自的配體懸浮至少90分鐘，而將未涂布的微球懸浮于相同體積的磷酸鹽緩沖鹽水中。每30分鐘渦旋懸浮液以確保微粒充分涂布。還可利用不同的化學(xué)軛合技術(shù)修飾微?；蚩蓪⑴潴w摻入到生物可降解微粒的基質(zhì)中。
負(fù)載藥物的微粒
利用標(biāo)準(zhǔn)雙乳化法(standard double emulsion technique)合成負(fù)載阿霉素或紫杉醇的PLGA微粒。通過單乳化溶劑蒸發(fā)法(single emulsionsolvent evaporation technique)-微蹄乳化(microsieve emulsification)制備 PLGA(RG502H，Boehringer hgelheim，德國)安慰劑(未負(fù)載)微球。在乳化之前，通過0. 2 μ m PTFE過濾器過濾7% w/v PLGA 二氯甲烷溶液。此后，通過微篩膜(Nanomi BV，荷蘭)將PLGA乳化到含有乳化劑的水溶液中，該微篩膜是沿著表面具有均勻孔隙的微制造膜。使得到的乳狀液在室溫下攪拌至少三小時以蒸發(fā)溶劑。通過過濾濃縮變硬的微球并重復(fù)洗滌。隨后，將顆粒冷凍干燥并在-20°C下存儲直到評價。對于負(fù)載紫杉醇的PLGA(RG502H，Boehringer hgelheim，德國)微球，將紫杉醇加入并溶解于6% w/v PLGA 二氯甲烷溶液中以便達(dá)到25% w/w的最終微粒藥物濃度。通過0.2ym PTFE過濾器過濾溶液并通過硅微篩乳化。含有乳化劑的超純水用作連續(xù)相。在室溫下磁力攪拌乳狀液至少3小時以蒸發(fā)二氯甲烷。固化后，微球同樣通過過濾收集并重復(fù)洗滌。隨后，將顆粒冷凍干燥并在_20°C下存儲直到評價。從Nanomi BV (荷蘭)獲得均勻尺寸的負(fù)載紫杉醇的微粒和安慰劑微粒(大約1. 5 μ m)。
卵巢癌異種移植
在第1天將切106 IGR0V1-螢光素酶細(xì)胞腹膜內(nèi)接種到雌性Balb Cnu/nu小鼠中。 每星期腹膜內(nèi)施用紫杉醇(20mg/kg)和PLGA微球一次(第7、14、21和觀天)。為了生物發(fā)光成像，用125mg/kg D-螢光素(CalliperLife Sciences, UK)腹膜內(nèi)注射小鼠，且然后麻醉(通過吸入2 %異氟烷)。五分鐘后，仍然在麻醉?xiàng)l件下，將其放置于不透光的室中的加溫載物臺上(37°C )，且從腹側(cè)面上確定的目標(biāo)區(qū)域中發(fā)射的光成像于Xenogen IVISImaging System 100 (Alameda, CA, USA) ±。禾Uffi Living Image (Xenogen, Alameda, CA, USA)分析數(shù)據(jù)并呈現(xiàn)為相對輻射強(qiáng)度(由平均輻射強(qiáng)度光子/s/cm2/sr計算)。
統(tǒng)計分析
平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)用于評估每個實(shí)驗(yàn)組之間的一致性。單向方差分析與 Bonferroni后檢驗(yàn)用于評價組之間的差異。雙尾t檢驗(yàn)用于比較兩組。
MM
非專門吞噬細(xì)胞中未修飾聚苯乙烯顆粒的吸收
先前發(fā)明人已說明了神經(jīng)元在體外和體內(nèi)吸收微粒和碎屑的能力(Bowen等人， 2007)。圖(1似)顯示了在聚苯乙烯顆粒的情況下初級感覺神經(jīng)元培養(yǎng)物中的此實(shí)例，并還包括關(guān)于另一個藥物遞送系統(tǒng)-聚合電解質(zhì)膠囊的先前未公布的數(shù)據(jù)。發(fā)明人還通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示了由其它細(xì)胞包括Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(圖幻、ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系(圖4)和初級皮層神經(jīng)元(圖5)吸收未修飾合成顆粒。
未修飾聚苯乙烯顆粒的毒性研究
這些研究考察加入未修飾1 μ m聚苯乙烯(PS)微球?qū)Σ煌?xì)胞類型的存活力的作用。以增加的濃度加入微球，且24h后定量每個視野的DRG神經(jīng)元、其它細(xì)胞的數(shù)目(圖 6)。關(guān)于此模型的重要的觀察是，在微球的存在下，即使在極高的濃度下，未見細(xì)胞數(shù)目減少。這表明這些培養(yǎng)物中吸收顆粒未導(dǎo)致任何顯著的毒性。在獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這點(diǎn)，獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)包括通過透射電子顯微術(shù)和掃描電子顯微術(shù)的詳細(xì)的超微結(jié)構(gòu)研究 (圖7)。利用Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(圖8)和ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系(圖9)的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)以7-AAD細(xì)胞死亡測定考察對細(xì)胞存活力的作用。
利用FasFc修飾聚苯乙烯顆粒的吸收研究
用FasFc融合蛋白表面修飾顆粒導(dǎo)致某些類型的神經(jīng)元細(xì)胞和癌細(xì)胞吸收的顆粒顯著增加。圖10說明對于背根神經(jīng)節(jié)初級神經(jīng)元與對照和用其它配體修飾相比的這種增加。這些結(jié)果強(qiáng)烈地說明了由本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的神經(jīng)元顆粒吸收的改善。利用透射電子顯微術(shù)(圖11)的研究證實(shí)了背根神經(jīng)節(jié)初級神經(jīng)元中的這些結(jié)果。Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(圖12)和ND7/23感覺神經(jīng)元細(xì)胞系(圖13)的另外的示例顯示了通過利用FasFc修飾顆粒增加某些細(xì)胞類型中的吸收的能力。此外，在Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞與小鼠皮層神經(jīng)元的共培養(yǎng)中，觀察到，與皮層神經(jīng)元相比，顆粒優(yōu)先被Daoy細(xì)胞吸收，顯示了在治療腦腫瘤中的實(shí)用性(圖14)。
利用FasFc修飾PLGA顆粒的細(xì)胞質(zhì)藥物遞送
利用建立的雙乳化方法或利用其專有的微篩TM技術(shù)的來自NanomiBV(荷蘭)的顆粒(www.nanomi.com)來合成乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)生物可降解顆粒。在合成過程中，可將一系列藥物活性劑或標(biāo)記包括小分子、肽、蛋白質(zhì)及核酸摻入到的顆粒中。發(fā)明人利用摻入乙啡啶同型二聚體核酸染料及抗癌藥物阿霉素和紫杉醇的微粒示例了我們的發(fā)明。發(fā)明人表明，F(xiàn)asFc修飾的負(fù)載乙啡啶同型二聚體的PLGA增強(qiáng)了吸收及隨后的劑的遞送(圖15H)，在未攝取顆粒的對照細(xì)胞中未見細(xì)胞質(zhì)核酸染色(圖15D)。當(dāng)未修飾的對照顆粒加入對照組中時，未發(fā)現(xiàn)吸收和劑遞送的實(shí)例。相似地，發(fā)明人向ND7/23細(xì)胞中加入負(fù)載阿霉素的PLGA顆粒，且用FACS分離細(xì)胞后，在攝取負(fù)載阿霉素的顆粒的那些細(xì)胞中細(xì)胞增殖被抑制(圖16)。與未負(fù)載的安慰劑顆粒相比，當(dāng)負(fù)載紫杉醇的顆粒加入Daoy人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中時，對于負(fù)載紫杉醇的顆粒在第1天和第3天觀察到了關(guān)于裸藥物的功能作用(圖17)。這些結(jié)果說明本發(fā)明在藥物遞送應(yīng)用中的實(shí)用性。
i^asFc (⑶95-Fc)修飾在體內(nèi)增強(qiáng)了負(fù)載紫杉醇的微粒的效力
轉(zhuǎn)移至臨床上更相關(guān)的情況，發(fā)明人通過腹膜內(nèi)注射利用原位卵巢癌模型在其它競爭細(xì)胞類型(例如巨噬細(xì)胞)的存在下在區(qū)劃空間內(nèi)靶向CD95L表達(dá)IGROVl-螢光素酶細(xì)胞(圖18C，D)?；铙w成像顯示，與等效劑量的紫杉酚(臨床護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)治療(紫杉醇溶解于聚氧乙烯蓖麻油中))相比，+⑶95-Fc PLGA紫杉醇治療組到第4周時腫瘤生物發(fā)光> 65-倍減(圖18C)。未修飾(-⑶95-Fc)PLGA紫杉醇匹配紫杉酚。在此模型中，安慰劑治療 (+⑶95-FC&-⑶95-Fc)均是無效的。暫停處理后，+⑶95_Fc PLGA紫杉醇治療的顯著的腫瘤減少作用持續(xù)(圖18C)。這組中的小鼠全部存活直到第48天，且第62天終止時，剩余80% 無癥狀的動物(數(shù)據(jù)未顯示)。先前的研究強(qiáng)調(diào)了利用以高劑量再配制的紫杉醇抑制腫瘤生長的潛能。由于報道死亡風(fēng)險減少25%，在臨床環(huán)境中還存在從靜脈注射治療向腹膜內(nèi)遞送卵巢癌藥物的轉(zhuǎn)變。然而，以標(biāo)準(zhǔn)劑量時很難發(fā)現(xiàn)如本文所報道的腫瘤負(fù)擔(dān)減少。數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持了 CD95修飾的負(fù)載藥物的微粒用于在卵巢癌中增強(qiáng)靶向細(xì)胞內(nèi)藥物遞送的重要作用。這是臨床需要的重要領(lǐng)域，因?yàn)樵诼殉舶┑耐砥诤茈y實(shí)現(xiàn)治療成功。
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權(quán)利要求
1.一種用于將藥學(xué)活性劑或標(biāo)記遞送至細(xì)胞的遞送運(yùn)載體，包括特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分，和所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的遞送運(yùn)載體，其中所述載體是微粒、納米顆粒、微膠囊、微球、膠束或脂質(zhì)體。
3.如權(quán)利要求2所述的遞送運(yùn)載體，其中所述載體是微粒。
4.如權(quán)利要求3所述的遞送運(yùn)載體，其中所述微粒具有達(dá)0.01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、 0. 2μπι、0· 5卩111、1卩111、2卩111、5卩1]1或10卩1]1的平均直徑，或0· lymMl0ym>0. 2ymM5ym> 0· 3μπι至 2μπκ0· 4μπι至 1· 5 μ m、或 0· 5 μ m 至 Ιμπ 的平均直徑。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中特異性針對Fas配體的所述運(yùn)載體的所述配體結(jié)合部分包括或由以下組成(a)Fas受體或其衍生物；(b)全長Fas蛋白，或其片段； (C)Fas蛋白的胞外域，或其片段；或， (d)Fas蛋白的配體結(jié)合域。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中特異性針對Fas配體的所述運(yùn)載體的所述配體結(jié)合部分是(a)肽、蛋白質(zhì)、適體、抗體、抗體片段、融合蛋白或嵌合蛋白質(zhì)；(b)Fas蛋白或其片段，與免疫球蛋白的可結(jié)晶片段區(qū)(Fe區(qū))融合以形成嵌合融合蛋白。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其包括多個特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分是人類的或鼠類的。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分通過表面吸收、吸附、化學(xué)軛合或基質(zhì)摻入與所述載體偶聯(lián)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分共價地或非共價地與所述載體締合。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述配體結(jié)合部分或每個配體結(jié)合部分通過連接分子與所述載體偶聯(lián)。
12.如權(quán)利要求12所述的遞送運(yùn)載體，其中所述連接分子是免疫球蛋白的可結(jié)晶片段區(qū)(Fe)。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物優(yōu)選地不是能夠與Fas配體特異性結(jié)合的劑。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記連接到所述載體，或容納或包封于所述載體，優(yōu)選地用于在靶細(xì)胞處或靶細(xì)胞內(nèi)釋放。
15.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述遞送運(yùn)載體是含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒，其中所述微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價或非共價 φ π O
16.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑是蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、多糖、脂質(zhì)、小分子藥物或任何其它生物活性物質(zhì)。
17.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑是細(xì)胞內(nèi)活性的，或特異性針對靶細(xì)胞內(nèi)的組分。
18.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑是細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞抑制劑，優(yōu)選地是抗癌劑，尤其是阿霉素或紫杉醇。
19.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記，放射性核素或造影劑。
20.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記容納或包封于所述載體或微粒。
21.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記通過化學(xué)鍵合被束縛至所述載體或微?；虮皇`于所述載體或微粒中，或物理地?fù)饺胄纬伤鲚d體或微粒的材料基質(zhì)中。
22.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，用于藥物。
23.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，用于治療。
24.如權(quán)利要求22或23所述的遞送運(yùn)載體，其中所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記連接到所述載體，或容納或包封于所述載體。
25.如權(quán)利要求22-M任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，用于治療與瘤或神經(jīng)障礙相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥。
26.一種治療疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，包括向受治療者施用如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述遞送運(yùn)載體包括有效量的藥學(xué)活性劑。
27.如權(quán)利要求25所述的遞送運(yùn)載體，或如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述疾病或病癥是腦腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜內(nèi)腫瘤、卵巢腫瘤、胃腸道腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)Fas配體的癌癥類型或腫瘤。
28.如權(quán)利要求25所述的遞送運(yùn)載體，或如權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述疾病或病癥是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，任選地，運(yùn)動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)性疼痛綜合征或周圍神經(jīng)或脊髓損傷。
29.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，用于包括檢測Fas配體表達(dá)細(xì)胞的診斷法中，其中標(biāo)記連接到所述載體，或容納或包封于所述載體。
30.一種診斷方法，包括通過向受治療者施用如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體來檢測Fas配體表達(dá)細(xì)胞，其中標(biāo)記連接到所述載體，或容納或包封于所述載體。
31.如權(quán)利要求四所述的遞送運(yùn)載體，或如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述診斷法或診斷方法是診斷瘤或神經(jīng)障礙的方法。
32.一種藥物組合物，其包括如權(quán)利要求1-25、27-四及31中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體和一種或多種生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。
33.一種用于制備如權(quán)利要求1-25、27-四及31中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體的方法，包括形成容納或包封藥學(xué)活性劑、標(biāo)記或藥物的微粒和將特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分連接到所述微粒的步驟。
34.一種含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒，其中所述微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價地或非共價地締合。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的微粒，其中所述微粒具有達(dá)0.01 μ m、0. 05 μ m、0. 1 μ m、 0. 2μπ 、0· 5μπ 、1μπ 、2μπ 、5μπ 或 ΙΟμ 的平均直徑。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的微粒，或根據(jù)權(quán)利要求1-25、27-四及31 中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述載體或所述微粒包括PLGA(乳酸-乙醇酸共聚物基質(zhì))、PLA(聚乳酸)、PCL(聚-ε -己內(nèi)酯)或PHB (聚羥丁酸酯)或?yàn)榭缮锝到獾臍ぞ厶俏⑶颉⒒诠璧念w粒、聚合電解質(zhì)膠囊、樹枝狀聚合物或脂質(zhì)體。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的微粒，或根據(jù)權(quán)利要求1-25、27-四及31中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述載體或所述微粒包括選自由以下組成的組的聚合物 聚烷撐、聚碳酸酯、聚對二氧雜環(huán)己酮、聚酐、多羥基酸、聚延胡索酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酰胺、 聚縮醛、聚醚、聚酯、聚原酸酯、聚羥丁酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚芳酯、聚碳酸酯、聚延胡索酸丙烯酯、 聚羥基鏈烷酸酯、聚縮酮、聚酰胺酯、聚羥基戊酸酯、聚原碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚草酸亞烷酯、聚琥珀酸亞烷酯、聚蘋果酸、聚甲基乙烯醚和聚馬來酸酐。
38.根據(jù)權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的微粒，或根據(jù)權(quán)利要求1-25、27-四及31中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體，其中所述載體或所述微粒是非聚合的。
39.根據(jù)權(quán)利要求34-38中任一項(xiàng)所述的微粒，其中所述微粒通過表面吸收、吸附、化學(xué)軛合或基質(zhì)摻入與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價地或非共價地締合。
40.根據(jù)權(quán)利要求34-39中任一項(xiàng)所述的微粒，其中所述Fas衍生物是全長i^as、 !^asFc、或Fas的融合蛋白。
41.如權(quán)利要求40所述的微粒，其中所述Fas配體的特異性結(jié)合分子是肽、蛋白質(zhì)、適體、抗體或抗體片段。
42.根據(jù)權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的微粒用于藥物。
43.根據(jù)權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)所述的微粒用于治療疾病或病癥，所述疾病或病癥選自由以下組成的組腦腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜內(nèi)腫瘤、卵巢腫瘤、胃腸道腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)Fas配體的癌癥類型和腫瘤。
44.根據(jù)權(quán)利要求34-43中任一項(xiàng)所述的微粒用于治療疾病或病癥，所述疾病或病癥選自由以下組成的組神經(jīng)系統(tǒng)疾病、運(yùn)動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)性疼痛綜合征和周圍神經(jīng)和脊髓損傷。
45.一種用于將根據(jù)權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的微粒或根據(jù)權(quán)利要求1-25、27-四及31中任一項(xiàng)所述的遞送運(yùn)載體遞送至細(xì)胞中的方法，包括向所述細(xì)胞施用所述遞送運(yùn)載體或微粒。
46.一種治療疾病或病癥的方法，包括以有效治療所述疾病或病癥的量向患者施用權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的微粒。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述疾病或病癥選自由以下組成的組腦腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、腹膜內(nèi)腫瘤、卵巢腫瘤、胃腸道腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)Fas配體的癌癥類型和腫瘤。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述疾病或病癥選自由以下組成的組神經(jīng)系統(tǒng)疾病、運(yùn)動神經(jīng)元病、阿爾茨海默病、帕金森病、神經(jīng)性疼痛綜合征和周圍神經(jīng)和脊髓損傷。
49.!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子在修飾含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒中的用途，其中所述修飾導(dǎo)致通過表面吸收、吸附、化學(xué)軛合或通過將Fas基質(zhì)摻入到顆粒中而將所述微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子共價地或非共價地締合。
50.一種用于制備含有藥學(xué)活性物質(zhì)的微粒的方法，其中所述微粒與!^s、其衍生物或 Fas配體的特異性結(jié)合分子共價地或非共價地締合，其包括通過表面吸收、吸附、化學(xué)軛合或通過基質(zhì)摻入而將所述微粒與!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子締合。
51.如權(quán)利要求49所述的用途或權(quán)利要求50所述的方法，其中所述Fas衍生物是全長 Fas、FasFc、或Fas的融合蛋白。
52.如權(quán)利要求49所述的用途或權(quán)利要求50所述的方法，其中所述Fas配體的特異性結(jié)合分子是肽、蛋白質(zhì)、適體、抗體或抗體片段。
53.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求34至41中任一項(xiàng)所述的微粒和合適的賦形劑。
54.一種藥物軛合物，包括藥物和!^s、其衍生物或Fas配體的特異性結(jié)合分子。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的藥物軛合物，其中所述Fas衍生物是全長i^as、i^asFc、或 Fas的融合蛋白。
56.根據(jù)權(quán)利要求討所述的藥物軛合物，其中所述Fas配體的特異性結(jié)合分子是肽、蛋白質(zhì)、適體、抗體或抗體片段。
57.權(quán)利要求討-56中任一項(xiàng)所述的藥物軛合物用于藥物。
全文摘要
一種用于將藥學(xué)活性劑或標(biāo)記遞送至細(xì)胞的遞送運(yùn)載體，包括特異性針對Fas配體的配體結(jié)合部分，和所述藥學(xué)活性劑或標(biāo)記的載體。
文檔編號A61K47/48GK102497886SQ201080041671
公開日2012年6月13日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者喬安妮·伊麗莎白·馬丁, 戴維森·達(dá)·阿捷赫 申請人:瑪麗皇后與斯特菲爾德學(xué)院