專利名稱：白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因PGBc2及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因PG5c2及其分離方法。
背景技術(shù)：
花粉發(fā)育與植物雄性不育密切相關(guān)，同時(shí)是研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、細(xì)胞分 化和細(xì)胞間信息傳遞等過(guò)程的理想模型。因此，花粉發(fā)育研究一直是生命科學(xué) 研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)?；ǚ郯l(fā)育過(guò)程復(fù)雜，涉及眾多基因的表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn) 花粉基因表達(dá)的一大特點(diǎn)就是表達(dá)大量與細(xì)胞壁合成、調(diào)控相關(guān)的基因?；ǚ?粒最具特色的一部分是花粉壁(Blackmore and Barnes, 1990; Owen andMakaroff, 1995)。由花粉外壁和花粉內(nèi)壁兩層組成，在花粉發(fā)揮正常功能上起 著舉足輕重的作用，尤其是在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中，花粉壁的異常是 導(dǎo)致花粉不能完成其生物學(xué)功能的主要原因之一。關(guān)于作用于花粉壁發(fā)育的基因或蛋白質(zhì)目前研究不多，在模式生物擬南芥 中，只發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)花粉外壁發(fā)育的異常的突變體，例如邁s么/7p入"e/7和^;^， 以及2個(gè)花粉外壁和內(nèi)壁同時(shí)異常的突變體邁s3灘/^7。這些突變體對(duì)應(yīng)的基因 所編碼的蛋白質(zhì)功能均未完全明確(Aarts eta7, 1997; Paxson-Sowders "a7， 1997， 2001; Shukla et a7. ， 1998; Fei and Sawhney， 2001; Ariizumi et a7， 2003， 2005)。在白菜中尚未有作用于花粉壁發(fā)育的基因或突變體被分離的報(bào) 導(dǎo)?；ǚ勖劝l(fā)時(shí)的水合花粉會(huì)釋放很多存在于花粉壁中的蛋白質(zhì)，或者從花粉 內(nèi)部分泌一些蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是花粉壁或花粉管壁發(fā)育所必需的 (Cosgrove eta7， 1997, 2000; Allen eta7， 1993)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)就是其中之一。它是一種細(xì)胞壁水解和疏松酶，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié) 構(gòu)解體。盡管目前的研究推測(cè)花粉管中的PG可能通過(guò)降解花柱細(xì)胞壁而允許花 粉管通過(guò)花柱，或者可能作用于本身的細(xì)胞壁而加速自身的生長(zhǎng)(Brown1990; Allen " a7， 1993; Hadfield " <a7, 1998; Honys " a二 2003)。但 是，確切證據(jù)卻少之又少。因此，花粉壁發(fā)育相關(guān)的基因的克隆和功能鑒定仍 然是一項(xiàng)重要的工作。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供了一種白菜花粉壁發(fā) 育相關(guān)的基因/^^^及其分離方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的-一種白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因尸6及么它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。進(jìn)一步地，還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入 或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。一種權(quán)利要求1所述的白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因/^^2的分離方法，包括以下步驟(1) 、用A8/T18引物對(duì) <矮腳黃'白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育 株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，獲得在可育株系花蕾中特異表 達(dá)的基因片段Bc-A8T18，該片段包含SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列和在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸生成 的衍生物；(2) 、利用RACE技術(shù)擴(kuò)增Bc-A8T18片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5' 末端，其中，正向特異引物S1序列為5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特異引物A1序列為5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3，；分別與3' RACE和 5' RACE錨定引物擴(kuò)增3'末端和5'末端；(3) 、用常規(guī)PCR擴(kuò)增Bc-A8T18片段相關(guān)基因的cDNA序列及其DNA序列，該 DNA序列即為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根據(jù)兩端拼接的cDNA全長(zhǎng)序 列設(shè)計(jì)特異引物Tl和T2，從花蕾cDNA中擴(kuò)增Be-A8T18片段相關(guān)基因的cDNA 序列，從基因組DNA中擴(kuò)增其DNA序列。Tl和T2的序列分別為Tl, 5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3' ; T2， 5' -AGAGCATACATCATAGAC-3，。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)'矮腳黃'白菜核不 育兩用系的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，同時(shí)配合RACE技術(shù)分離獲得與花粉壁發(fā)育相關(guān)基因?yàn)檫M(jìn)一步弄清不育株系花粉敗育的原因，以及闡明植物花粉壁發(fā)育和雄性不育發(fā)生的分子機(jī)制提供研究基 礎(chǔ)，進(jìn)而為人工創(chuàng)建不育材料、培育優(yōu)良品種提供物質(zhì)條件。


圖1是白菜尸6^W cDNA和DNA全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增圖； 圖2為推測(cè)的白菜尸6^^氨基酸序列圖； 圖3為白菜尸6^^的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)示意圖； 圖4為白菜尸6^^表達(dá)的原位雜交分析圖；圖5為反義/^^2基因表達(dá)載體示意圖；圖6為Northern雜交檢測(cè)戶6^^在轉(zhuǎn)基因菜心中的表達(dá)示意圖; 圖7轉(zhuǎn)反義/^^^基因菜心的花粉離體萌發(fā)觀察圖；圖8轉(zhuǎn)反義/^ft^基因菜心花粉掃描電鏡觀察圖；圖9轉(zhuǎn)反義/^A^基因菜心花粉發(fā)育透射電鏡觀察圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過(guò)基因表達(dá)差異分析從白菜^力^5" Wca^^7-W力S'的可育株 系花蕾中分離得到一個(gè)可育花蕾特異表達(dá)的基因尸"萬(wàn)c么序列分析表明該基因 具有植物PG基因家族的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，并與已知的PG基因具有較高的相似 性，但不同于已知的PG基因家族成員，因此為一個(gè)新的PG基因。RT-PCR、 Northern雜交及原位雜交表明，凡Wc2的轉(zhuǎn)錄本最早在白菜花藥四分體時(shí)期的 絨氈層和四分小孢子中出現(xiàn)，且在絨氈層中的表達(dá)量要比在四分小孢子中的表 達(dá)量高。隨后在絨氈層中一直維持很強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)，直到絨氈層的降解退化， 在小孢子中的表達(dá)水平從單核小孢子時(shí)期開(kāi)始增強(qiáng)， 一直持續(xù)到花粉成熟期。 通過(guò)反義RNA技術(shù)，將尸6^^的反義基因?qū)胝？捎陌撞思?xì)胞，驗(yàn)證了該基因的功能。發(fā)現(xiàn)/^&^表達(dá)受抑制或沉默的轉(zhuǎn)基因植株花粉因花粉壁發(fā)育的 受阻導(dǎo)致花粉不能正常萌發(fā)，植株雄性育性降低，表明/^ft^為一個(gè)重要的花 粉壁發(fā)育相關(guān)基因。該基因的分離克隆，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育 分子機(jī)理，對(duì)生產(chǎn)上人為控制植物育性，培育優(yōu)良品種具有重要的實(shí)踐意義。 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下1. 白菜/^5ci"基因的分離和序列分析利用cDNA-AFLP技術(shù)分析白菜'Aa力W-^M/W的不育株系與可 育株系花蕾基因表達(dá)差異，篩選到A8/T18引物擴(kuò)增得到的在可育株系花蕾中 特異表達(dá)的基因片段Bc-A8T18，長(zhǎng)250 bp，具體序列見(jiàn)SEQ ID No. 1。通過(guò) RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該片段相關(guān)基因的cDNA的3'末端，2次擴(kuò)增結(jié)果均顯示 目的片段大小約為1 400bp，如圖1A泳道1、2所示；3' RAGE產(chǎn)物克隆至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5d感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，堿裂解法抽提質(zhì) 粒，酶切鑒定'(圖1B)后測(cè)序。類似地，通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該片段相關(guān) 基因的cDNA的5'末端(圖1C泳道1、 2)，經(jīng)克隆后酶切鑒定(圖1C泳道3、 4)再測(cè)序。根據(jù)兩端拼接的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增Bc-A8T18 片段相關(guān)基因的cDNA序列(圖1D泳道1)及其DNA序列(圖1D泳道2)，經(jīng) 克隆后酶切鑒定(圖lD泳道l為cDNA單克隆的酶切鑒定，圖1D泳道2為DNA 單克隆的酶切鑒定)再測(cè)序。DNA序列全長(zhǎng)1 594 bp，具體序列見(jiàn)SEQ ID No. 2。利用生物信息學(xué)相關(guān) 軟件分析該基因序列，發(fā)現(xiàn)其含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，最大開(kāi)放閱讀框 長(zhǎng)l 188 bp，編碼395個(gè)氨基酸。在假定的蛋白質(zhì)序列的N端具有一段疏水信 號(hào)肽。在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源搜索發(fā)現(xiàn)推測(cè)的氨基酸序列與擬南芥花粉表達(dá)的假 定的多聚半乳糖醛酸酶PGA3序列具有86%的一致性和94%的相似性。在蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索發(fā)現(xiàn)推測(cè)的氨基酸序列中具有一個(gè)典型的PG活性位點(diǎn)。與其 他發(fā)表的植物PG的氨基酸序列比較，其氨基酸序列中包含植物PG所特有的4 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖2下劃線部分即為植物PG特有的功能結(jié)構(gòu)域)。這些結(jié)果說(shuō) 明，該基因是一個(gè)典型的PG基因，命名為/^&7么2. /^9c^的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)分析(1 )RT-PCR和Northern雜交分析尸Cft^在白菜aJ/ fifc5" ' ^c^^;7-^^/^ 可育植株5級(jí)不同大小的花蕾(花蕾縱徑的大小從I級(jí)到V級(jí)分別為:小于1 mm、 1.2 ~ 1.6 mm、 1. 8 2. 2 mm、 2. 4 2. 8 mm、 3. 0 3. 4 mm，這些大小不同 的花蕾分別對(duì)應(yīng)于小孢子母細(xì)胞形成及形成前時(shí)期、四分體時(shí)期、單核花粉粒 時(shí)期及成熟花粉時(shí)期)以及開(kāi)放的花、嫩角果、花莖和花莖葉片中的表達(dá)情況。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT-PCR分析(如圖3A所示)和Northern雜交分析(如圖3B所示) H^^的表達(dá)模式均顯示相同的結(jié)果，其轉(zhuǎn)錄本最早在III級(jí)花蕾中也就是四分 體時(shí)期開(kāi)始出現(xiàn)，并且表達(dá)量較高，隨后在單核花粉粒時(shí)期的花蕾、包含成熟花粉粒的v級(jí)花蕾、開(kāi)放的花及嫩角果中持續(xù)表達(dá)。而在減數(shù)分裂以前的II、 I 級(jí)花蕾以及花莖和花莖葉片中均未檢測(cè)到/^^^的表達(dá)(圖3中，B1 B5表示 Wcsj力W-OW的1 V級(jí)花蕾；F、 Si、 S、 L依次表示"ca^W;7-OW開(kāi)放的 花、嫩角果、花莖和葉片；遍在表達(dá)的A7^'/7-7作為對(duì)照。)。(2)利用原位雜交技術(shù)進(jìn)一步分析了 /^ft^在不同發(fā)育階段的花蕾中的表 達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)，雜交信號(hào)首先在四分體時(shí)期的絨氈層和四分小孢子中出現(xiàn)，且 在絨氈層中的信號(hào)要比在四分小孢子中的信號(hào)強(qiáng)(圖4B);在單核小孢子后期， 絨氈層開(kāi)始降解，但仍能看到很強(qiáng)的雜交信號(hào)，而在此時(shí)的單核小孢子中，雜 交信號(hào)要強(qiáng)于四分體時(shí)期(圖4C);到成熟花粉期，絨氈層己經(jīng)完全降解，這時(shí)，表達(dá)信號(hào)僅在花粉粒中檢測(cè)到，信號(hào)強(qiáng)弱類似于單核小孢子時(shí)期(圖4D);而在四分體時(shí)期之前的花藥(圖4A)、所有被檢測(cè)花蕾的萼片、花瓣、中柱、雌蕊中， 以及用正義探針進(jìn)行雜交的對(duì)照中(圖4 E、 F)均沒(méi)有檢測(cè)到/^^2的表達(dá)信號(hào)。3.利用反義RNA技術(shù)驗(yàn)證A^c^的功能分別構(gòu)建含CaMV35S組成型啟動(dòng)子和BcA9組織特異型啟動(dòng)子的反義/^5c2 基因表達(dá)載體(圖5)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入菜心(白菜的一個(gè)變種)植株， 通過(guò)菜心無(wú)菌苗的培養(yǎng)、菜心子葉-子葉柄外植體的預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、分化培養(yǎng) 誘導(dǎo)KanB苗的產(chǎn)生、在無(wú)菌瓶中生長(zhǎng)擴(kuò)繁Kar^苗、生根培養(yǎng)、移栽轉(zhuǎn)化植株等 一系列過(guò)程，分別獲得/^5c2的轉(zhuǎn)基因植株J55"-;^^i"(含CaM35S組成型啟動(dòng) 子的轉(zhuǎn)化植株)和^^-p^bc^ (含BcA9絨氈層特異表達(dá)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植株)。 選取轉(zhuǎn)基因直至進(jìn)行Northern雜交，以白菜Wcaj力^7-^M/5'植株花蕾(圖6 中的B)、花(圖6中的F)及非轉(zhuǎn)基因菜心植株(圖6中的non-tra)花蕾和花 為對(duì)照，用尸fift^的cDNA作為模板標(biāo)記探針。結(jié)果顯示，選取的其中一株轉(zhuǎn)基 因植株J5S-;^^^的花蕾和花中均沒(méi)有檢測(cè)到/^^^的表達(dá)信號(hào)，在另一株的 花蕾和花中檢測(cè)到了很弱的雜交信號(hào)；在4株選取的^^-;^k^植株中，有l(wèi)株 的花蕾和1株的花中仍有較弱的表達(dá)信號(hào)，在另外2株的花蕾和花中均沒(méi)有檢 測(cè)到明顯的雜交信號(hào)。相反在可育株^&a^W7-^^'(圖6中的B strain即 為'萬(wàn)ca力W-W萬(wàn)'，A strain為Wcaj7^7-。W )及非轉(zhuǎn)基因菜心植株的花 蕾和花中都檢測(cè)到很高的/^^2表達(dá)水平。這些結(jié)果說(shuō)明凡Wc^的表達(dá)在轉(zhuǎn)基 因植株中受到較明顯的抑制，經(jīng)過(guò)Northern印跡雜交，得到尸^ft^的表達(dá)受到 明顯抑制的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)S55-;^bc^和力9-;^力c2轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)性狀觀察，發(fā)現(xiàn); ^;c^和^9-;^&^營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)正常，并且能正常開(kāi)花，花器官的發(fā)育也與非轉(zhuǎn)基因植株 的沒(méi)有明顯區(qū)別。經(jīng)蕾期授粉自交，轉(zhuǎn)基因植株能結(jié)出果莢，但與非轉(zhuǎn)基因的 野生型植株自交產(chǎn)生的果莢相比，其果莢不飽滿，每個(gè)果莢只產(chǎn)生1 5粒種 子。而正常非轉(zhuǎn)基因植株果莢飽滿，能產(chǎn)生約15粒種子。將非轉(zhuǎn)基因植株正常 的花粉分別授到轉(zhuǎn)基因植株J必-p^^和必-/^7^的柱頭上，結(jié)出的果莢大小 及產(chǎn)籽數(shù)和野生型植株沒(méi)有差異。轉(zhuǎn)基因植株自交^產(chǎn)生的種子播種能正常生長(zhǎng) 發(fā)育，得到Ti代植株各50株。這些說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株雌性育性和胚珠發(fā)育正常， 其育性降低應(yīng)該歸咎于花粉功能的異常。后期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1 5^-/^^^和^^-/7^^2 植株所呈現(xiàn)的性狀沒(méi)有明顯區(qū)別，因此合稱pg力c么/^力ci"植株花粉離體正常萌 發(fā)率明顯降低(圖71)，與非轉(zhuǎn)基因植株(圖7中的WT)正常的花粉離體萌發(fā)(圖7A)和花粉萌發(fā)時(shí)核和內(nèi)含物在花粉管內(nèi)的正常移動(dòng)(圖7 B D)相比， /^&^植株約81%的花粉萌發(fā)時(shí)花粉管爆裂(圖7E)，同時(shí)，核能進(jìn)入爆裂的花 粉管(圖7F H)。掃描電鏡觀察顯示，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?WT)的正?；ǚ?圖8E、 F)相比，"^^表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植株<^5""7^力^和^-/7^7^產(chǎn) 生外壁網(wǎng)紋淺的畸形花粉(圖8A D)。透射電鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)基因植株/^^2在 三核花粉的花粉萌發(fā)溝處外壁開(kāi)始脫落，內(nèi)壁異常增厚(圖9F、 H),范圍比非 轉(zhuǎn)基因植株(圖犯、G)的萌發(fā)溝廣，增厚程度大；成熟花粉期，因?yàn)橥獗谄茐模?/^bd花粉外壁含油層外溢(圖9J、 L)。圖9左欄為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕ǚ?發(fā)育過(guò)程，右欄為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)^bc2的花粉發(fā)育過(guò)程，Ba表示基粒棒；exine 表示花粉外壁；Fm表示游離小孢子；Gf表示萌發(fā)溝；In表示內(nèi)壁；Ne表示外 壁內(nèi)層；Np表示單核花粉；Tc表示覆蓋層；Tp表示三核花粉。這些結(jié)果說(shuō)明 尸6^^基因參與了花粉壁的發(fā)育。結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。 實(shí)施例l /^^^基因的分離和克隆(1) Be-A8T18片段的分離用A8/T18引物對(duì)白菜aj力^5" WcajM7-WJ/F的不育株系與可育株系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，檢測(cè) 到在可育株系花蕾中特異表達(dá)的基因條帶Be-A8T18,用手術(shù)刀片割下聚丙烯 酰胺凝膠上的差異片段，溶于100 PLTE (10mmol'l^Tris， pH 7. 5, 1畫(huà)1'L/1 EDTA， pH8.0)，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件與cDNA-AFLP中的預(yù)擴(kuò)增相 同。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化。回收產(chǎn)物連接 到pGEM-T Easy Vector (Promega)并轉(zhuǎn)化到A coh' DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，測(cè)序，最后RT-PCR驗(yàn)證得到該條帶的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相關(guān)的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴(kuò)增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒(SMART PCR cDNA Synthesis Kit)中接頭及引物的 特征設(shè)計(jì)了 3' RACE和5' RACE錨定引物P3和P5;根據(jù)差異片段Bc-A8T18 設(shè)計(jì)正向特異引物S1，與錨定引物P3擴(kuò)增3'末端，反向引物Al與錨定引物 P5擴(kuò)增5'末端。錨定引物P5的序列為5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特異引物Sl序 列為5， -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特異引物Al序列為 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3， 。 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，堿裂解法 抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到 Bc-A8T18片段相關(guān)的基因的cDNA的3'末端和5'末端。(3) /^^^基因的全長(zhǎng)克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引 物Tl (序列為5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3，)和T2 (序列為 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，)。常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴(kuò)增 Bc-A8T18片段相關(guān)基因的cDNA序列；用同一特異引物對(duì)在基因組DNA中擴(kuò)增 得到其DNA序列。實(shí)施例2利用反義RNA技術(shù)驗(yàn)證/^ft^的功能(1)反義表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)尸""cDNA全長(zhǎng)序列，在尸MW序列內(nèi)部 第85個(gè)堿基至第546個(gè)堿基之間設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增462 bp序列作為反義基因片 段，見(jiàn)SEQ ID No:3。并根據(jù)植物雙元載體pBI121的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)分 別含有萬(wàn)』I和Z力a I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以及三個(gè)保護(hù)堿基的兩條PCR擴(kuò)增引 物，上游引物為5' -ACAGGATCCGAGCTTTTACCGTTTTTA-3，，下游引物為 5， -GCCTCTAGATGGCATCTATTGMGATA-3 ，(劃線部分為酶切位點(diǎn))。以 Wca力W-。75，花蕾cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物克隆至pGEM-T Easy載 體，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pTPGBc2A。(2) CaMV35S組成型啟動(dòng)子表達(dá)載體和BcA9組織特異型啟動(dòng)子表達(dá)載體的 構(gòu)建將反義尸^c^片段與經(jīng)飽/zH I和JZ^ I雙酶切的雙元載體pBI121混合 連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含Kan 50 mg'L—1的固體LB培養(yǎng)基平板 上培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，在含Kan50mg'L—'的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜， 堿裂解法抽提其質(zhì)粒DNA，采用PCR和限制性內(nèi)切酶酶切等方法鑒定陽(yáng)性克隆。 陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pBI35S-PGBc2A。 BcA9啟動(dòng)子是從白菜中分離得到的、在花藥組織中特異表達(dá)的組織特異型啟動(dòng)子。將反義戶G&^片段、BcA9啟動(dòng)子和 經(jīng)歷y^III和A』I雙酶切的pBI121混合連接，如上方法轉(zhuǎn)化、鑒定獲得陽(yáng) 性克隆質(zhì)粒，命名為pBIBcA9-PGBc2A。(3) 反義表達(dá)載體對(duì)菜心的遺傳轉(zhuǎn)化將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體 pBI35S-PGBc2A及pBIBcA9-PGBc2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,菜心的遺傳轉(zhuǎn)化 通過(guò)組織培養(yǎng)途徑實(shí)現(xiàn)。各培養(yǎng)基的成分如下預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2倍濃度肌+的MS培養(yǎng)基的鹽類+ 2%蔗糖+ 0.8%瓊脂+ 3 mg'l/1 BAP + 1 mg'l/1 NAA + 7.5 mg,L—1 AgN03 (pH值5. 8)。分化培養(yǎng)基1/2倍濃度NH/的MS培養(yǎng)基的鹽類+ 2%蔗糖+ 0. 8%瓊脂+ 3 mg丄-1 BAP + 1 mg丄—1 NAA + 7. 5 mg'L—1 AgN03 + 7. 5 mg丄-1 Kan + 300 mg'l/1 Amp (pH值5.8)。生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基的鹽類及維生素+0.8%瓊脂+5mg'L_1Kan (PH 值5.8)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在高壓滅菌前加入，AgN03和抗生素在高壓滅菌后加入，高 壓滅菌的條件為121。C保持20 min， 50。C保溫。本實(shí)驗(yàn)以子葉-子葉柄為外植體，把子葉柄插入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中2 ~ 3 ram 深，培養(yǎng)3 d，農(nóng)桿菌侵染后平放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d。將共培養(yǎng)2 d 后的菜心子葉-子葉柄外植體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，大約20 d左右，待分化出的 抗性芽長(zhǎng)到一定大小，小心從基部將其切下轉(zhuǎn)入到新的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)。 得到的抗性芽在分化培養(yǎng)基上繼代并篩選，每20d左右轉(zhuǎn)瓶一次，去除其中的 假陽(yáng)性植株。待抗性植株長(zhǎng)到2 ~ 3 cm時(shí)，將其從愈傷組織切下，轉(zhuǎn)到生根培 養(yǎng)基上。待抗性植株在生根培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大量白色的須狀根時(shí)，打開(kāi)瓶口煉苗2 3d，小心去除根上的培養(yǎng)基，移入含水量為60%的培養(yǎng)土中，保濕培養(yǎng)5~7 天后，再轉(zhuǎn)到室外培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR檢測(cè)、Southern及Northern印跡雜交檢測(cè)，篩選獲得 /^5c2基因表達(dá)沉默和受抑制的轉(zhuǎn)基因植株J55"-; ^7C^和力9-j^6c么(4) 轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察檢測(cè)體外和體內(nèi)花粉萌發(fā)情況,用于 花粉離體萌發(fā)的半固體培養(yǎng)基組成為15%蔗糖+ 0.4 mmol L-l硼酸+ 0. 4 mmol *L-1 CaN03 + 0.1%瓊脂。采集花朵的時(shí)間均為上午9:00左右，每株采5朵 花藥剛裂開(kāi)的花，采后先將花粉抖落到硫酸紙上，充分混勻，將其點(diǎn)涂在載玻 片上的培養(yǎng)基中，不加蓋玻片，將載玻片置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于 黑暗、20 25t:恒溫條件下培養(yǎng)，4 ~ 6 h后在顯微鏡下觀察萌發(fā)率。掃描電鏡觀察花粉形態(tài)，采剛開(kāi)放的花朵，用鑷子夾持花藥將花粉輕輕地涂在貼有雙面膠的金屬載物臺(tái)上，噴金后在Philips XL-40型掃描電鏡下觀察花粉形狀、飽滿 程度及表面網(wǎng)紋，拍照。透射電鏡觀察花粉發(fā)育過(guò)程，取不同大小花蕾中的花藥， 制備超薄切片觀察花粉花藥發(fā)育過(guò)程。最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本 發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表〈110>浙江大學(xué)〈120〉白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因尸6^C2及其分離方法〈160〉 2〈170> Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 250〈212〉 DNA〈213> Brassica ra<400〉 1ttttattaaaggggtgcatattttggagctttttccgtttttatttt60ctgtttattgggattttcagccaatgctgtatacatcaccattggctcctctccaggctc120caggcacttctgagcattc3C3acagcatgccaatctccaacaccgag180cgtggtg3tCCCgg3g3gttCgcttgggtgagatccagatgggtccat240gcagctcc250〈210〉 2〈211〉 1594〈212〉 DNA〈213> Brassica ra〈400〉 2gaeigaaacaacaaataaaatagtaatattaaatttttt60gggtgcatatUtggagcttttaccgtttttattttctgtttattgggat120tttcagccaatgctgtatscatcaccattggctcctctccttctgacattactcagg180ttagttacattgctctcctttttcttgctatacaagcaatatattatcgg240ctacgttgttaaggttctattgcgcatgacatatgcaggcacttctgaaagC3ttC3C33300C￡lgC3tgCC￡lccgagcgtggtgatccc3aggagagttcaagcttg360gtgagatccagatgaggggtccatgcaaagctccagtcgagatcaccattcaaggcactg420tcaaaLgctg3tggtaacgcgatcc3gggaggscacatggattgtctttggcaac3tta480atggctttaagttgaacggaggtggagctttcgatggtga3cgcagcttggg540ttcaactgtcaccagactttcaactgcaagaaacttcccatcgtatgtgtgcttatat600atgtCCtC3LSLtttaattggcttttgtgaaaaataatageit.tagtgatgtt660attttgtcttttttttatag3gt3taaggtttgatttcgtggeLgaacgctgagatcaaag720acatatcttcaatagatgccaagaacttccgctcggtgcc780ccatggatcacatcaacatcattgccccaaaagaceLgtcccaacactgacggtatccatt840tggga卿3gtgacggagtc犯gstccttactccaccggagacgactgta900tatccgttgg卿tggg2Ltgaagaaccttc3Cgtgg卿3agtcacgtgcggtcc鄉(xiāng)ac960atggaatcagtgtcgg鄉(xiāng)ccttgg犯ggtacggaaacgaac3ggaitgtcagcggcatta1020g3gtc￡ita<aactgcactctcC6LaCELgactgacaacggactgaggatxaagacatggcctt1080ctgcagcttgCtCC3CC3CCgcctccgatattcatttcgagaatatcattctcaagaacg1140ttatgaacccaatcctcatcgaccaagagtactgcccttggaaccaatgtaac犯gcaga1200aaccat caacgattaagcttgccaacatcagcttcaagcagatc柳ggaacatcagggat1260acaaggatgceigtgeL8igcta>ttgtgCEigcaggggatacccatgccaaaacgttg鄉(xiāng)ttg1320g￡lga_C3ttg3cattaggtacagcggagcag3tggtccagcgactttccagtgctcaaacg1380tgagccccaaactcatgggaactcagagccctaaagcttgC3gtggtCC3gtgaccaact1440taccccaata3gt3g犯gCtcaaaaaatatt aaac t aaaacacccattcattatttgttt1500tgtttcctac8cccaattta3tttatatggtctatgatgtatgctctcattctttctaat1560tcaatataaatgcattcattatgcctttttgELCC159權(quán)利要求
1、一種白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因PGBc2，其特征在于它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因其特征在于 還包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或 多個(gè)核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
3、 一種權(quán)利要求l所述的白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因HWc^的分離方法，其特征在于，包括以下步驟(1) Bc-A8T18片段的分離用A8/T18引物對(duì)白菜的不育株系與可育株 系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，檢測(cè)到在可育株系花蕾中特異表 達(dá)的基因條帶Bc-A8T18，用手術(shù)刀片割下聚丙烯酰胺凝膠上的差異片段，溶 于100叱TE，并作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件與cDNA-AFLP中的預(yù)擴(kuò)增相 同，PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化，回收產(chǎn)物連接 到pGEM-T Easy Vector并轉(zhuǎn)化到f. DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞。 經(jīng)藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，測(cè)序，最后RT-PCR驗(yàn)證得到該條帶的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相關(guān)的基因的cDNA的3，末端和5，末端擴(kuò)增根 據(jù)雙鏈cDNA合成試劑盒中接頭及引物的特征設(shè)計(jì)3' RACE和5' RACE錨定引 物P3和P5;根據(jù)差異片段Be-A8T18設(shè)計(jì)正向特異引物SI和反向特異引物Al, 正向特異引物SI與錨定引物P3擴(kuò)增3'末端，反向特異引物Al與錨定引物 P5擴(kuò)增5'末端。錨定引物P5的序列為5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 錨定引物P3的序列為5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特異引物Sl序 列為5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3';反向特異引物Al序列為 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3' ; PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收，插入 pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，堿裂解法 抽提質(zhì)粒，酶切鑒定后，測(cè)序，得到Bc-A8T18片段相關(guān)的基因的cDNA的3， 末端和5'末端。(3) /^&^基因的全長(zhǎng)克隆根據(jù)兩端拼接的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引 物Tl和T2， Tl的序列為5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3， ， T2的序列為 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，；常規(guī)PCR方法再次從花蕾cDNA中擴(kuò)增Be-A8T18 片段相關(guān)基因的cDNA序列；用同一特異引物對(duì)在基因組DNA中擴(kuò)增得到其DNA 序列SEQ ID No. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因PGBc2及其分離方法，白菜花粉壁發(fā)育相關(guān)基因PGBc2包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，該基因的分離克隆及功能驗(yàn)證，有助于闡明花粉發(fā)育和植物雄性不育產(chǎn)生的分子機(jī)理，對(duì)生產(chǎn)上人為控制植物育性，培育優(yōu)良品種具有重要的實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101255429SQ20081006058
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者葉意群, 張愛(ài)紅, 張?jiān)コ? 曹家樹(shù), 鸝 黃 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)