海綿細胞團冷凍保存液及其保存方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞團，尤其是涉及海綿細胞團冷凍保存液及其保存方法。
【背景技術】
[0002]細胞團(primmorph)是指分散的海綿動物細胞重新聚集后，形成的細胞小團，這些細胞團具有全能功能，即能夠增加生物量，同時能分化出海綿的各類細胞。它是重要的實驗材料，主要用于研究海綿細胞的分化、信號傳遞、細胞識別、基因表達等。細胞團不同于普通的細胞系，它無法無限制傳代，但是它可以生長成具有三維結(jié)構(gòu)的海綿。
[0003]近年來，海綿細胞離體培養(yǎng)的研究取得了一定的進展，穩(wěn)定的傳代細胞系的建立仍是世界范圍內(nèi)的難題。以海綿混合細胞為起點在特定情況下形成了細胞團，經(jīng)研究細胞團離體培養(yǎng)體系具有生物量增殖能力及細胞定向分化的潛力，相較其他離體培養(yǎng)技術有穩(wěn)定、易保存、細胞活性高的優(yōu)點。現(xiàn)細胞團已成為海綿細胞離體培養(yǎng)研究的核心，但海綿細胞團培養(yǎng)的研究還處于起步階段，細胞團的培養(yǎng)技術、形成規(guī)律及維持培養(yǎng)是重點研究內(nèi)容。
[0004]由于細胞團的制備過程較為復雜，常常需要新鮮的海綿作為初始材料，為了便于實驗研究的開展，以及課題組間實驗材料的便捷傳遞，持續(xù)穩(wěn)定的細胞團供給方法顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種海綿細胞團冷凍保存液。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種海綿細胞團的保存方法。
[0007]所述海綿細胞團冷凍保存液的組成如下:
[0008]基礎液、二甲亞砜、牛血清白蛋白、硅酸鈉、羥基脯氨酸，按質(zhì)量百分比二甲亞砜為基礎液的5%?10%，牛血清白蛋白為基礎液的5%?10%，硅酸鈉的質(zhì)量濃度為10?50mg/L，羥基脯氨酸的質(zhì)量濃度為0.2?5g/L。
[0009]所述基礎液可采用海水，所述海水可采用天然海水或人工海水。
[0010]所述海綿細胞團的保存方法如下:
[0011]I)將細胞團用海綿細胞團冷凍保存液清洗后，轉(zhuǎn)移到裝有海綿細胞團冷凍保存液的管中；
[0012]在步驟I)中，所述細胞團可采用以下方法制備:
[0013](I)將海綿動物供體切成I?4cm3小塊，用無菌過濾天然海水反復清洗3次，用無菌剪刀將組織塊在無菌平皿中剪成顆粒狀，顆粒直徑為0.5?4_3;
[0014](2)將海綿小顆粒轉(zhuǎn)入50mL離心試管中，用含有0.93g/L EDTA 二鈉鹽的無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)沖洗；
[0015](3)濾出較大的海綿顆粒，再加入40ml新的CMFSW-E溶液；
[0016](4)在25°C條件下，振蕩20min，獲得亮黃色的懸液，棄去上清液；
[0017](5)加入20ml新鮮的CMFSW-E，振蕩40min，使用50 μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，保留濾液；
[0018](6)殘渣中再次加入20ml CMFSW-E，振蕩40min，使用50 μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，合并濾液；
[0019](7)將濾液按照500g，5min的條件進行離心，棄上清，用無鈣鎂海水清洗沉淀兩次；
[0020](8)加入無菌天然海水進行懸浮，控制細胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml ;
[0021](9)往六孔板加入6ml細胞懸液培養(yǎng)，每天換三分之二，溫度控制在16°C以下；
[0022](10)0.5mm大小的細胞團一旦形成，用吸管吸出，在裝有1mL的15mL離心管中，用無菌天然海水洗兩次，離心沉淀；
[0023](11)形成的細胞團放在天然海水中培養(yǎng)。
[0024]所述管可采用凍存管或麥桿管等，每管的細胞團數(shù)量可控制在20個以內(nèi)。
[0025]2)將裝有海綿細胞團冷凍保存液的管放在12?16°C的環(huán)境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，進行冷凍保存。
[0026]所述海綿細胞團的解凍方法如下:
[0027](I)將需要解凍的裝有海綿細胞團的管投入海水中，攪動海水使管解凍，當管內(nèi)的海綿細胞團冷凍保存液初步融化并有流動跡象時，取出管；
[0028](2)將步驟(I)取出的管置于10?16°C空氣中升溫，平衡I?2h后，取出海綿細胞團，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后將海綿細胞團置于16°C自然海水中培養(yǎng)。
[0029]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:
[0030]1.本發(fā)明通過獲取海綿細胞團、冷凍后復蘇、檢測細胞活性，來測試并確定海綿細胞團冷凍保存液配方，獲得一套相對完整長期保存海綿細胞團的方法。
[0031]2.本發(fā)明提供了長期保存海綿細胞的方法，為世界范圍內(nèi)海綿生物材料交換和海綿細胞庫的建立提供了基礎，為海綿研究的國際難點一海綿細胞培養(yǎng)，研究細胞分化增殖提供借鑒。
[0032]3.本發(fā)明的細胞活性高，凍存后再復蘇的海綿細胞仍能保持與未凍存的海綿細胞相當?shù)募毎钚院蜕沉Α?br>【具體實施方式】
[0033]以下給出海綿細胞團冷凍保存液的組成:
[0034]基礎液、二甲亞砜、牛血清白蛋白、硅酸鈉、羥基脯氨酸，按質(zhì)量百分比二甲亞砜為基礎液的5%?10%，牛血清白蛋白為基礎液的5%?10%，硅酸鈉的質(zhì)量濃度為10?50mg/L，羥基脯氨酸的質(zhì)量濃度為0.2?5g/L。所述基礎液可采用海水，所述海水可采用天然海水或人工海水。
[0035]以下給出所述海綿細胞團的保存方法:
[0036]I)將細胞團用海綿細胞團冷凍保存液清洗后，轉(zhuǎn)移到裝有海綿細胞團冷凍保存液的管中；
[0037]所述細胞團可采用以下方法制備:
[0038](I)將海綿動物供體切成I?4cm3小塊，用無菌過濾天然海水反復清洗3次，用無菌剪刀將組織塊在無菌平皿中剪成顆粒狀，顆粒直徑為0.5?4_3;
[0039](2)將海綿小顆粒轉(zhuǎn)入50mL離心試管中，用含有0.93g/L EDTA 二鈉鹽的無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)沖洗。
[0040](3)濾出較大的海綿顆粒，再加入40ml新的CMFSW-E溶液。
[0041](4)在25°C條件下，振蕩20min，獲得亮黃色的懸液，棄去上清液。
[0042](5)加入20ml新鮮的CMFSW-E，振蕩40min，使用50 μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，保留濾液；
[0043](6)殘渣中再次加入20ml CMFSW-E，振蕩40min，使用50 μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，合并濾液。
[0044](7)將濾液按照500g，5min的條件進行離心，棄上清，用無鈣鎂海水清洗沉淀兩次。
[0045](8)加入無菌天然海水進行懸浮，控制細胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml。
[0046](9)往六孔板加入6ml細胞懸液培養(yǎng)，每天換三分之二，溫度控制在16°C以下。
[0047](10)0.5mm大小的細胞團一旦形成，用吸管吸出，在裝有1mL的15mL離心管中，用無菌天然海水洗兩次，離心沉淀。
[0048](11)形成的細胞團放在天然海水中培養(yǎng)。
[0049]所述管可采用凍存管或麥桿管等，每管的細胞團數(shù)量可控制在20個以內(nèi)。
[0050]2)將裝有海綿細胞團冷凍保存液的管放在12?16°C的環(huán)境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，進行冷凍保存。
[0051]以下給出所述海綿細胞團的解凍方法:
[0052](I)將需要解凍的裝有海綿細胞團的管投入海水中，攪動海水使管解凍，當管內(nèi)的海綿細胞團冷凍保存液初步融化并有流動跡象時，取出管；
[0053](2)將步驟(I)取出的管置于10?16°C空氣中升溫，平衡I?2h后，取出海綿細胞團，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后將海綿細胞團置于16°C自然海水中培養(yǎng)。
【主權(quán)項】
1.海綿細胞團冷凍保存液，其特征在于其組成如下: 基礎液、二甲亞砜、牛血清白蛋白、硅酸鈉、羥基脯氨酸，按質(zhì)量百分比二甲亞砜為基礎液的5 %?10 %，牛血清白蛋白為基礎液的5 %?10 %，硅酸鈉的質(zhì)量濃度為10?50mg/L，羥基脯氨酸的質(zhì)量濃度為0.2?5g/L。2.如權(quán)利要求1所述海綿細胞團冷凍保存液，其特征在于所述基礎液采用海水。3.如權(quán)利要求2所述海綿細胞團冷凍保存液，其特征在于所述海水采用天然海水或人工海水。4.海綿細胞團的保存方法，其特征在于其具體步驟如下: 1)將細胞團用海綿細胞團冷凍保存液清洗后，轉(zhuǎn)移到裝有海綿細胞團冷凍保存液的管中； 2)將裝有海綿細胞團冷凍保存液的管放在12?16°C的環(huán)境中平衡I?2h后，投入液氮(_196°C )中，進行冷凍保存。5.如權(quán)利要求4所述海綿細胞團的保存方法，其特征在于在步驟I)中，所述細胞團采用以下方法制備: (1)將海綿動物供體切成I?4cm3小塊，用無菌過濾天然海水反復清洗3次，用無菌剪刀將組織塊在無菌平皿中剪成顆粒狀，顆粒直徑為0.5?4_3; (2)將海綿小顆粒轉(zhuǎn)入50mL離心試管中，用含有0.93g/L EDTA二鈉鹽的無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)沖洗； (3)濾出較大的海綿顆粒，再加入40ml新的無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)溶液； (4)在25°C條件下，振蕩20min，獲得亮黃色的懸液，棄去上清液； (5)加入20ml新鮮的無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)，振蕩40min，使用50μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，保留濾液； (6)殘渣中再次加入20ml無鈣鎂離子的人工海水(CMFSW-E)，振蕩40min，使用50μ m無菌尼龍網(wǎng)過濾，合并濾液； (7)將濾液按照500g，5min的條件進行離心，棄上清，用無鈣鎂海水清洗沉淀兩次； (8)加入無菌天然海水進行懸浮，控制細胞密度在(1.5?2.0) X 106ind/ml ； (9)往六孔板加入6ml細胞懸液培養(yǎng)，每天換三分之二，溫度控制在16°C以下； (10)0.5mm大小的細胞團一旦形成，用吸管吸出，在裝有1mL的15mL離心管中，用無菌天然海水洗兩次，離心沉淀； (11)形成的細胞團放在天然海水中培養(yǎng)。6.如權(quán)利要求4所述海綿細胞團的保存方法，其特征在于在步驟I)中，所述管采用凍存管或麥桿管，每管的細胞團數(shù)量控制在20個以內(nèi)。7.海綿細胞團的解凍方法，其特征在于其具體步驟如下: (1)將需要解凍的裝有海綿細胞團的管投入海水中，攪動海水使管解凍，當管內(nèi)的海綿細胞團冷凍保存液初步融化并有流動跡象時，取出管； (2)將步驟(I)取出的管置于10?16°C空氣中升溫，平衡I?2h后，取出海綿細胞團，再用10?16°C的海水清洗I?2次，然后將海綿細胞團置于16°C自然海水中培養(yǎng)。
【專利摘要】海綿細胞團冷凍保存液及其保存方法，涉及細胞團。所述海綿細胞團冷凍保存液的組成如下：基礎液、二甲亞砜、牛血清白蛋白、硅酸鈉、羥基脯氨酸，按質(zhì)量百分比二甲亞砜為基礎液的5％～10％，牛血清白蛋白為基礎液的5％～10％，硅酸鈉的質(zhì)量濃度為10～50mg/L，羥基脯氨酸的質(zhì)量濃度為0.2～5g/L。所述海綿細胞團的保存方法如下：將細胞團用海綿細胞團冷凍保存液清洗后，轉(zhuǎn)移到裝有海綿細胞團冷凍保存液的管中；將裝有海綿細胞團冷凍保存液的管放在12～16℃的環(huán)境中平衡1～2h后，投入液氮(-196℃)中，進行冷凍保存。細胞活性高，凍存后再復蘇的海綿細胞仍能保持與未凍存的海綿細胞相當?shù)募毎钚院蜕沉Α?br>【IPC分類】C12N5/07, A01N1/02
【公開號】CN105076115
【申請?zhí)枴緾N201510545810
【發(fā)明人】盧毓浩, 王德祥, 張苑, 黃丹, 夏光遠, 王偉娜
【申請人】廈門大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月31日