專利名稱：一種建立新疆雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，具體涉及一種建立雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法，尤其是新疆雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的建立方法。
背景技術(shù)：
雪蓮是一種重要的中藥和民族藥材，具有溫腎助陽，祛風(fēng)去濕，活血通經(jīng)。中醫(yī)和民間用于腎虛，寒濕瘀阻所致的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及痛經(jīng)等病癥。市場上已有雪蓮口服液作為中藥制品用于治療多種慢性病，如新疆天山蓮藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的“雪蓮口服液”是2002年國家批準(zhǔn)的準(zhǔn)字號中成藥(國藥準(zhǔn)字Z20025166)，后上升為國家標(biāo)準(zhǔn)藥品(WS-10155 (ZD-0155) -2002)，其擁有良好的國內(nèi)市場。但是，目前雪蓮藥材主要是按照國家標(biāo)準(zhǔn)采用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比色測定進(jìn)行質(zhì)量檢測和分析。由于中藥材GAP標(biāo)準(zhǔn)尚不能完全實(shí)行到位，資源稀缺；市場上藥材品質(zhì)不規(guī)范，僅僅用蘆丁和綠原酸不能較準(zhǔn)確反映雪蓮中有效活性成分；同時，蘆丁是多種植物藥材中的普遍成分，尤其不能準(zhǔn)確反映雪蓮這種特殊藥材的特征性成分。有研究同時使用的薄層色譜定性分析也不能準(zhǔn)確反映作為藥品的雪蓮口服液中不同物質(zhì)成分和組分之間比例。隨著藥物檢測技術(shù)的發(fā)展和高效液相色譜(HPLC)在中藥分析中應(yīng)用日益廣泛，高效液相色譜方法檢測雪蓮化學(xué)成分的研究和技術(shù)相繼出現(xiàn)，相關(guān)研究對不同產(chǎn)地的雪蓮藥材或雪蓮藥材進(jìn)行了液相色譜分析，以鑒定其中共有峰為目標(biāo)進(jìn)行研究[1，2]。近年相關(guān)研究(包括中國發(fā)明專利申請)開始關(guān)注雪蓮液相色譜圖中色譜峰進(jìn)行指認(rèn)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的對照，這些研究的報道，對雪蓮的藥材分析和檢測的方法有了較大改善[3-8]。但是，其中使用的標(biāo)準(zhǔn)對照物質(zhì)均為黃酮類成分和綠原酸，液相指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中缺乏雪蓮藥材中的特征性成分倍半萜內(nèi)酯，使得現(xiàn)有液相指紋圖譜仍然不能全面反映雪蓮藥材和雪蓮口服液藥品的化學(xué)物質(zhì)特征。造成上述問題的原因主要在于雪蓮藥材中倍半萜單體化合物分離鑒定的困難和液相檢測條件的困難。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有苗愛東，孫殿甲，彭燕等.HPLC法建立新疆雪蓮指紋圖譜研究.中成藥2003，25 (9) 691-693.黃毅，周茜，閻明等，天山雪蓮不同部位總黃酮含量及高效液相指紋圖譜分析·中藥材 2005，28 (11): 980 - 982.苗愛東，孫殿甲，彭燕等.雪蓮注射液HPLC指紋圖譜的研究.中國中藥雜志2004， 29 (11) 1044 - 1046.薛秀峰，張海茹，潘麗娜等.雪蓮及其注射液的指紋圖譜研究.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2005，39 (1) 72-74.王曉玲，蔡敏，周燕等.新疆雪蓮的高效液相指紋圖譜及及液-質(zhì)聯(lián)用分析.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)2006，18 (4) 624 - 627.閻明，黃毅，仲婕等，HPLC/DAD光譜相似指數(shù)法在雪蓮指紋圖譜中的研究.藥物分析雜志 2007，27 (4) 506-509.歐元，袁曉凡，徐春明等.天山雪蓮HPLC指紋圖譜的研究.中草藥2008，39(1) 105 - 108.中國發(fā)明專利，袁曉凡，趙兵等.新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜和DNA指紋圖譜的建立方法.發(fā)明專利申請公布說明書，CN101418348A(2009)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種建立雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法，尤其是建立新疆雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法。本發(fā)明對雪蓮藥材尤其是新疆雪蓮藥材中特征成分倍半萜類化合物用色譜技術(shù)進(jìn)行分離，通過波譜方法確定它們的成分，并以其作為標(biāo)識物質(zhì)對新疆雪蓮的藥材的提取物建立了液相色譜指紋圖譜的方法。具體而言，本發(fā)明的建立雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法，其特征在于，其包括步驟
步驟一確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分離方法
所述的分離方法為正相硅膠色譜法(300-400目，硅膠H)，反相硅膠色譜法(RP-18)，凝膠色譜法或溶解度分離法。步驟二確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鑒定方法其中，
核磁共振方法
Varian Mercury Plus 400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀，樣品溶于氘代試劑中測定1HNMR, 13C NMR, DEPT, 二維譜，解析圖譜結(jié)合其它波譜數(shù)據(jù)，確定化合物結(jié)構(gòu)；質(zhì)譜方法
質(zhì)譜:HRMALDIMS 用 IonSpec 4. 7 Tesla FTMS 型質(zhì)譜儀測定；ESIMS 用 Agilent 1100Series LC/MSD G1946D 型質(zhì)譜儀；X-射線單晶衍射方法
化合物0. 20 χ 0. 15 χ 0. 12 mm無色棱狀結(jié)晶體的單晶置于Bruker Smart Apex CCD型衍射儀上，用石墨單色化的Mo Ka (2= 0.71073 A)輻射為光源，在27. 00°彡θ彡2.08° 范圍內(nèi)，以2〃掃描方式，共收集衍射點(diǎn)數(shù)為3676，獨(dú)立衍射點(diǎn)數(shù)3676，[R(int) = 0.0000]，完整度為99.4%，優(yōu)化方法基于F2全矩陣最小二乘法，衍射區(qū)為_9彡 h 彡 9，0 彡 k 彡 14，0 彡 1 彡 22，最后修正值 Rl = 0.0488，wR2 = 0. 1184，R(all data) Rl = 0.0655，wR2 = 0. 1280, GOF = 1.039。其晶體學(xué)數(shù)據(jù)=C38H48O4, MW =568.76;單斜晶系，空間群Ρ2! ;a = 7.789(3) A，b = 11. 713(4) A, c = 17. 834(7) A ；α = 90°，β = 95. 680(6)。，γ = 90°，廠=1619. 0(11) A3 -J = 293(2) K = 2 ；Dcalc = 1.167 g/cm 3 ； F(OOO) = 616。步驟三樣品的提取及測定
稱取新疆雪蓮藥材全草20 g，剪碎，65%乙醇浸泡過夜，超聲萃取40min兩次，濃縮，乙酸乙酯超聲萃取30 min兩次，每次10 ml，合并，濃縮，用甲醇(色譜純)配制成10 mg/mL的供試品溶液，0. 45 μ m有機(jī)相針式濾器過濾后取濾液進(jìn)行色譜分析。色譜條件
流動相乙腈-水二元梯度洗脫，梯度條件水(A)-乙腈(B):(0-10min)8%B,(20min)20%B, (40-50min) 35%B, (53min) 60%B, (70_75min) 100%B ；色譜柱Agilent EclipseXDB-C18, 5 ym, 4.6X250 mm，紫外光檢測，檢測波長200 nm;柱溫25 °C，流速1.0mL · mirf1。樣品測定精密吸取供試品10 μ L進(jìn)樣分析，記錄時間為75 min ；高效液相色譜指紋圖譜通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指定色譜峰。本發(fā)明中，對新疆雪蓮酒精提取物及其乙酸乙酯部位進(jìn)行了高效液相色譜(HPLC)分析，并對其中六個色譜峰進(jìn)行了指定，其中五個峰為雪蓮藥材中倍半萜類特征性化學(xué)成分；
本發(fā)明中，對新疆天山蓮藥業(yè)公司生產(chǎn)的雪蓮口服液及其提取液原料進(jìn)行了高效液相色譜(HPLC)分析，并用分離到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了色譜峰的指定；
本發(fā)明中，分別對新疆四個產(chǎn)地的雪蓮藥材進(jìn)行了高效液相色譜(HPLC)分析。本發(fā)明中，用于指定色譜峰的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系從雪蓮藥材中分離得到；它們的結(jié)構(gòu)通過波譜和化學(xué)方法得以確定。本發(fā)明中，所述的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜峰中1，2，3，4，5，6號峰為雪蓮藥材中雪蓮內(nèi)酯倍半萜類特征性化學(xué)成分色譜峰，分別為11 β，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯8-β -D-葡萄糖；3 α，8 α -羥基，11 β Η-11，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯；11 β，13-Dihydro-deascylcynaropicrin ； p ?。?11 β H-11, 13-去 S 二 S 廣木香內(nèi)酉旨8 α-0-β-D-葡萄糖；8 0-羥基，11(1!1-11，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯。表1顯示了六個標(biāo)識化合物的質(zhì)譜分子離子峰([M + Η]+，[Μ - Η]+，或[Μ +NHJ+) ο表權(quán)利要求
1.一種建立新疆雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法，其特征在于，對雪蓮藥材中特征成分倍半萜類化合物用色譜技術(shù)進(jìn)行分離，通過波譜方法確定它們的成分，并以其作為標(biāo)識物質(zhì)對新疆雪蓮的藥材的提取物建立液相色譜指紋圖譜，其包括步驟步驟一確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分離方法正相硅膠色譜法300-400目，硅膠H，反相硅膠色譜法RP-18，凝膠色譜法或溶解度分離法；步驟二確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鑒定方法其中，核磁共振方法Varian Mercury Plus 400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀，樣品溶于氘代試劑中測定1HNMR, 13C NMR, DEPT, 二維譜，解析圖譜結(jié)合其它波譜數(shù)據(jù)，確定化合物結(jié)構(gòu)；質(zhì)譜方法質(zhì)譜:HRMALDIMS 用 IonSpec 4. 7 Tesla FTMS 型質(zhì)譜儀測定；ESIMS 用 Agilent 1100Series LC/MSD G1946D 型質(zhì)譜儀；X-射線單晶衍射方法化合物0. 20 χ 0. 15 χ 0. 12 mm無色棱狀結(jié)晶體的單晶置于Bruker Smart Apex CCD型衍射儀上，用石墨單色化的Mo Κα = 0.71073 Α)輻射為光源，在27. 00°彡θ彡2.08°范圍內(nèi)，以ω/ 2Θ掃描方式，共收集衍射點(diǎn)數(shù)為3676，獨(dú)立衍射點(diǎn)數(shù)3676，[R(int) = 0.0000]，完整度為99.4%，優(yōu)化方法基于F2全矩陣最小二乘法，衍射區(qū)為_9彡 h 彡 9，0 彡 k 彡 14，0 彡 1 彡 22，最后修正值 Rl = 0.0488，wR2 = 0.1184，R (all data) Rl = 0· 0655，wR2 = 0. 1280，GOF = 1. 039 ；其晶體學(xué)數(shù)據(jù)C38H48O4, MW =568.76;單斜晶系，空間群Ρ2! ;a = 7.789(3) A，b = 11. 713(4) A, c = 17. 834(7) A ；α = 90°，β = 95. 680(6)。，γ = 90°，廠=1619. 0(11) A3 -J = 293(2) K = 2 ；Dcalc = 1. 167 g/cm 3 ； F(OOO) = 616 ；步驟三樣品的提取及測定稱取新疆雪蓮藥材全草，剪碎，65%乙醇浸泡過夜，超聲萃取40min兩次，濃縮，乙酸乙酯超聲萃取30 min兩次，，合并，濃縮，用甲醇配制成供試品溶液，0.45 μ m有機(jī)相針式濾器過濾后取濾液進(jìn)行色譜分析；色譜條件流動相乙腈-水二元梯度洗脫，梯度條件:7jC (A)-乙腈(B):(0-10min)8%B,(20min)20%B, (40-50min) 35%B, (53min) 60%B, (70_75min) 100%B ；色譜柱Agilent EclipseXDB-C18, 5 ym, 4.6X250 mm，紫外光檢測，檢測波長200 nm;柱溫25 °C，流速1.0mL · mirf1 ；樣品測定精密吸取供試品 ο μ L進(jìn)樣分析，記錄時間為75 min ；高效液相色譜指紋圖譜通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指定色譜峰。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟三的高效液相色譜條件中Agilentl200液相色譜儀；流速1 ml/min ；進(jìn)樣量10 μ 1 ；檢測波長200 nm ；洗脫條件水/乙腈0-75分鐘梯度洗脫，水乙腈92-8至水乙腈0-100。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的雪蓮藥材用65%酒精70攝氏度提取。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟三的高效液相色譜指紋圖譜通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指定6個色譜峰。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的6個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜峰中1，2，3，4，5，6號峰為雪蓮藥材中雪蓮內(nèi)酯倍半萜類特征性化學(xué)成分色譜峰，分別為化合物11 β，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯8-i3-D-葡萄糖；3、8(1-羥基，11日!1-11，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯；11 β, 13 -Dihydro-deascylcynaropicrin ；蘆丁 ； ΙΙβΗ-11, 13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯8 α-0-β-D-葡萄糖；8 0-羥基，11(1!1-11，13-去氫二氫廣木香內(nèi)酯。
6.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的倍半萜類化合物1、2、3、6為通過核磁共振波譜數(shù)據(jù)和質(zhì)譜方法鑒定所得到；倍半萜類化合物5為通過核磁共振波譜數(shù)據(jù)和質(zhì)譜方法和單晶衍射鑒定所得到。
7.權(quán)利要求1的方法在鑒定新疆雪蓮藥材的質(zhì)量中的用途。
8.權(quán)利要求1的方法在新疆雪蓮酒精提取物的質(zhì)量控制中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種建立雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的方法，尤其是新疆雪蓮高效液相色譜指紋圖譜的建立方法。本發(fā)明對雪蓮藥材尤其是新疆雪蓮藥材中特征成分倍半萜類化合物用色譜技術(shù)進(jìn)行分離，通過波譜方法確定它們的成分，并以其作為標(biāo)識物質(zhì)對新疆雪蓮的藥材的提取物建立了液相色譜指紋圖譜的方法。本發(fā)明的方法可用于新疆雪蓮藥材的質(zhì)量鑒定和用于作為藥物原料的新疆雪蓮酒精提取物生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。對于雪蓮口服液的藥品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號A61K36/285GK102565257SQ20101059430
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月19日
發(fā)明者王新宇, 穆青, 胡雪梅, 蘇倩, 饒峰, 黃靜 申請人:復(fù)旦大學(xué), 新疆天山蓮藥業(yè)有限公司