專(zhuān)利名稱(chēng)：肽及其作為進(jìn)入癌細(xì)胞的載體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在癌細(xì)胞的分析或治療中用于診斷或治療目的的產(chǎn)品的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)起人們就已經(jīng)知道染色體異常與腫瘤發(fā)展之間的關(guān)系。然而直至近二十 年來(lái)，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們才明確證實(shí)了腫瘤形成遺傳學(xué)的原理并 且認(rèn)識(shí)到染色體改變是人類(lèi)腫瘤發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵因素。在最近的一項(xiàng)研究中，人們檢測(cè)脂肉瘤細(xì)胞株并發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞培養(yǎng)基中可 分泌和生成多種蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)中，特別鑒定出錳超氧化物歧化酶(已知為 LSA-type-MnSOD)，它除了轉(zhuǎn)化自由基為過(guò)氧化氫的酶活性(所有SOD都具有的普遍活性) 外，證實(shí)它具有其他結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)例如其可從髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株U937中表達(dá)的相 應(yīng)MnSOD中分化而來(lái)。一方面LSA-Type-MnSOD由LSA細(xì)胞分泌，而天然MnSOD位于線粒體基質(zhì)中，前者 的分子量(30kDa)顯著高于天然MnSOD Q4kDa)。此外，如果體內(nèi)或體外注射LSA-type-MnSOD，它能夠到達(dá)所有細(xì)胞并且與其中存 在的自由基反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫。但是其在腫瘤細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中更容易達(dá)到毒性閾 值，這是由于腫瘤細(xì)胞沒(méi)有足夠數(shù)量的過(guò)氧化氫酶，不能代謝這種過(guò)氧化物。這樣導(dǎo)致了對(duì) 增生的選擇性抑制并且僅增加腫瘤細(xì)胞的死亡。這證實(shí)了 LSA-type-MnSOD對(duì)于腫瘤細(xì)胞 的細(xì)胞毒性具有選擇性和專(zhuān)一性。由特定cDNA克隆生產(chǎn)的LSA-type-MnSOD的重組體(rMnSOD)也保留了該天然蛋 白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞毒性性質(zhì)，此外提取出的LSA-type-MnSOD和rMnSOD都在N-末端具有一 段M個(gè)殘基的肽，這段肽與MnSOD的引導(dǎo)序列精確對(duì)應(yīng)。附圖簡(jiǎn)述

圖1 (a-d)表示單獨(dú)的順鉬(d)、與rMnSOD的引導(dǎo)肽綴合的順鉬(c)以及單獨(dú)的 rMnSOD的引導(dǎo)肽(b)與陰性對(duì)照(a)相比較的對(duì)不同細(xì)胞株的作用。圖2表示凋亡基因Bax僅在用rMnSOD-Lp-CC處理的腫瘤細(xì)胞中具有活性。發(fā)明詳述現(xiàn)在人們驚訝地發(fā)現(xiàn)代表rMnSOD引導(dǎo)肽的肽序列為 MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)它能夠穿透癌細(xì)胞從而作為載體來(lái)運(yùn)送用于治療或診斷目的的分子或放射性同 位素至所述細(xì)胞中，并且考慮到與以上序列的相似性，LSA-type-MnSOD的引導(dǎo)肽序列也具 有此性質(zhì)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及一個(gè)以下序列的肽MLSRAVC (SEQ 2)它也能夠以與上述肽(SEQ 1)類(lèi)似的方式作為載體。此外，本發(fā)明還涉及通過(guò)插入一個(gè)半胱氨酸至前述七肽(與N-末端甲硫氨酸相連)或通過(guò)用一個(gè)半胱氨酸取代所述甲硫氨酸且在所述插入的半胱氨酸和之前已存在的 半胱氨酸之間環(huán)化形成一個(gè)二硫橋來(lái)獲得的肽；因此所述肽分別具有以下序列CMLSRAVC (SEQ 3)CLSRAVC (SEQ 4)在所述肽中兩個(gè)末端半胱氨酸通過(guò)一個(gè)二硫橋連接在一起。本發(fā)明還涉及前述的引導(dǎo)肽與能夠結(jié)合放射性同位素的螯合基團(tuán)(例如D0TA、 DTPA、ΝΟΤΑ、HYNIC等等)、染料例如熒光素、若丹明等等、具有細(xì)胞毒性性質(zhì)的分子例如順 鉬、紫杉酚、表阿霉素等等、或具有酶活性的分子例如能夠阻止有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶抑 制劑、以及反義寡核苷酸(ο. η.)形成的綴合物。此外，如果需要，已和順鉬綴合的引導(dǎo)肽(SEQ 1)(在下文中涉及時(shí)表示為 rMnSOD-Lp-CC的一種復(fù)合物)還可進(jìn)一步與生物多聚物或脂質(zhì)體綴合并且用于通過(guò)口服 或皮下方式給藥的抗腫瘤治療。因此本發(fā)明還涉及一種控制釋放rMnSOD-Lp-CC的制劑。所述制劑可包括例如由 生物可降解材料制成的微球體，其中生物可降解材料為例如透明質(zhì)酸、PEG、聚乳酸-乙醇 酸共聚物(PLGA)和其他制藥領(lǐng)域中完善使用的生物可降解的和生物相容的共聚物。如果使用PLGA，為了評(píng)價(jià)聚合物性質(zhì)如何影響微球體的性質(zhì)，可以使用具有不同 的乳酸-乙醇酸比例(75 25和50 50)、不同的分子量和不同親水性的PLGAs ；例如可 使用Resomer RG 504H和Resomer RG 756 (或其等價(jià)物)，它們的固有粘度分別為0. 5和 0. 8dl/g 而分子量(Mw)分別為 20，000 和 89，OOODa0以與上述類(lèi)似的方式與DOTA綴合并結(jié)合于生物多聚物或脂質(zhì)體的引導(dǎo)肽還可用 作納米技術(shù)方法中的分子載體，這些方法已通過(guò)了美國(guó)FDA的批準(zhǔn)。此外，rMnSOD-Lp-CC可用來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)試驗(yàn)(通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù))以了解使用 rMnSOD-Lp-CC的抗腫瘤治療是否對(duì)腫瘤產(chǎn)生影響。在這一方面，如果使用rMnSOD-Lp-CC處理腫瘤的組織冷凍切片60分鐘，然后 在Zamboni液體固定后，用抗rMnSOD的抗體處理，可以確定腫瘤組織細(xì)胞是否摻入了 rMnSOD-Lp-CC。陽(yáng)性結(jié)果表示如果rMnSOD-Lp-CC注射入腫瘤侵襲的生物體，那么它可以到達(dá)腫 瘤并且破壞腫瘤。此外，通過(guò)比較rMnSOD-Lp-CC穿透腫瘤細(xì)胞的能力和這些細(xì)胞中雌二醇受體的 存在，可以通過(guò)描述的免疫細(xì)胞化學(xué)分析來(lái)確定該腫瘤的雌二醇受體表達(dá)程度。因此本發(fā)明涉及用于治療腫瘤疾病和診斷方法的包含至少一種前述綴合物的藥 學(xué)組合物。本發(fā)明可通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)更好地理解。實(shí)施例1序列為MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)的肽的合成使用固相合成技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法在手動(dòng)反應(yīng)器中合成M個(gè)氨基酸的引導(dǎo)肽 (SEQ 1)。使用半制備RP-HPLC和C18結(jié)合硅膠柱(Vydac 218TP1010)來(lái)進(jìn)行純化。得到 99%純度的肽；肽的分子量通過(guò)質(zhì)譜和氨基酸分析來(lái)確認(rèn)。實(shí)施例2
序列為MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)的肽和 DOTA 的綴合以及用 68fei 標(biāo)記 所獲得的復(fù)合物。實(shí)施例1中獲得的合成引導(dǎo)肽隨后與20 μ g DOTA和放射性68^i在!fepes緩沖液 中120°C下綴合15分鐘。然后通過(guò)反相色譜法在C18柱上純化被標(biāo)記的肽，用水沖洗并在 空氣中風(fēng)干。然后將肽在400 μ 1的96%乙醇中再次溶解。將此種肽在醋酸/醋酸鈉緩沖液或龍膽酸緩沖液中用9°Y、mLu、mh在90°C下標(biāo) 記30分鐘。對(duì)與DOTA綴合的rMnSOD弓丨導(dǎo)肽進(jìn)行分析以確定其在生理溶液中的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn) 此肽可穩(wěn)定存在48小時(shí)而不表現(xiàn)出任何物理化學(xué)結(jié)構(gòu)上的變化。實(shí)施例3序列為MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)的肽和熒光素的綴合在固相上通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)方法使用5(6)-羧基熒光素(FAM)在母體肽 MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ和其較短的類(lèi)似物MLSRAVC的N-末端進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)施例4序列為MLSRAVC(SEQ幻的肽的合成在一個(gè)手動(dòng)反應(yīng)器中使用固相合成技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法來(lái)合成實(shí)施例1中 獲得的肽序列的前7個(gè)氨基酸形成的肽。通過(guò)半制備RP-HPLC使用C-18結(jié)合硅膠柱 (Vydac218TP1010)來(lái)進(jìn)行純化。肽的純度為99%；通過(guò)質(zhì)譜和氨基酸分析來(lái)確認(rèn)肽的分子量。實(shí)施例5SEQ 2肽的環(huán)化通過(guò)對(duì)肽序列MLSRAVC引入第二個(gè)半胱氨酸殘基來(lái)獲得兩個(gè)環(huán)狀類(lèi)似物類(lèi)似物1CMLSRAVC(SEQ 3)類(lèi)似物2CLSRAVC (SEQ 4)類(lèi)似物1 通過(guò)原始肽序列的甲硫氨酸上結(jié)合一個(gè)半胱氨酸來(lái)獲得。類(lèi)似物2 通過(guò)用半胱氨酸取代原始肽上的N-末端甲硫氨酸來(lái)獲得。通過(guò)末端的兩個(gè)半胱氨酸上的SHs的鍵來(lái)形成二硫橋。添加0. IMNH4HCO3水溶液至肽鏈(每IOmg肽加IOml溶液)然后在室溫下只用空 氣氧化大約48小時(shí)以完成環(huán)化。獲得兩個(gè)環(huán)狀肽與螯合劑結(jié)合并在醋酸/醋酸鈉緩沖液或龍膽酸緩沖液中用9°Y、 17W11In在90°C下標(biāo)記30分鐘。實(shí)施例6將ImCi實(shí)施例2中獲得的標(biāo)記綴合物注射至一只患有多發(fā)乳腺腫瘤的13年齡大 的雌性犬中。注射后使用ECAT 47PET掃描儀(Siemens)掃描大約30分鐘，根據(jù)軸狀面、冠狀面 和矢狀面構(gòu)建圖像。實(shí)施例7在室溫下用實(shí)施例3獲得的綴合物和一個(gè)“亂序”肽分別處理MCF-7細(xì)胞1小時(shí)，該“亂序”肽具有相同的氨基酸組成但是順序不同，也對(duì)其進(jìn)行了標(biāo)記且用作對(duì)照。處理后，使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞。在用實(shí)施例3獲得的綴合物孵育的細(xì)胞中可見(jiàn)標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)熒光，而在亂序肽處 理的對(duì)照組細(xì)胞中沒(méi)有見(jiàn)到任何熒光；這說(shuō)明標(biāo)記的肽能夠進(jìn)入細(xì)胞而亂序肽沒(méi)有表現(xiàn)出 所述的穿透細(xì)胞的能力。實(shí)施例8與順鉬綴合的rMnSOD弓|導(dǎo)肽復(fù)合物的合成rMnSOD的引導(dǎo)肽由M個(gè)氨基酸組成，其序列為MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ,它通過(guò)固相Fmoc法在適合的反應(yīng)管中合成。獲得的樣品隨后通過(guò)半制備HPLC使用C18結(jié)合硅膠柱(Vydac 218TP1010)來(lái)進(jìn) 行純化。RP-HPLC分析確認(rèn)肽純度為99 %。然后在肽殘基的N-末端位置(M)結(jié)合一個(gè)二氨基-乙基-甘氨酸，由于兩個(gè)游離 的氨基功能團(tuán)處于適合的距離0個(gè)共價(jià)鍵)，所以其可以與PTCl2B式的鉬(II)離子綴合。 根據(jù)Mewart JM, Young JD.的方法(固相肽合成)通過(guò)質(zhì)譜分析和氨基酸序列分析檢測(cè) 和確認(rèn)正確的分子量和肽質(zhì)量。實(shí)施例9免疫細(xì)胞化學(xué)來(lái)源于人源乳腺腫瘤、連續(xù)培養(yǎng)的靶細(xì)胞(MCF-7)在(a)沒(méi)有與任何其他分子綴 合的rMnSOD-Lp-CC的M個(gè)氨基酸引導(dǎo)肽、(b)與順鉬綴合的M個(gè)氨基酸引導(dǎo)肽的存在和 不存在下孵育三小時(shí)。孵育后，將細(xì)胞用Zamboni固定劑低聚甲醛+15%苦味酸組成的溶液)固定 60分鐘且用PBS沖洗。然后在含有0. 3%過(guò)氧化氫的PBS中保存細(xì)胞以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化 物酶。然后添加1/200稀釋的多克隆抗體(抗兔源rMnSOD引導(dǎo)肽)至細(xì)胞中，在室溫下孵 育1小時(shí)。使用DAKO SLAB Peroxidase K0679試劑盒來(lái)顯影該反應(yīng)。實(shí)施例10使用原子吸收分光光度法通過(guò)rMnSOD引導(dǎo)肽定量來(lái)確定轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞中的順 鉬胰蛋白酶消化靶細(xì)胞MCF-7，用緩沖溶液(PBS)沖洗兩次，然后用50 μ 1 35% HNO3 處理16小時(shí)。使用Analyst 800儀器(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)根據(jù)以下參數(shù) 對(duì)樣品進(jìn)行原子吸收檢測(cè)來(lái)確定鉬含量預(yù)處理溫度，1300°C ；原子化溫度，2200°C ；使用 0. 015mg鉬和0. Olmg Mg (N03) 2的組合物作為基質(zhì)校正物。使用“塞曼效應(yīng)背景”校正系統(tǒng) 和熱解石墨包被的THGA管(Perkin Elmer)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，而Lvov型整合平臺(tái)用于金屬檢測(cè)。
NH — CH2- C(O) — MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ我們用2. 5% HN03溶液(Spectrascan)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)獲得校正曲線上的三個(gè)參考點(diǎn)。圖1從左至右表示了用rMnSOD引導(dǎo)肽處理多種正常細(xì)胞株(MCFlO)和腫瘤細(xì)胞 株(MCF7、M1735、MRC5和A2780)的細(xì)胞(b)、用與順鉬綴合的引導(dǎo)肽處理細(xì)胞(c)和最后 用順鉬單獨(dú)處理細(xì)胞(d)獲得結(jié)果并與各個(gè)未處理對(duì)照細(xì)胞(a)比較。免疫組織化學(xué)反應(yīng) 表明此種肽自身可穿透腫瘤細(xì)胞而不損傷細(xì)胞，而與順鉬綴合的肽在僅三個(gè)小時(shí)的孵育后 產(chǎn)生了很強(qiáng)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。從以下表1中可看出，rMnSOD弓丨導(dǎo)肽可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的順鉬的量是單獨(dú)添加順鉬 至腫瘤細(xì)胞時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的順鉬的量的兩倍。表 1通過(guò)rMnSOD引導(dǎo)肽轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞中的順鉬量(通過(guò)原子吸收法定量)
權(quán)利要求
1.含有序列MLSRAVC(SEQ2)的肽作為靶向癌細(xì)胞的載體的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述肽具有MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)序列。
3.由序列MLSRAVC(SEQ2)組成的肽作為靶向癌細(xì)胞的載體的用途。
4.肽，其具有以下序列MLSRAVC(SEQ2)。
5.肽，其具有序列CMLSRAVC(SEQ3)和CLSRAVC(SEQ 4)，其中兩個(gè)末端半胱氨酸通過(guò) 一個(gè)二硫橋連接在一起。
6.綴合物，所述綴合物包含序列為MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ(SEQ 1)的肽或權(quán)利要 求4和5所述的肽，以及具有能夠與放射性同位素、染料結(jié)合的螯合基團(tuán)的分子、具有細(xì)胞 生長(zhǎng)抑制性質(zhì)的分子、具有酶活性的分子、反義寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述具有螯合基團(tuán)的分子是D0TA、DTPA、N0TA、 HYNIC。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述染料是熒光素或若丹明。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述具有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性質(zhì)的分子選自順鉬、 紫杉酚、表阿霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的綴合物，其中所述具有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性質(zhì)的分子是順鉬。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綴合物，其中所述具有酶活性的分子是能夠阻止有絲分裂 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶抑制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一權(quán)利要求所述的綴合物作為診斷試劑的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任一權(quán)利要求所述的綴合物用于制備治療腫瘤疾病的藥學(xué) 組合物的用途。
14.由rMnSOD-Lp-CC復(fù)合物組成的綴合物，其可能與DOTA結(jié)合，其與生物多聚物或脂 質(zhì)體綴合。
15.rMnSOD-Lp-CC綴合物的控釋制劑，所述制劑包含生物可降解材料制備的微球體，其 中裝載有所述綴合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述生物可降解材料選自透明質(zhì)酸、PEG、聚乳 酸-乙醇酸共聚物和其他已在制藥領(lǐng)域完善使用的生物可降解和生物相容的共聚物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的綴合物作為納米技術(shù)方法的分子載體的用途。
18.rMnSOD-Lp-CC綴合物用于抗腫瘤治療活動(dòng)中預(yù)測(cè)性診斷劑的用途。
19.rMnSOD-Lp-CC綴合物用于確定腫瘤的雌二醇受體的表達(dá)程度的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了肽作為將分子或放射性同位素轉(zhuǎn)運(yùn)至癌細(xì)胞中的載體的用途；還描述了所述肽的變體以及它們的用途。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102105172SQ200980125779
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者奧爾多·曼奇尼 申請(qǐng)人:高級(jí)催化劑應(yīng)用品有限公司