專利名稱：用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于靜電紡納米纖維材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法。
背景技術(shù)：
目前，癌癥的早期診斷和治療正受到各國(guó)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注。有研究表明很多腫瘤在一個(gè)毫米的情況下在血液里已經(jīng)可以查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumor cell, CTC),這些CTC通過(guò)進(jìn)一步遷移、粘附、相互聚集形成微小癌栓,并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，是目前導(dǎo)致癌癥發(fā)生的原因之一。傳統(tǒng)方法采用密度梯度離心法、膜濾過(guò)法、熒光細(xì)胞分選法及免疫磁珠分離法對(duì)血液中癌細(xì)胞進(jìn)行捕獲并檢測(cè)。但是，腫瘤患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量極少，約每IO6 IO7個(gè)白細(xì)胞中才會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)，上述方法容易造成癌細(xì)胞丟失，缺乏特異性且檢測(cè)靈敏度差。納米材料由于其尺寸較小(1-lOOnm)，具有特殊的光學(xué)、電子學(xué)和磁學(xué)等性質(zhì)而后來(lái)居上，受到越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)報(bào)道證明納米結(jié)構(gòu)可以很好地促進(jìn)其與細(xì)胞間的相互作用，大大提高捕獲效果[Chen, L.，et al., Aptamer - Mediated EfficientCapture and Release of T Lymphocytes on Nanostructured Surfaces.AdvancedMaterials2011, 23，4376-4380]。靜電紡絲是一種有效地制備具有高比表面積的納米或微米級(jí)纖維的生產(chǎn)技術(shù)，所制得的納米纖維具有極大的比表面積，能提供大量的細(xì)胞接觸位點(diǎn)，使單位體積內(nèi)捕獲細(xì)胞的數(shù)量增加；大量研究表明納米纖維易進(jìn)行表面修飾，并且可以負(fù)載生物活性分子，如蛋白質(zhì)、核酸、糖類及生長(zhǎng)因子等；同時(shí)，納米纖維能夠很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，為細(xì)胞的粘附、增殖及生理功能提供良好的微環(huán)境。在癌癥的早期診斷中，許多癌細(xì)胞捕獲材料由于缺乏特異性、 檢測(cè)靈敏度差，常常導(dǎo)致癌癥患者無(wú)法及早發(fā)現(xiàn)病情，威脅生命健康。據(jù)報(bào)道，靜電紡納米纖維修飾后不僅可以提高癌細(xì)胞捕獲靈敏度，并且具備檢測(cè)特異性[Zhang, N.，et al., Electrospun Ti02Nanofiber - Based Cell Capture Assay forDetecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.Advanced Materials2012, 24，2756-2760]。近年來(lái)，發(fā)展一種具有靶向分子修飾的納米材料，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)能夠與該靶向分子特異性結(jié)合的癌細(xì)胞的捕獲，已成為必然的發(fā)展趨勢(shì)。葉酸(Folid acid, FA)與葉酸受體(Folate receptor, FR)有很高的親和力。FR是一種跨膜單鏈糖蛋白，在多種癌細(xì)胞上都過(guò)度表達(dá)，而在正常的器官中很少表達(dá)，甚至不表達(dá)，常被用作抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)。但是，將FA修飾在納米纖維表面存在著一定的技術(shù)困難，而聚酰胺胺(PAMAM)樹(shù)狀大分子可以很好地在其表面修飾葉酸，用于癌細(xì)胞的靶向[Shiet al.Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles as a Nanoplatform for Cancer-CellTargeting and Imaging.Small2007, 3, 1245-1252] 聚酰胺胺(PAMAM)樹(shù)狀大分子是一種高度支化的大分子，表面有大量可控功能基團(tuán)，容易在其表面進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或物理吸附。因此，借助PAMAM樹(shù)狀大分子，將靶向分子葉酸修飾在靜電紡納米纖維表面，有望制備一種能夠高效特異性捕獲癌細(xì)胞的材料，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的早期診斷。檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，該方法制備的靶向分子葉酸修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維材料可用于特異性捕獲人口腔上皮癌細(xì)胞(KB);該發(fā)明制備的癌細(xì)胞捕獲材料具有制備工藝簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、可短時(shí)間內(nèi)靶向捕獲癌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥的早期診斷方面具有很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，包括:( I)將醋酸纖維素溶于有機(jī)溶劑中，攪拌，得到紡絲液進(jìn)行紡絲，干燥，得醋酸纖維素納米纖維，其中醋酸纖維素和有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為Ig:5ml ;(2)將上述醋酸纖維素納米纖維在堿性條件下進(jìn)行水解l_8h，洗滌，干燥，得到再生纖維素納米纖維；再生纖維素納米纖維表面攜帶大量負(fù)電荷；(3)通過(guò)靜電吸附作用，依次將帶有正電荷的聚電解質(zhì)聚二甲基二烯丙基氯化銨PDADMAC和帶負(fù)電荷的聚丙烯酸PAA組裝在靜電紡再生纖維素納米纖維表面，得到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維，表面含有大量羧基；其中組裝方法為:分別配制聚二甲基二烯丙基氯化銨PDADMAC/NaCl溶液和聚丙烯酸PAA/NaCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為3.5，然后將再生纖維素納米纖維浸泡在PDADMAC/NaCl溶液，取出后洗滌，吸干表面流動(dòng)水，再浸泡在PAA/NaCl溶液中，洗滌，真空干燥，得到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維；(4)將第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的DMSO溶液中，逐滴滴加含有異硫氰酸熒光素FITC的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)l-2d，然后加入EDC活化3_5h后的葉酸FA的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)3-5d，得到FITC與FA修飾的樹(shù)狀大分子溶液，最后將溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得G5.NH2-F1-FA,然后配制成溶液；(5)配制聚電解質(zhì)自組裝納米纖維溶液，加入EDC活化3_5h，然后逐滴加入G5.NH2-F1-FA溶液，避光，振蕩，得G5.NH2-F1-FA修飾后的聚電解質(zhì)自組裝納米纖維；其中G5.NH2-F1-FA在溶液中的最終濃度為0.2-1.2mg/mL ；通過(guò)G5.NH2-F1-FA表面氨基及纖維表面羧基間的化學(xué)反應(yīng)將G5.NH2-F1-FA修飾到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面。(6)將上述G5.NH2-F1-FA修飾后的聚電解質(zhì)自組裝納米纖維中加入三乙胺，反應(yīng)30-60min，再加入乙酸酐，繼續(xù)反應(yīng)12_24h，即得具有靶向捕獲癌細(xì)胞功能的納米纖維材料，其中，三乙胺及乙酸酐與樹(shù)狀大分子的摩爾比控制在550:550:1，使樹(shù)狀大分子表面剩
余氨基全部乙?；?。通過(guò)乙?；磻?yīng)將修飾在聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面G5.NH2-F1-FA的剩余氨基全部轉(zhuǎn)化為乙酸基，提聞材料的生物相容性，制備得到具有祀向捕獲癌細(xì)胞功能的納米纖維材料。所述步驟(I)中醋酸纖維素的Mn為30，000 (Aldrich);有機(jī)溶劑為體積比為2:1
的丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺的混合液。
所述步驟(I)中紡絲工藝條件為:電壓為20-22kV，接收距離為25cm，流速為ImL/h，環(huán)境濕度40-50% ;所述的干燥為真空干燥，干燥時(shí)間為12-24h。所述步驟(2)中堿性條件為0.05M的NaOH/乙醇溶液，水解時(shí)間為4h。所述步驟(2)中洗滌為用去離子水洗滌3-5次，干燥為真空干燥，干燥時(shí)間為12-24h。所述步驟(3)中PDADMAC與PAA在再生纖維素納米纖維表面組裝層數(shù)各為I層。所述步驟(3)中PDADMAC/NaCl溶液的濃度為2mg/mL，PAA/NaCl溶液濃度為2mg/
mT.nPDADMAC/NaCl溶液和PAA/NaCl溶液的配制:稱取5.85g NaCl，將其溶解在200mL超純水中，得到濃度為0.5M的NaCl溶液，然后稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PDADMAC(Mw=IOO, 000 2000，000)溶液2.0g,將其加入上述0.5M的NaCl溶液中，得到2mg/mL的PDADMAC/NaCl溶液。同理，稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PAA (Mw=240, 000)溶液1.6g，將其加入上述0.5M的NaCl溶液中，得到2mg/mL的PAA/NaCl溶液。并分別將兩種溶液的pH值調(diào)至
3.5。所述步驟(3)中浸泡時(shí)間均為3-10min，洗滌均為超純水洗滌3_4次，每次2min，真空干燥時(shí)間為12-24h。所述步驟(4)中G5.NH2-F1-FA的制備方法為:稱取第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子G5.NH2 (購(gòu)于Dendritech公司)，溶于DMSO中，配制成濃度為10.0mg/mL的溶液，稱取異硫氰酸熒光素(FITC)，溶于DMSO，按照FI/G5.NH2摩爾比為5:1，將FITC溶液加入到G5.NH2溶液中，避光處理，室溫條件下磁力攪拌l-2d，制備得到G5.NH2-FI溶液。稱取葉酸(FA)，溶于DMSO，稱取EDC溶于DMSO中，按照EDC/FA摩爾比為5:1，將EDC溶液加入到FA溶液中，避光處理，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)3-5h，按照FA/G5.NH2摩爾比為5:1，將活化好的FA溶液加入G5.NH2-FI溶液中，避光處理，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3-5d。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，先用pH值為7.4的0.02M PBS緩沖液透析12-24h，再在蒸餾水中透析24_48h。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到G5.NH2-F1-FA反應(yīng)產(chǎn)物。所述步驟(5)中聚電解質(zhì)自組裝納米纖維溶液的濃度為3mg/mL，G5.NH2-F1-FA溶液濃度為lmg/mL ;振蕩時(shí)間為3-5d。所述步驟(5)稱取聚電解質(zhì)自組裝納米纖維的質(zhì)量為2.56mg，根據(jù)其在溶液中的最終濃度為3mg/mL計(jì)算所需溶液體積為0.853mL,首先加入0.427mL濃度為20mg/mL的EDC活化納米纖維氈3-5h，最后將0.427mL濃度為2mg/mL的G5.NH2-F1-FA逐滴滴加至EDC活化后的納米纖維氈中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的最終濃度為1.0mg/mL，避光處理，搖床上搖晃反應(yīng)3-5d。同理，稱取聚電解質(zhì)自組裝納米纖維的質(zhì)量分別為4.68mg, 4.89mg, 4.48mg，4.65mg, 5.0lmg，根據(jù)其在溶液中的最終濃度為3mg/mL計(jì)算所需溶液總體積分別為
1.56mL, 1.63mL, 1.49mL, 1.55mL, 1.67mL,首先加入體積分別為 1.404mL, 1.304mL, 1.045mL,
0.93mL, 0.668mL濃度為20mg/mL的EDC活化納米纖維氈3_5h，最后將將體積分別為0.156mL, 0.326mL, 0.448mL, 0.62mL, 1.002mL 濃度為 2mg/mL 的 G5.NH2-F1-FA 溶液逐滴滴加至 EDC活化后的納米纖維氈中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的終濃度分別為0.2mg/mL, 0.4mg/mL, 0.6mg/mL, 0.8mg/mL, 1.2mg/mL,避光處理,搖床上搖晃反應(yīng) 3_5d。 利用Lambda25紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)珀金埃爾默儀器公司)測(cè)量G5.NH2-F1-FA溶液修飾納米纖維前及修飾后在500nm處的吸光值；繪制G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI的濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線；并記錄濃度為1.0mg/mL的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI溶液修飾納米纖維前后的紫外吸收?qǐng)D譜。所述步驟(6)中三乙胺和乙酸酐與樹(shù)狀大分子的摩爾比控制在550:550:1，使樹(shù)狀大分子表面剩余氨基全部乙?；?。本發(fā)明以靶向分子葉酸修飾的靜電紡醋酸纖維素納米纖維為基質(zhì)，通過(guò)培養(yǎng)葉酸受體高表達(dá)人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)探究其特異性捕獲癌細(xì)胞的效果。本發(fā)明通過(guò)核磁共振(NMR)對(duì)修飾在樹(shù)狀大分子表面的葉酸數(shù)量進(jìn)行了表征。借助掃描電鏡(SEM)對(duì)納米纖維水解前后及靶向分子修飾后的形貌進(jìn)行表征，傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。同時(shí)利用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)對(duì)靶向分子的成功修飾進(jìn)行了定性表征；通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis )對(duì)修飾至納米纖維氈表面靶向分子的量進(jìn)行了定量表征。最后，通過(guò)在材料上培養(yǎng)細(xì)胞，借助共聚焦顯微鏡及細(xì)胞計(jì)數(shù)器，研究材料對(duì)癌細(xì)胞的特異捕獲性能。和對(duì)照的未經(jīng)靶向分子葉酸修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素捕獲癌細(xì)胞的效果相比，本發(fā)明制備的材料能夠顯著地提高對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞的捕獲能力，因此本發(fā)明制備的靶向分子葉酸修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維能夠作為新型材料用于癌細(xì)胞的特異性捕獲。核磁共振(NMR)、掃描電鏡圖(SEM)、傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)、激光共聚焦顯微鏡結(jié)果(CLSM)、紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)、KB細(xì)胞捕獲定性試驗(yàn)、KB細(xì)胞捕獲特異性定量試驗(yàn)以及自由葉酸阻斷試驗(yàn)結(jié)果分別如下:(I)核磁共振(1H NMR)測(cè)試結(jié)果1H NMR圖譜用于表征葉酸對(duì)樹(shù)狀大分子表面的修飾。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1:在化學(xué)位移分別為6.4和7.0ppm處有兩個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FI分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。在化學(xué)位移分別為6.6,7.5和8.5ppm處有三個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FA分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。根據(jù)積分面積可以求出每個(gè)G5.NH2表面連接了 3.4個(gè)FI分子和3.8個(gè)FA分子。(2)掃描電鏡圖(SEM)結(jié)果SEM圖用于表征納米纖維的形貌和直徑大小。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖2。所得到的CA納米纖維形貌規(guī)整，表面光滑，平均直徑為431.6nm。水解lh、2h、4h后，部分纖維表面均變粗糙，這主要是由于水解作用使纖維的組分發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其行貌略有變化但不影響纖維結(jié)構(gòu)。水解8小時(shí)后由于強(qiáng)烈的水解作用使得部分纖維發(fā)生斷裂。為了保證納米纖維的充分水解，選擇最佳水解時(shí)間為4h。將G5.NH2-F1-FA和對(duì)照材料G5.NH2-FI修飾到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面后，纖維仍然保持良好形貌，但其平均直徑略有增加，分別為506.9nm和544.0nm，這主要是因?yàn)槔w維在溶液中反應(yīng)使其部分溶脹所致。(3)傅里葉變換-紅外光譜(FTIR)結(jié)果
FTIR結(jié)果表明，CA納米纖維已成功水解，且G5.NH2-F1-FA和對(duì)照材料G5.NH2-FI均成功修飾到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖3。CA納米纖維在1750CHT1、1370CHT1及1235CHT1處的吸收峰分別歸屬于醋酸纖維素中C=O鍵，C-O-C鍵的伸縮振動(dòng)峰及C-CH3的彎曲振動(dòng)峰。纖維水解后在1750CHT1及1235CHT1處吸收峰消失，這主要是因?yàn)榇姿崂w維素上縮醛鍵發(fā)生斷裂。同時(shí)，在3400CHT1左右出現(xiàn)一個(gè)寬峰，在1160CHT1處吸收峰強(qiáng)度增加，這兩個(gè)峰均歸屬于羥基的振動(dòng)峰，說(shuō)明乙?；涣u基取代，纖維被水解。G5.NH2在1560CHT1處存在振動(dòng)吸收峰，同時(shí)，G5.NH2-F1-FA及G5.NH2-FI修飾的功能化納米纖維在1560CHT1處也存在振動(dòng)吸收峰，這說(shuō)明在聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面有G5的存在，即G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI均成功修飾到纖維表面。(4)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果(CLSM)表征結(jié)果共聚焦顯微鏡圖片定性表征了 G5.NH2-F1-FA成功修飾到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖4。(5)紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)結(jié)果UV-Vis定量表征了修飾在聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面G5.NH2-F1-FA和對(duì)照材料G5.NH2-FI的質(zhì)量。測(cè)試結(jié)果如說(shuō)明書(shū)附圖5所示。結(jié)果表明，修飾聚電解質(zhì)自組裝納米纖維所用G5.NH2-F1-FA的最佳濃度應(yīng)為lmg/mL。通過(guò)測(cè)定不同濃度G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI在水溶液中的吸光值，繪制濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸附在Img功能化納米纖維氈表面G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI的量分別為0.056mg和0.043mg。(6) KB細(xì)胞捕獲定性試驗(yàn)結(jié)果以具有葉酸受體高表達(dá)的人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)為模型細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)兩種材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維捕獲KB細(xì)胞的效果。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖6。試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(5min、20min、40min、60min)，含有革巴向分子葉酸的功能化納米纖維均可以捕獲更多的癌細(xì)胞。尤其在60min時(shí),兩種材料捕獲癌細(xì)胞的數(shù)量相差最為明顯。這主要是因?yàn)楹邪邢蚍肿拥牟牧暇邆涓鼜?qiáng)的特異性，但細(xì)胞的粘附需要一定的時(shí)間。(7) KB細(xì)胞捕獲特異性定量試驗(yàn)結(jié)果以具有葉酸受體高表達(dá)的人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)及不具備葉酸受體高表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞(L929)兩種模型細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)兩種材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維特異性捕獲細(xì)胞的效果。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖7。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于KB細(xì)胞，經(jīng)過(guò)40min、60min培養(yǎng)，兩種材料捕獲細(xì)胞的數(shù)量具有顯著性差異，但對(duì)于L929細(xì)胞，在不同的捕獲時(shí)間后(5min、20min、40min、60min)，兩種材料捕獲細(xì)胞的數(shù)量幾乎相同。這說(shuō)明，這種靶向分子修飾的功能化納米纖維對(duì)特定的細(xì)胞具有高效捕獲作用。(8)自由葉酸阻斷試驗(yàn)結(jié)果以在添加葉酸的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)為模型來(lái)檢測(cè)檢驗(yàn)兩種材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維對(duì)葉酸受體被屏蔽后的KB細(xì)胞的捕獲效果。參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖8。對(duì)于在添加自由葉酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的KB細(xì)胞，兩種材料捕獲細(xì)胞的數(shù)量接近。這一結(jié)果證明:在癌細(xì)胞上的葉酸受體被屏蔽后，G5.NH2-F1-FA修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維不再具備對(duì)癌細(xì)胞的特異性靶向捕獲作用。
本發(fā)明采用靜電紡絲法制備天然聚合物醋酸纖維素納米纖維，充分利用納米纖維比表面積大、孔隙率高且能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性，有利于細(xì)胞與材料間的有效接觸并促進(jìn)其相互作用，同時(shí)結(jié)合靶向分子的特異細(xì)胞結(jié)合能力，可達(dá)到特異性捕獲癌細(xì)胞的目的。有益.效果( I)本方法制備的靶向分子葉酸修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維材料可用于特異性捕獲人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)；(2)本發(fā)明制備的癌細(xì)胞捕獲材料具有制備工藝簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、可短時(shí)間內(nèi)靶向捕獲癌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥的早期診斷方面具有很好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明制備的G5.NH2-F1-FA的核磁共振氫譜圖；圖2為本發(fā)明制備的CA納米纖維及直徑分布(圖2A)，水解不同時(shí)間后納米纖維形貌(圖 2B, (a) lh, (b)2h，(c)4h，(d) 8h)，及 G5.NH2-F1-FA (a)和 G5.NH2-FI (b)修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維的掃描電鏡圖及其直徑分布(圖2C)；圖3為G5.NH2及本發(fā)明制備CA納米纖維、水解后納米纖維、及G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維的的紅外圖譜；圖4為本發(fā)明制備的G5.NH2-F1-FA修飾的功能化后納米纖維的共聚焦顯微鏡圖片;圖5為本發(fā)明制備的不同濃度G5.NH2-F1-FA修飾功能化納米纖維前后在500nm處的紫外吸收值(圖5A)、G5.NH2-F1-FA (a)和G5.NH2-FI (c)濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線、以及在lmg/mL條件下G5.NH2-F1-FA (b)和G5.NH2-FI Cd)修飾納米纖維前后的紫外吸收?qǐng)D譜(圖5B);圖6為本發(fā)明制備的G5.NH2-F1-FA (a)和G5.NH2-FI (b)修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維對(duì)KB細(xì)胞捕獲的共聚焦顯微鏡圖片；圖7為本發(fā)明制備的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維在不同時(shí)間內(nèi)(5min、20min、40min、60min)捕獲KB (a)細(xì)胞及L929 (b)細(xì)胞的
數(shù)量；圖8為本發(fā)明制備的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修飾的功能化靜電紡醋酸纖維素納米纖維在不同時(shí)間內(nèi)(5min、20min、40min、60min)對(duì)葉酸受體被屏蔽的KB細(xì)胞捕獲的數(shù)量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1稱取醋酸纖維素3g，將其溶于15mL丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺混合有機(jī)溶劑中，兩者體積比為2:1，磁力攪拌過(guò)夜制備得到紡絲液進(jìn)行紡絲。所采用紡絲工藝條件為:電壓為20-22kV，接收距離為25cm，流速為lmL/h，環(huán)境濕度40_50%。將纖維氈真空條件下干燥12-24h。SEM結(jié)果顯示所得到的CA納米纖維形貌規(guī)整，表面光滑，平均直徑為431.6nm (圖2A)。實(shí)施例2稱取400mgNa0H，將其溶于200mL無(wú)水乙醇溶液中，磁力攪拌30min，得到濃度為
0.05M的NaOH/乙醇溶液，用該溶液對(duì)醋酸纖維素纖維氈進(jìn)行水解，水解時(shí)間為4h，使纖維氈在堿性條件下發(fā)生皂化反應(yīng)，去除表面的乙酰基，得到再生纖維素納米纖維。然后用去離子水洗滌3-5次，放入真空干燥箱12-24h。SEM結(jié)果顯示，水解后部分纖維表面變粗糙，但不影響顯微結(jié)構(gòu)(圖2B)。FTIR結(jié)果表明，CA納米纖維已成功水解(圖3)。實(shí)施例3稱取第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子(G5.NH2)66.47mg,溶于6.647mL DMSO中，配制成濃度為10.0mg/mL的溶液。稱取異硫氰酸熒光素(FITC)6.79mg，溶于2mL DMSO。按照FI/G5.NH2摩爾比為5:1，將1.465mLFITC加入到G5.NH2溶液中，避光處理，室溫條件下磁力攪拌l-2d，得到G5.NH2-FI溶液。稱取葉酸斤4)6.0411^，溶于511^01^0，稱取16.3311^0(:溶于21111DMSO 中，按照EDC/FA摩爾比為5:1，將1.60mLEDC加入到FA溶液中，避光處理，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)3_5h。按照FA/G5.NH2摩爾 比為5/1，將活化好的FA溶液6.163mL加入G5.NH2-FI溶液中，避光處理，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3-5d。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，先用pH值為7.4的0.02M PBS緩沖液透析12-24h (3x2L)，再在蒸餾水中透析24_48h (6x2L)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到G5.NH2-F1-FA反應(yīng)產(chǎn)物。NMR表征結(jié)果如

書(shū)I所示，在化學(xué)位移分別為6.4和7.0ppm處有兩個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FI分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。在化學(xué)位移分別為6.6,7.5和8.5ppm處有三個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FA分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。根據(jù)積分面積可以求出每個(gè)G5.NH2表面連接了 3.4個(gè)FI分子和3.8個(gè)FA分子(圖1)。實(shí)施例4稱取纖維氈的質(zhì)量為2.56mg,根據(jù)其在溶液中的最終濃度為3mg/mL計(jì)算所需溶液體積為0.853mL,首先加入0.427mL濃度為20mg/mL的EDC活化納米纖維氈3_5h，最后將0.427mL濃度為2mg/mL的G5.NH2-F1-FA逐滴滴加至EDC活化后的納米纖維氈中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的最終濃度為1.0mg/mL，避光處理，搖床上避光搖晃反應(yīng)3_5d。然后加入2.51iiL三乙胺，磁力攪拌30_60min，再加入L71yL乙酸酐，反應(yīng)12-24h。其中，三乙胺及乙酸酐與樹(shù)狀大分子的摩爾比控制在550:550:1，使樹(shù)狀大分子表面剩余氨基全部乙?；呙桦婄R結(jié)果表明G5.NH2-F1-FA組裝到功能化納米纖維表面后，纖維仍然保持良好形貌，但其平均直徑略有增加，為506.9nm (圖2C，(a))。FTIR (圖3)及激光共聚焦顯微鏡圖片(圖4)表明G5.NH2-F1-FA已成功修飾到功能化納米纖維表面，且UV-Vis結(jié)果表明吸附在Img功能化納米纖維氈表面G5.NH2-F1-FA的質(zhì)量為0.056mg (圖5B，(a))。實(shí)施例5以具有葉酸受體高表達(dá)的人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)為模型細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)實(shí)施例4制備的G5.NH2-F1-FA修飾的功能化納米纖維及對(duì)比例2制備的G5.NH2-FI修飾的功能化納米纖維特異性捕獲KB細(xì)胞的效果。將兩種材料剪成方形(a=16mm),將大于玻片(C>=14mm)的部分折在玻片的背面，然后將樣品放入12孔培養(yǎng)板。不同時(shí)間點(diǎn)的樣品要放置在不同的培養(yǎng)板中，每個(gè)樣品3個(gè)平行樣。將培養(yǎng)板用鋁箔紙包裹，防止FI淬滅，在紫外條件下照射滅菌6h。最后用ImL含有10%FBS的1640培養(yǎng)基浸泡，放入CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。KB細(xì)胞的種植密度為5X IO4個(gè)每孔，培養(yǎng)不同時(shí)間后(5min、20min、40min、60min)，吸取上清液，并且用PBS將纖維氈清洗三遍，收集PBS清洗液使之與上清液混合，離心5min，速度為lOOOrpm，并將其用一定體積培養(yǎng)液吹打均勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定該培養(yǎng)液中剩余細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算得知兩種纖維氈表面在不同時(shí)間內(nèi)捕獲KB細(xì)胞的數(shù)量。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果定性表明含有靶向分子葉酸的功能化納米纖維可以捕獲更多的KB細(xì)胞(圖6)，且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)40min、60min培養(yǎng)，兩種材料捕獲細(xì)胞的數(shù)量具有顯著性差異(圖7，(a))。對(duì)比例I稱取第五代聚酰胺胺樹(shù)狀大分子(G5.NH2)66.49mg，溶于6.649mL DMSO中，配制成濃度為10.0mg/mL的溶液。稱取異硫氰酸熒光素(FITC)6.23mg，溶于2mL DMSO。按照FI/G5.NH2摩爾比為5/1，將1.58mLFITC加入到G5.NH2溶液中，避光處理，室溫條件下磁力攪拌l-2d。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，先用pH值為7.4的0.02M PBS緩沖液透析12-24h (3x2L)，再在蒸餾水中透析24_48h (6x2L)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到G5.NH2-FI反應(yīng)產(chǎn)物。NMR表征結(jié)果表明在化學(xué)位移分別為6.4和7.0ppm處有兩個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FI分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。根據(jù)積分面積可以求出每個(gè)G5.NH2表面連接了 4.7個(gè)FI分子。對(duì)比例2稱取纖維氈的質(zhì)量為2.47mg，根據(jù)其在溶液中的最終濃度為3mg/mL計(jì)算所需溶液體積為0.823mL,首先加入0.412mL濃度為20mg/mL的EDC活化納米纖維氈3_5h，最后將0.412mL濃度為2mg/mL的G5.NH2-FI逐滴滴加至EDC活化后的納米纖維氈中，使得G5.NH2-FI在溶液中的最終濃度為1.0mg/mL，避光處理，搖床上搖晃反應(yīng)3_5d。然后加入2.42 ii L三乙胺，磁力攪拌30_60min，再加入1.65iiL乙酸酐，反應(yīng)12-24h，其中，三乙胺及乙酸酐與樹(shù)狀大分子的摩爾比控制在550:550:1，使樹(shù)狀大分子表面剩余氨基全部乙酰化。掃描電鏡結(jié)果表明G5.NH2-FI修飾到功能化納米纖維表面后，纖維仍然保持良好形貌，但其平均直徑略有增加，為544.0nm (圖2C, (b))。FTIR結(jié)果表明G5.NH2-FI已成功修飾到功能化納米纖維表面(圖3)，且UV-Vis結(jié)果表明吸附在Img功能化納米纖維氈表面G5.NH2-FI 的質(zhì)量為 0.043mg (圖 5B，(b))。對(duì)比例3以不具備葉酸受體高表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞(L929)為模型細(xì)胞來(lái)檢驗(yàn)實(shí)施例4制備的G5.NH2-F1-FA修飾的功能化納米纖維及對(duì)比例2制備的G5.NH2-FI修飾的功能化納米纖維捕獲不含靶向配體的L929細(xì)胞的效果。材料處理方法同實(shí)施例5。所用培養(yǎng)基為含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。L929細(xì)胞的種植密度為5X IO4個(gè)每孔，培養(yǎng)不同時(shí)間后(5min、20min、40min、60min)，吸取上清液，并且用PBS將纖維氈清洗三遍，收集PBS清洗液使之與上清液混合。離心5min，速度為lOOOrpm，并將其用一定體積培養(yǎng)液吹打均勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定該培養(yǎng)液中剩余細(xì)胞的個(gè)數(shù)。計(jì)算得知兩種纖維氈表面在不同時(shí)間內(nèi)捕獲L929細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示培養(yǎng)不同時(shí)間后兩種材料捕獲L929細(xì)胞的數(shù)量幾乎一致(圖7，(b))。對(duì)比例4以具有葉酸受體被屏蔽的人口腔上皮癌細(xì)胞(KB)為模型細(xì)胞來(lái)檢測(cè)實(shí)施例4制備的G5.NH2-F1-FA修飾的功能化納米纖維及對(duì)比例2制備的G5.NH2-FI修飾的功能化納米捕獲葉酸受體屏蔽后KB細(xì)胞的效果。材料處理方法同實(shí)施例5，細(xì)胞屏蔽方法為將模型細(xì)胞培養(yǎng)于含有自由葉酸(5 ii M)的培養(yǎng)基中24h。葉酸受體屏蔽KB細(xì)胞的種植密度為5 X IO4個(gè)每孔，培養(yǎng)不同時(shí)間后(5min、20min、40min、60min),吸取上清液,并且用PBS將纖維租清洗三遍。收集PBS清洗液使之與上清液混合，離心5min，速度為lOOOrpm，并將其用一定體積培養(yǎng)液吹打均勻。用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定該培養(yǎng)液中剩余細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算得知兩種纖維氈表面在不同時(shí)間內(nèi)捕獲葉酸屏蔽后KB細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示對(duì)于在添加自由葉酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的KB細(xì)胞，兩種材料捕獲細(xì)胞的數(shù)量接近(圖8)。
權(quán)利要求
1.一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，包括: (1)將醋酸纖維素溶于有機(jī)溶劑中，攪拌，得到紡絲液進(jìn)行紡絲，干燥，得醋酸纖維素納米纖維，其中醋酸纖維素和有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為Ig:5ml ； (2)將上述醋酸纖維素納米纖維在堿性條件下進(jìn)行水解l_8h，洗滌，干燥，得到再生纖維素納米纖維； (3)依次將聚電解質(zhì)聚二甲基二烯丙基氯化銨PDADMAC和聚丙烯酸PAA組裝在靜電紡再生纖維素納米纖維表面，得到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維；其中組裝方法為:分別配制聚二甲基二烯丙基氯化銨PDADMAC/NaCl溶液和聚丙烯酸PAA/NaCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為3.5，然后將再生纖維素納米纖維浸泡在PDADMAC/NaCl溶液，取出后洗滌，吸干表面流動(dòng)水，再浸泡在PAA/NaCl溶液中，洗滌，真空干燥，得到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維； (4)將第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的DMSO溶液中，逐滴滴加含有異硫氰酸熒光素FITC的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)l-2d，然后加入EDC活化3_5h后的葉酸FA的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)3-5d，得到FITC與FA修飾的樹(shù)狀大分子溶液，最后將溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，即得G5.NH2-F1-FA,然后配制成溶液； (5)配制聚電解質(zhì)自組裝納米纖維溶液，加入EDC活化3-5h，然后逐滴加入G5.NH2-F1-FA溶液，避光，振蕩，得G5.NH2-F1-FA修飾后的聚電解質(zhì)自組裝納米纖維；其中G5.NH2-F1-FA在溶液中的最終濃度為0.2-1.2mg/mL ； (6)將上述G5.NH2-F1-FA修飾后的聚電解質(zhì)自組裝納米纖維中加入三乙胺，反應(yīng)30-60min，再加入乙酸酐，繼續(xù)反應(yīng)12_24h，即得具有靶向捕獲癌細(xì)胞功能的納米纖維材料，其中，三乙胺及乙酸酐與樹(shù)狀大分子的摩爾比控制在550:550:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中醋酸纖維素的Mn為30，000 ;有機(jī)溶劑為體積比為2:1的丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中紡絲工藝條件為:電壓為20-22kV，接收距離為25cm，流速為lmL/h，環(huán)境濕度40-50%;所述的干燥為真空干燥，干燥時(shí)間為12-24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中堿性條件為0.05M的NaOH/乙醇溶液，水解時(shí)間為4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中洗滌為用去離子水洗滌3-5次，干燥為真空干燥，干燥時(shí)間為 12-24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中PDADMAC與PAA在再生纖維素納米纖維表面組裝層數(shù)各為I層。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中PDADMAC/NaCl溶液的濃度為2mg/mL，PAA/NaCl溶液濃度為 2mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中浸泡時(shí)間均為3-10min，洗滌均為超純水洗滌3_4次，每次2min，真空干燥時(shí)間為12-24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中第五代聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子的DMSO溶液的濃度為10.0mg/mL, FITC與樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1，F(xiàn)A與樹(shù)狀大分子的摩爾比為5:1，透析為:在截留分子量為14000的透析袋中，先用pH值為7.4的0.02M PBS緩沖液透析12_24h，再在蒸餾水中透析24-48h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中聚電解質(zhì)自組裝納米纖維纖維溶液的濃度為3mg/mL,G5.NH2-F1-FA溶液濃度為l mg/mL ;振蕩時(shí)間為3_5d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于癌細(xì)胞捕獲的葉酸修飾的靜電紡納米纖維的制備方法，包括(1)靜電紡醋酸纖維素納米纖維的制備并干燥；(2)醋酸纖維素納米纖維水解，得到再生纖維素納米纖維，干燥；(3)將聚電解質(zhì)聚二甲基二烯丙基氯化銨PDADMAC和聚丙烯酸PAA組裝在靜電紡再生纖維素納米纖維表面，得到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維，干燥；(4)將G5.NH2-FI-FA修飾到聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面；(5)將修飾在聚電解質(zhì)自組裝納米纖維表面G5.NH2-FI-FA的剩余氨基全部轉(zhuǎn)化為乙?；１景l(fā)明制備的癌細(xì)胞捕獲材料具有制備工藝簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、可短時(shí)間內(nèi)靶向捕獲癌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥的早期診斷方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)D06M13/355GK103114450SQ20131005805
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者史向陽(yáng), 趙毅麗 申請(qǐng)人:東華大學(xué)