專利名稱：初乳肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及初乳肽(colostrinin)及其作為藥物的用途。
初乳是由雌性哺乳動(dòng)物乳房在分娩后最初數(shù)天內(nèi)產(chǎn)出的黃色粘稠液體。分娩4至5天后它將被成熟母乳替代。與成熟母乳相比，初乳含糖較低。然而，初乳中卻含有豐富的脂類、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、維生素和免疫球蛋白。并且它還含有多種飄浮細(xì)胞，例如粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，以及生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子。
已從哺乳動(dòng)物初乳中分離并定性了多種因子。1974年，Janusz等人(FEBS Lett.,49,276-279)從綿羊初乳中分離出一種高脯氨酸含量的多肽(PRP)。該參考文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，除綿羊以外的哺乳動(dòng)物都以PRP的類似物作為初乳的組分。PRP也因此稱作初乳肽，并且被暫定成一類新的細(xì)胞因子。
Janusz等人在“高脯氨酸含量的多肽(PRP)-綿羊初乳中的一種免疫調(diào)制肽”(Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis,1993,41,275-279)中指出，綿羊初乳的PRP對(duì)小鼠具有親免活性。然而，該文獻(xiàn)卻沒有報(bào)導(dǎo)PRP對(duì)其他動(dòng)物有任何治療作用。事實(shí)上應(yīng)承認(rèn)，從一種對(duì)小鼠有治療作用的組合物并不能預(yù)見到它也對(duì)其他任何動(dòng)物有治療作用。
本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，初乳肽具有許多前所未知的治療功效。具體而言，我們發(fā)現(xiàn)初乳肽可顯現(xiàn)出親免作用和精神病治療作用。
作為本發(fā)明的一個(gè)方面，本申請(qǐng)人提供了用作藥物的初乳肽。所述初乳肽可作為藥物用于非嚙齒動(dòng)物；我們還發(fā)現(xiàn)，所述初乳肽特別適合作為治療人類的藥物。
另一方面，本發(fā)明提供了初乳肽在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病用藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述初乳肽被用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病?？梢杂贸跞殡闹委煹闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)病包括神經(jīng)病和精神病。
適合用初乳肽治療的神經(jīng)病的例子包括癡呆，誘發(fā)癡呆的疾病，例如神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病包括，例如老年性癡呆和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元??；帕金森氏病是一個(gè)可用初乳肽治療的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的實(shí)例?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，初乳肽在治療稱作早老性癡呆的神經(jīng)變性疾病中特別有效。
適合用初乳肽治療的精神病的例子包括精神病和神經(jīng)官能癥。例如，可用初乳肽治療情緒紊亂，特別是治療處于抑郁狀態(tài)的精神病患者的情緒紊亂-已發(fā)現(xiàn)初乳肽幫助患者改善感覺安寧和心境安定。初乳肽還可以在藥物癖嗜者、解毒期以后以及興奮劑依賴性人群中用作輔助性戒除治療劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述初乳肽被用于治療免疫系統(tǒng)的疾病，尤其是慢性免疫系統(tǒng)疾病。因此我們發(fā)現(xiàn)，可在需要免疫調(diào)節(jié)的疾病治療中采用所述初乳肽。特別是，初乳肽適合治療包括人類在內(nèi)的非嚙齒動(dòng)物的上述疾病。初乳肽在治療許多基于免疫和感染的疾病中十分有效。例如，用初乳肽治療與細(xì)菌病原和病毒病原有關(guān)的慢性疾病，還可以治療繼發(fā)的，例如腫瘤化療和放療繼發(fā)的獲得性免疫缺損。本發(fā)明特別適合治療需要非特異性免疫刺激和免疫校正的細(xì)菌性和病毒性慢性傳染病。
通常，慢性病是一種持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的疾病，常常至少一周，更常見至少一個(gè)月，并且經(jīng)常是至少3個(gè)月或至少6個(gè)月。
本發(fā)明的特征之一是用初乳肽改善新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育。本發(fā)明的另一特征在于用初乳肽校正兒童的免疫缺乏。所述初乳肽的這些用途特別適合未曾獲得初乳的嬰兒或兒童。而這種情況發(fā)生在，例如，出生后沒有母乳喂養(yǎng)的嬰兒和兒童中；在給這些嬰兒和兒童的人工食物中不含有初乳肽。
本發(fā)明的另一方面中，我們提供了初乳肽作為食品強(qiáng)化劑的用途。所述初乳肽特別適合用作嬰兒和幼童的食品強(qiáng)化劑，以校正其免疫系統(tǒng)發(fā)育中的缺乏。正如上文所述，這種缺乏發(fā)生在出生后未母乳喂養(yǎng)的嬰兒和兒童中。所述初乳肽也可以作為接受化療或患有惡病質(zhì)或因慢性病而體重減輕的成人的食品強(qiáng)化劑。作為本發(fā)明的一個(gè)方面，我們提供了一種含有與生理可接受載體合用的口服可攝取初乳肽結(jié)合物的食品強(qiáng)化劑。該食品強(qiáng)化劑是液體或固體的形式；也適于將其以片劑形式供給。
本發(fā)明中可預(yù)防性給予所述初乳肽，以便有助于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)展。
本發(fā)明上述初乳肽可以是綿羊初乳肽，或者是非綿羊產(chǎn)的初乳肽。非綿羊產(chǎn)的初乳肽可以從，例如人、母牛、馬、山羊、豬、牦牛、美洲駝和驢的初乳中獲得。初乳肽通常存在于上述動(dòng)物分娩后1至4天后的初乳中。
此處的術(shù)語“初乳肽”是指一種從哺乳動(dòng)物初乳中獲得的天然形式的多肽。有時(shí)初乳肽也稱作“colostrinine”，并且具有下列性質(zhì)(ⅰ)分子量在16,000至26,000道爾頓之間；(ⅱ)它是亞單位的二聚體或三聚體，各亞單位的分子量是5,000至10,000道爾頓，優(yōu)選6,000道爾頓；(ⅲ)它含有脯氨酸，并且脯氨酸的含量高于其他任何一種氨基酸的量。
我們發(fā)現(xiàn)，所述初乳肽以及組成它的亞單位都是非極性的。
在SDS(十二烷基硫酸鈉)存在下采用電泳法可對(duì)所述初乳肽的分子量進(jìn)行測(cè)定；這種技術(shù)也可顯示出存在的二聚體和三聚體。還原或非還原條件的電泳皆表明，亞單位之間的鍵是非共價(jià)鍵。通過常規(guī)的氨基酸分析技術(shù)可以確定存在的脯氨酸。非極性色譜可能夠證實(shí)初乳肽的非極性。
本發(fā)明所用初乳肽可以是綿羊初乳肽或非綿羊初乳肽。綿羊初乳肽的分子量約為18,000道爾頓，并且由三個(gè)非共價(jià)鍵合亞單位組成，每個(gè)亞單位的分子量分別是約6,000道爾頓，其中含有22％重量的脯氨酸。每個(gè)亞單位的氨基酸組成由數(shù)量如下的殘基構(gòu)成賴氨酸-2、組氨酸-1、精氨酸-0、天門冬氨酸-2、蘇氨酸-4、絲氨酸-3、谷氨酸-6、脯氨酸-11、甘氨酸-2、丙氨酸-0、纈氨酸-5、蛋氨酸-2、異亮氨酸-2、亮氨酸-6、酪氨酸-1、苯丙氨酸-3和半胱氨酸-0。
如上所述，天然形式的初乳肽來源于哺乳動(dòng)物的初乳。通過除去初乳中的脂類和多數(shù)蛋白質(zhì)可以獲取哺乳動(dòng)物初乳的初乳肽。廣義上，初乳肽是從例如大型畜牧動(dòng)物的初乳中通過柱色譜技術(shù)和其他生物技術(shù)獲得，或者通過基因工程技術(shù)來制得。
具體而言，可以通過下列步驟從哺乳動(dòng)物初乳中分離出初乳肽(ⅰ)脫脂，例如通過離心法；(ⅱ)去除蛋白質(zhì)(例如酪蛋白)，例如通過降低pH；(ⅲ)分離出與免疫球蛋白鍵合的初乳肽，例如通過(a)對(duì)脫脂和除蛋白后的乳清進(jìn)行離子交換色譜；和(b)用磷酸鹽緩沖鹽水洗脫，并收集含有與免疫球蛋白，例如綿羊的IgG2鍵合的初乳肽的餾分；(ⅳ)從免疫球蛋白上分離初乳肽，例如采用篩分色譜法；和(ⅴ)提純初乳肽，優(yōu)選通過(a)將分子量低于30,000道爾頓的部分進(jìn)行脫鹽；和(b)為免疫球蛋白引入抗體，由此除去此類蛋白質(zhì)，得到終產(chǎn)物。
盡管上述定義是指天然的哺乳動(dòng)物初乳肽，但此處的術(shù)語“初乳肽”也包括其生物活性基本相同的類似物和片斷，以及通過DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物初乳肽、其類似物或片斷。此處的初乳肽還包括通過多肽合成技術(shù)制備的、組成與天然初乳肽基本相同的生物活性多肽。
本發(fā)明另一方面提供了一種用初乳肽治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病的方法。上文已對(duì)適合用本發(fā)明所述方法治療的疾病作了描述。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，患者接受初乳肽的第一階段給藥，該第一階段中每天給予約1至2個(gè)治療單位，隨后是沒有初乳肽給藥的第二階段。所述第一階段優(yōu)選是約2至4周，更優(yōu)選約3周；并且，第二階段優(yōu)選約2至5周，更優(yōu)選約4周。優(yōu)選至少重復(fù)一次這種治療循環(huán)，并且更優(yōu)選重復(fù)不止一次。
本發(fā)明方法中所用的治療單位優(yōu)選25至1,000微克，更優(yōu)選50至100微克的初乳肽。
可以將初乳肽制成適當(dāng)?shù)男问絹斫o藥。例如，制成口服、直腸或非腸道給藥的形式。具體而言，可將初乳肽配制成注射劑給藥，或者優(yōu)選配制成適合通過口腔/鼻咽腔粘膜、食道或其他粘膜表面吸收的形式給藥。所述口服制劑可以是適于吞咽的形式；或優(yōu)選溶于唾液的形式，這種制劑是在口腔/鼻咽腔粘膜內(nèi)吸收。所述口服制劑也可以是口服給藥的片劑、糖錠(即適合留在口腔內(nèi)含服的甜片)、可咀嚼成口膠的粘性凝膠。還可將所述初乳肽配制成膠用粘性硬膏或貼劑。所述初乳肽還可以是涂敷在生殖泌尿器官粘膜上的制劑。
當(dāng)然，盡管能夠以完整初乳的形式給予所述初乳肽，但這并不可取，因?yàn)橥暾某跞榫哂胁贿m的味道并且難以儲(chǔ)存。
本發(fā)明所用初乳肽可以來源于任何哺乳動(dòng)物，例如取自人類或動(dòng)物，例如母牛、馬、山羊、豬、牦牛、綿羊、美洲駝或驢、駱駝等。
對(duì)綿羊初乳肽和人初乳肽進(jìn)行試驗(yàn)。綿羊的初乳肽以ColostrininTM的商標(biāo)出售。
在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，初乳肽的特征是其體內(nèi)外親免作用，這種親免作用是基于對(duì)胸腺細(xì)胞向活性T細(xì)胞分化和成熟的發(fā)展的調(diào)節(jié)性質(zhì)，基于對(duì)免疫反應(yīng)的刺激或抑制作用，并且基于對(duì)胸腺細(xì)胞上多種表面標(biāo)記的表達(dá)的誘導(dǎo)作用。在對(duì)小鼠腹膜內(nèi)給藥中，初乳肽可抑制NZB系小鼠溶血性貧血的發(fā)展，也抑制小鼠肉瘤180的生長(zhǎng)，并且對(duì)于受到γ射線照射的小鼠，初乳肽可以保護(hù)該動(dòng)物對(duì)抗放射病。小鼠的毒理學(xué)試驗(yàn)表明，口服和非腸道給藥后毒性極低，這是由于LD50高于1.25g/kg體重。初乳肽還表現(xiàn)出對(duì)人和試驗(yàn)動(dòng)物中免疫活性細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟和分化的刺激能力。在人外周血液的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(包括從臍帶血中分離出的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物)中，初乳肽的特征在于它可刺激細(xì)胞因子，特別是γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素類(例如IL-6和IL-10)以及多種生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生。通過已知方法可以定量測(cè)定所生產(chǎn)的細(xì)胞因子。
在自然狀況下，分娩后1至4天內(nèi)，人的初乳和所有哺乳動(dòng)物，尤其是大型畜牧動(dòng)物(例如母牛、馬、山羊、豬、牦牛、綿羊、美洲駝或驢、駱駝等)的初乳中都存在具有該生化活性的綿羊初乳肽類似物。初乳肽在新生動(dòng)物吸吮和吞咽母體初乳的過程中進(jìn)入到體內(nèi)。由于初乳肽分子量較低，初乳肽可以在口腔/鼻咽腔粘膜上通過細(xì)胞受體起作用，甚至進(jìn)行簡(jiǎn)單擴(kuò)散(ordinary diffusion)。研究表明，由于消化道上段的粘膜和上皮含有某些免疫調(diào)制劑的受體，所述初乳肽可以以片劑和舌下含片、吞咽用片劑和膠囊、粘性凝膠形式以及與樹膠固定在一起的粘性硬膏形式來給藥。也可以將初乳肽涂敷在生殖泌尿器官的粘膜上。
以弄清初乳肽所誘導(dǎo)的生化活性為目的的科學(xué)試驗(yàn)還揭示了，來源于產(chǎn)后1至7天婦女的人類初乳具有類似生物活性。人體原料中初乳肽的分離方法類似于從畜牧動(dòng)物的初乳，尤其是綿羊初乳中獲取初乳肽的方法。由產(chǎn)后1至7天婦女乳腺分泌的初乳含有多肽類的初乳肽，它的量取決于泌乳作用，并且在2至3天內(nèi)最佳，此時(shí)1升初乳中可檢測(cè)出300mg初乳肽。這樣的人初乳肽產(chǎn)量可見于綿羊初乳中?，F(xiàn)已證明，人初乳肽具有許多與例如綿羊產(chǎn)類似物相似的生物性質(zhì)。來源于人初乳的初乳肽可刺激初乳所含淋巴細(xì)胞以及臍血淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子主要包括干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子TNF-α、白介素類(IL-10和IL-6)或其它細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子參與體液和細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
采用公開在波蘭專利(PL 170592B1)和歐洲專利EP-B-0609225中的性能試驗(yàn)免疫學(xué)方法，可對(duì)人和動(dòng)物來源的初乳肽的生物活性進(jìn)行測(cè)定。
在對(duì)人類志愿者的研究中發(fā)現(xiàn)，用至少含有25μg初乳肽的含片以每天至少一片的劑量給藥約3周后，沒有觀察到任何副作用；另一方面，卻形成一種對(duì)誘導(dǎo)IFN-γ以及部分腫瘤壞死因子TNF-α的低反應(yīng)狀態(tài)。在停止初乳肽給藥后，這種低反應(yīng)性狀態(tài)將恢復(fù)正常。這些反應(yīng)的結(jié)果是Th1和Th2淋巴細(xì)胞和輔助細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。
臨床試驗(yàn)還表明，初乳肽具有免疫調(diào)節(jié)作用以及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，它可以預(yù)防性和治療性地應(yīng)用于下列疾病，例如，用于預(yù)防早老性癡呆的出現(xiàn)和進(jìn)行，并緩解這種疾??；也可應(yīng)用于一些其它起因的老年性癡呆，并可治療與免疫和感染有關(guān)的慢性疾病。
可用具有下列組成和氨基酸序列的、縮寫為NP的九肽取代初乳肽Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro。通過糜蛋白酶的消化作用和柱色譜的分離，可從初乳肽中獲取NP，或者通過化學(xué)合成法來制得NP。NP是初乳肽有效片段的一個(gè)例子?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，NP具有與初乳肽相似的生物作用，特別是，它適合治療上述慢性免疫疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(尤其是早老性癡呆)。可以用NP治療上述任何一種疾病。也可以將它應(yīng)用于食品強(qiáng)化劑中?？梢园凑张c初乳肽相同的方法來配制它。NP適合治療哺乳動(dòng)物，尤其是人類。
為了更全面地理解本發(fā)明，可以參考下列僅作說明作用的實(shí)施例。實(shí)施例1分子量18,000道爾頓的綿羊初乳肽是由三個(gè)非共價(jià)連接的亞單位構(gòu)成，亞單位的分子量為6000道爾頓，各亞單位具有下列氨基酸組成<
>
所用初乳肽來源于在綿羊分娩至多24小時(shí)后泌乳開始后的綿羊初乳。將原料在35000×g離心，以便除去脂肪及部分酪蛋白。將所得部分的1g置于DEAE-纖維素柱中，從而分離出與免疫球蛋白IgG2絡(luò)合的多肽初乳肽，利用葡聚糖膠凝G-100柱色譜法以及用葡聚糖凝膠G-75再次進(jìn)行的色譜，可從柱中洗脫出與IgG2分離的初乳肽。隨后，將一部分多肽通過結(jié)合有綿羊IgG2抗體的瓊脂糖膠凝柱，以除去痕量的IgG2雜質(zhì)。所得制備物通過葡聚糖膠凝G-25的方式脫鹽并冷凍干燥，此后將其儲(chǔ)存在+4℃或-20℃下。
所得初乳肽的商標(biāo)名被命名為ColostrininTM。
在有SDS存在的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在與分子量5800道爾頓相對(duì)應(yīng)處可以觀察到一個(gè)強(qiáng)帶，同時(shí)還出現(xiàn)兩個(gè)弱帶，它們分別與分子量12400道爾頓和18200道爾頓相對(duì)應(yīng)。實(shí)施例Ⅱ從實(shí)施例1所述初乳肽中可以得到九肽NP,NP的組成和氨基酸序列為Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro。
通過10個(gè)活性單位的蛋白水解酶糜蛋白酶在30℃的溫度下對(duì)50mg初乳肽進(jìn)行20小時(shí)的消化。對(duì)消化產(chǎn)物的分離應(yīng)通過至少一個(gè)循環(huán)的葡聚糖凝膠G-10柱色譜。凍干所得制備物，隨后儲(chǔ)存在+4℃或-20℃的溫度下。通過測(cè)定N-末端氨基酸對(duì)九肽進(jìn)行分離。實(shí)施例Ⅲ吸吮片形式的劑量單位具有下列組成活性成分 實(shí)施例1所得的Colostrinin多肽 0.0001g穩(wěn)定劑 白蛋白，無雜質(zhì)，主要I.P.S 0.000135g潤(rùn)滑劑/粘合劑硬脂酸鎂 0.003g載體 甘露糖醇0.1g(0.1497g)將上述組分懸浮在0.0001M NaCl中。吸吮片主要用于治療早期和晚期癡呆癥(包括早老性癡呆)以及不同時(shí)期的老年性癡呆；還可以治療慢性細(xì)菌性及病毒性感染、所需的非特異性免疫刺激和免疫校正以及由多種試劑誘發(fā)的獲得性免疫缺乏。此外，也可用它治療情緒紊亂，特別是治療不同抑郁狀態(tài)的精神病患者，從而改善他們的全身安全感和心境穩(wěn)定性；初乳肽還可以在藥物癖嗜者、解毒期以后以及興奮劑依賴性人群中用作輔助性戒除治療劑。ColostrininTM也可以作為人工食品來校正新生兒和幼童的營養(yǎng)缺乏。實(shí)施例Ⅳ制備具有下列組成的粘膜涂敷用凝膠形式活性成分實(shí)施例1所得ColostrininTM多肽穩(wěn)定劑 白蛋白膠凝載體Orabase-Plain，它含有果膠、膠凝、羧甲基纖維素鈉和碳?xì)浠衔锬z每1ml凝膠載體使用0.0003g多肽ColostrininTM和0.0015g白蛋白。如此配制的劑量單位主要用于口腔和上呼吸道細(xì)菌性及病毒性感染的循環(huán)治療。實(shí)施例Ⅴ肌肉內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射形式的制劑?；钚猿煞謱?shí)施例1所得ColostrininTM多肽穩(wěn)定劑 人白蛋白，無雜質(zhì)膠凝載體滅菌的無熱原水每1ml安瓿中使用0.0003g ColostrininTM多肽、0.0015g白蛋白、作為抗菌劑的0.001％硫柳汞(即乙汞硫代水楊酸鈉鹽)。這種劑量單位主要用于細(xì)菌性和病毒性感染的循環(huán)治療。實(shí)施例Ⅵ肌肉內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射形式的制劑。活性成分實(shí)施例Ⅱ所得NP穩(wěn)定劑 白蛋白，無雜質(zhì)膠凝載體滅菌的無熱原水每1ml安瓿中使用0.0003gNP、0.0015g白蛋白、作為抗菌劑的0.001％硫柳汞(即乙汞硫代水楊酸鈉鹽)。這種劑量單位主要用于細(xì)菌性和病毒性感染的循環(huán)治療。實(shí)施例Ⅶ按照下列方法從接受實(shí)施例Ⅲ所述藥物形式循環(huán)治療的健康和患病志愿者中采集血液，分析血中多肽ColostrininTM對(duì)體外細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用。
將不含防腐劑但每1ml含有10個(gè)單位肝素的全血以1∶10的配比稀釋在RPMI1640培養(yǎng)基中。在37℃和含有5％二氧化碳的條件下于相同培養(yǎng)基中孵育20小時(shí)，孵育所用培養(yǎng)基不含有誘導(dǎo)物(陰性對(duì)照)，或者含有1至100μg/ml多肽ColostrininTM，或含有2μg/ml血的植物凝集素(PHA)和2μg/ml血的脂多糖(LPS)。含有PHA和LPS的混合物的樣品作為陽性對(duì)照物，原因在于它們可以刺激最高量的細(xì)胞因子。表1和2中列出了試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，ColostrininTM在1至100μg/ml的濃度下以劑量依賴方式刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生。與陰性對(duì)照物(不含誘導(dǎo)物)比較，這些結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0001)。早老性癡呆患者的IFN生產(chǎn)能力降低，并且TNF的也較小程度地降低。
表1綿羊ColostrininTM(系列A 1993)在健康志愿者或早老性癡呆患者的全血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用
健康志愿者組(22人)的年齡各不相同(年齡在20至64歲間)。早老性患者組(50人)年齡也不相同(年齡63±7.5歲)。盡管不含(無)誘導(dǎo)物的空白對(duì)照組之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SD)差異性較大，但ColostrininTM有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
表2綿羊ColostrininTM(A系列1993)在用健康志愿者和多種疾病患者全血進(jìn)行的試驗(yàn)中對(duì)干擾素(IFN)生產(chǎn)的刺激例
<p>附注對(duì)存在的IFN進(jìn)行的生物試驗(yàn)可以測(cè)出不同類型干擾素的含量，而ELISA試驗(yàn)僅檢測(cè)免疫活性IFN-γ的水平。實(shí)施例Ⅷ從Wroclaw的地區(qū)專業(yè)醫(yī)院的婦產(chǎn)科獲得臍帶血。在產(chǎn)后4至6小時(shí)獲取的臍帶血的淋巴細(xì)胞中，ColostrininTM通過下列途徑體外有效誘導(dǎo)細(xì)胞因子。
用每100ml含有5.7g Ficoll 400和9.0g泛影酸鈉的Ficoll-Paque梯度物分離淋巴細(xì)胞。以每1ml培養(yǎng)基2×106個(gè)淋巴細(xì)胞的密度將分離的淋巴細(xì)胞懸浮在RPMI-1640培養(yǎng)基中。向該淋巴細(xì)胞懸浮液中加入濃度為1至20μg/ml的ColostrininTM或10μg/ml植物凝集素。將該培養(yǎng)物在37℃下孵育20小時(shí)。隨后通過生物學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的水平進(jìn)行檢測(cè)。表3中給出了一個(gè)典型實(shí)例。1至100μg/ml濃度的ColostrininTM所具有的細(xì)胞因子(IFN和TNF)刺激作用與傳統(tǒng)IFN-γ誘導(dǎo)物一植物凝集素的相類似。
表3ColostrininTM(A系列1996)在臍帶血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(CBL)中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)作用
N-被檢測(cè)CBL樣品數(shù)學(xué)生t-檢驗(yàn)中，ColostrininTM的顯著性差異幾率(p)-IFN和TNF中所用的“無”是p＜0.0001。
由于臍帶血中富含未成熟干細(xì)胞，而這種細(xì)胞能夠繁殖成造血細(xì)胞和多種免疫活性細(xì)胞，所以ColostrininTM極大地加快了干細(xì)胞的成熟。結(jié)果還表明，ColostrininTM可以有效治療不同類型的免疫缺陷，也可以在例如外傷、感染、化療和放療后用于刺激造血系統(tǒng)。在生物醫(yī)學(xué)研究中，具有類似作用的天然產(chǎn)物很罕見。實(shí)施例Ⅸ對(duì)一組患有早期和中期早老性癡呆癥的志愿者進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病療法的試驗(yàn)。所用劑量單位以吸吮片形式在兩餐之間給藥，該劑量單位含有0.00015實(shí)施例Ⅰ和Ⅲ所述的ColostrininTM。首先，每天使用一片并持續(xù)3周，隨后中止治療達(dá)2至4周，此后再次進(jìn)行治療并且每天服用2片且持續(xù)3周。發(fā)現(xiàn)ColostrininTM療法可誘導(dǎo)一種低反應(yīng)性或耐受的狀態(tài)。這表明沒有合成IFN及腫瘤壞死因子TNF-α的能力。可以用這種現(xiàn)象對(duì)活性劑的功效進(jìn)行定量測(cè)定。
在中止上述藥物的給藥后，這種耐受狀態(tài)也發(fā)生自發(fā)性逆轉(zhuǎn)。ColostrininTM的這種暫時(shí)性耐受狀態(tài)歸因于由Th1和Th2淋巴細(xì)胞、輔助細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，所述輔助細(xì)胞例如是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及其產(chǎn)物。其結(jié)果是，可在早老性癡呆患者中觀察到人際關(guān)系的改善和心境高漲。
附

圖1圖示了女性早老性癡呆患者(J.M)中的對(duì)于γ-干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)作用的低反應(yīng)性狀態(tài)部分耐受的出現(xiàn)以及自然消失，這些患者每隔一天服用100μg的ColostrininTM片劑并持續(xù)3周。隨后將治療中止3周(在暫定期間，對(duì)誘導(dǎo)物的耐受性恢復(fù)正常)。每周采集血樣以用于檢測(cè)ColostrininTM和空白對(duì)照(PHA-10μg/ml)的IFN-γ刺激作用。上文部分已描述了進(jìn)行細(xì)胞因子誘導(dǎo)試驗(yàn)及其定量測(cè)定的方法。
被誘導(dǎo)IFN-γ水平的檢測(cè)結(jié)果表明，低反應(yīng)性早在服用ColostrininTM(每2天100μg/片)的第一周即出現(xiàn)并在治療的第三周達(dá)到最高值。在中止治療的3周內(nèi)(即治療開始后第6周內(nèi))，對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)作用的耐受狀態(tài)發(fā)生自發(fā)性逆轉(zhuǎn)。并且，該附圖表示，“特別是”綿羊ColostrininTM(OvCal)，這種低反應(yīng)性在觀察的第6周仍能夠維持，而PHA低反應(yīng)性卻完全消失。實(shí)施例Ⅹ對(duì)一組患有早期早老性癡呆癥的志愿者進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病療法的試驗(yàn)。所用劑量單位以吸吮片形式在兩餐之間給藥，該劑量單位含有0.00015實(shí)施例Ⅱ所述NP。首先，每天使用一片并持續(xù)3周，隨后中止治療達(dá)3周，此后再次進(jìn)行治療并且每天服用2片且持續(xù)3周。發(fā)現(xiàn)NP療法可誘導(dǎo)一種低反應(yīng)性或耐受的狀態(tài)。這表明沒有合成IFN及腫瘤壞死因子TNF-α的能力?？梢杂眠@種現(xiàn)象對(duì)活性劑的功效進(jìn)行定量測(cè)定。
在中止上述藥物的給藥后，這種耐受狀態(tài)發(fā)生自發(fā)性逆轉(zhuǎn)。NP的這種暫時(shí)性耐受狀態(tài)歸因于由Th1和Th2淋巴細(xì)胞、輔助細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，所述助細(xì)胞例如是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及其產(chǎn)物。其結(jié)果是，可在早老性癡呆患者中觀察到人際關(guān)系的改善和心境高漲。
權(quán)利要求
1．用作藥物的初乳肽。
2．作為人用藥物的初乳肽。
3．用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病的初乳肽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的初乳肽，是用于治療神經(jīng)病和/或精神病的初乳肽。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的初乳肽，是用于治療癡呆和/或神經(jīng)變性疾病的初乳肽。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的初乳肽，是用于治療早老性癡呆和/運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的初乳肽。
7．根據(jù)權(quán)利要求3的初乳肽，是用于治療精神病和/或神經(jīng)官能癥的初乳肽。
8．用于治療慢性免疫系統(tǒng)疾病的初乳肽。
9．用于治療人的慢性免疫系統(tǒng)疾病的初乳肽。
10．根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的初乳肽，是用于治療與細(xì)菌性和病毒性病原有關(guān)的疾病和/或治療獲得性免疫缺損的初乳肽。
11．根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的初乳肽，是用于治療慢性細(xì)菌性和/或病毒性感染的初乳肽。
12．根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的初乳肽，其中該初乳肽來自非綿羊來源。
13．初乳肽在制備用于治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療神經(jīng)病和/或精神病。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療癡呆和/或神經(jīng)變性疾病。
16．根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療早老性疾病和/或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病。
17．根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療精神病和/或神經(jīng)病。
18．初乳肽在制備用于治療慢性免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
19．初乳肽在制備用于治療人的慢性免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
20．根據(jù)權(quán)利要求18或19的應(yīng)用，用于治療與細(xì)菌性和病毒性病原有關(guān)的疾病和/或治療獲得性免疫缺損。
21．根據(jù)權(quán)利要求18、19或20的應(yīng)用，所述藥物用于治療慢性細(xì)菌性和/或病毒性感染。
22．根據(jù)權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中該初乳肽來自非綿羊來源。
23．一種利用初乳肽治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或免疫系統(tǒng)疾病的方法。
24．一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或免疫系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給患者在預(yù)定時(shí)期內(nèi)施用含有預(yù)定量初乳肽的組合物。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述患者是病人。
26．根據(jù)權(quán)利要求23、24或25任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中該初乳肽來自非綿羊來源。
27．根據(jù)權(quán)利要求23至26任一項(xiàng)所述的方法，其中包括，所述初乳肽的預(yù)定量是在約25至2000微克內(nèi)。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法，該方法包括一個(gè)循環(huán)，循環(huán)的第一階段每天給患者施用25至2000微克初乳肽，隨后是沒有初乳肽給藥的第二階段。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述第一階段是約2至4周間，并且所述第二階段是在約2至5周。
30．根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法，其中所述循環(huán)至少重復(fù)一次。
31．一種藥物組合物，該藥物組合物含有預(yù)選量的與生理可接受載體結(jié)合的初乳肽。
32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述初乳肽是非綿羊的初乳肽。
33．根據(jù)權(quán)利要求31或32的組合物，該組合物是適合注射的形式。
35．根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的組合物，該組合物是適合通過口腔/鼻咽腔粘膜吸收的形式和/或適合食道吸收的形式。
36．根據(jù)權(quán)利要求31至34任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物是片劑、錠劑、凝膠、貼劑或硬膏。
36．根據(jù)權(quán)利要求31至35任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物含有25至1000微克的初乳肽。
37．根據(jù)權(quán)利要求31至35任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物含有50至100微克的初乳肽。
39．初乳肽作為食品強(qiáng)化劑的用途。
40．初乳肽作為嬰兒、幼兒、接受化療的成人和/或患有惡質(zhì)病或因慢性疾病體重減輕的成人的食品強(qiáng)化劑。
41．一種食品強(qiáng)化劑，其中含有與生理可接受載體結(jié)合的口服可攝取的初乳肽。
42．用于刺激和/或調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的初乳肽。
43．用于刺激和/或調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)的初乳肽。
44．初乳肽在制備用于刺激和/或調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的藥物中的應(yīng)用。
44．初乳肽在制備用于刺激和/或調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)的藥物中的應(yīng)用。
45．用作預(yù)防性藥物的初乳肽。
46．用作人用預(yù)防性藥物的初乳肽，所述藥物可預(yù)防或抑制早老性癡呆的發(fā)展。
47．初乳肽在制備人用預(yù)防性藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防或抑制早老性癡呆的發(fā)展。
48．一種從哺乳動(dòng)物初乳中制備初乳肽的方法，該方法包括(1)除去初乳中的脂和大部分蛋白質(zhì)；(2)從初乳中分離出與免疫球蛋白鍵合的初乳肽；和(3)分離初乳肽和免疫球蛋白，并提純初乳肽。
49．根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中在步驟(1)中通過離心脫脂，通過降低pH值除去蛋白質(zhì)；在(2)中通過對(duì)已除去脂類和蛋白質(zhì)的產(chǎn)物進(jìn)行離子交換色譜、用磷酸鹽緩沖鹽水洗脫并收集含有與免疫球蛋白鍵合的初乳肽，從而分離出初乳中的與免疫球蛋白鍵合的初乳肽；和在步驟(3)中包括，通過篩分色譜將免疫球蛋白與初乳肽分離，并且初乳肽的提純是通過將分子量在30,000道爾頓以下的部分脫鹽，并引入免疫球蛋白的抗體以除去此類蛋白質(zhì)，從而得到終產(chǎn)物。
50．一種制備藥物組合物的方法，其中包括將初乳肽與生理可接受載體混合，并且將所得混合物成形為適合患者給藥的形式。
51．一種用作藥物的九肽，該九肽的組成和氨基酸序列如下Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro。
52．組成和氨基酸序列是Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro的九肽在制備治療人的慢性免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
53．組成和氨基酸序列是Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro的九肽在制備治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
54．一種藥物組合物，該組合物含有與生理可接受載體結(jié)合的、組成和氨基酸序列為Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro的九肽。
55．一種制備藥物組合物的方法，其中包括將組成和氨基酸序列為Val-Glu-Ser-Tyr-Val-Pro-Leu-Phe-Pro的九肽與生理可接受載體混合，并且將所得混合物成形為適合患者給藥的形式。
全文摘要
初乳肽作為藥物，特別是治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1238782SQ9719853
公開日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1997年3月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月3日
發(fā)明者馬林·雅努什, 約瑟夫·利索夫斯基, 安娜·杜博夫斯卡－因格洛特 申請(qǐng)人:波蘭科學(xué)院路德維克·希爾斯費(fèi)爾德免疫學(xué)和實(shí)驗(yàn)治療學(xué)研究所, 喬治亞季斯生物技術(shù)有限公司