專利名稱：在生長因子和生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)存在下進(jìn)行細(xì)胞增殖和分化的方法和裝置的制作方法
在生長因子和生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)存在下進(jìn)行細(xì)胞增殖和
分化的方法和裝置 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2003年6月20日、申請(qǐng)?zhí)枮?3816829. 4、發(fā)明名稱為"在生長 因子和生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)存在下進(jìn)行細(xì)胞增殖和分化的方法和裝置"的發(fā)明專利申請(qǐng)的 分案申請(qǐng)。 本發(fā)明涉及使用至少一種分離形式的生長因子進(jìn)行初級(jí)分化細(xì)胞的培養(yǎng)，用于成 體細(xì)胞的局部特異分化和/或定向分化和/或骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生。
在個(gè)體發(fā)生(即生物個(gè)體的胚胎發(fā)育)中，生長因子被表達(dá)，其能夠引發(fā)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu) 的和與細(xì)胞數(shù)目相關(guān)的眾多過程。在正在生長的生物中，因?yàn)椴辉俦磉_(dá)這些生長因子而日 漸喪失通過再生進(jìn)行結(jié)構(gòu)性修復(fù)的能力。在特定的個(gè)體發(fā)生過程中，骨髓或造血器官的因 子在時(shí)間上與其它器官的生長過程耦聯(lián)。 已知的生長因子(如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或肝細(xì)胞生 長因子(HGF))的缺點(diǎn)是增殖過程是受限的，特別是體外使用初級(jí)細(xì)胞的增殖過程，而體內(nèi) 的使用由于可能的副作用(如激活致癌基因)存在問題。 至今認(rèn)為組織提取物(例如來自垂體或下丘腦的組織提取物)特別適合用于引起 肝細(xì)胞的增殖(例如見US 6008047)。已經(jīng)將這類動(dòng)物的(偶爾為人的)提取物加入到細(xì) 胞培養(yǎng)物中。然而，由于可傳播的病毒疾病(如BSE、豬或綿羊病毒)，使在實(shí)驗(yàn)室工作或臨 床中使用動(dòng)物或人組織提取物存在問題。這類提取物的應(yīng)用說明對(duì)確切的相關(guān)因子以及它 們潛在的用途和效果缺乏了解。另一實(shí)質(zhì)性缺點(diǎn)是，通過這類通常難以限定并相當(dāng)依賴于 所使用的來源的異質(zhì)性提取物也向培養(yǎng)物中引入了因子，這些因子在臨床使用中可能帶來 了不需要的副作用或性質(zhì)。因此，對(duì)因子的確切了解和對(duì)其劑量的控制，不僅對(duì)于能夠相應(yīng) 地增殖和分化細(xì)胞(特別是在組織工程領(lǐng)域)是重要的因素，并且對(duì)于誘導(dǎo)三維(3-D)再 生的結(jié)構(gòu)過程也是重要的。 這類結(jié)構(gòu)的設(shè)定，特別對(duì)于組織工程而言是重要的，其中3-D生長和它的起始至 今仍不了解。雖然如聚集培養(yǎng)之類的傳統(tǒng)方法能夠達(dá)到高密度，但必須使用預(yù)擴(kuò)增的或分 離自原初組織的細(xì)胞(如肝細(xì)胞)才能建立起來。到目前為止，產(chǎn)生精細(xì)的預(yù)定結(jié)構(gòu)的誘 導(dǎo)性生長過程還是不可能的。 相反，目前在增殖階段之后仍然將細(xì)胞(如肝細(xì)胞)包埋進(jìn)凝膠中，以避免形成進(jìn) 一步的(也是大的)聚集體(超聚集體)。這些凝膠在維度上是二維的，它們包含很高的細(xì) 胞密度，因此阻止了細(xì)胞增殖。這種導(dǎo)致分層的2-D凝膠內(nèi)含物已經(jīng)被Bader等人(1995)， Artif. Organs, 19， 368-374描述為三明治模型或凝膠包載。雖然聚集體在凝膠中的包埋改 善了分化的保持，但并不進(jìn)一步的生長。 至今，從少數(shù)前體細(xì)胞到3-D結(jié)構(gòu)的造型生長以及體外和體內(nèi)組織再生意義上的 相鄰過程的誘導(dǎo)行為還不可能。然而，細(xì)胞的誘導(dǎo)生長行為意味著相當(dāng)大的創(chuàng)新，特別是對(duì) 于治療或生物技術(shù)過程。這種由3-D載體基質(zhì)協(xié)助的生長行為應(yīng)該，不僅能夠允許移殖或 結(jié)構(gòu)重建意義上的生長，事實(shí)上還能夠允許從誘導(dǎo)核區(qū)的定向地重新形成。這類過程發(fā)生 在個(gè)體形成中，并建立在預(yù)先存在的結(jié)構(gòu)上。
僅僅知道生長因子，特別是來自胎兒的神經(jīng)元祖先細(xì)胞的生長因子(如白血病抑 制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)或神經(jīng)生 長因子(NGF))使未分化神經(jīng)元增殖階段成為可能。然而，一旦分化完成以后這些因子便失 去作用。 在組織工程中，還存在額外的問題，S卩，使用的是已經(jīng)比胎兒細(xì)胞進(jìn)一步分化的患 者特異性的成體細(xì)胞系統(tǒng)。另外，在傳統(tǒng)應(yīng)用中并不考慮原位或體外的共培養(yǎng)。相反，例如 甚至嘗試在擴(kuò)增肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞時(shí)避免內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的如存在于肝臟中的 共培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈兪遣恍枰?。然而，目前已知在分化培養(yǎng)物中這些所謂的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存 在為分化提供了實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)。 因此需要提供能夠基本上保持細(xì)胞系統(tǒng)生理狀態(tài)并能提供實(shí)質(zhì)性的結(jié)構(gòu)生長的 體外增殖方法和/或體內(nèi)再生方法。 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用生長因子——血小板生成素(TP0)和/或促紅細(xì)胞生成素 (EP0)和/或生長激素(GH)和/或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫 狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)——能夠起始、終止并在結(jié)構(gòu)上指導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化。
令人吃驚的是，這不僅引起了細(xì)胞增殖還誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)過程，特別是通過對(duì)移植物 的就地(原位)誘導(dǎo)作用(例如經(jīng)由所謂的歸巢方法(homing process))引起局部特異分 化和/或定向分化。這意味著這些生長激素既能誘導(dǎo)也能終止這些結(jié)構(gòu)過程(structure process)。 本發(fā)明因此涉及體外增殖和分化細(xì)胞的方法，其中通過使用生長因子TP0和/或 EP0和/或GH，特別是HGH和/或促生長素抑制素和/或LIF和/或CNTF來起始、終止并 在結(jié)構(gòu)上指導(dǎo)細(xì)胞的生長過程。 因此已知，TPO也可以作為例如c-Mpl配體、mpl配體、巨生成素或巨核細(xì)胞生長和 發(fā)育因子，并且除了血小板及其前體細(xì)胞之外，至今未被用于培養(yǎng)例如成體肝細(xì)胞或其它 初級(jí)細(xì)胞。TPO對(duì)于巨核細(xì)胞和血小板的增殖和發(fā)育是必需的，因此對(duì)于血液血小板的形成 也是必需的。TP0以332個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)構(gòu)成產(chǎn)生于肝臟和腎臟。
根據(jù)本發(fā)明能夠使用的其它生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子13 (TGF P)、前列腺素、 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞剌激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素 (TRH)、促性腺激素釋放激素(Gnra)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激 素(ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin和/或血管 升壓素。 除了停止或減少所述生長因子向培養(yǎng)物的供給之外，促生長素抑制素和/或TGF P和/或前列腺素也適合終止本發(fā)明的生長過程。 生長因子在溶液中的單獨(dú)濃度通常約1至100ng/ml，優(yōu)選的是約10至50ng/ml， 特別是約10到20ng/ml。然而，在局部覆蓋的情況下，生長因子的濃度也可以是上述的幾倍。 例如，在內(nèi)分泌器官再生的情況下，生長因子(特別是生長激素釋放激素(GHRH)、 促甲狀腺素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素 (CRH)、促生長素抑制素、多巴胺、抗利尿激素(ADH)和/或催產(chǎn)素)與載體基質(zhì)的相互作用 可能誘導(dǎo)內(nèi)分泌細(xì)胞原位的分化和/或生長。
對(duì)于結(jié)構(gòu)過程可以額外使用催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin禾口 /或血管升壓素。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以額外使用一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選神經(jīng)生長 因子(NGF))和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小 板衍生生長因子(PDGF))。 在內(nèi)皮細(xì)胞存在的情況下還可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)皮化，并由此具有最佳的血液相容性 (hemocompatibility)。 所述生長因子通?？梢酝ㄟ^商業(yè)購買，但也可以通過技術(shù)人員已知的方法基因操 作制備。它們不僅包括天然產(chǎn)生的生長因子，而且也包括基本具有相同的生物活性的生長 因子衍生物或變體。 因此，商購獲得例如CellSystems GmbH， St Katharinen生產(chǎn)的TP0。對(duì)于培養(yǎng) 人成體肝細(xì)胞而言優(yōu)選使用人TPO。另外，TPO和它的變體的制備和表征被描述于例如EP 1201246、W0 95/21919、W095/21920和W0 95/26746中。 合適的TP0變體例如是描述于W0 95/21919的TP0衍生物或描述于W0 95/21920 的等位基因變體或種系同源物，或描述于WO 95/26746和EP 1201246的聚乙二醇化的TP0， 但并不限于這些。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，聚乙二醇化的TPO意指與有機(jī)聚合物(如聚乙二醇、 聚丙二醇、聚氧化烯)連接的TPO衍生物。其它TP0變體還指與TP0具有低于100X序列一 致性但具有優(yōu)選如EP 1201246中所描述的TPO活性的TPO衍生物。TPO衍生物通常與人 TPO(包括其具有TPO活性的片段)具有至少70%的序列一致性，優(yōu)選至少75%，特別是至 少80% ，尤其是至少85% 。特別優(yōu)選的滿足本發(fā)明目的的TPO活性是通過TPO或其變體促 進(jìn)巨核細(xì)胞或巨核細(xì)胞前體增殖、分化和/或成熟為這些細(xì)胞的成血小板產(chǎn)生形式。
EPO也被稱為TPO的胚胎形式，并和它的變體一起被描述于例如EP0148605、 EP 0205564、EP 0209539、EP 0267678或EP 0411678中。 上文詳細(xì)描述的、舉例說明的衍生物和變體也以類似的方式適合于其它所述的生 長因子。 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"生長因子"并不限于天然產(chǎn)生的形式，也包括非天然產(chǎn)生的形 式或者變體或衍生物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"生長因子"不僅包括生長促進(jìn)子也包括生長抑 制子，例如促生長素抑制素、TGF 13和/或前列腺素。通過同時(shí)或相繼的局部高濃度使用 (例如通過水合凝膠或緩慢釋放材料)，這類生長抑制子特別適合抑制或阻止已改變的細(xì) 胞(如腫瘤細(xì)胞)的生長。 本發(fā)明的生長過程在適合特定細(xì)胞的培養(yǎng)物中進(jìn)行。在這方面，該方法可以通過 合適的裝置任選地將生長過程形成的細(xì)胞聚集體打碎、任選地包囊化以及任選地冷凍。
適當(dāng)裝置的實(shí)例是例如具有大小為例如500iim的相交網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的柵格，它具有 能反復(fù)產(chǎn)生新的亞聚集物(subsidiary aggregate)(如肝細(xì)胞的)的效果。這可以有利地 發(fā)生在完全封閉的系統(tǒng)中。特別是可以使用非接觸的、自動(dòng)或手動(dòng)控制的泵系統(tǒng)，此系統(tǒng)例 如由活塞泵組成產(chǎn)生定向流，或者由磁力或管道壓縮空氣產(chǎn)生定向流。在內(nèi)皮細(xì)胞存在的 情況下，可能通過經(jīng)灌注的生物反應(yīng)器中的剪切壓力使內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)匯合于聚集物表面， 這對(duì)于進(jìn)一步的使用可能是有利的。 技術(shù)工人已知適合包囊化的材料，其中例如整合了結(jié)構(gòu)化的形狀或空間，并且使原位生長結(jié)構(gòu)或放大成為可能。無需包囊化的一種替代的可能性是例如內(nèi)皮細(xì)胞存在的情 況下的內(nèi)皮化，并由此達(dá)到最佳的血相容性。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞的生長過程被定點(diǎn)引發(fā)或終止，并接受結(jié)構(gòu)指導(dǎo)，優(yōu) 選的是通過生物基質(zhì)來完成。 在此，生物基質(zhì)被例如一種所述生長因子處理或被所述生長因子的組合以混合物 的形式或相繼被處理。由此即使使用成體細(xì)胞系統(tǒng)，仍能使3-D再生和/或人工指導(dǎo)組織 修復(fù)或組織培養(yǎng)成為可能。 生物基質(zhì)通常是植入物，例如支架、補(bǔ)片(patch)或?qū)Ч堋⒁浦参?，如皮膚移植物 和/或用于細(xì)胞生長的載體材料，如所謂的緩慢釋放材料，如基于如纖維蛋白的水合凝膠 和/或聚合物(如聚交酯或聚羥基鏈烷酸酯)，和/或藻酸鹽、骨替代材料(如磷酸三鈣)、 同種異型、自體或異種無細(xì)胞化或非無細(xì)胞化的組織(如心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動(dòng)脈瓣膜、 皮膚、血管、大動(dòng)脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管(tracea)、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、輸尿管、尿 道或膀胱(例如見EP 0989867或EP1172120)、基質(zhì)(如層粘連蛋白、膠原蛋白IV和/或 Matrigel-基質(zhì)，優(yōu)選飼養(yǎng)層(如膠原蛋白1、3T3和/或MRC-5飼養(yǎng)層，或膠原纖維))。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過技術(shù)人員已知的方法，使用細(xì)胞預(yù)先移殖生物 基質(zhì)，優(yōu)選組織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織，例如 用來自骨髓的成體前體細(xì)胞。通過這種方式可以在體外預(yù)先進(jìn)行體內(nèi)創(chuàng)傷恢復(fù)過程，因此 縮短了體內(nèi)移植后所需的再整合時(shí)間。 根據(jù)本發(fā)明使用的細(xì)胞特別是成體細(xì)胞，即優(yōu)選不再具有胚胎或胎兒表型的初級(jí) 分化細(xì)胞，特別優(yōu)選人成體細(xì)胞。它們的例子有成體祖細(xì)胞、組織特異性細(xì)胞，優(yōu)選造骨細(xì) 胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和/或平滑肌細(xì)胞。 然而，也有可能通過高濃度地同時(shí)或相繼使用生長抑制子(如促生長素抑制素、 TGF 13和/或前列腺素)來抑制或阻止已改變的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)。在這種情況下可以 使用已經(jīng)提及的含有或由此富集了至少一種所述生長抑制子的水合凝膠或緩慢釋放材料， 它們被局部施用或施用在已改變的細(xì)胞的附近。 因此，本發(fā)明方法特別適合成體細(xì)胞的局部特異的或定向的增殖、結(jié)構(gòu)生長和隨 后的分化，和/或骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生，如心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動(dòng)脈瓣膜、皮 膚、血管、大動(dòng)脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、輸尿管、尿道或膀胱。
通過單獨(dú)使用所述生長因子或以混合物或相繼的形式使用所述生長因子的組合， 或與所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)聯(lián)合使用，本發(fā)明的方法也能用于體內(nèi)局部使用，如用于肝 臟再生、心肌再生之類的組織再生或用于糖尿病潰瘍或齒齦之類的皮膚區(qū)域創(chuàng)傷復(fù)原。例 如，TPO可以以水合凝膠如纖維蛋白和/或聚合物(如聚交酯或聚羥基鏈烷酸酯)和/或 藻酸鹽的形式被用于如肝臟的切除表面促進(jìn)肝臟再生，或例如在急性肝衰竭中，在導(dǎo)管的 協(xié)助下經(jīng)由肝門被局部或全身性給藥。因此，所述生長因子可以在肝臟切除或肝組織被除 去之前、之中或之后被使用以協(xié)助肝臟再生。在使用所述生長因子促進(jìn)軟骨再生時(shí)，生長因 子可以被直接注射到膝關(guān)節(jié)。因此，生長因子可能經(jīng)由滑液直接對(duì)新軟骨結(jié)構(gòu)的形成發(fā)揮 作用。 因此本發(fā)明也涉及生長因子TPO和/或EPO禾P /或GH禾P /或促生長素抑制素和 /或LIF和/或CNTF在生產(chǎn)藥物中的用途，該藥物用于治療骨、軟骨、組織和/或內(nèi)分泌
6器官(如實(shí)質(zhì)或非實(shí)質(zhì)器官，特別是心肌、心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動(dòng)脈瓣膜、皮膚、血管、大動(dòng) 脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、miniscus、椎間盤、肝、腸上皮、輸尿管、尿道或膀胱)的 再生，或治療退化性疾病和/或協(xié)助創(chuàng)傷復(fù)原過程，特別是局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和 /或皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷(優(yōu)選為糖尿病潰瘍或齒齦)，和/或用于治療肝臟疾病，特別是肝硬 化、肝炎、急性或慢性肝衰竭，和/或運(yùn)動(dòng)損傷后肌肉組織的創(chuàng)傷復(fù)原、肌肉疾病、骨損傷、 軟組織損傷和/或改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生(如手術(shù)、急性和慢性疾病后)，和/或改善創(chuàng) 傷復(fù)原和組織再生(如手術(shù)、急性和慢性紊亂后)，和/或剌激血管新生或再生以治療缺血 性心肌病癥，和/或治療受傷和外傷后的缺血，和/或緊隨組織損傷后的再生，如心肌梗塞 或血栓(中樞或外周)可能導(dǎo)致的隨后缺血。在這種情況下，給予EPO使血管新生以及隨 后或伴隨的組織再生成為可能。 在一特定的實(shí)施方案中，用作生長因子的還有轉(zhuǎn)化生長因子13 (TGF P)、前列腺 素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞剌激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素 (TRH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激 素(ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin和/或血管 升壓素，或加上一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF)和/或一種或多種血管 再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍生生長因子(PDGF))。
描述于本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案以類似的方式也適用于本發(fā)明所描述的用途。
進(jìn)一步的可能性是含有生長因子TP0、 EP0、 GH，特別是HGH、促生長素抑制素、LIF 和/或CNTF的至少一種的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，用作為擴(kuò)增階段中3-D生長和/或再生的 誘導(dǎo)性底物，或用于誘導(dǎo)擴(kuò)增階段后的分化，或者用于阻滯生長。例如，至少一種所述生長 因子可以與上述例舉描述的所謂緩慢釋放材料組合被涂敷于支架上。
因此本發(fā)明還進(jìn)一步涉及生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，它們包含生長因子血小板生成素 (TP0)、促紅細(xì)胞生成素(EP0)、生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)、促生長素抑制素、 白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)中的至少一種，其中這種生物基質(zhì) 或載體結(jié)構(gòu)也可以另外包含生長因子TGF P 、前列腺素、GM-CSF、 GHRH、 TRH、 GnRH、 CRH、多 巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin和/或血 管升壓素中的至少一種，任選地還可以含有一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選神經(jīng)生長因子 (NGF))和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板衍 生生長因子(PDGF))。 本發(fā)明生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是例如植入物、移植物和/或細(xì)胞生長的載體材料， 該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)可能是支架、導(dǎo)管、皮膚、水合凝膠、骨替代材料、同種異型、自體或 異種無細(xì)胞化或非無細(xì)胞化的組織、合成的組織、飼養(yǎng)層或纖維片(fabric)，如膠原、層粘 連蛋白和/或纖連蛋白形成的纖維片(具有或不具有合成的或其它類型的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(如塑 料或生物基質(zhì))。上文已經(jīng)描述了示范性的實(shí)施方案。 所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是，如上文已經(jīng)詳細(xì)描述的，優(yōu)選已使用組織特異性細(xì) 胞、前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織進(jìn)行了預(yù)移殖的，或用于體內(nèi)移 殖或誘導(dǎo)性重建已體外準(zhǔn)備好的。 所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)也可以是被含有至少一種所述生長因子的(生物)聚合 物層包覆的。例如纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯適用于(生物)聚合物層。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的方法，其中未活化或經(jīng)活化的、 經(jīng)生長因子TP0、 EP0、 GH(特別是HGH)、促生長素抑制素、LIF和/或CNTF中的至少一種 包覆的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其中所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)可以任選地被額外的生長因子 TGF P 、前列腺素、GM-CSF、 GHRH、 TRH、 GnRH、 CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮 質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種包覆，并且任選地 還可額外的被一種或多種神經(jīng)再生因子(優(yōu)選NGF)和/或一種或多種血管再生因子(優(yōu) 選VEGF和/或PDGF)包覆。 生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的活化可例如通過等離子離子化(如使用過氧化氫)或激光 活化的方式進(jìn)行。 其它的可能性是使用含有所述生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層進(jìn)行包 覆。在此合適的實(shí)例是纖維蛋白、血漿、血液、膠原和/或聚交酯。 本發(fā)明方法中同樣可以使用細(xì)胞在體外對(duì)生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)移殖，優(yōu)選
使用組織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織。 以上描述的優(yōu)選的本發(fā)明特征或特征性實(shí)例以類似的方式適合于本發(fā)明的生產(chǎn)方法。 本發(fā)明也延伸至實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的裝置，其中優(yōu)選為灌注生物反應(yīng)器(perfused
bioreactor)，特別是封閉形式的灌注生物反應(yīng)器。 以下實(shí)施例意圖詳細(xì)解釋本發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明不具限制性。
實(shí)施例 1.骨再生 制備具有例如大于15 ii m的微孔性的單相13磷酸三鈣顆粒，并以3-D空缺形狀成 形，該3-D空缺形狀符合患者的需要。這通常通過燒結(jié)方法進(jìn)行。隨后通過等離子離子化 處理該材料，以便產(chǎn)生表面的活化，并將該構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素 和/或生長激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精細(xì)地包覆?；蛘撸梢栽跊]有事先進(jìn)行 表面活化的情況下在溶液中孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物 層包覆。在這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。 然后將該構(gòu)建物立即放入空缺中，或使用組織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞或骨髓細(xì)胞
進(jìn)行體外預(yù)移殖。這實(shí)現(xiàn)了在體外預(yù)先進(jìn)行體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程，并由此縮短了 (例如7天之
后)體內(nèi)植入后的再整合時(shí)間?？梢耘c神經(jīng)再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)
聯(lián)合使用。在此與結(jié)構(gòu)形成因子聯(lián)用并且考慮環(huán)境因素是令人感興趣的。 在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細(xì)胞的骨髓的整合、造骨細(xì)胞分化速率的增加
以及載體基質(zhì)吸收和被正常骨骼取代的速率增加。通過重構(gòu)能力和誘導(dǎo)特征實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異
性整合。 可以通過已經(jīng)在體外用骨膜于外側(cè)進(jìn)行覆蓋移殖的方式進(jìn)一步促進(jìn)整合。
2.心臟瓣膜再生和尿道構(gòu)建物的產(chǎn)生 使用血小板生成素和促紅細(xì)胞生成素作為生長因子對(duì)生物基質(zhì)進(jìn)行預(yù)包覆。該生 物基質(zhì)包括具有和不具有細(xì)胞化的同種異型或自體心臟瓣膜，由塑料制成的合成載體結(jié) 構(gòu)(其在膠原的化學(xué)組成和空間排列方面與目的心血管組織的生理微環(huán)境相似)。
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然后通過等離子離子化(如使用過氧化氫H202)處理該材料，同時(shí)達(dá)到滅菌作用， 以便產(chǎn)生表面的活化，并將該構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素和/或生長 激素(GH)的溶液中，由此以微小的量精細(xì)地包覆?；蛘撸梢栽跊]有事先進(jìn)行表面活化的 情況下在溶液中孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。在 這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。 然后將該構(gòu)建物立即置入需要的位置(心臟瓣膜位置，作為補(bǔ)片或血管替代物)， 或使用組織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞或骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外預(yù)移殖。這實(shí)現(xiàn)了在體外預(yù)先進(jìn)行 體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程，并由此縮短了 (例如7天之后)體內(nèi)植入后的再整合時(shí)間?？梢耘c神 經(jīng)再生因子(NGF)或血管再生因子(VEGF、PDGF)聯(lián)合使用，但這并不是絕對(duì)必需的。
在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細(xì)胞的骨髓的整合、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞 分化速率的增加以及載體基質(zhì)吸收和被正常心血管組織取代的速率增加。通過重構(gòu)能力和 誘導(dǎo)特征實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合。 可以通過已經(jīng)在體外使用內(nèi)皮細(xì)胞于外側(cè)進(jìn)行覆蓋移殖的方式進(jìn)一步促進(jìn)整合。 可以通過相應(yīng)的方式制備尿道構(gòu)建物。 3.在具有非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)物中進(jìn)行成體肝細(xì)胞增殖 向培養(yǎng)基上清加入濃度為10-50ng/ml的TPO和/或EPO和/或生長激素(如HGH) 以處理來自活檢組織或部分切除物的混合肝細(xì)胞群體。接種細(xì)胞的密度是10000細(xì)胞/ cm。匯合之后，在加入2g/1的白蛋白或自體血清(10-20%)的情形下，用0.005%的膠原 酶和0.01%胰蛋白酶處理5小時(shí)。然后吹落細(xì)胞，并在培養(yǎng)基(Williams E(Williams等人 (1971)E鄧tl.Ce11 Res. ，69,106)中用含有2g/l白蛋白清洗3次，然后將細(xì)胞置于膠原包 覆的培養(yǎng)皿上沉淀。 通過用胞外基質(zhì)覆蓋可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分化。
或者通過攪拌阻止細(xì)胞沉淀，并使它們聚在一起。 為了防止在生長過程中形成過大的聚集物，可以使細(xì)胞通過具有大小為500iim 的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的柵格裝置，以便可以反復(fù)產(chǎn)生新的亞聚集物。這可以在完全封閉的系統(tǒng)中進(jìn) 行。理想地，可以使用非接觸的泵系統(tǒng)(無蠕動(dòng)系統(tǒng)的擠壓，而是由磁力或管道壓縮空氣產(chǎn) 生定向流，或者活塞泵——自動(dòng)或手動(dòng))。 然后可以將細(xì)胞包囊化和冷凍?？梢栽诎医Y(jié)構(gòu)中整合進(jìn)結(jié)構(gòu)化的形狀和空間， 這使原位結(jié)構(gòu)生長和擴(kuò)大成為可能。 或者，可以免于進(jìn)行包囊，通過在該系統(tǒng)中存在內(nèi)皮細(xì)胞以及靶向的加入這些細(xì) 胞以實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化，并因此達(dá)到最佳的血相容性。 灌注生物反應(yīng)器中的剪切力導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞在聚集物表面自發(fā)匯合。當(dāng)達(dá)到所需大 小時(shí)，可以將它們冷凍在例如適合用于培養(yǎng)的袋中。4.軟組織(肌肉片、神經(jīng)、腱)
為了重建腹壁缺損，相應(yīng)于上文可以制備膠原片或纖維片(如層粘連蛋白、具有 或不具有合成或其它類型基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)(如塑料或生物基質(zhì))的纖連蛋白)，或具有限定空間的 結(jié)構(gòu)(神經(jīng)管、腱)。這些膠原片或結(jié)構(gòu)被成形，并用TPO、 EPO和/或生長激素(GH)包覆 和植入或用目的組織的細(xì)胞(如跟腱細(xì)胞、神經(jīng)元)預(yù)移殖。 使用血小板生成素和促紅細(xì)胞生成素作為生長因子對(duì)生物基質(zhì)進(jìn)行預(yù)包覆。該生 物基質(zhì)包括具有和不具有細(xì)胞化的同種異型或自體心臟瓣膜，由塑料制成的合成載體結(jié)構(gòu)(其在膠原的化學(xué)組成和其空間排列方面與目的組織的生理微環(huán)境相似)。
在這之前或之后，通過等離子離子化(如使用過氧化氫H202)處理該材料，同時(shí)達(dá) 到滅菌作用，以便產(chǎn)生表面的活化，將構(gòu)建物置于具有血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素和/ 或生長激素的溶液中，由此以微小的量精細(xì)地包覆?；蛘撸梢栽跊]有事先進(jìn)行表面活化的 情況下在溶液中進(jìn)行孵育，或用含有這些生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。 在這種情況下可使用纖維蛋白、血漿、膠原和/或聚交酯。 然后將構(gòu)建物立即引入需要的位置(腹壁、心肌、骨骼肌片)，或使用組織特異性 細(xì)胞、前體細(xì)胞或骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外預(yù)移殖。這實(shí)現(xiàn)了在體外預(yù)先進(jìn)行體內(nèi)創(chuàng)傷復(fù)原過程， 并由此縮短了 (例如7天之后)體內(nèi)植入后的再整合時(shí)間?？梢耘c神經(jīng)再生因子(NGF)或 血管再生因子(VEGF、PDGF)聯(lián)合使用，但這并不是絕對(duì)必需的。 在體內(nèi)和體外都存在造血和富集干細(xì)胞的骨髓的整合、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞 分化速率的增加以及載體基質(zhì)吸收和被正常心血管組織取代速率的增加。通過重構(gòu)能力和 誘導(dǎo)特征實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合。 可以通過已經(jīng)在體外使用角質(zhì)細(xì)胞(腹肌)、Schwann' s細(xì)胞和/或纖維組織于 外側(cè)進(jìn)行覆蓋移殖的方式進(jìn)一步促進(jìn)整合。
5.組織的體內(nèi)再生
a)肝臟 肝臟被部分切除后，通過與聚合物聯(lián)合施用于切除表面而將EP0全身性地和/或 局部地施用于患者。聚合物可以是生物聚合物如纖維蛋白(如來自纖維蛋白膠)、聚合血 漿、聚合血液或生物粘附劑(如貝類粘附劑)。但是也可以是人工合成的或是生物凝膠和水 合凝膠。EPO也可被引入用于止血的纖維片(如膠原纖維片、填篩物(Tamponade)、機(jī)織織 物和編織物)。 通過EP0的作用，肝臟在兩周內(nèi)恢復(fù)到原來的體積。這不僅涉及肝細(xì)胞的增殖，還
涉及一個(gè)協(xié)同生長過程，其中血管、膽管和囊狀結(jié)構(gòu)生長恢復(fù)原來的大小。 可以在30種動(dòng)物中表明，肝臟的所述再生顯著好于(沒有提供EP0的)對(duì)照動(dòng)物。 EPO也可以在慢性肝疾病(如硬化、纖維化、肝炎)中被用于肝臟再生。因此可以
首次獲得對(duì)于肝實(shí)質(zhì)的治療效果。 b)腸炎疾病 局限性回腸炎的患者在腸上皮區(qū)域出現(xiàn)創(chuàng)傷復(fù)原障礙。更深層的組織結(jié)構(gòu)可能也
參與炎癥反應(yīng)。在這些患者中，全身性或局部使用EPO導(dǎo)致腸上皮通過再生而復(fù)原。局部
施用可通過腸區(qū)緩釋膠囊或施予使用凝膠的栓劑或使用溶液局部注入而實(shí)現(xiàn)。 通過使用聚乙二醇化(PEG)的化合物可以使局部的血管區(qū)域的吸收最佳化，以便
在發(fā)炎區(qū)域的局部給藥實(shí)現(xiàn)整體的效果，并由此實(shí)現(xiàn)引發(fā)創(chuàng)傷復(fù)原過程。 貧血的存在被看作是局限性回腸炎患者的診斷陽性指標(biāo)。過去認(rèn)為貧血是獨(dú)立的
伴隨性病癥或是由于吸收問題導(dǎo)致的消瘦。我們的研究表明創(chuàng)傷復(fù)原障礙涉及內(nèi)源EPO的
不足。因此通過使用外源EPO可能高度選擇性的治療局限性回腸炎。也可以進(jìn)一步應(yīng)用于
潰瘍性結(jié)腸炎領(lǐng)域。 c)皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷復(fù)原障礙 糖尿病潰瘍患者具有營養(yǎng)障礙，它們導(dǎo)致通常在腿部區(qū)域的傷口愈合困難。由于
10基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)組織的再生能力受限。在這些病例中，通過全身性或局部使用EP0誘導(dǎo) 創(chuàng)傷復(fù)原。已證明清創(chuàng)術(shù)中對(duì)底層粗糙處理后使用EPO是有利的。氯化鈣誘導(dǎo)的多聚化作 用與EP0聯(lián)合導(dǎo)致EP0整合入血凝塊，從而形成一種局部緩釋制劑?；蛘撸珽PO也可以與纖 維蛋白膠或纖維片或包裹EPO的填篩物(如膠原纖維片)聯(lián)合施用。 對(duì)于所有的其它創(chuàng)傷復(fù)原需要(如運(yùn)動(dòng)損傷后的肌肉區(qū)域、肌肉疾病、骨損傷、軟 組織損傷)和一般的改善創(chuàng)傷復(fù)原和組織再生(如術(shù)后、急性和慢性疾病)，可以以相似的 方式使用EP0。 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式如下 1.進(jìn)行體外細(xì)胞增殖和分化的方法，其特征在于通過使用生長因子血小板生成素 (TP0)和/或促紅細(xì)胞生成素(EPO)，和/或生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)，和/ 或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)起始和 終止細(xì)胞的生長過程，并對(duì)細(xì)胞的生長過程進(jìn)行結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。 2.項(xiàng)目1的方法，其特征在于還使用轉(zhuǎn)化生長因子13 (TGF P)、前列腺素、粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞剌激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、 促性腺激素釋放激素(Gnra)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿激素 (ADH)、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin和/或血管升 壓素作為生長因子。 3.項(xiàng)目l或2的方法，其特征在于還使用一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選神經(jīng)生長 因子(NGF)，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和/或血小板 衍生生長因子(PDGF)。 4.項(xiàng)目1到3中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于此方法在內(nèi)皮細(xì)胞存在下進(jìn)行。
5.項(xiàng)目l到4中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于細(xì)胞的生長過程被局部引發(fā)和終止， 并被結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。 6.項(xiàng)目5的方法，其特征在于通過生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)來對(duì)細(xì)胞的生長過程進(jìn)行 局部引發(fā)或終止和結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。 7.項(xiàng)目6的方法，其特征在于使用一種所述生長因子處理所述生物基質(zhì)或載體結(jié) 構(gòu)，或用所述生長因子的組合以混合物形式或相繼的形式處理所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。
8.項(xiàng)目6或7的方法，其特征在于植入物、移植物和/或載體材料被用作細(xì)胞生長 的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。 9.項(xiàng)目1到8中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于使用細(xì)胞，優(yōu)選組織特異性細(xì)胞、前
體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織對(duì)生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)移殖，
或該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)已被體外制備，以用于體內(nèi)移殖或誘導(dǎo)性重建。 10.項(xiàng)目l到9中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于使用的細(xì)胞是成體祖細(xì)胞和/或組
織特異性細(xì)胞，優(yōu)選造骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和/或平滑肌細(xì)胞。 11.項(xiàng)目l到10中至少一項(xiàng)的方法，其用于成體細(xì)胞的局部特異和/或定向增殖、 結(jié)構(gòu)生長和隨后的分化，和/或用于骨、組織和/或內(nèi)分泌器官的再生。
12.項(xiàng)目1到4中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于通過合適的裝置任選地打碎細(xì)胞在 生長過程中形成的聚集物，并且任選地進(jìn)行包囊化和任選地冷凍。 13.生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其含有生長因子TPO、 EP0、 GH，特別是HGH、促生長素抑
11制素、LIF和/或CNTF中的至少一種。 14.項(xiàng)目13的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其還含有生長因子TGF P 、前列腺 素、GM-CSF、 GHRH、 TRH、 GnRH、 CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、 beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種，并且任選地，還含有一種 或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選NGF，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選VEGF和/或PDGF。
15.項(xiàng)目13或14的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于該生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是用 作細(xì)胞生長的植入物、移植物和/或載體材料。 16.項(xiàng)目13到15中任一項(xiàng)的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于該生物基質(zhì)或載體 結(jié)構(gòu)是支架、補(bǔ)片、導(dǎo)管、皮膚、水合凝膠、骨替代材料、同種異型、自體或異種無細(xì)胞化或非 無細(xì)胞化的組織、合成組織、飼養(yǎng)層或纖維片。 17.項(xiàng)目13到16中任一項(xiàng)的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于使用細(xì)胞，優(yōu)選組 織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織對(duì)該生物基質(zhì)或載 體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)移殖。 18.項(xiàng)目13到17中任一項(xiàng)的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)，其特征在于此生物基質(zhì)或載體
結(jié)構(gòu)被含有至少一種所述生長因子的生物可降解的(生物)聚合物層包覆。
19.項(xiàng)目13到18中任一項(xiàng)的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)方法，其特征在于任選 活化的生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)被生長因子TP0、 EP0、 GH，特別是HGH、促生長素抑制素、LIF和 /或CNTF中的至少一種包覆。 20.項(xiàng)目19的方法，其特征在于所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)還被另外的生長因子 TGF P 、前列腺素、GM-CSF、 GHRH、 TRH、 GnRH、 CRH、多巴胺、ADH、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮 質(zhì)激素、beta-celltropin、 lutrotropin和/或血管升壓素中的至少一種包覆，任選地還 被一種或多種神經(jīng)再生因子，優(yōu)選NGF，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選VEGF和/或 PDGF包覆。 21.項(xiàng)目19或20的方法，其特征在于通過等離子離子化或激光活化的方式活化所 述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。 22.項(xiàng)目19到21中至少一項(xiàng)的方法，其特征在于使用細(xì)胞，優(yōu)選組織特異性細(xì)胞、 前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、外周血、脂肪組織和/或纖維組織在體外對(duì)所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu) 進(jìn)行預(yù)移殖。 23. —種用于實(shí)施項(xiàng)目1到12和項(xiàng)目19到22中至少一項(xiàng)的方法的裝置。
24.項(xiàng)目23的裝置，其特征在于此裝置是灌注生物反應(yīng)器，優(yōu)選封閉系統(tǒng)的形式。
25.生長因子TPO和/或EPO和/或GH和/或促生長素抑制素和/或LIF和/ 或CNTF在生產(chǎn)藥物中的用途，其中該藥物用于治療骨、軟骨、組織和/或內(nèi)分泌器官，特別 是心肌、心臟瓣膜、靜脈瓣膜、動(dòng)脈瓣膜、皮膚、血管、大動(dòng)脈、腱、角膜、軟骨、骨、氣管、神經(jīng)、 miniscus、椎間盤、肝臟、腸上皮、輸尿管、尿道或膀胱的再生，或用于治療退化性疾病和/ 或協(xié)助創(chuàng)傷復(fù)原過程，特別是局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎和/或皮膚區(qū)域的創(chuàng)傷，優(yōu)選糖 尿病潰瘍或齒齦，和/或用于治療肝臟疾病，特別是治療肝硬化、肝炎、急性或慢性肝衰竭， 和/或運(yùn)動(dòng)損傷、肌肉疾病、骨損傷、軟組織損傷后肌肉組織的創(chuàng)傷復(fù)原，和/或用于改善創(chuàng) 傷復(fù)原和組織再生，如手術(shù)、急性和慢性疾病和/或缺血性心肌疾病后，以剌激血管新生和 再生，和/或用于治療受傷和外傷后的缺血，和/或促進(jìn)組織損傷后的再生。
12
26.如項(xiàng)目25中的用途，其特征在于還另外使用轉(zhuǎn)化生長因子13 (TGF P)、前列 腺素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞剌激因子(GM-CSF)、生長激素釋放激素(GHRH)、促甲狀腺素釋放激 素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnPH)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、多巴胺、抗利尿 激素、催產(chǎn)素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素、beta-celltropin、lutrotropin和/或血管升壓 素作為生長因子。 27.如項(xiàng)目25或26中的方法，其特征在于還另外使用一種或多種神經(jīng)再生因子， 優(yōu)選神經(jīng)生長因子(NGF)，和/或一種或多種血管再生因子，優(yōu)選血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 和/或血小板衍生生長因子(PDGF)。
1權(quán)利要求
促紅細(xì)胞生成素(EPO)或其生物活性衍生物用于制備在創(chuàng)傷復(fù)原過程中局部治療皮膚的藥物的用途。
2. 權(quán)利要求1的用途，其用于治療齒齦。
3 權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于將EPO應(yīng)用于生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)。
4. 權(quán)利要求3的用途，其中所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)是移植物、植入物、支架、補(bǔ)片、皮 膚、水合凝膠或骨髓替代材料。
5. 權(quán)利要求4的用途，其中所述生物基質(zhì)是水合凝膠。
6. 權(quán)利要求3的用途，其中使用組織特異性細(xì)胞、前體細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、纖維組織或外 周血對(duì)所述生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)移殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及在生長因子和生物基質(zhì)或載體結(jié)構(gòu)存在下進(jìn)行細(xì)胞增殖和分化的方法和裝置。具體而言，本發(fā)明涉及細(xì)胞增殖和分化的體內(nèi)和體外方法，其中通過使用生長因子——血小板生成素(TPO)和/或促紅細(xì)胞生成素(EPO)，和/或生長激素(GH)，特別是人生長激素(HGH)，和/或促生長素抑制素和/或白血病抑制因子(LIF)和/或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)——來起始或終止細(xì)胞生長過程，并對(duì)細(xì)胞生長過程進(jìn)行結(jié)構(gòu)性指導(dǎo)。本發(fā)明也涉及含有前述生長因子的生物基質(zhì)和載體結(jié)構(gòu)，以及制造它們并實(shí)行本發(fā)明方法的裝置和方法。
文檔編號(hào)A61L27/54GK101766809SQ20091022492
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月20日
發(fā)明者A·巴德 申請(qǐng)人:奧古斯蒂努斯·巴德