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一種增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法

文檔序號:415425閱讀:679來源:國知局
專利名稱:一種增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法
技術領域
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域,具體涉及一種增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法。
背景技術
:民以食為天,食品安全已經(jīng)成為國內(nèi)外關注的熱點之一。不可否認食品中添加的各種防腐劑對食品防腐保鮮起了重要作用,促進了食品工業(yè)的發(fā)展,可以說現(xiàn)代食品工業(yè)離不開防腐劑,但傳統(tǒng)使用的化學合成防腐劑對人體有一定潛在危害,如硝酸鹽及亞硝酸鹽具有致癌性,常用的苯甲酸及其鹽、山梨酸及其鹽也有一定毒性,為提高食品的安生性,使用天然、安全、綠色防腐劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學合成防腐劑是今后發(fā)展的必然趨勢,是解決和提高食品安全的必然選擇。ε-聚賴氨酸是鏈霉菌(Streptomyces)生物合成的胞外次級代謝產(chǎn)物,通常由25-35個L-賴氨酸殘基組成的,通過α-ε酰胺鍵連接,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、絲狀真菌均具有一定抑制作用,對病毒也有一定抑制作用。ε -聚賴氨酸具有對人體安全無毒、可生物降解等優(yōu)點,因此,ε -聚賴氨酸是替代傳統(tǒng)化學合成防腐劑的理想選擇,引起了人們的高度重視。美國FDA批準了 ε-聚賴氨酸的GRAS (認為安全)地位。目前,ε_聚賴氨酸已經(jīng)在日本、韓國、美國等國家作為食品防腐劑得到應用。ε -聚賴氨酸作為食品防腐劑有諸多的優(yōu)勢,因此在食品工業(yè)中有極大的潛在需求。目前,微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的惟一方法,但其發(fā)酵過程中存在一個顯著制約因素,即液體深層發(fā)酵時ΡΗ4.0或以下是ε -聚賴氨酸生物合成所必須的條件,但低pH不利于細胞生長,因此,通常培養(yǎng)條件下難以獲得高細胞密度,這不利于提高發(fā)酵產(chǎn)率,針對這些狀況,研究人員提出了兩階段PH控制發(fā)酵工藝,即當發(fā)酵過程pH下降至5.0時,將pH控制在5.0 一段時間,以利于細胞生長,為階段I ;然后讓其pH自然下降,降至4.0時,控制pH在4.0以利ε-聚賴氨酸合成,為階段2。兩階段pH控制ε -聚賴氨酸發(fā)酵可參見附圖1,該工藝已廣泛應用于ε-聚賴氨酸的工業(yè)發(fā)酵。但該工藝在階段I及先前生長細胞由于PH過高細胞不能合成ε -聚賴氨酸,而在人為延長的階段I細胞活性可能損失,這會影響細胞ε -聚賴氨酸合成能力,此外,由于合成階段pH較低,細胞密度仍然難以根本提高,基于這些不足,研發(fā)更有效的發(fā)酵工藝,尤其是提高細胞生長和細胞活性的發(fā)酵工藝十分必要
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的是提供一種增強細胞生長及生物過程效率的ε -聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法。本發(fā)明的增強細胞生長及生物 過程效率的ε -聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,包括以下步驟:
ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌用其發(fā)酵培養(yǎng)基對其進行發(fā)酵培養(yǎng),當培養(yǎng)體系的pH值下降至3.6^4.1之間時,按照每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.025g、.5g酵母粉或其他有機氮源至培養(yǎng)體系中直至發(fā)酵結(jié)束,同時自PH降至3.6^4.1之間開始,用氨水控制培養(yǎng)體系的PH維持在3.6^4.1之間直至發(fā)酵結(jié)束,并補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為5 30g/L直至發(fā)酵結(jié)束。所述的補料培養(yǎng)基優(yōu)選每升含有800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水。進一步優(yōu)選,所述的當培養(yǎng)體系的pH值下降的pH值為3.9,所述的自pH值降至是降至3.9開始,用氨水控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.9直至發(fā)酵結(jié)束,所述的并補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為5 30g/L直至發(fā)酵結(jié)束是自當培養(yǎng)體系的葡萄糖低于10g/L時,自動補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為10g/L直至發(fā)酵結(jié)束。所述的ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌指的是能夠產(chǎn)生ε -聚賴氨酸的鏈霉菌,使用的發(fā)酵培養(yǎng)基是ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基,本領域技術人員可以根據(jù)本領域的常規(guī)知識去選擇ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌以及與其相配套的發(fā)酵培養(yǎng)基,所述的ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌優(yōu)選為不吸水鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus) str_8。 所述的其他氮源優(yōu)選為豆餅粉或王米漿等。所述的氨水優(yōu)選為10% (w/w)的氨水。本發(fā)明的增強細胞生長及生物過程效率的ε -聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法通過補加酵母粉以提高細胞生長和活性,使細胞持續(xù)生長、顯著提高細胞密度、增強細胞活性,由于發(fā)酵過程細胞生長及ε -聚賴氨酸生物合成利用大量葡萄糖,因此在發(fā)酵過程中補加葡萄糖和硫酸銨,使ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌能持續(xù)的合成ε-聚賴氨酸。與現(xiàn)有技術的兩階段PH控制發(fā)酵相比,本發(fā)明的細胞較快的進入ε-聚賴氨酸合成階段,避免了細胞進入合成階段前細胞活性的損失,延長了細胞合成ε-聚賴氨酸的時間,從而顯著提高細胞ε-聚賴氨酸合成能力,克服了兩階段PH控制發(fā)酵的不足,使得ε -聚賴氨酸產(chǎn)率顯著提高,該發(fā)酵方法具有適用廣泛,易于操作的特征。


:圖1是ε -聚賴氨酸補料分批發(fā)酵兩階段pH控制示意圖I表示pH控制階段I,pH為5.0 ; II表示pH控制階段2,pH為3.9。圖2是本發(fā)明的增強細胞生長及生物過程效率的ε -聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法的一階段PH控制結(jié)合酵母粉補加的示意圖;YE表示酵母粉;I表示pH控制階段,pH為3.9。
具體實施方式
:實施例1:1、孢子制備將新鮮的ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌不吸水 鏈霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)str-8(該菌于2011年6月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址:中國武漢武漢大學,保藏編號為:CCTCC NO:M2011191,該菌種的保藏信息公開于專利號為:ZL201110152802.0,發(fā)明名稱為:不吸水鏈霉菌Str_8及利用制備ε -聚賴氨酸及其鹽的方法的專利中)斜面菌種多次劃線接種于燕麥瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)中,30° C、倒置培養(yǎng)7天,以無菌水洗滌收集成熟的孢子,制備孢子懸浮液,作為接種物,通常情況下可獲得孢子懸浮液濃度約5X108CFU/mL。燕麥瓊脂培養(yǎng)基(ISP3)的制備:稱取40g燕麥,經(jīng)去離子水洗滌后置于IL裝有800mL去離子水的燒杯中,加熱煮沸l(wèi)Omin,紗布過濾,棄渣,將15_20g瓊脂置入過濾液中,加熱充分溶解后定容至1L,121° C滅菌30min。2、種子培養(yǎng)將IOmL孢子懸浮液(約為5 X IO8孢子/mL)接種于裝有500mL M3G培養(yǎng)基(IOOOmL搖瓶)中,溫度30° C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)20h作為種子液。M3G 培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖 30 ;酵母粉 5 ; (NH4) 2S047 ;FeS04.7Η200.03 ;MgSO4.7Η200.5 ;ZnSO4.7Η200.04 ;Κ2ΗΡ040.8 ;KH2PO41.36 ;ρΗ7.2。IX IO5Pa 滅菌 30min。3、發(fā)酵罐的補料分批發(fā)酵工藝 取150mL種子液接種于滅菌的2.85L M3G培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐),溫度為30° C,轉(zhuǎn)速為300r/min,通氣為lvvm,當發(fā)酵過程出現(xiàn)泡沫時,在線添加消泡劑自動消泡。發(fā)酵罐接種種子液后,當培養(yǎng)體系中的發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降至約為3.9時,此時施以質(zhì)量分數(shù)10%氨水在線控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.9的水平至發(fā)酵終點,即一階段pH控制;并在PH降至3.9時始持續(xù)流加滅菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.042g酵母粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束,以提高細胞生長和活性。發(fā)酵過程pH控制及酵母粉補加參見附圖2。發(fā)酵過程細胞生長及聚賴氨酸生物合成利用大量葡萄糖,當培養(yǎng)體系的葡萄糖濃度下降至約為10g/L時,自動流加滅過菌的葡萄糖與硫酸銨的補料培養(yǎng)基(每升含800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水)使培養(yǎng)體系的葡萄糖維持約為10g/L直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵IOd結(jié)束時ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達5.23g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為3.74g/L,因此,本發(fā)明的方法顯著提高了 ε -聚賴氨酸的產(chǎn)率。實施例2:1、孢子制備和種子液培養(yǎng)同實施例1,由此得到種子液。2、發(fā)酵罐的補料分批發(fā)酵工藝取150mL種子液接種于滅菌的2.85L M3G培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐),溫度為30° C,轉(zhuǎn)速為300r/min,通氣為lvvm,當發(fā)酵過程出現(xiàn)泡沫時,在線添加消泡劑自動消泡。發(fā)酵罐接種種子液后,當培養(yǎng)體系中的發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降至約為3.6時,此時施以質(zhì)量分數(shù)10%氨水在線控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.6^4.1之間的水平至發(fā)酵終點,即一階段PH控制;并在pH降至3.6時始持續(xù)流加滅菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.025g酵母粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束,以提高細胞生長和活性。發(fā)酵過程細胞生長及聚賴氨酸生物合成利用大量葡萄糖,當培養(yǎng)體系的葡萄糖濃度下降至約為5g/L時,自動流加滅過菌的葡萄糖與硫酸銨的補料培養(yǎng)基(每升含800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水)使培養(yǎng)體系的葡萄糖維持約為5g/L直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵IOd結(jié)束時ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達5.17g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為3.74g/L,因此,本發(fā)明的方法顯著提高了 ε -聚賴氨酸的產(chǎn)率。實施例3:1、孢子制備和種子液培養(yǎng)同實施例1,由此得到種子液。2、發(fā)酵罐的補料分批發(fā)酵工藝取150mL種子液接種于滅菌的2.85L M3G培養(yǎng)基中(5L發(fā)酵罐),溫度為30° C,轉(zhuǎn)速為300r/min,通氣為lvvm,當發(fā)酵過程出現(xiàn)泡沫時,在線添加消泡劑自動消泡。發(fā)酵罐接種種子液后,當培養(yǎng)體系中的發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降至約為4.1時,此時施以質(zhì)量分數(shù)10%氨水在線控制培養(yǎng)體系的pH維持在4.1的水平至發(fā)酵終點,即一階段pH控制;并在PH降至4.1時始持續(xù)流加滅菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.5g酵母粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束,以提高細胞生長和活性。發(fā)酵過程細胞生長及ε -聚賴氨酸生物合成利用大量葡萄糖,當培養(yǎng)體系的葡萄糖濃度下降至約為30g/L時,自動流加滅過菌的葡萄糖與硫酸銨的補料培養(yǎng)基(每升含800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水)使培養(yǎng)體系的葡萄糖維持約為30g/L直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵IOd結(jié)束時ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達7.51g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為3.74g/L,因此,本發(fā)明的方法顯著提高了 ε -聚賴氨酸的產(chǎn)率。實施例4:本實施例與實施例1基本相同,只是在培養(yǎng)體系的pH降至3.9時始持續(xù)流加滅菌的豆餅粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.042g豆餅粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束,其他步驟相同。 發(fā)酵IOd結(jié)束時ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達5.07g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為3.74g/L,因此,本發(fā)明的方法顯著提高了 ε -聚賴氨酸的產(chǎn)率。實施例5:1、孢子制備和種子液培養(yǎng)同實施例1,由此得到種子液。2、取IL (5%,ν/ν)種子液接種于滅菌的19L M3G培養(yǎng)基(30L發(fā)酵罐),溫度為30° C,轉(zhuǎn)速為300r/min,通氣為lvvm,當發(fā)酵過程出現(xiàn)泡沫時,在線添加消泡劑自動消泡。向發(fā)酵罐接種種子液后,當培養(yǎng)體系中的發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降至約為3.9時,此時施以10% (w/w)氨水在線控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.9的水平至發(fā)酵終點,并在PH3.9時始持續(xù)流加滅菌的酵母粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.025g酵母粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程細胞生長及聚賴氨酸生物合成利用大量葡萄糖,當培養(yǎng)體系中的葡萄糖下降至約為10g/L時,自動流加滅過菌的含葡萄糖與硫酸銨的補料培養(yǎng)基(每升含800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水)使培養(yǎng)體系的葡萄糖維持約為10g/L至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵13day結(jié)束時,發(fā)酵液中ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達28.2g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為16.3g/L,因此,本發(fā)明的方法顯著提高了 ε-聚賴氨酸的產(chǎn)率。實施例6:本實施例與實施例5基本相同,只是在培養(yǎng)體系中的發(fā)酵培養(yǎng)基pH下降至約為
3.9時,持續(xù)流加滅菌酵母粉溶液(200g/L)(按每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.21g酵母粉的量添加)至發(fā)酵結(jié)束,其他步驟相同。
發(fā)酵15d結(jié)束時ε -聚賴氨酸發(fā)酵終濃度達35.4g/L,而對照(常規(guī)2階段法)僅為16.3g/L,因此,本發(fā)明的方法 顯著提高了 ε-聚賴氨酸的產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,包括以下步驟:ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌用其發(fā)酵培養(yǎng)基對其進行發(fā)酵培養(yǎng),當培養(yǎng)體系的PH值下降至3.6^4.1之間時,按照每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.025g^0.5g酵母粉或其他有機氮源至培養(yǎng)體系中直至發(fā)酵結(jié)束,同時自PH降至3.6^4.1之間開始,用氨水控制培養(yǎng)體系的PH維持在3.6^4.1之間直至發(fā)酵結(jié)束,并補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為5 30g/L直至發(fā)酵結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,所述的補料培養(yǎng)基每升含有800g葡萄糖和IOOg硫酸銨,余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,所述的當培養(yǎng)體系的PH值下降的pH值為3.9,所述的自pH值降至是降至3.9開始,用氨水控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.9直至發(fā)酵結(jié)束,所述的并補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為5 30g/L直至發(fā)酵結(jié)束是自當培養(yǎng)體系的葡萄糖低于10g/L時,自動補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為10g/L直至發(fā)酵結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,所述的ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌為不吸水鏈霉菌(Streptomycesahygroscopicus)str-8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,所述的其他氮源為豆餅粉或王米漿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法,其特征在于,所 述的氨水為質(zhì)量分數(shù)10%的氨水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強細胞生長及生物過程效率的ε-聚賴氨酸補料分批發(fā)酵方法。它是用ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌用其發(fā)酵培養(yǎng)基對其進行發(fā)酵培養(yǎng),當培養(yǎng)體系的pH值下降至3.6~4.1之間時,按照每小時每升發(fā)酵培養(yǎng)基中補加0.025g~0.5g酵母粉或其他有機氮源至培養(yǎng)體系中直至發(fā)酵結(jié)束,同時自pH降至3.6~4.1之間開始,用氨水控制培養(yǎng)體系的pH維持在3.6~4.1之間直至發(fā)酵結(jié)束,并補加滅過菌的含葡萄糖和硫酸銨的補料培養(yǎng)基,維持培養(yǎng)體系的葡萄糖為5~30g/L直至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明的細胞較快的進入ε-聚賴氨酸合成階段,避免了細胞進入合成階段前細胞活性的損失,延長了細胞合成ε-聚賴氨酸的時間,從而顯著提高細胞ε-聚賴氨酸合成能力。
文檔編號C12P13/02GK103074393SQ20121051827
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者吳清平, 劉盛榮, 莫樹平, 柏建玲, 王惠惠, 丘明泉, 張菊梅 申請人:廣東省微生物研究所
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