專利名稱：使用結締組織生長因子的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本公開涉及血管發(fā)生相關的使用結締組織生長因子的藥物組合物，更具體地涉及用于促進血管發(fā)生的含有所述結締組織生長因子的藥物組合物，或用于抑制血管發(fā)生的含有選自可結合結締組織生長因子的多肽、抗體和化合物中至少一種的藥物組合物。
背景技術：
血管發(fā)生是從現(xiàn)有的微血管形成新的毛細血管的過程，血管發(fā)生通常發(fā)生在胚胎發(fā)育、組織再生和創(chuàng)傷愈合、黃體(corpus luteum)發(fā)育期間，其中黃體發(fā)育是雌性生殖系統(tǒng)中的周期性變化，即使在這種情況下，血管發(fā)生也是嚴格地受到控制和進行的(FolkmanJ et al. , Int. Rev. Exp. Pathol. , 16, pp207_248, 1976)。
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在成人中，血管內皮細胞生長非常慢，并且與其他類型細胞相比幾乎不分裂。血管發(fā)生的過程通常由以下組成通過血管發(fā)生促進劑的刺激引起蛋白酶對血管基底膜的分解，血管內皮細胞的遷移、增殖，以及由血管內皮細胞的分化形成管來重新構成血管以產(chǎn)生新的毛細血管。存在由血管發(fā)生的自身調節(jié)失敗和異常生長導致的疾病。在病理狀態(tài)下發(fā)生的與血管發(fā)生相關的疾病包括血管瘤、血管纖維瘤、血管畸形和諸如動脈粥樣硬化的心血管疾病、血管粘附、硬皮病，由血管發(fā)生導致的眼科疾病包括由于角膜移植造成的血管發(fā)生、新生血管性青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病、由血管發(fā)生導致的角膜疾病、黃斑變性、翼狀胬肉、視網(wǎng)膜變性、晶狀體后纖維增生、顆粒性結膜炎等。慢性炎性疾病例如關節(jié)炎、皮膚病例如銀屑病、毛細管擴張、化膿性肉芽腫、脂溢性皮炎、痤瘡、阿爾茨海默病和肥胖也與血管發(fā)生相關，并且癌的生長和代謝必須依賴血管發(fā)生(D，Amato RJ et al. , Ophthalmology, 102 (9), ppl261-1262, 1995; Arbiser JL, J.Am. Acad. Dermatol. , 34(3), pp486-497, 1996;0’Brien KD et al. Circulation, 93 (4), pp672-682，1996;Hanahan D et al. , Cell, 86, pp353-364, 1996)。具體地，在癌中，血管發(fā)生對于癌細胞生長和代謝發(fā)揮著重要的功能。腫瘤是通過血管發(fā)生被供給生長所需的營養(yǎng)物和氧氣，伸入腫瘤中的血管原性血管為癌細胞提供了進入血液循環(huán)系統(tǒng)從而允許癌細胞轉移的途徑(Folkm an and Tyler, Cancer Invasionand metastasis, Biologicmechanisms and Therapy (S.B.Day ed. ) Raven press,NewYork, pp94-103, 1977;Polverini PJ, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. ,6(3), pp230_247, 1995)。相反地，雖然血管的過量形成有時成為疾病惡化的主要原因，但是不形成血管也成為嚴重疾病的原因。血管發(fā)生是創(chuàng)傷愈合或組織再生的必要現(xiàn)象，例如，血管形成發(fā)育不良的胎盤是流產(chǎn)的重要原因，由于血管不形成造成的壞死、潰瘍和缺血可以誘導組織或器官的異常功能或者成為死亡的原因。疾病例如動脈粥樣硬化、心肌梗死和心絞痛也成為血液供應緩慢的原因。因此，需要開發(fā)一種治療方法，其可以降低由血管不形成導致的低氧或低營養(yǎng)狀態(tài)而造成的組織損傷，并且誘導或促進用于平滑組織再生的新血管形成。
具體實施例方式技術問題發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在血管發(fā)生中涉及一種炎性細胞因子一血管內皮生長因子-A(VEGF-A)和FPRLl (甲酰肽受體樣1)，結締組織生長因子(CTGF)結合FPRLl以誘導血管發(fā)生，具體地發(fā)現(xiàn)CTGF中結合FPRLl的區(qū)域，證實了血管發(fā)生是通過該區(qū)域誘導的，并完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供了一種用于促進血管發(fā)生的藥物組合物，其含有與CTGF中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因；與CTGF中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因用于促進血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生促進劑的用途；以及一種用于促進血管發(fā)生的方法，其包括將與CTGF中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因給予需要促進血管發(fā)生的患者。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種抑制血管發(fā)生的藥物組合物，其含有與CTGF·中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因；與CTGF中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因用于抑制血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生抑制劑的用途；并且/或者一種抑制血管發(fā)生的方法，其包括將與CTGF中FPRLl結合區(qū)域對應的蛋白片段和/或編碼該蛋白片段的基因給予需要抑制血管發(fā)生的患者。本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種使用CTGF中FPRLl結合區(qū)域作為靶標來篩選血管發(fā)生抑制劑的方法。技術方案為解決所述問題，本發(fā)明的一個實施方案提供了一種用于促進血管發(fā)生的藥物組合物，其含有結締組織生長因子蛋白片段，所述片段包括SEQ ID NO. 9的氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5的氨基酸序列(WVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV)的連續(xù) 38-39 個氨基酸，所述 SEQ IDNO. 5為第164位到第201位氨基酸的區(qū)域；所述結締組織生長因子蛋白片段用于促進血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生促進劑中的用途；以及一種用于促進血管發(fā)生的方法，其包括將所述結締組織生長因子蛋白片段給予需要促進血管發(fā)生的患者。另一個實施方案提供了一種用于促進血管發(fā)生的藥物組合物，其含有編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因，所述結締組織生長因子蛋白片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸；編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因用于促進血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生促進劑的用途；以及一種用于促進血管發(fā)生的方法，其包括將所述編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因給予需要促進血管發(fā)生的患者。所述用于促進血管發(fā)生的方法可以進一步包括，在所述給藥前，確認需要促進血管發(fā)生的患者，其中所述需要促進血管發(fā)生的患者可以是這樣的患者，即其需要預防或治療心絞痛、動脈粥樣硬化、中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷。所述患者可以是哺乳動物，優(yōu)選人。另一個實施方案提供了一種抑制血管發(fā)生的藥物組合物，其含有選自可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種，所述結締組織生長因子蛋白片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸；所述可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物用于 抑制血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生抑制劑的用途；以及一種抑制血管發(fā)生的方法，其包括將所述可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物給予需要抑制血管發(fā)生的患者。另一個實施方案提供了一種抑制血管發(fā)生的藥物組合物，其含有結締組織生長因子片段的表達抑制劑，所述結締組織生長因子片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸作為其活性成分，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸；所述結締組織生長因子蛋白片段的表達抑制劑用于抑制血管發(fā)生和/或制備血管發(fā)生抑制劑的用途；以及一種抑制血管發(fā)生的方法，其包括將結締組織生長因子蛋白片段的表達抑制劑給予需要抑制血管發(fā)生的患者。例如，所述表達抑制劑可以是選自反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA的至少一種，所述反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA互補性結合到編碼所述SEQ ID NO. 5氨基酸序列的基因的堿基序列(SEQ ID NO. 7)或其mRNA，例如，由所述mRNA中連續(xù)15-30個、優(yōu)選連續(xù)20-25個堿基組成的堿基序列。所述抑制血管發(fā)生的方法還可以包括，在所述給藥前，確認需要抑制血管發(fā)生的患者，其中所述需要抑制血管發(fā)生的患者可以是這樣的患者，即其需要預防或治療癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、月巴胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病(Crohn’ s disease)、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎(neophritis)、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病或炎癥。所述患者可以是哺乳動物，優(yōu)選人。另一個實施方案提供了用于篩選血管發(fā)生抑制劑的方法，其包括(a)用一種候選化合物處理包含有編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因的細胞，所述結締組織生長因子片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸；和(b)測量所述基因的表達程度，其中如果與沒有用所述候選化合物處理的細胞相比，在用所述候選化合物處理的所述細胞中所述基因的表達程度降低，那么所述候選物質就被確定為血管發(fā)生抑制劑。下文將詳細闡述本發(fā)明。所述用于促進血管發(fā)生的組合物含有結締組織生長因子蛋白片段，所述結締組織生長因子蛋白片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸。所述結締組織生長因子(CTGF)的全長氨基酸序列可以源自人(例如登錄號CAG46559. 1)，并由SEQ ID N0.9表示。在血管發(fā)生中涉及一種炎性細胞因子——血管內皮生長因子-A (VEGF-A)和FPRLl (甲酰肽受體樣1)，所述結締組織生長因子蛋白可以結合FPRLl以誘導血管發(fā)生。具體地，所述結締組織生長因子具有誘導FPRLl特異性ERK磷酸化的活性(參見實驗結果2)，是一種其表達受VEGF-A誘導的蛋白(參見實驗結果3)，并且它結合FPRLl以誘導血管發(fā)生(參見實驗結果11)。具體地，其中所述結締組織生長因子蛋白結合FPRLl的區(qū)域是結締組織生長因子蛋白全長氨基酸序列SEQ ID NO. 9中從第164位氨基酸到第201位氨基酸的區(qū)域，其可以 由SEQ ID NO. 5氨基酸序列表示(參見實驗結果4)。因此，所述結締組織生長因子蛋白片段一其是本發(fā)明用于促進血管發(fā)生的藥物組合物的活性成分一可以包括所述結締組織生長因子蛋白的全長序列SEQ ID NO. 9中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選連續(xù)38-39個氨基酸，其包括SEQ ID NO. 5的氨基酸序列——SEQ ID NO. 9中第164位氨基酸到第201位氨基酸的區(qū)域。所述結締組織生長因子蛋白片段可以優(yōu)選地由SEQ ID NO. 6的氨基酸序列(EWVraEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV )表示，但不限于此。所述結締組織生長因子蛋白片段是FPRLl的結合區(qū)域(參見實驗結果5)，有效地誘導FPRLl特異性ERK磷酸化(參見實驗結果6)，活化FPRLl以增加細胞內Ca2+濃度(參見實驗結果7)，最后有效地誘導血管發(fā)生(參見實驗結果9)。本發(fā)明所述用于促進血管發(fā)生的藥物組合物可以含有編碼結締組織生長因子蛋白的基因，所述結締組織生長因子蛋白包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自從第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸。優(yōu)選地，所述基因可以編碼SEQ IDN0.5的氨基酸序列——所述結締組織生長因子蛋白全長氨基酸序列中第164位氨基酸到第201位氨基酸的區(qū)域，或者編碼包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的SEQ ID NO. 6氨基酸序列，但不限于此。更優(yōu)選地，所述基因可以由編碼SEQ ID NO. 5氨基酸序列的SEQ ID NO. 7的堿基序列表示(164-TGG GTG TGT GACGAG CCC AAG GAC CAA ACCGTG GTT GGG CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTG GAAGAC ACGTTT GGC CCA GAC CCA ACT ATG ATT AGA GCC MCTGC CTG GTC-201)，并且它可以由編碼SEQID NO. 6 氨基酸序列的 SEQ ID NO. 8 的堿基序列表示(163-GAG TGG GTG TGT GAC GAGCCCAAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG CCT GCC CTC GCGGCT TAC CGA CTG GAA GAC ACG TTT GGCCCA GAC CCA ACTATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC-201)。所述基因可以被插入載體中，優(yōu)選重組表達載體，但不限于此，其中所述重組表達載體可以包含所述基因以及包括可操作地連接的啟動子等在內的表達調節(jié)基因。例如，所述重組表達載體可以是例如EcoRI-INSERT-Xba I in pAB-bee -FH載體(包括信號肽和flag標簽),但不限于此。具體地，所述載體被用于將DNA片段從一個細胞轉移到另一個細胞的核酸分子，可以源自選自質粒、噬菌體、植物病毒和動物病毒的那些，但不限于此。所述表達載體是指這樣的重組DNA，其包含目標編碼序列以及可操作地連接在具體宿主中的表達所述編碼序列需要的適合核酸序列，并且通常，原核細胞中表達所需要的核酸序列可以包括啟動子、操縱子(任選的)和核糖體結合區(qū)以及其他序列，而真核細胞使用啟動子、增強子以及終止和多聚腺苷酸化信號，這在本領域中是已知的。所述重組表達載體可以是包含可操作地連接的必需調節(jié)基因元件以便表達所述基因的基因構建體，其可以在適合的宿主細胞中產(chǎn)生目的蛋白——本發(fā)明所述的結締組織生長因子片段?！ばg語“可操作地連接”意指核酸表達調節(jié)基因序列和編碼目標蛋白的核酸序列有功能地連接以便執(zhí)行通常的功能。例如，啟動子與編碼蛋白或RNA的核酸可以是可操作地連接的以影響編碼序列的表達。所述與重組載體的可操作地連接可以使用本領域中公知的基因重組技術制備，位點特異性的DNA切割和連接可以使用本領域中廣泛已知的酶等來執(zhí)行。適合的表達載體包括表達調節(jié)元件例如啟動子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號和增強子等，其可以根據(jù)目的以不同方式制備。當基因構建體被給予時所述起始密碼子和終止密碼子應該在個體中起作用，并且其應該與編碼序列同框。所述用于促進血管發(fā)生的藥物組合物可以用于治療由血管發(fā)生抑制導致的疾病或可以由促進血管發(fā)生治愈的疾病，但不限于此，例如，其可以用于治療心絞痛、動脈粥樣硬化、缺血性中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷。因此，本發(fā)明的另一個實施方案提供一種用于預防和/或治療心絞痛、動脈粥樣硬化、缺血性中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷的組合物，其包括所述用于促進血管發(fā)生的藥物組合物作為活性成分。同時，所述抑制血管發(fā)生的藥物組合物含有選自可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種，所述結締組織生長因子蛋白片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自從第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸。如上所述，因為包括一結締組織生長因子全長蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO. 9中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸——的結締組織生長因子蛋白片段結合FPRLl以誘導血管發(fā)生，所以選自可結合所述結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種可以有效地抑制血管發(fā)生。所述結締組織生長因子片段可以包括所述結締組織生長因子蛋白全長序列SEQID NO. 9的氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸 序列的連續(xù)38-39個氨基酸，所述SEQID NO. 5為第164位到第201位的區(qū)域，更優(yōu)選地，其可以由包括SEQID NO. 5氨基酸序列的SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表示。因為所述結締組織生長因子蛋白片段包含結合FPRLl的區(qū)域，所以可結合所述結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體或化合物可以阻斷所述結締組織生長因子蛋白與FPRLl的結合以有效地抑制血管發(fā)生。所述多肽、抗體或化合物沒有具體限制，只要其可以結合所述結締組織生長因子蛋白片段，但是優(yōu)選地，其可以結合SEQ ID NO. 6或SEQID NO. 5氨基酸序列，并且其可以根據(jù)所述要結合的結締組織生長因子蛋白片段的氨基酸序列容易地由本領域普通技術人員制備。此外，抑制血管發(fā)生的藥物組合物可以含有選自反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA的至少一種，所述反義核苷酸、短干擾RNA和短發(fā)夾RNA互補性結合到編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因，或其mRNA，例如所述mRNA中由連續(xù)15-30優(yōu)選連續(xù)20-25個堿基組成的堿基序列，所述結締組織生長因子蛋白片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第242位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸。所述siRNA包括正義RNA鏈和互補的反義RNA鏈，所述兩條鏈通過標準沃森-克里克(Watson-Crick)堿基對相互作用互相退火，所述正義鏈包含與靶標mRNA中所述靶標序列相同的核酸序列。選擇所述siRNA的靶標序列的技術記載于例如Tuschl T et al，"ThesiRNAUser Guide^revised Oct. 11,2002 中。所述siRNA的正義和反義鏈可以包含兩條互補的單鏈RNA分子，或者其可以包含其中兩個互補部分形成堿基對并通過單鏈“發(fā)夾”區(qū)域共價鍵合的單個分子。后者被稱為短發(fā)夾RNA(shRNA)，其中所述shRNA為單鏈并在體內形成莖環(huán)結構。所述shRNA通常通過在體內由Pol III啟動子轉錄互補DNA序列合成。Pol-III誘導的轉錄起始于明確限定的起始位點并終止于由4個或4個以上胸腺嘧啶核苷組成的線性(-TTTT-)的第二個殘基處，以產(chǎn)生無Poly(A)的轉錄物。Pol-III啟動子可以在所有細胞中被活化，它可以表達shRNA。在轉錄后，所述shRNA的環(huán)被dicer酶切開，并且所述shRNA像siRNA —樣與RISC (RNA誘導的沉默復合物)作用(參見，Tuschl, T. (2002), CellllO (5) : 563-74)。所述siRNA可以使用本領域普通技術人員已知的許多技術獲得。例如，siRNA可以使用本領域中已知方法化學合成或通過重組產(chǎn)生。優(yōu)選地，所述siRNA可以使用以適合方法保護的核糖核苷亞磷酰胺和現(xiàn)有的DNA/RNA合成儀來化學合成。所述siRNA可以被合成為兩個互補且分離的RNA分子或一個具有兩個互補區(qū)域的RNA分子?；蛘?所述siRNA可以使用合適的啟動子從重組DNA質粒表達。適合于從質粒表達所述siRNA的啟動子可以包括例如，U6或HlRNA pol III啟動子序列和巨細胞病毒啟動子。所述重組質?？梢园烧T導的或可控制的啟動子以便在特定組織或特定細胞內環(huán)境中表達siRNA。所述siRNA可以從重組質粒被表達為兩個互補且分離的RNA分子或一個具有兩個互補區(qū)域的RNA分子。對用于siRNA表達的適合質粒的選擇、在質粒中插入核酸以表達siRNA的方法和將重組質粒轉移到目標細胞的方法都在本發(fā)明所屬領域的技術范圍內。例如，參見[Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448] ; [Brummelkamp TR et al.(2002), Science296:550-553];[Miyagishi M et al. (2002)，Nat. Biotechnol. 20:497-500]; [Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev.16:948-958;Lee NS et al. (2002), Nat.Biotechnol. 20:500-505];和[PaulCP et al. (2002)，Nat. Biotechnol. 20: 505-508]，以上文獻都以引用的方式納入本文。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可以使用具有靶標AAUUCACAUCGUGGUGGACAU(SEQ ID NO. 10)的雙鏈 RNA 分子(例如，正義鏈UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT(SEQ ID NO. 3)和反義鏈AU⑶CCACCACGAUGUGAAdTdT (SEQ ID NO. 4))作為 FPRLl 的 siRNA。所述用于抑制血管發(fā)生的藥物組合物可以用于預防和/或治療血管發(fā)生相關的·疾病。所述血管發(fā)生相關的疾病可以是選自以下的疾病或癥狀癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、炎癥等。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供一種用于預防或治療選自以下的疾病或癥狀的組合物癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、炎癥等，所述組合物含有所述用于抑制血管發(fā)生的藥物組合物作為活性成分。為了給予所述用于促進血管發(fā)生的藥物組合物或用于抑制血管發(fā)生的藥物組合物，除上述的活性成分外還可包括至少一種可藥用載體。所述可藥用載體可以是選自鹽水溶液、無菌水、林格溶液(Ringer’ ssolution)、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂質體及其混合物中的至少一種，并且如果必要的話，可以添加其他普通添加劑例如抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑等?？梢灶~外地添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合齊_潤滑劑以配制成用于注射的劑型，例如水性溶液、懸液、乳劑等，丸劑、膠囊、顆?；蚱RU，并且靶器官-特異性抗體或其他配體可以結合到所述載體以便特異地在靶器官上起作用。此外，優(yōu)選地，可以根據(jù)疾病或成分通過本領域中適合的方法或使用Remington’sPharmaceutical Science (最新版)，Mack PublishingCompany, Easton PA 中公開的方法配制所述藥物組合物。本發(fā)明所述用于促進血管發(fā)生的藥物組合物或用于抑制血管發(fā)生的藥物組合物可以被制備用于口服給藥、局部給藥、腸胃外給藥、靜脈給藥、肌內給藥、皮下給藥、眼內給藥、經(jīng)皮給藥等。優(yōu)選地，其可以以可注射形式使用。因此，可以將可注射組合物與可藥用介質混合以直接注射到要治療的區(qū)域。本發(fā)明所述組合物可以包括凍干的組合物，所述凍干組合物一旦加入等滲無菌溶液、無菌水或適合的生理鹽水后就能夠構成可注射溶液。直接注射到患者的腫瘤中是有利的，因為治療效力集中于受感染的組織。所使用的劑量可以通過多種參數(shù)控制，所述參數(shù)具體包括基因、載體、使用的給藥途徑、目的疾病或所需要的治療期。并且，劑量范圍可以根據(jù)體重、年齡、性別、健康狀況、患者飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率和疾病嚴重程度等變動。每日劑量可以為約O. 0001-10mg/kg,優(yōu)選O. 001-lmg/kg,其可以優(yōu)選地一天給藥一次或分為幾次。同時,一種用于篩選血管發(fā)生抑制劑的方法包括(a)用一種候選化合物處理包含有編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因的細胞，所述結締組織生長因子片段包括SEQ ID NO. 9氨基酸序列中連續(xù)38個或更多個氨基酸，例如連續(xù)38-140個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)、連續(xù)38-100個氨基酸(例如選自第103位到第202位氨基酸的區(qū)域)或連續(xù)38-80個氨基酸(例如選自第163位到第242位氨基酸的區(qū)域)，優(yōu)選包括SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸；和 (b)測量所述基因的表達程度，其中如果與沒有用所述候選化合物處理的細胞相比，在用所述候選化合物處理的所述細胞中所述基因的表達程度減少，那么所述候選物質被確定為血管發(fā)生抑制劑。在所述步驟(a)中，所述結締組織生長因子蛋白片段可以由SEQ IDN0. 5或SEQ IDNO. 6的氨基酸序列表示。所述候選化合物可以是肽、蛋白質、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物或動物提取物，但不限于此，并且其可以包括廣泛已知的那些以及新物質。在所述步驟(a)中，所述細胞可以用包括所述基因的重組表達載體轉化，所述轉化方法為中本領域公知的。在所述步驟(b)中，所述基因的表達程度可以優(yōu)選地通過免疫縈光方法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白印跡或RT-PCR測量，但不限于此。在使用抗體根據(jù)表達確定蛋白的量時，可以加入對靶蛋白特異性的并連接可檢測標簽的第二抗體，在加入所述第二抗體后，可以加入對所述第二抗體具有結合親和力并連接可檢測標簽的第三抗體。作為所述第二或第三抗體的可檢測標簽，可以使用在培養(yǎng)時顯色的酶和適合的顯色底物。所述可檢測部分可以包括可通過光譜的、酶的、光化學的、生物電的、免疫化學的、電的、光學的或化學的工具檢測的組合物，例如，其可以包括縈光標記和染料、磁性標簽、連接的酶、質譜標簽、自旋標簽、電子供體和受體，但不限于此。如果，與未用所述候選化合物處理的對照相比，用所述候選化合物處理的細胞中所述基因表達程度減少，那么所述候選化合物可以被選作血管發(fā)生抑制劑。所述血管發(fā)生抑制劑可以用于預防或治療選自以下的疾病或癥狀類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、癌癥、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病、炎癥等，但不限于此。使用本發(fā)明的篩選方法時，可以在短時間內選擇所述機制中涉及的治療劑，通過用于證明的實驗，可以將有用的預防和/或治療劑提供給需要預防和/或治療由血管發(fā)生導致的疾病的患者。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的所述結締組織生長因子蛋白片段，是FPRLl的結合區(qū)域，有效地誘導FPRLl特異性ERK磷酸化，活化FPRLl以增加細胞內Ca2+濃度，最后有效地誘導血管發(fā)生，因此，所述結締組織生長因子蛋白片段可以用于促進血管發(fā)生的藥物組合物，同時可結合所述結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體或化合物可以用于抑制血管發(fā)生的藥物組合物。


圖I示出了免疫印跡法結果，其用于確認通過用VEGF-A處理獲得的HUVEC條件培養(yǎng)基是否在FPRLl過表達的FPRL1/RBL細胞中誘導ERK磷酸化。圖2示出了實驗結果，其用于確認條件培養(yǎng)基、VEGF-A和陽性對照(WKYMVm)只在FPRLl過表達的FPRL1/RBL細胞中誘導ERK磷酸化。圖3示出了以下結果，其用于確認通過用條件培養(yǎng)基的HPLC級分處理FPRL1/RBL細胞，ERK磷酸化是否發(fā)生。 圖4示出了條件培養(yǎng)基的B12級分的MS/MS分析結果。圖5示出了根據(jù)VEGF-A的處理時間，分析以VEGF-A處理的HUVEC的細胞裂解物或條件培養(yǎng)基中CTGF表達程度的結果。圖6示出了根據(jù)VEGF-A的處理量，分析以VEGF-A處理的HUVEC的細胞裂解物或條件培養(yǎng)基中CTGF表達程度的結果。圖7示出了以下結果，其用于確認當給予VEGF-A受體的抗體時，CTGF表達顯著減少。圖8的示意圖顯示了，測定CTGF中FPRLl的結合區(qū)域的方法。圖9示出了以下結果，其用于確認在FPRL1/RBL細胞中全長CTGF蛋白或其部分缺失的蛋白是否誘導ERK磷酸化。圖10示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭(linker)多肽是否只與FPRL1/RBL細胞結合。圖11示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽誘導ERK磷酸化至與rhCTGF相似的水平，并且所述ERK磷酸化被FPRLl拮抗劑(WRW4)降低。圖12示出了以下結果，其用于確認在以SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽處理的FPRLI/RBL細胞中Ca2+濃度是否增加。圖13示出了以下結果，其用于確認在HUVEC細胞中SEQ ID N0.6的CTGF接頭多肽是否與FPRLl結合。圖14示出了以下結果，其用于確認如果以SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽處理HUVEC,那么ERK磷酸化被有效地誘導。圖15示出了以下結果，其用于確認如果以SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽處理HUVEC，那么細胞內Ca2+濃度以濃度依賴的方式增加。圖16示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽不會顯著影響HUVEC的增殖。圖17示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽以濃度依賴的方式誘導HUVEC的遷移。圖18示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽以濃度依賴的方式誘導HUVEC的管形成。圖19示出了以下結果，其用于確認SEQ ID NO. 6的CTGF接頭多肽在體內以濃度依賴的方式誘導血管發(fā)生。圖20示出了根據(jù)孵育時間通過進行RT-PCR或流式細胞計量術確認在HUVEC細胞中VEGF-A是否誘導FPRLl表達的結果。圖21示出了根據(jù)處理量通過進行RT-PCR或流式細胞計量術確認在HUVEC細胞中VEGF-A是否誘導FPRLl表達的結果。圖22示出了以下實驗結果，其用于確認由VEGF-A誘導的HUVEC的增殖沒有被FPRLl拮抗劑(WRW4)顯著降低。 圖23示出了以下實驗結果，其用于確認由VEGF-A誘導的HUVEC的遷移沒有被FPRLl拮抗劑(WRW4)顯著降低。圖24示出了以下實驗結果，其用于確認由VEGF-A誘導的HUVEC的管形成沒有被FPRLl拮抗劑(WRW4)顯著降低。圖25示出了以下實驗結果，其用于確認如果以FPRLl siRNA處理HUVEC，那么FPRLl表達被抑制。圖26示出了以下實驗結果，其用于確認如果以FPRLl siRNA處理HUVEC，那么由VEGF-A誘導的細胞遷移被抑制。圖27示出了以下實驗結果，其用于確認如果以FPRLl siRNA處理HUVEC，那么由VEGF-A誘導的管形成被抑制。圖28示出了以下實驗結果，其用于確認FPRLl拮抗劑(WRW4)通過VEGF-A抑制血
管發(fā)生。圖29的示意圖示出了通過由VEGF-A表達的CTGF和FPRLl的結合誘導的血管發(fā)生的機制。實施例下文中將參考以下實施例詳細闡述本發(fā)明。但是，這些實施例僅是為了解釋本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不限于此。在以下實施例中，所有數(shù)據(jù)以均值土標準差表示，通過Student’s t檢驗進行統(tǒng)計對比，并且當P〈0. 05時認為是統(tǒng)計學上顯著的。<實驗方法>I.實驗材料憐酸化-ERK1/2(Thr2CI2/Tyr2CI4)和 ERK1/2 抗體購自 Cell SignalingTechnologyInc. (Beverly, MA, USA),人 CTGF 抗體和抗 Flag 的抗體分別購自 Abeam (Cambridge, MA, USA)和 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)。重組人CTGF購自 BioVendor Laboratory Medicine Inc.(Brno, Czech R印ublic)。重組人VEGF-A165、抗VEGF-AmAb、抗VEGFR-ImAb和抗VEGFR_2mAb獲自 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)。針對FPRLl 的 siRNA (正義鏈UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT (SEQ ID NO. 3)，反義鏈AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT (SEQ ID NO. 4))和針對螢光素酶的 siRNA (正義鏈CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT (SEQ IDN0. 11)，反義鏈UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT (SEQID NO. 12))在 Dharmacon Research, Inc. (Chicago, IL)合成。WKYMVm(SEQID NO. I)、WRffffffff (SEQ ID NO. 2, WRW4)和生物素化的 WKYMVm 在 A&PEP Inc (Seoul, Korea)合成，其純度高于95%。包括人CTGF連接區(qū)域的氨基酸序列的接頭多肽(EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV (SEQID NO. 6)-NH2)在 Anygen Co. Ltd. (Gwangjoo, Korea)合成，其純度約為 99. 1%。2.細朐培養(yǎng)根據(jù)本領域中已知方法(Ferrero,E. etal. Transendothelialmigration leadsto protection from starvation-induced apoptosis inCD34+CDI4+circulatingprecursors: evidence for PECAM-I involvem ent through Akt/PKB activation.BloodlOl, 186-193，2003)用膠原酶(Sigma，St. Louis, MO，USA)處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)以將其從臍帶(ST. MARY’ S Hospital, Seoul, Korea)分離。所述分離的HUVEC使用Mediuml99 (含有20% (v/v)熱滅活的胎牛血清和1% (w/v)的青霉素/鏈霉素)在以O. 2%(w/v)明膠包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。對于該實驗，將每個細胞培養(yǎng)至亞匯合(subconfluence)狀態(tài)，并使用3_5代(3to5passages)的細胞。表達FPRLl的大鼠嗜堿性細胞白血病(RBL)_2H3 (FPRL1/RBL)細胞、表達FPR的RBL-2H3 (FPR/RBL)細胞和RBL-2H3 (載體/RBL)細胞(其中FPRLl或FPR受體不會過表達的細胞)(ATCC，Manassas, VA, USA)維持在含有高濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(Sigma，St. Louis，MO，USA)中，其中加入1%的青霉素/鏈霉素、20% (v/v)熱滅活的胎牛血清和 G418 (Geneticin) (500ug/ml)。所述細胞培養(yǎng)于 37°C，5%C02 中。3.備件培養(yǎng)某條件培養(yǎng)基是用在不包括FBS的Mediuml99中培養(yǎng)的(3_5代)HUVEC獲得的。所述條件培養(yǎng)基被離心以除去殘留細胞，并儲存在_80°C下待用。4.蛋白質印跡分析載體/RBL細胞、FPR/RBL細胞、FPRLI/RBL細胞和HUVEC被培養(yǎng)至匯合，并進入血清饑餓狀態(tài)。所述被刺激的細胞(I X IO5細胞)用PBS洗滌兩次，溶解于Iml上樣緩沖液(50mM Tris-HCl, IOOmMNaCl, 0. 1%SDS, 1% 諾乃洗滌劑 P-40 (Nonidet P-40), 50mM NaF, ImMNa3VO4, I μ g/ml 抑酶肽(aprotinin) , I μ g/ml 胃酶抑素(pepstatin)，和 I μ g/ml 亮肽酶素(leup印tin))，在95°C下加熱30秒，用SDS-PAGE分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上。使用抗磷酸化-ERK (細胞外信號調節(jié)激酶)1/2SignalingTechnology, Beverly, MA, USA)、抗 ERK1/2 的抗體(Cell Signaling Technology, Beverly,MA, USA)、抗 CTGF 的抗體(Abeam, Cambridge, MA, USA)、抗肌動蛋白的抗體(Sigma, St.Louis, MO, USA)或抗Flag的抗體(Sigma, St. Louis, MO, USA)進行免疫印跡,然后,用化學發(fā)光底物(AmershamPharmacia)使所述膜顯影。5. FPRLl (甲釀肽樣受體I)活化蛋白的鑒定從所述HUVEC中獲得的條件培養(yǎng)基(CM)上樣到HLB小柱(waters)中，使用反相(RP)C18 柱分離。所述 RP C18HPLC 柱(218TP5215;2. ImmX 150mm，Vydac)使用水/0. l%(w/V) TFA 平衡。通過 ACN/0. 1%(w/v) TFA 從 0%(w/v)到 100%(w/v)的濃度梯度，獲得 150ul 級分。用胰蛋白酶處理所獲得的活化的級分，并在37°C下培養(yǎng)過夜。為獲得所述活化的級分的MS和MS/MS數(shù)據(jù)，使用了由UltimateHPLC系統(tǒng)(LCPackings)和 QSTAR PULSAR I hybrid Q-TOF MS/MS 系統(tǒng)(Applied Biosytems/PE SCIEX)組成的并裝備有nano-ESI源的nano_LC MS。所述QSTAR以8000-10000的分辨率在恒定質量下運行24小時。噴嘴電壓為2300V,使用由Applied Biosystems Inc. (AB)提供的Analyst QS軟件測量通過QSTAR檢測的所有質量值。對于MS/MS分析，使用MASCOT搜索引擎(內部版本I. 7 (version, in-house))通過非冗余數(shù)據(jù)庫分析共同的質量值譜以獲得序列信息。所獲得的MASCOT結果具有比通過隨機匹配指出的更高的MOWSE值(p〈0. 05)。6.質粒吿丨丨造、轉染矛口蛋白純仆,插入到含有Flag標簽序列(在腱蛋白(chordin)信號肽后直到Ala41)的pCS2+表達載體中的非洲蟾蜍CTGF的全長和缺失變體由E. M. De Robertis (University ofCalifornia, Los Angeles, CA)提供( 在pCS2+中EcoRI-腱蛋白信號肽-腱蛋白的20個N 末端氨基酸-FLAG 表位(DYKDDDDK) -Xho I-INSERT-Xba I) (Abreu, J. G.，Ketpura, N.I., Reversade, B. & De Robertis,E.M.Connective-tissue growth factor (CTGF)modulates cell signalling by BMP and TGF-[beta]. Nat Cell Biol4, 599-604，2002)。所述缺失變體命名為 CTGF/I-II-L、CTGF/II-L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L-III-IV 和 CTGF/I-L-III-IV，其具體的缺失顯示在圖8 (所缺失的部分用點線表示)。根據(jù)制造商的說明書，通過使用lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)瞬時轉染HEK293T細胞(ATCC，Manassas, VA, USA)來獲得帶有所述flag標簽的分泌蛋白。從HEK293T細胞中，使用抗Flag M2親和凝膠柱將全長和缺失變體Flag-CTGF親和純化出來，并根據(jù)制造商的說明書洗脫Flag肽。所述蛋白的純度使用Silver StainPlus試劑盒(Bio-Rad)通過銀染測定。7.牛物素化和流式細胞計量術為評估對應人CTGF連接區(qū)域的接頭多肽的結合程度，根據(jù)制造商的說明書，使用 EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation 試劑盒(Pierce Chemical Co.,Rockford, IL, USA)標記接頭多肽。所述接頭多肽在含有9mM硫代-NHS-LC-生物素(PierceChemical Co.，Rockford, IL，USA)的PBS中在室溫下培養(yǎng)I小時。在生物素化期間，將載體/RBL細胞、FPR/RBL細胞、FPRL1/RBL細胞或HUVEC用胰蛋白酶處理，收集，然后用兔血清在室溫下處理30分鐘。在所述生物素化的接頭多肽在冰中培養(yǎng)30分鐘后，將所述細胞以用冰預冷的PBS短暫洗滌，用抗人縈光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)軛合的鏈霉親和素(PierceChemical Co.)培養(yǎng)，然后以用冰預冷的PBS洗滌，用1%甲醛溶液固定。然后，根據(jù)之前已知方法(He, R.，Sang, H. & Ye, R. D. Serum amyloid A induces IL_8secretion through a Gprotein-coupledreceptor,FPRLl/LXA4R. BloodlOl, 1572-1581，2003)使用具有 CellQuest和 WinMDI2. 9 軟件的 FACS Caliber 系統(tǒng)(BD Biosciences, San Jose, CA)分析所述細胞。8. Ca-的測量FPRL1/RBL、載體/RBL 或 FPR/RBL 細胞在含有 O. 03%(w/v)plutonic F_127(分子探針)的fluo-3-AM工作溶液中在37°C下培養(yǎng)I小時，以使fluo-3-AM的最終濃度變?yōu)?0uM/L0在所述培養(yǎng)后，所述細胞中使用高功率Ar+激光時在488nm處出現(xiàn)f luo-3-AM熒光，用光電倍增管在530nm處測量了發(fā)射帶。使用裝備有尼康E-600EclipSe顯微鏡的共聚焦激光掃描系統(tǒng)(LSM5IOMeta; Carl Zeiss, Jena, Germany)檢測了熒光信號。測量了在加入CTGF(F0)前和加入CTGF (F)后的熒光強度。細胞內Ca2+濃度[Ca2Ii的改變由F/匕比例指示。從每個細胞掃描50-120幅圖像。
9.體外血管發(fā)牛測定對于增殖測定，將HUVEC以2 X IO4個細胞/孔鋪板培養(yǎng)在明膠包被的24孔培養(yǎng)皿中，并允許其貼附過夜。在血清耗盡后4小時，將所述細胞用多種促細胞分裂劑(CTGF接頭多肽，CTGF)處理48小時。在獲得最終培養(yǎng)物之前6小時，將[3H]-胸腺嘧啶核苷(I μ Ci,AmershamInternational)加入到每個孔。將所插入的[3H]-胸腺卩密唳核苷在O. 2MNa0H和O. 1%SDS溶液中在37°C下提取I小時。使用液體閃爍計數(shù)器(Beckmann Instruments)測量放射性，重復三次，所述結果由每分鐘的均值土標準差表示。按如下確認HUVEC的創(chuàng)傷遷移和管形成的活性。具體地，用移液管末端對接種在60-mm培養(yǎng)皿上至匯合的HUVEC造成創(chuàng)傷，并用溶于其中加有1%血清和ImM胸腺嘧啶核苷的Mediuml99中的接頭多肽(KT1 102nM)或重組CTGF (重組 CTGF，rhCTGF ；BioVendor R&D, NC, USA) (IO1 或 102nM)處理所述創(chuàng)傷細胞。在培養(yǎng)16小時后，計數(shù)遷移越過參考線的細胞數(shù)目以定量遷移程度，將所述細胞以50X放大倍數(shù)拍照。 同時，為分析管形成，將HUVEC與特定量的接頭多肽、rhCTGF或VEGF-A165 —起接種在之前聚合的基質膠(Matrigel, BD Biosciences)層上。培養(yǎng)18小時后,通過相差顯微鏡觀察所述細胞的形狀，以40x放大倍數(shù)拍照。通過使用image-Pro Plus v4. 5 (MediaCybernetics, SilverSpring, MD)測量從每個孔中隨機選擇的LPF (低功率區(qū)域)中的管長度5次，定量管形成的程度。10. CAM (絨毛膜尿囊膜)的分析體內CAM分析根據(jù)之前已知的方法進行(Lee, M. -S. et al. AngiogenicActivity of Pyruvic Acid in in Vivo and in Vitro AngiogenesisModeIs. CancerRes61,3290-3293, 2001)。將受精卵在37°C下培養(yǎng)在設定為固定濕度的卵孵育器中。培養(yǎng)3天后，為從殼體脫下表達的CAM，用18號皮內針取出約2ml卵白蛋白。再培養(yǎng)6天后，將含有所述樣品的thermanox蓋玻片(Nunc)在空氣中干燥，并涂敷在所述CAM表面以測試由接頭多肽或rhCTGF引起的血管發(fā)生的活性。3天后,將l_2mll0%(w/v) Intralipose注射到絨毛膜尿囊中，并用顯微鏡觀察。11.針對FPRLl轉錄的siRNA的制備和轉染為使用siRNA抑制人FPRLl的轉錄，使用了 FPRLl的siRNA (正義鏈UUCACAUCGUGGUGGACAUdTdT (SEQ ID NO. 3)，反義鏈AUGUCCACCACGAUGUGAAdTdT (SEQID NO. 4))。作為所述siRNA序列的BLAST搜索結果，確認了與數(shù)據(jù)庫中其他序列沒有顯著相似性。所述寡核苷酸顯示了相似結果。HUVEC被用于siRNA轉染。將所述細胞用終濃度為 20nM 的 FPRLl siRNA (SEQ ID NO. 3 和 SEQID NO. 4)轉染，或用螢光素酶 siRNA (SEQ IDNO. 11和SEQ ID NO. 12)轉染作為對照。此時，根據(jù)制造商的說明書使用了 lipofectamine試劑(Invitrogen Life Technologies)。將所述細胞用無血清培養(yǎng)基洗漆,然后用其中加有含20% (v/v)FBS的培養(yǎng)基的轉染混合物培養(yǎng)4. 5小時。在培養(yǎng)后24小時和48小時，收集所述細胞，通過RT-PCR分析確認FPRLl表達程度。12. RT-PCR 分析使用市購的TRI試劑(Molecular Research Center)根據(jù)制造商的說明書從所述被轉染的HUVEC分離所有RNA。使用3ug的每種無DNA的總RNA樣品和oligo (dT) 15以及Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶(Promega, WI,USA)根據(jù)造商的說明書合成了第一鏈cDNA。然后，用含有I X PCR緩沖液、200uM dNTPs、IOuM的每種特異性引物(sFPRLl: 5’ -GACCTTGGATTCTTGCTCTAGTC-3’ (SEQ ID NO. 13)，asFPRLl:5’-GGATCAGTCTCTCTCGGAAGTC-3’ (SEQIDN0. 14)，sCTGF:5’-TTCCAGAGCAGCTGCAAGTACCA-3’ (SEQID NO. 15)，asCTGF:5’-TTGTCATTGGTAACCCGGGTGGA-3’ (SEQ ID NO. 16))和 I. 25 單位 Taq DNA 聚合酶(Perkin-Elmer)的50ul的反應溶液，擴增了相同量的cDNA。所述擴增產(chǎn)物在I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，用EtBr(溴化乙錠)染色并通過紅外穿透(infraredpenetration)顯影?！磳嶒灲Y果〉I.用VEGF-A處理的HUVEC的備件培養(yǎng)某的ERK磷酸化誘導活件血管內皮生長因子A (VEGF-A)——一種炎性細胞因子——與G蛋白偶聯(lián)受體 FPRLl (甲酰肽樣受體I)共享許多細胞功能，以控制血管發(fā)生。但是，VEGF-A和FPRLl怎樣相互作用是未知的。為確認這點，發(fā)明人在用VEGF-A處理的HUVEC中獲得了條件培養(yǎng)基(CM)，并用其以10ng/ml或50ng/ml的濃度處理FPRLl過表達的FPRL1/RBL細胞8小時。同時，作為陽性對照，用 IOnM FPRLl 激動妝(agonistic peptide)WKYMVm(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met，SEQ ID NO. I)處理所述細胞。在所述處理后，用抗磷酸化erk (細胞外信號調節(jié)激酶)1/2的抗體和抗erkl/2的抗體(cell signaling technology, beverly, ma, usa)對轉移到硝酸纖維素膜的細胞裂解物進行免疫印跡，然后，用化學發(fā)光底物(Amersham Pharmacia)使所述膜顯影,結果在圖I示出。如圖I所示，可以看到在用VEGF-A處理的HUVEC中獲得的條件培養(yǎng)基以濃度依賴的方式增加了 ERK磷酸化。同時，將上述的載體/RBL、FPR/RBL或FPRL1/RBL細胞分別用上述條件培養(yǎng)基或VEGF-A以10ng/ml濃度處理8小時，并將陽性對照用IOnM激動肽WKYMVm (SEQ ID NO. I)處理。然后，按如上所述進行免疫印跡，結果在圖2示出。如圖2所示，可以看到僅在FPRLl過表達的FPRL1/RBL細胞中，條件培養(yǎng)基、VEGF-A和陽性對照都增加了 ERK磷酸化。因此，可以看到由所述條件培養(yǎng)基誘導的ERK磷酸化是對FPRLl特異性的。2.條件培養(yǎng)基中具有ERK磷酸化誘導活性的蛋白的鑒定如〈實驗方法5>所述，將FPRL1/RBL細胞用40ug的所述條件培養(yǎng)基的HPLC級分處理5分鐘，圖3示出了確認ERK磷酸化是否按〈實驗結果1>中描述的發(fā)生的結果。如圖3所示，可以看到在FPRLI/RBL細胞中含有B12-C4的級分可誘導ERK磷酸化，作為檢查B11-C4中每個級分的活性峰的結果，可以看到僅在B12、C3級分中觀察到峰。由所述結果，設想在FPRLI/RBL細胞中具有誘導ERK磷酸化活性的蛋白包含在B12中，對所述B12級分進行如〈實驗方法5>所述的MS/MS分析，結果在圖4示出。如圖4所示，檢測到與人結締組織生長因子(CTGF)氨基酸序列對應的5個多肽序列(圖4中下劃線部分)。因此，可以看到FPRL1/RBL細胞中具有誘導ERK磷酸化活性的蛋白是CTGF。
3.由VEGF-A引起的CTGF表汰誘導從所述〈實驗2>中，認為在由VEGF-A處理的HUVEC中分泌的所述條件培養(yǎng)基中，CTGF可以結合FPRLl以在FPRL1/RBL細胞中誘導ERK磷酸化。為確認這點，按實驗方法部分所述進行RT-PCR和蛋白質印跡分析。具體地，根據(jù)VEGF-A的處理時間和處理量分析了，用VEGF-A處理的HUVEC的細胞裂解物或條件培養(yǎng)基中的CTGF表達程度，其結果分別在圖5和圖6示出。如圖5所示，依照RT-PCR分析的結果，可以看到CTGF mRNA從用VEGF-A處理HUVEC半小時后起增加，依照蛋白質印跡分析的結果，可以看到在所述細胞裂解物中CTGF值從2小時后起增加，在所述條件培養(yǎng)基中CTGF值從4小時后起增加。如圖6所示，依照RT-PCR和蛋白質印跡分析結果，可以看到CTGF值以與所述·VEGF-A的處理量成比例地增加。同時，本發(fā)明人另外確認了 VEGF-A受體是否涉及CTGF合成。具體地，將 HUVEC 用 VEGF-A 的中和抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、VEGF 受體-I(VEGFR-I) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、VEGF 受體-2 (VEGFR-2) (R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)和作為對照的IgG抗體以5ug/ml的濃度處理30分鐘，然后將其用VEGF-A以20ng/ml的濃度處理。在2小時后，獲得細胞裂解物，用抗人CTGF進行免疫印跡，結果在圖7不出。如圖7所示，可以看到如果給予VEGF-A受體的抗體，CTGF表達顯著減少。因此，可以看到VEGF-A的CTGF表達誘導是受受體偶聯(lián)控制的。4. CTGF的FPRLl結合位點的測定為測定CTGF的FPRLl結合位點，根據(jù)〈實驗方法6>中描述的方法制備了如圖8所示的其中插入編碼全長CTGF蛋白或部分缺失的蛋白CTGF/I-II-L、CTGF/II-L、CTGF/II、CTGF/L、CTGF/L-III-IV和CTGF/I-L-III-IV的基因的質粒，并將其轉染到HEK293T細胞(ATCC, Manassas, VA, USA),純化了每種蛋白。為確認所純化的蛋白是否能在FPRL1/RBL細胞中誘導ERK磷酸化，按〈實驗結果1>所述進行免疫印跡，結果在圖9示出。如圖9所示，可以看到除CTGF/II外的所有蛋白均可誘導ERK磷酸化。通過從所述結果中繪出除CTGF/II外的缺失蛋白的共同區(qū)域，可以看到全長CTGF蛋白的第164位到第 201 位(由粗體指示，SEQ IDN0.5) (MTAASMGPVRVAFVVLLALCSRPAVGQNCSGPCRCPDEPAPRCPAGVSLVLDGCGCCRVCAKQLGELCTERDPCDPHKGLFCDFGSPANRKIGVCTAKDGAPCIFGGTVYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGKCCEEWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLVQTTEWSACSKTCGMGISTRVTNDNASCRLEKQSRLCMVRPCEADLEENIKKGKKCIRTPKISKPIKFELSGCTSMKTYRAKFCGVCTDGRCCTPHRTTTLPVEFKCPDGEVMKKNMMFIKTCACHYNCP⑶NDIFESLYYRKMYGDMA)為FPRLl的CTGF結合位點。5. CTGF接頭多肽的FPRLl結合的確認將IOnM包含在〈實驗結果4>中確認的CTGF結合區(qū)域的接頭多肽(SEQ ID NO. 6，EWVCDEPKDQTVVGPALAAYRLEDTFGPDPTMIRANCLV，在 SEQID NO. 5 的 N 末端多含有一個氨基酸(E))被按照〈實驗方法7>所述生物素化，并將其與FPRL1/RBL、載體/RBL或FPR/RBL細胞培養(yǎng)，然后進行流式細胞計量術，結果在圖10示出。
如圖10所示，可以看到CTGF接頭多肽僅結合FPRL1/RBL細胞。如圖I所示，可以看到如果將FPRL1/RBL、載體/RBL或FPR/RBL細胞用IOuM的FPRLl拮抗劑WRW4 (SEQ IDNO. 2)處理并培養(yǎng)30分鐘，那么在FPR/RBL細胞中所述接頭多肽結合被抑制。因此，從所述結果可以看出CTGF接頭多肽特異性地結合FPRL1，從而所述接頭多肽可以通過FPRLl增加ERK磷酸化或Ca2+濃度。6. CTGF接頭多肽的ERK磷酸化促進作用將CTGF接頭多肽的ERK磷酸化誘導與重組人CTGF (rhCTGF)進行比較。具體地，將FPRL1/RBL細胞用CTGF接頭多肽和rhCTGF以多種濃度處理5分鐘，測量ERK磷酸化，結果在圖11示出。如圖11所示，可以看到CTGF接頭多肽與rhCTGF誘導ERK磷酸化至相似的水平。
并且，當將IOnM的所述CTGF接頭多肽或rhCTGF加入到FPRL1/RBL細胞時，加入或不加入IOuM的WRW4，比較ERK磷酸化程度，結果在圖11示出。如圖11所示，可以看到CTGF接頭多肽(由LK表示)與rhCTGF (由CTGF表示)誘導ERK磷酸化至相似的水平，特別地，在加入FPRLl拮抗劑WRW4的情況下，ERK磷酸化被抑制。7.由CTGF接頭多肽引起的Ca2"*度增加因為FPRLl的活化增加細胞內Ca2+濃度，本發(fā)明人通過〈實驗方法8>確認了 CTGF接頭多肽是否活化FPRLl以最終增加細胞內Ca2+濃度，結果在圖12示出。如圖12所示，作為用共聚焦顯微鏡檢查的結果，Ca2+濃度僅在用CTGF接頭多肽處理的FPRLI /RBL細胞中增加。此外，作為測量FPRLI /RBL細胞中Ca2+濃度的結果，可以看到Ca2+濃度增加依賴于所述CTGF接頭多肽的濃度，并且所述CTGF接頭多肽的活性比rhCTGF更有效，與陽性對照FPRLl激動劑WKYMVm(由Wm表示)相似。并且，可以看到如果給予IOuMFPRLl拮抗劑WRW4，則由CTGF接頭多肽引起的細胞內Ca2+濃度增加的程度減小。從所述結果可以看到，CTGF通過所述接頭區(qū)域直接結合到FPRL1，從而活化FPRLl。8. HUVEC中CTGF接頭多肽結合FPRLl并活化的確認因為FPRLl在HUVEC中大量表達，因此確認了在用VEGF-A處理的HUVEC中是否分泌CTGF，從而檢查了血管發(fā)生。按〈實驗方法7>所述檢查了在HUVEC中CTGF接頭多肽是否結合到FPRLl，結果在圖13示出。具體的，將HUVEC用IOnM的所述CTGF接頭多肽處理，并培養(yǎng)30分鐘，然后按<實驗方法7>所述進行流式細胞計量術。此時，將所述細胞用IOuM的WRW4 —起處理。如圖13所示，可以看到與不用所述CTGF接頭多肽處理的HUVEC (僅用賦形劑(vehicle)處理)的情況相比，在將HUVEC用所述CTGF接頭多肽處理的情況中，平均值向右移動。但是，在將其用FPRLl拮抗劑WRW4處理的情況中，沒有觀察到所述移動。同時，將HUVEC用所述CTGF接頭多肽或rhCTGF以多種濃度處理5分鐘，獲得細胞裂解物，然后用抗-磷酸化ERK1/2的抗體進行免疫印跡，結果在圖14示出。如圖14所示，可以看到在將HUVEC用CTGF接頭多肽處理的情況中，ERK磷酸化被有效地誘導，而如果用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理，則ERK磷酸化被抑制。將HUVEC用所述CTGF接頭多肽或rhCTGF以多種濃度處理I小時，確認了利用上述方法時細胞內Ca2+濃度是否增加，結果在圖15示出。如圖15所示，可以看到雖然CTGF接頭多肽以濃度依賴的方式增加細胞內Ca2+濃度，但是當用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理所述細胞時情況不是這樣。從所述結果可以看到在HUVEC中，CTGF通過所述接頭區(qū)域特異性結合到FPRLl以活化HUVEC。9. CTGF接頭多肽的血管發(fā)生誘導效應如果進行了血管發(fā)生，則內皮細胞會生長，現(xiàn)有的血管可根據(jù)生芽遷移，形成管(Carmeliet, P. & Jain,R.K.Angiogenesis in cancer andother diseases.Nature407, 249-257，2000)，因此，通過〈實驗方法9>確認了 CTGF接頭多肽是否誘導所述血管發(fā)生，結果在圖16-18不出。 如圖16所示，雖然CTGF接頭多肽以濃度依賴的方式誘導HUVEC的增殖，但是程度在統(tǒng)計學上不顯著。如圖17所示，可以看到所述CTGF接頭多肽以濃度依賴的方式、比重組CTGF更有效地誘導HUVEC的遷移，此外，可以看到在將所述細胞用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理的情況中，沒有誘導細胞遷移。如圖18所示，可以看到所述CTGF接頭多肽比重組CTGF更有效地誘導HUVEC的管形成，此外，可以看到在將所述細胞用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理的情況中，沒有誘導
管形成。從所述結果中，可以看到因為CTGF接頭多肽比全長CTGF更有效地誘導細胞遷移和管形成而不是細胞增殖，所以其可以促進血管發(fā)生。因此，基于所述結果，本發(fā)明人通過〈實驗方法10>確認了體內的血管發(fā)生活性，結果在圖19示出。如圖19所示，可以看到CTGF接頭多肽在體內也以濃度依賴的方式非常強烈地誘導血管發(fā)生，因此，形成了所謂的輪狀血管(wheel-shaped blood vessel)。但是,可以看到在將所述細胞用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理的情況中，沒有誘導血管形成。因此，可以看到CTGF通過所述接頭區(qū)域結合到FPRL1，從而在體外和體內均誘導
血管發(fā)生。10. VEGF-A的FPRLl表汰促講效應基于所述結果，認為CTGF/FPRL1組合可以在血管發(fā)生過程中介導VEGF-A的活性。因此，確認了在HUVEC中VEGF-A是否誘導FPRLl表達。具體地，將HUVEC用20ng/ml的VEGF-A處理，并培養(yǎng)不同的時間，然后根據(jù)〈實驗方法12>進行RT-PCR，測量了 FPRLl表達程度，結果在圖20示出。根據(jù)〈實驗方法7>進行流式細胞計量術分析，結果在圖20示出。將HUVEC用不同濃度的VEGF-A處理，并培養(yǎng)，然后根據(jù)〈實驗方法12>進行RT-PCR，測量了 FPRLl表達程度，結果在圖21示出。根據(jù)〈實驗方法7>進行流式細胞計量術分析，結果在圖21示出。如圖20和圖21所示，可以看到VEGF-A以濃度依賴的方式誘導FPRLl的表達。11. VEGF-A通過CTGF/FPRL1組合講行的血管發(fā)牛誘導效應另外確認了 FPRLl拮抗劑WRW4是否抑制由VEGF-A誘導的血管發(fā)生。從而可以看到在由VEGF-A誘導的血管發(fā)生中涉及FPRLl活化。首先，將20ng/ml的VEGF-A給予HUVEC，通過 < 實驗方法9>確認了細胞增殖、細胞遷移或管形成的程度，結果在圖22-24示出。此時，額外地加入FPRLl拮抗劑WRW4。如圖22所示，可以看到VEGF-A誘導HUVEC的增殖，但是FPRLl拮抗劑WRW4沒有展示出統(tǒng)計學上顯著的對由VEGF-A誘導的HUVEC增殖的抑制。如圖23所示，可以看到VEGF-A誘導HUVEC的遷移，在將所述細胞用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理的情況中，沒有誘導細胞遷移。如圖24所示，可以看到VEGF-A誘導HUVEC的管形成，在將所述細胞用FPRLl拮抗劑WRW4 (IOuM)處理的情況中，沒有誘導管形成。 同時，如〈實驗方法11>所述，使用FPRLl siRNA抑制FPRLl表達，然后根據(jù)〈實驗方法12>進行RT-PCR以測量所述FPRLl表達程度，結果在圖25示出。如圖25所示，可以看到將HUVEC用FPRLl siRNA處理時，F(xiàn)PRLl表達被抑制，在用螢光素酶siRNA作為對照進行處理的情況中，F(xiàn)PRLl表達沒有被抑制。因此，確認了在將HUVEC用FPRLl siRNA處理的情況中，由VEGF-A誘導的細胞遷移或管形成被抑制，結果在圖26和27示出。如圖26和27所示，與將HUVEC用螢光素酶siRNA作為對照進行處理的情況相比，在將HUVEC用FPRLl siRNA處理的情況中，由VEGF-A誘導的細胞遷移或管形成被抑制。通過 < 實驗方法10>確認了，在體內在將HUVEC用FPRLl拮抗劑(10ug/CAM)處理的情況中，VEGF-A (25ng/CAM)的血管發(fā)生活性被抑制，結果在圖28示出。如圖28所示，可以看到FPRLl拮抗劑強烈地抑制由VEGF-A誘導的血管發(fā)生。從所述結果中可以看到，F(xiàn)PRLl對于由VEGF-A誘導的血管發(fā)生是重要的因子，CTGF對于FPRLl的誘導活化是重要的因子。也就是說可以看到，F(xiàn)PRLl和由VEGF-A誘導的CTGF通過相互之間的結合促進內皮細胞遷移和管形成，藉此參與由VEGF-A誘導的血管發(fā)生。
權利要求
1.一種用于促進血管發(fā)生的含有結締組織生長因子蛋白片段或編碼該片段的基因作為活性成分的組合物，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成。
2.根據(jù)權利要求I所述用于促進血管發(fā)生的組合物，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ IDNO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
3.根據(jù)權利要求2所述用于促進血管發(fā)生的組合物，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表示。
4.根據(jù)權利要求I所述用于促進血管發(fā)生的組合物，其中所述基因具有由SEQIDNO. 7或SEQ ID NO. 8表不的喊基序列。
5.根據(jù)權利要求I所述用于促進血管發(fā)生的組合物，其中所述基因被插入到載體中。
6.一種FPRLl (甲酰肽樣受體I)的短干擾RNA (siRNA)，其包括SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 4。
7.一種用于促進血管發(fā)生的組合物，其包括權利要求6所述的siRNA作為其活性成分。
8.一種用于預防或治療心絞痛、動脈粥樣硬化、中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷的組合物，其包括根據(jù)權利要求1-5和7任一項所述的用于促進血管發(fā)生的組合物。
9.一種用于抑制血管發(fā)生的組合物，其含有 選自可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成；或 選自與編碼所述結締組織生長因子蛋白的基因的mRNA互補性結合的反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA的至少一種。
10.根據(jù)權利要求9所述用于抑制血管發(fā)生的組合物，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ IDNO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
11.根據(jù)權利要求10所述用于抑制血管發(fā)生的組合物，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表示。
12.根據(jù)權利要求9所述用于抑制血管發(fā)生的組合物，其中所述編碼所述結締組織生長因子蛋白片段的基因具有SEQ ID NO. 7或SEQID NO. 8的堿基序列，并且所述反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA與由SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的mRNA的連續(xù)15-30個堿基組成的堿基序列互補性結合。
13.一種用于預防或治療癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病或炎癥的組合物，其含有根據(jù)權利要求9-12任一項所述用于抑制血管發(fā)生的組合物作為活性成分。
14.一種用于篩選血管發(fā)生抑制劑的方法,其包括 (a)用候選化合物處理包含編碼結締組織生長因子蛋白片段的基因的細胞，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成； (b)測量所述基因的表達程度， 其中如果與沒有用所述候選化合物處理的細胞相比，在用所述候選化合物處理的所述細胞中，所述基因的表達程度下降，那么所述候選化合物被確定為血管發(fā)生抑制劑。
15.根據(jù)權利要求14所述的篩選方法，其中在所述步驟(b)中，所述基因的表達程度是通過選自免疫熒光方法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質印跡和RT-PCR的方法測量的。
16.根據(jù)權利要求14所述的篩選方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑是用于預防或治療癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜移植排斥、青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病或炎癥。
17.結締組織生長因子蛋白片段或編碼該片段的基因用于促進血管發(fā)生的用途，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成。
18.根據(jù)權利要求17所述的用途，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQIDNO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
19.根據(jù)權利要求18所述的用途，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQIDNO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表示。
20.根據(jù)權利要求17的用途，其中所述基因具有由SEQID NO. 7或SEQ ID NO. 8表示的堿基序列。
21.根據(jù)權利要求17的用途，其中所述基因被插入到載體中。
22.根據(jù)權利要求17-21任一項的用途，其中所述血管發(fā)生促進劑用于預防或治療心絞痛、動脈粥樣硬化、中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷。
23.選自可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成；或 選自與編碼所述結締組織生長因子蛋白的基因的mRNA互補性結合的反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA的至少一種 用于制備血管發(fā)生抑制劑的用途。
24.根據(jù)權利要求23所述的用途，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQIDNO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
25.根據(jù)權利要求23所述的用途，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQIDNO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表示。
26.根據(jù)權利要求24的用途，其中編碼所述結締組織生長因子蛋白片段的所述基因具有SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的堿基序列，并且所述反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA與由SEQ IDNO. 7或SEQ ID NO. 8的mRNA的連續(xù)15-30個堿基組成的堿基序列互補性結合。
27.根據(jù)權利要求23-26任一項的用途，其中所述血管發(fā)生抑制劑用于預防或治療癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病或炎癥。
28.一種用于促進血管發(fā)生的方法，其包括將結締組織生長因子蛋白片段或編碼該片段的基因給予需要促進血管發(fā)生的患者，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成。
29.根據(jù)權利要求28的方法，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
30.根據(jù)權利要求29的用途，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQID NO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表不。
31.根據(jù)權利要求28的方法，其中所述基因具有由SEQID NO. 7或SEQ ID NO. 8表示的堿基序列。
32.根據(jù)權利要求28的方法，其中所述基因被插入到載體中。
33.根據(jù)權利要求28的方法，其中所述需要促進血管發(fā)生的患者需要預防或治療心絞痛、動脈粥樣硬化、中風、血管性癡呆、慢性潰瘍或創(chuàng)傷。
34.一種用于抑制血管發(fā)生的方法，其包括將以下給予需要抑制血管發(fā)生的患者 選自可結合結締組織生長因子蛋白片段的多肽、抗體和化合物中的至少一種，所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQ ID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38個或更多個氨基酸組成；或 選自與編碼所述結締組織生長因子蛋白的基因的mRNA互補性結合的反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA的至少一種。
35.根據(jù)權利要求34的方法，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQID NO. 9氨基酸序列中包含SEQ ID NO. 5氨基酸序列的連續(xù)38-39個氨基酸組成。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述結締組織生長因子蛋白片段由SEQID NO. 5或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列表不。
37.根據(jù)權利要求34的方法，其中所述編碼所述結締組織生長因子蛋白片段的基因具有SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的堿基序列，并且所述反義核苷酸、短干擾RNA (siRNA)和短發(fā)夾RNA與由SEQ IDNO. 7或SEQ ID NO. 8的mRNA的連續(xù)15-30個堿基組成的堿基序列互補性結合。
38.根據(jù)權利要求34的方法，其中所述需要抑制血管發(fā)生的患者需要預防或治療癌生長和轉移、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病、高血壓、子宮內膜異位、肥胖病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜炎癥排斥、新生血管性青光眼、增殖性視網(wǎng)膜病、血友病性關節(jié)病、瘢痕疙瘩、傷口肉芽形成、血管粘附、骨關節(jié)炎、克羅恩病、再狹窄、動脈粥樣硬化、腸粘連、潰瘍、肝硬化、腎炎、惡性腎硬化、器官移植排斥、腎小球病、糖尿病或炎癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及與使用結締組織生長因子的血管發(fā)生相關的藥物組合物；涉及用于促進血管發(fā)生的含有所述結締組織生長因子的藥物組合物，或用于抑制血管發(fā)生的含有選自以下的成分的藥物組合物可結合結締組織生長因子的多肽、抗體和化合物。本發(fā)明中闡述的結締組織生長因子蛋白的片段是結合FPRL1的位點，其可有效地誘導FPRL1特異性的ERK磷酸化，并且通過活化FPRL1來增加細胞內Ca2+濃度，并因而最終具有可有效地誘導血管發(fā)生的作用，因此所述結締組織生長因子的片段可有利地用作促進血管發(fā)生的藥物組合物，而可結合所述結締組織生長因子蛋白的片段的多肽、抗體或化合物可有利地用作抑制血管發(fā)生的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK102958532SQ201180032686
公開日2013年3月6日 申請日期2011年2月21日 優(yōu)先權日2010年4月28日
發(fā)明者柳成浩, 徐判吉, 李美淑, 金完郁 申請人:浦項工科大學校產(chǎn)學協(xié)力團