專利名稱：：抗Cyr61蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，該抗體能與Cyr61蛋白結(jié)合，具有抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞增殖、粘附和遷延的作用，還可用于Cyr61蛋白的體外檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：人Cyr61蛋白(hCyr61)由381個(gè)氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸和脯氨酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為42kDa。目前已知，Cyr61廣泛表達(dá)于多種正常組織細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膀胱及血管平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。此外，Cyr61還在某些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，目前已知的有乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等，是重要的細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)因子，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、粘附、遷移、分化、凋亡等多種功能。由于Cyr61蛋白富含半胱氨酸，在表達(dá)時(shí)容易形成二硫健而導(dǎo)致出現(xiàn)多種構(gòu)象，而且，Cyr61作為重要的基質(zhì)蛋白，保守性很強(qiáng)，在哺乳動(dòng)物之間的同源性很高，尤其是與小鼠的Cyr61同源性高達(dá)93%，因此，制備單抗的技術(shù)難度較高。由于種種原因，到目前為止，世界上只有商業(yè)化的抗Cyr61的多克隆抗體(SantaCrus，USA)，而沒(méi)有單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)制備了2株抗Cyr61單抗，分別為雜交瘤CGMCCNO.2766和CGMCCNO.2767(已經(jīng)申請(qǐng)專利)。為了深入研究Cyr61的功能及進(jìn)行后續(xù)的臨床應(yīng)用，本發(fā)明報(bào)道了新制備和篩選出的單抗4株這4株單抗均為IgGlk型、分別結(jié)合不同的Cyr61蛋白的不同區(qū)片斷、生物學(xué)功能也不同。因此，本發(fā)明中的4株單抗可用于下列研發(fā)應(yīng)用如制備人源化抗體、構(gòu)建用于檢測(cè)人樣本中Cry61表達(dá)量的試劑盒等，有巨大的潛在商業(yè)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，該抗體能與Cyr61蛋白結(jié)合。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體在抑制細(xì)胞增殖、粘附和遷延中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體在Cyr61蛋白體外檢測(cè)中應(yīng)用。本發(fā)明所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其能與Cyr61蛋白C端103-381序列(SEQIDNo1)專一性結(jié)合。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則及GeneBank(NMJ)01554)中公布的人Cyr61全長(zhǎng)cDNA序列2295bp，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，去除信號(hào)肽部分，兩端各加相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)構(gòu)建人Cyr61蛋白(hCyr61(26-381))(SEQIDNo2)表達(dá)載體和人Cyr61蛋白C端103-381(hCyr61(103-381))表達(dá)載體并于工程菌中表達(dá)。雜交瘤技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員制備單克隆抗體所熟知，將具有分泌抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤，使得融合細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性，即成為能夠分泌抗體并能在體外長(zhǎng)期繁殖的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)克隆化后成為單個(gè)細(xì)胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。該技術(shù)一般包括三個(gè)步驟(一)細(xì)胞融合和篩選；(二)培養(yǎng)基培養(yǎng)和篩選，以及(三)細(xì)胞克隆和培養(yǎng)。本發(fā)明使用常用的雜交瘤技術(shù)制備抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，包括按照常規(guī)免疫方法(如腹腔、皮下和靜脈)，在皮內(nèi)注射蛋白抗原(如人Cyr61蛋白)免疫哺乳動(dòng)物，將免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與同種系來(lái)源的骨髓瘤細(xì)胞融合。本發(fā)明中，純化的重組人Cyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠(常規(guī)方法)。于免疫結(jié)束后取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP20/Ag-14在聚乙二醇(PEG)作用下進(jìn)行融合，通過(guò)ELISA篩選穩(wěn)定分泌抗hCyr61的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，ELISA方法鑒定單克隆抗體的亞類和亞型，并比較陽(yáng)性克隆培養(yǎng)上清抗體的效價(jià)。利用純化的人Cyr61N端融合蛋白片段(hCyr61(103-381))包被固相，通過(guò)ELISA方法初步分析篩選出單克隆抗體的結(jié)合表位所在區(qū)域。選擇重鏈亞型為IgGl的雜交瘤細(xì)胞株，通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)及親和層析獲取少量純化抗體，從中再選擇效價(jià)較高的雜交瘤細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔，制備大量高效價(jià)的單克隆抗體，用ProteinA-S印harose柱純化腹水單克隆抗體并定量。最后，通過(guò)WesternBlotting進(jìn)一步明確純化單克隆抗體的特異性及其抗原結(jié)合表位分布區(qū)域。本發(fā)明選擇雜交瘤細(xì)胞株CGMCC3299和CGMCC3300制備抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，所制得的抗體為IgGl亞型k亞類。這些抗體具有抑制抑制人乳腺癌細(xì)胞粘附。本發(fā)明抗Cyr61蛋白的單克隆抗體能與Cyr61蛋白體外檢測(cè)中應(yīng)用，如ELISA方法體外檢測(cè)Cyr61蛋白本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明通過(guò)常用的雜交瘤技術(shù)篩選出2株Cyr61蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)測(cè)定，這些抗Cyr61蛋白的單克隆抗體屬于IgGl，且其輕鏈為k型。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，抗Cyr61蛋白的單克隆抗體具有抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞增殖、黏附和遷延的作用。圖1為表達(dá)人全長(zhǎng)Cyr61的表達(dá)質(zhì)粒pET28(a)_hCyr61構(gòu)建示意圖；圖2A為pET28a-hCyr61重組質(zhì)粒酶切鑒定；圖2B為pET28a-hCyr61重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果；其中A表示T7promoter引物測(cè)序結(jié)果，B表示T7terminator引物測(cè)序結(jié)果；圖上箭頭標(biāo)識(shí)hCyr61上、下游引物所在位置；圖3A為His-hCyr6融合蛋白的表達(dá)鑒定；其中M表示低分子量蛋白Marker;圖3A左圖1、3、5和7表示4個(gè)不同克隆誘導(dǎo)前；2、4、6和8表示4個(gè)不同克隆誘導(dǎo)后；圖3A右圖Pre表示誘導(dǎo)前；IN表示誘導(dǎo)后；CL表示裂解上清；Pellet表示包涵體沉淀，箭頭所示為表達(dá)蛋白；圖3B為His-hCyr61融合蛋白序列測(cè)定；其中方框部分為去除的信號(hào)肽序列，下劃線部分為pET28a(+)載體上帶有組氨酸等序列；圖4A為His-hCyr61融合蛋白的割膠電洗脫純化與鑒定結(jié)果；其中M表示低分子量蛋白Marker,Pre表示誘導(dǎo)前；IN表示誘導(dǎo)后，Pellet表示包涵體裂解液，Elu表示過(guò)層析柱后的洗脫蛋白，Ele表示割膠電洗脫的純化蛋白；圖4B為WesternBlotting鑒定；其中M表示預(yù)染蛋白Marker,1表示pET28a-0VA66m菌體裂解液，2表示pET28a-hCyr61菌體裂解液，3表示割膠電洗脫純化的His-hCyr61重組蛋白；圖5為表達(dá)載體pET28(a)-hCyr61_XN構(gòu)建示意圖；圖6為pET28a-hCyr61-XN重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果其中Mark表示DNA標(biāo)志，1表示pET28a-hCyr61-XN質(zhì)粒，2表示pET28a-hCyr61-XN酶切片斷；圖7A為純化蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果；圖中M表示低分子量蛋白Marker,FL表示純化的His-hCyr61全長(zhǎng)的融合蛋白，XN表示純化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；圖7B為及WesternBlotting鑒定重組His-hCyr61N末端片段；圖中M表示低分子量蛋白Marker,FL表示純化的His-hCyr61全長(zhǎng)的融合蛋白，XN表示純化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；圖8A為9株抗人Cyr61單克隆抗體特異性鑒定；其中His-Cyr61代表以His-Cyr61融合蛋白包被孔測(cè)定雜交瘤培養(yǎng)上清的0D492nm值，His_0VA66代表以His-0VA66m融合蛋白包被孔測(cè)定雜交瘤培養(yǎng)上清的0D492nm值；圖8B為ELISA分析單克隆抗體的亞類及亞型；PAb:免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定其抗體的亞類及亞型；CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300、CGMCC3351;圖8C為SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度與分子量；其中，M表示低分子量蛋白Marker;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)CGMCC3298、CGMCC3351、CGMCC3299和CGMCC3300相對(duì)應(yīng)；圖9A為4株重鏈為IgGl型單克隆抗體的結(jié)合抗原位點(diǎn)的ELISA分析；其中，F(xiàn)L表示hCyr6126—訓(xùn)全長(zhǎng)蛋白包被孔的OD值，XN表示hCyr6126—267包被孔的0D值，XC表示hCyr611Q3—381包被孔的0D值；數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖9B為免疫印跡分析小鼠抗hCyr61單克隆抗體的特異性及對(duì)Cyr61不同片段的結(jié)合；其中，F(xiàn)L表示hCyr6126—381全長(zhǎng)蛋白，XN表示hCyr6126—267，XC表示hCyr61103_381，hCyr61購(gòu)自P印rotech公司的人Cyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白，0VA66m為人卵巢癌相關(guān)腫瘤抗原(作為陰性對(duì)照)；數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖10A為間接免疫熒光法檢測(cè)滑膜細(xì)胞表達(dá)Cyr61蛋白(X400);鼠抗人Cyr61單抗以單克隆抗體CGMCC3298及CGMCC3299為一抗檢測(cè)FLS細(xì)胞中Cyr61蛋白；DAPI表示用DAPI染料顯示細(xì)胞核，Merge表示Cyr61抗體測(cè)定的細(xì)胞圖片與DAPI染核的圖片的疊加；數(shù)字3298和3299分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖10B為抗Cyr61McAb與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達(dá))結(jié)合，而不與MCF-7(Cyr61低表達(dá))結(jié)合天然的Cyr61蛋白特異性的結(jié)合；其中，A表示real-timePCR分析顯示人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為Cyr61高表達(dá)，MCF-7為Cyr61低表達(dá)，B表示W(wǎng)esternBlotting顯示抗Cyr61McAb能與細(xì)胞所表達(dá)的Cyr61特異的結(jié)合，C表示免疫熒光顯示抗Cyr61單抗CGMCC3351能與細(xì)胞所表達(dá)的Cyr61特異的結(jié)合；圖11為細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)人FLS及小鼠NIH3T3細(xì)胞表達(dá)Cyr61蛋白(X200);圖12小鼠抗人Cyr61單克隆抗體對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的抑制作用，*p<0.05，**:p<0.01;*p<0.0001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng);圖13A為hCyr61促進(jìn)滑膜細(xì)胞的粘附并成劑量依賴關(guān)系，*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001;圖13B為不同株單克隆抗體或不同濃度的肝素與hCyr61包被板預(yù)孵育后，檢測(cè)滑膜細(xì)胞的粘附能力的變化，與hCyr61包被孔相比具有顯著差異；其中，R78E4為CGMCC3298;R131E3為CGMCC3299;R220E5為CGMCC3300;R367E10為CGMCC3351*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001;圖14A為3H-TDR摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖，氺p<0.05，**p<0.001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖14B為MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，計(jì)算抑制率X，*p<0.05，**p<0.001;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖15為抗體抑制MDA-MB-231細(xì)胞的粘附，*:P<0.05;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖16為抗體抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移，林P<0.01;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；圖17為抗體抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移作用，**:P<0.01;數(shù)字3298、3351、3299和3300分別與保藏號(hào)相對(duì)應(yīng)；具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自西格瑪_奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實(shí)施例1構(gòu)建表達(dá)人Cyr61全長(zhǎng)(26-381)蛋白質(zhì)粒與蛋白表達(dá)根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則及GeneBank(NM001554)中公布的人Cyr61全長(zhǎng)cDNA序列2295bp，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，去除信號(hào)肽部分，兩端各加相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)。Cyr61全長(zhǎng)(26-381)蛋白的引物上游引物5'-TTGGATCCTGCCCCGCTGCCTGCCACT-3'(劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))；下游引物5'-TTAAGCTTCTAGTCCCTAAATTTGTGAATGTCATT-3'(劃線處為HindIII酶切位點(diǎn))。工程菌BL21(DE3)、表達(dá)載體pET28(a)。將質(zhì)粒pET28(a)分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hind111共消化，根據(jù)常規(guī)連接方法將所擴(kuò)增出的人全長(zhǎng)Cyr61(hCyr61-FL)連接入pET28(a)載體，構(gòu)建質(zhì)粒pET28(a)-hCyr61(見(jiàn)圖1)采用酶切和測(cè)序方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明所構(gòu)建重組質(zhì)粒完全正確，與GenBank上所報(bào)道的序列NM_001554完全一致(見(jiàn)圖2A，酶切鑒定用箭頭標(biāo)出；圖2B，測(cè)序鑒定)。表明所擴(kuò)增片斷與PET28(a)連接正確，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用于后續(xù)質(zhì)粒擴(kuò)增與目的蛋白的表達(dá)。重組人Cyr61全長(zhǎng)表達(dá)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)按照常規(guī)分子克隆方法進(jìn)行。簡(jiǎn)述之挑取單克隆菌落振搖過(guò)夜后接種于5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C250rpm振搖至0D600至0.60.8時(shí)，加入終濃度lmmol/LIPTG誘導(dǎo)3h;SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌液蛋白在45KDa處有明顯的條帶，而未誘導(dǎo)的菌液蛋白無(wú)相應(yīng)條帶(見(jiàn)圖3A左，箭頭所示)。進(jìn)一步收集表達(dá)菌經(jīng)超聲碎菌及高速離心后收集沉淀物并用含有8M尿素的變性裂解液(DSB)徹底溶解后，SDS-PAGE電泳顯示在45KDa處有明顯的條帶表達(dá)(見(jiàn)圖3A右，箭頭所示)。而序列分析顯示，去除信號(hào)肽部分的hCyr61蛋白的分子量約為38.9KDa，而融合蛋白帶有的pET28a(+)載體組氨酸等序列，其分子量約為5.8KDa，故構(gòu)建的His-hCyr61融合蛋白分子量約44.7KDa，與SDS-PAGE凝膠顯示的目的蛋白分子量一致(見(jiàn)圖3B)。重組人Cyr61表達(dá)蛋白純化與鑒定采用上述方法，進(jìn)行大量誘導(dǎo)。收集菌液沉淀，提取包涵體蛋白的裂解上清用protin-2000鎳柱純化，加入不同濃度咪唑洗脫純化蛋白。為了進(jìn)一步得到高純度的蛋白，將含有目的蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE割膠純化?？梢?jiàn)純化后獲得單個(gè)條帶，表明純度很高(圖4A，箭頭所示)。進(jìn)一步采用SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用商品化兔抗人hCyr61抗體作為一抗進(jìn)行WesternBlotting檢測(cè)。結(jié)果顯示，pET28a-hCyr61菌體裂解液及純化后的目的蛋白在45kDa處均有結(jié)合條帶，而陰性對(duì)照的pET28a-0VA66m菌體裂解液無(wú)條帶顯示，表明重組蛋白為目的蛋白(圖4B)。實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)人Cyr61全長(zhǎng)(103-381)蛋白質(zhì)粒與蛋白表達(dá)Cyr61蛋白C端片段的引物(Cyr61-XC-103-381aa)上游引物5'-TTGGATCCGGCTGTCCCAACCCTCGGCTG-3'(劃線處為BamHI酶切位點(diǎn));下游引物5'-TTAAGCTTCTAGTCCCTAAATTTGTGAATGTCATT-3'(劃線處為HindIII酶切位點(diǎn))；工程菌BL21(DE3)，表達(dá)載體pET28(a)。將質(zhì)粒pET28(a)分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII共消化，根據(jù)常規(guī)連接方法將所擴(kuò)增出的人Cyr61近C端2/3片段(hCyr61-XC-103-381aa)分別插入pET28(a)載體中，獲得相應(yīng)重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hCyr61-XC(見(jiàn)圖5)。His-Cyr61C末端片段重組質(zhì)粒的鑒定抽提類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞的總RNA，通過(guò)RT-RCR方法獲取cDNA，利用針對(duì)N末端及C末端的兩對(duì)引物PCR擴(kuò)增得到Cyr61-XCDNA片段，分別與經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切回收的pET28(a)載體進(jìn)行連接反應(yīng)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后，抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒做酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明Cyr61-XN基因?yàn)?16bp(圖6，箭頭所示)，而與GeneBank中序列比對(duì)，可見(jiàn)上述片斷分別位于Cyr61基因序列的638-1353nt，而且酶切結(jié)果表明與pET28(a)連接正確，符合預(yù)期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。His-Cyr61N末端融合蛋白片段的表達(dá)純化及鑒定采用與人全長(zhǎng)Cyr61蛋白表達(dá)和純化的相同方法，誘導(dǎo)表達(dá)hCyr61-XC融合蛋白片段，并將純化的hCyr61-XC融合蛋白片段進(jìn)行蛋白印跡分析。結(jié)果表明純化后的hCyr61-XC融合蛋白片段在35kDa處，hCyr61-FL(人Cyr61全長(zhǎng)蛋白)條帶位于45kDa(圖7A);蛋白印跡分析表明該35kDa左右片段與hCyr61-FL(人Cyr61全長(zhǎng)蛋白)相同，均能與市售抗Cyr61蛋白特異性結(jié)合(圖7B)，符合預(yù)期實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。上述結(jié)果表明獲得了hCyr61皿—381并誘導(dǎo)這個(gè)蛋白片段的表達(dá)，通過(guò)層析柱洗脫獲得純度相對(duì)高的目的蛋白，用于后續(xù)單克隆抗體表位的初步篩選。實(shí)施例3小鼠抗人Cyr61單克隆抗體的制備與結(jié)合部位分析BABC/c小鼠雌性，68周齡4只及810周齡以上50只，由中國(guó)科學(xué)院上海科學(xué)研究院動(dòng)物中心提供。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP20/Ag-14，為傳代保存。按照常規(guī)單抗制備方法制備，用作鑒定用Cyr61蛋白為商品化重組人Cyr61蛋白(P印roTechInc.NewJersey,USA，Cat:120-25)。按照常規(guī)免疫方法，用自制人His-hCyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠并取小鼠脾細(xì)胞，按照經(jīng)典方法進(jìn)行細(xì)胞融合。經(jīng)連續(xù)5次亞克隆和ELISA篩選，其中9株雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌特異性抗人Cyr61抗體(僅與純化或者His-hCyr61反應(yīng)，而不結(jié)合His，也不與His-0VA66m結(jié)合)(見(jiàn)圖8A)。進(jìn)一步鑒定其抗體的類型，其中5株亞型為IgM類k型，另外4株亞型為IgGl類k型(分別命名為CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300和CGMCC3351(見(jiàn)圖8B)。采用這4株單抗雜交瘤制備腹水(常規(guī)方法)，經(jīng)ProteinA-S印harose親和層析后，進(jìn)行SDS-page電泳，結(jié)果表明這4株單抗的重鏈均位于52kD左右，而輕鏈位于27kD左右，再次驗(yàn)證這4株單克隆抗體的類型為IgGl類k型(圖8C)。單克隆抗體的結(jié)合表位分析用原核表達(dá)純化的His-hCyr61全長(zhǎng)及其N末端hCyr6126—267、C末端片段hCyr611Q3—381包被ELISA板，分別測(cè)定4株IgGl類雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體與上述不同抗原的結(jié)合能力。進(jìn)一步采用蛋白印跡法進(jìn)行確定。結(jié)果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351僅結(jié)合hCyr61全長(zhǎng)和N末端，而對(duì)C末端無(wú)結(jié)合能力，提示這兩株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合表位位于hCyr61蛋白的N末端26103aa之間，故其不與C末端103267片段結(jié)合；單克隆抗體CGMCC3299和CGMCC3300對(duì)3種蛋白均有結(jié)合能力，提示這CGMCC3299和CGMCC3300的結(jié)合表位位于hCyr61蛋白N末端和C末端片段的重疊部位即103267aa之間，故其和N末端hCyr6126—267(XN)及C末端片段hCyr611Q3—381(XC)均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而與陰性對(duì)照0VA66蛋白無(wú)結(jié)合。ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9A，蛋白印跡結(jié)果見(jiàn)圖9B。4株抗體效價(jià)與親和力測(cè)定分別采用商業(yè)化無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4株雜交瘤，收集上清，用Bethyl抗體定量法和ELISA法測(cè)定了抗體的濃度與效價(jià)。采用Biocore方法分析了這4株抗體的親和力。結(jié)果見(jiàn)表l。表14株IgGl雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗人Cyr61抗體濃度、效價(jià)和親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例4抗人Cyr61單克隆抗體功能類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞來(lái)自于關(guān)節(jié)置換手術(shù)的廢棄滑膜(病人均經(jīng)過(guò)知情同意與醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò))。BALB/c小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231，均為傳代保存。細(xì)胞培養(yǎng)等方法見(jiàn)結(jié)果中簡(jiǎn)述。與人細(xì)胞中Cyr61蛋白結(jié)合能力以純化的4株小鼠抗人Cyr61單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300、CGMCC3351)作為一抗，通過(guò)間接免疫熒光法測(cè)定制備的單克隆抗體與胞漿Cyr61的結(jié)合能力，結(jié)果證實(shí)該抗體能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜細(xì)胞胞漿的Cyr61蛋白結(jié)合，細(xì)胞核無(wú)熒光顯示。圖10A顯示CGMCC3298、CGMCC3299的熒光檢測(cè)結(jié)果。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了制備單克隆抗體的特異性，同時(shí)也證實(shí)了RA病人滑膜細(xì)胞高表達(dá)Cyr61蛋白，與既往的RealtimePCR及WesternBlotting測(cè)定結(jié)果相符。同樣，4株單抗均能與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達(dá))結(jié)合，而不與MCF-7(Cyr61低表達(dá))結(jié)合。圖10B顯示CGMCC3351與人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(Cyr61高表達(dá))結(jié)合，而不與MCF-7(Cyr61低表達(dá))結(jié)合的熒光檢測(cè)結(jié)果。與小鼠3T3細(xì)胞胞內(nèi)Cyr61蛋白結(jié)合能力由于人Cyr61蛋白與小鼠Cyr61同源性高達(dá)93%。由此，本發(fā)明中制備CGMCC3298單克隆抗體作為一抗，通過(guò)間接法檢測(cè)，同時(shí)測(cè)定人滑膜成纖維細(xì)胞和小鼠3T3細(xì)胞胞內(nèi)Cyr61蛋白。如圖11所示，兩種細(xì)胞顯色均呈陽(yáng)性，而無(wú)關(guān)抗體作為一抗的細(xì)胞不顯色，提示該抗體即可特異性結(jié)合人Cyr61蛋白又與小鼠的Cyr61蛋白具有交叉反應(yīng)性。這一方面顯示制備抗Cyr61單抗的難度，另一方面表明在后續(xù)的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，抗人Cyr61抗體阻斷小鼠的腫瘤和關(guān)節(jié)炎發(fā)病具有可行性和理論依據(jù)。對(duì)類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞的作用(1)、抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞增殖在正常血清培養(yǎng)的類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞中，分別加入不同濃度的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，3H-TdR摻入方法檢測(cè)這4株單抗對(duì)于其增殖的作用。結(jié)果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351對(duì)于滑膜細(xì)胞增殖有抑制作用，而且呈典型的濃度依賴性。而CGMCC3299及CGMCC3300無(wú)此作用(見(jiàn)圖12)。(2)、抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞粘附Cyr61作為一種基質(zhì)蛋白，能促進(jìn)多種細(xì)胞的粘附，并因此而參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及損傷修復(fù)等病理生理過(guò)程。但是對(duì)于Cyr61促進(jìn)滑膜細(xì)胞的粘附尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明中測(cè)定了所制備4株單抗對(duì)于人類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞粘附的作用。首先采用不同濃度的人Cyr61標(biāo)準(zhǔn)蛋白包板，通過(guò)粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cyr61能促進(jìn)滑膜細(xì)胞的粘附并成劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖13A)。然后用所制備的4株小鼠抗人Cyr61蛋白與包被Cyr61蛋白預(yù)孵育，再加入類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞檢測(cè)其黏附作用的改變。結(jié)果顯示，單克隆抗體CGMCC3299及CGMCC3300具有明顯抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞粘附的作用，并以CGMCC3299的抑制效果更明顯，而單克隆抗體CGMCC3298及CGMCC3351的抑制作用不顯著(見(jiàn)圖14B)。因?yàn)镃yr61是一種肝素結(jié)合蛋白，其促進(jìn)細(xì)胞粘附的作用有賴于其肝素結(jié)合位點(diǎn)。因此，采用低分子量肝素與Cyr61蛋白預(yù)作用作為陽(yáng)性對(duì)照，可見(jiàn)肝素顯著抑制Cyr61促滑膜細(xì)胞的粘附作用，并成劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖13B)。對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的作用(1)抑制人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231體外增殖在正常血清培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞中，分別加入不同濃度的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，3H_TdR摻入法和MTT法檢測(cè)這4株單抗對(duì)于其增殖的作用。結(jié)果表明單克隆抗體CGMCC3298和CGMCC3351對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞增殖有抑制作用，而且呈典型的濃度依賴性。而CGMCC3299及CGMCC3300無(wú)此作用(見(jiàn)圖14)。CGMCC3298CGMCC3351CGMCC3299CGMCC3300(2)、抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231粘附作用將Cyr61蛋白以4ug/ml，100ul/well包板，4。過(guò)夜。經(jīng)1%BSA封閉2h，PBS洗滌后加入lug/孔的4株單克隆抗體(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)，37°孵育lh后，加入5Xl(^的細(xì)胞/孔，37。孵育lh后結(jié)晶紫染色、2XSDS溶解結(jié)晶，0D550檢測(cè)。結(jié)果顯示抗體CGMCC3299有抑制細(xì)胞粘附的作用，而其他3株(CGMCC3298、CGMCC3300及CGMCC3351)無(wú)明顯作用(見(jiàn)圖15)。(3)、抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231遷移采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察抗體對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響。在Transwell下室里加入條件培養(yǎng)液(MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)液)O.8ml，同時(shí)分別加入4株單抗(CGMCC3298、CGMCC3299、CGMCC3300及CGMCC3351)和對(duì)照IgGl單抗(濃度為10ug/ml);在培養(yǎng)上層加入2XIOV孔的MDA-MB-231細(xì)胞。于孵育4h后吸棄上層液體，4%多聚甲醛固定15min，棉簽拭去膜上層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色20分鐘。鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示4株單抗中，只有CGMCC3351具有明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移的作用(見(jiàn)圖16)。(3)、抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231侵襲生長(zhǎng)在Transwell的上層小室里鋪膠100ul、下室仍加入條件培養(yǎng)液(MDA_MB_231細(xì)胞培養(yǎng)液)0.8ml和4株單抗及對(duì)照IgGl單抗(濃度均為10ug/ml)。將MDA-MB-231細(xì)胞加入上層(5XIOV孔)，26h后吸棄上層液體，4%多聚甲醛固定15min，棉簽拭去膜上層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色20分鐘。鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示4株單抗中，只有CGMCC3351具有明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移的作用(見(jiàn)圖17)。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明篩選得到的抗人Cyr61單克隆抗體生物學(xué)特性見(jiàn)表2表24株抗人Cyr61單克隆抗體生物學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>序列表〈110〉上海免疫學(xué)研究所〈120〉抗Cyr61蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用〈130>LBJ.HF.9012〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>SEQIDNo1〈211>279〈212>PRT〈213>Cyr61蛋白C端103-381序列〈400>1AsnSerArglieTyrGinAsnGlyGluSerPheGinProAsnCysLysHisGinCysThrCyslie15101520AspGlyAlaValGlyLeuGlyCysProAsn254045ProArgLeuValLysAspSerlieLys65AspProMetGluAspGinAspGlyLeuLeuGlyLysGluLeuGlyPheAspAlaSerGluValGluLeu7075808590ThrArgAsnAsnGluLeulieAlaValGlyLysGlySerSerLeuLysArgLeuCyslieProLeuCysProGinGluLeuSerLeuProAsn3035ValThrGlyGinCysCysGluGluTrpValCysAspGlu505560ProVal110ThrThr130ProGlu155SerSer175AlaGly200CysThr220AsnVal245ProPhe265PheGly95100105LeuTyrAsnProLeuGinGlyGinLysCyslieValGin120125CysGlyThrGlylieSerThrArgValThrAsnAspAsn140145150ArglieCysGluValArgProCysGlyGinProValTyr165170LysThrLysLysSerProGluProValArgPheThrTyr185190195ArgProLysTyrCysGlySerCysValAspGlyArgCys210215MetArgPheArgCysGluAspGlyGluThrPheSerLys230235240lieGinSerCysLysCysAsnTyrAsnCysProHisAlaAsnGluAlaAlaPheTyrArgLeu250255260270PheAsnAsplieHisLysPheArgAsp275〈210>SEQIDNo2〈211>356〈212〉PRT〈213〉人Cyr61蛋白26-381序列<400>2CysProAlaAlaCysHisCysProLeuGluAlaProLysCysAlaProGlyValMetGluProArglieSerTrpSer115135GinCysSerLysThrCysArgLeuValLysGluThrLeuLysLys160180GlyLysLysCysSerCysLeuSerValLysLysTyrProGinLeu205225ThrArgThrValLysMetMetGlyLeuValArg15101520AspGlyCysGlyCysCysLysValCysAlaLysGinLeuAsnGluAspCysSerLysThrGinProCys2530354045AspHisThrLysGlyLeuGluCysAsnPheGlyAlaSerSerThrAlaLeuLysGlylieCysArg50556065AlaGinSerGluGlyArgProCysGluTyrAsnSerArglieTyrGinAsnGlyGluSerPheGinPro7075808590AsnCysLysHisGinCysThrCyslieAspGlyAlaValGlyCyslieProLeuCysProGinGlu95100105110LeuSerLeuProAsnLeuGlyCysProAsnProArgLeuValLysValThrGlyGinCysCysGluGlu115120125130135TrpValCysAspGluAspSerlieLysAspProMetGluAspGinAspGlyLeuLeuGlyLysGlu140145150155LeuGlyPheAspAlaSerGluValGluLeuThrArgAsnAsnGluLeulieAlaValGlyLysGlySer160165170175180SerLeuLysArgLeuProValPheGlyMetGluProArglieLeuTyrAsnProLeuGinGlyGin185190195200LysCyslieValGinThrThrSerTrpSerGinCysSerLysThrCysGlyThrGlylieSerThrArg205210215220225ValThrAsnAspAsnProGluCysArgLeuValLysGluThrArglieCysGluValArgProCys230235240245GlyGinProValTyrSerSerLeuLysLysGlyLysLysCysSerLysThrLysLysSerProGluPro250255260265270ValArgPheThrTyrAlaGlyCysLeuSerValLysLysTyrArgProLysTyrCysGlySerCys275280285290ValAspGlyArgCysCysThrProGinLeuThrArgThrValLysMetArgPheArgCysGluAspGly295300305310315GluThrPheSerLysAsnValMetMetlieGinSerCysLysCysAsnTyrAsnCysProHisAla320325330335AsnGluAlaAlaPheProPheTyrArgLeuPheAsnAsplieHisLysPheArgAsp34034535035權(quán)利要求一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體與Cyr61蛋白SEQIDNo1特異結(jié)合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC3299或CGMCC3300制得。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC3299制得的腹水型抗Cyr61蛋白的單克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1X109。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC3300制得的腹水型抗Cyr61蛋白的單克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1X107。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體為IgGl。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體輕鏈為k型。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞增殖、黏附和遷延中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在Cyr61蛋白體外檢測(cè)中應(yīng)用9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，在ELISA體外檢測(cè)Cyr61蛋白中的應(yīng)用。10.—種Cyr61蛋白的ELISA檢測(cè)方法，包括權(quán)利要求1所述的抗Cyr61蛋白的單克隆抗體。全文摘要一種抗Cyr61蛋白的單克隆抗體，由雜交瘤細(xì)胞株CGMCC3299或CGMCC3300制得，能與Cyr61蛋白C端SEQIDNo1特異結(jié)合。該抗Cyr61蛋白單克隆抗體可用于抑制類風(fēng)關(guān)滑膜細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附和遷延，還可用于Cyr61蛋白的體外檢測(cè)。文檔編號(hào)A61K39/395GK101709089SQ200910199938公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年12月4日優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日發(fā)明者李寧麗,林錦驃,沈佰華,王利申請(qǐng)人:上海市免疫學(xué)研究所