專利名稱：作為蛋白激酶抑制劑的嘧啶衍生物的制作方法
作為蛋白激酶抑制劑的嘧啶衍生物本發(fā)明涉及取代的嘧啶衍生物及其在治療中的用途。更具體地，但不是排他地，本 發(fā)明涉及能夠抑制一種或多種蛋白激酶(尤其是polo-樣激酶)的化合物。發(fā)明背景 Polo-樣激酶家族由在控制進(jìn)入有絲分裂和控制有絲分裂過程進(jìn)程的具有整合作 用的關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)酶組成。許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的PLK1，且對靶向該蛋白的反義 寡核苷酸有響應(yīng)。有絲分裂的起始需要激活促M-期因子(MPF)，即⑶Kl和B-型細(xì)胞周期蛋白之間 的復(fù)合物[Nurse，P. (1990) Nature，344，503-508]。后者在細(xì)胞周期的S和G2期聚集，并通 過TOEl、MIK1和MYTl激酶促進(jìn)MPF復(fù)合物的抑制磷酸化。在G2期的最后，通過雙重-特異 性磷酸酶CDC25C的相應(yīng)的去磷酸化引發(fā)MPF的激活[Nigg，E. Α. (2001)Nat. Rev. Mol. Cell Biol. ,2, 21-32] 0在分裂期間，細(xì)胞周期蛋白B集中在細(xì)胞質(zhì)，且在前期期間進(jìn)行磷酸化， 然后核轉(zhuǎn)運。認(rèn)為在前期期間活化的MPF的核聚集對于引發(fā)M-期事件是重要的[Takizawa， C. G.和 Morgan，D. 0. (2000) Curr. Opin. Cell Biol.，12，658-665]。然而，核 MPF 由 WEEl 保 持無活性，除非由CDC25C解除。磷酸酶CDC25C本身(在分裂期間集中在細(xì)胞質(zhì))，在前期 聚集在核中。細(xì)胞周期蛋白B和CDC25C通過由PLKl磷酸化進(jìn)入核[Roshak，A. K. ,Capper, Ε. Α. , Imburgia, C. , Fornwald, J. , Scott, G.禾口 Marshall, L. Α. (2000)Cell. Signalling, 12,405-411]。因此，該激酶M-期起始的重要調(diào)節(jié)劑。在人中，存在三種密切相關(guān)的polo-樣激酶(PLK) [Glover, D. Μ.，Hagan, I. Μ.和 Tavares, Α. Α. (1998) Genes Dev.，12，3777-3787]。它們包含高度同源的N-末端催化激酶 域，且它們的C-末端包含2或3個保守域(polo盒)。polo盒的功能尚不完全清楚，但是 對于適合的中期/后期轉(zhuǎn)變和胞質(zhì)分裂需要polo盒_依賴性PLKl活性[Seong，Y. -S.， Kamijo, K. , Lee, J. -S. , Fernandez, Ε. , Kuriyama, R. , Miki, Τ.禾口 Lee, K. S. (2002) J. Biol. Chem.，277，32282-32293]。三種PLK中，PLKl的表征是最充分的；其調(diào)節(jié)許多細(xì)胞分裂周 期效果，包括有絲分裂的開始、DNA-破壞檢查點活化(damage checkpointactivation)、后 期促進(jìn)復(fù)合物的調(diào)節(jié)、蛋白酶體的磷酸化，和中心體復(fù)制和成熟。哺乳動物PLK2(也稱為 SNK)和PLK3 (也稱為PRK和FNK)最初表現(xiàn)為立即早期基因產(chǎn)物。PLK3激酶活性在S期 后期和G2期達(dá)到最高。其在DNA-破壞檢查點活化期間也被激活，并產(chǎn)生氧化應(yīng)激。PLK3 在細(xì)胞中調(diào)節(jié)微管動態(tài)和中心體功能中起重要作用，且解除管制的(deregulated)PLK3 的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期停止和凋亡[Wang，Q.，Xie, S.，Chen, J.，F(xiàn)ukusawa, K.，Naik, U.， Traganos, F. , Darzynkiewicz, Ζ. , Jhanwar-Uniyal, M.禾口 Dai, W. (2002)Mol. Cell. Biol., 22，3450-3459]。PLK2是三種PLK中了解最少的同族體。PLK2和PLK3均可具有其它重要 的后有絲分裂功能[Kauselmann, G.，ffeiler, Μ.，Wulff, P.，Jessberger, S.，Konietzko, U.，Scafidi, J.，Staubli, U.，Bereiter-Hahn, J.，Strebhardt, K.和 Kuhl，D. (1999)EMBO J. ，18,5528-5539]。人PLK調(diào)節(jié)有絲分裂的一些重要方面的事實通過抗-PLKl抗體微注射人腫瘤細(xì)胞 表現(xiàn)出來[Lane, H. Α.和 Nigg，Ε. Α. (1996) J. Coll. Biol.，135，1701-1713]。該處理對于DNA復(fù)制沒有作用，但損害細(xì)胞分裂。細(xì)胞有絲分裂中停止，且表現(xiàn)出凝聚染色質(zhì)和單星微 管(從復(fù)制但未分離的中心體成核)的異常分布。相反，非-無限增殖的人細(xì)胞在G2期作 為單個的單核細(xì)胞停止。而且，當(dāng)PLK1功能通過腺病毒_介導(dǎo)的顯性負(fù)相基因的遞送被阻 斷時，觀察到在許多腫瘤細(xì)胞系中的腫瘤選擇性凋亡，相反正常上皮細(xì)胞(雖然在有絲分 裂中停止)再次逃離在腫瘤細(xì)胞中觀察到的有絲分裂破壞[Cogswell，J. P.，Brown, C. E.， Bisi, J. E.和Neill，S. D. (2000)Cell Growth Differ.，11，615-623]。因此，對于在G2期晚 期/前早期中心體的功能成熟以及隨后兩極紡錘體的建立，需要PLK1活性。而且，這些結(jié)果 表明對PLK1損傷敏感的中心體-成熟檢查點存在于正常細(xì)胞中。通過小干擾RNA(siRNA) 技術(shù)消耗細(xì)胞PLK1也證明對于多重有絲分裂進(jìn)化成和胞質(zhì)分裂的完成需要該蛋白[Liu， X.和 Erikson，R. L. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100，5789-5794]。還通過與 PLK1-特 異性反義核苷酸的作用表明了對于PLK抑制的可能的治療原理，其表現(xiàn)出誘導(dǎo)體內(nèi)和體外 癌細(xì)胞的生長抑制[Spankuch-Schmitt，B.，Wolf, G.，Solbach, C.，Loibl, S.，Knecht, R.， Stegmuller, M. , vonMinckwitz, G. , Kaufmann, M.禾口 Strebhardt, K. (2002)Oncogene,21, 3162-3171]。PLK1在哺乳動物細(xì)胞中的組成型表達(dá)表現(xiàn)出導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化[Smith，M. R.， Wilson, M. L. , Hamanaka, R. , Chase, D. , Kung, H. , Longo, D. L.禾口 Ferris, D. K. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun.，234，397-405]。而且，經(jīng)常在人腫瘤中觀察到 PLK1 的過 表達(dá)，且PLK1表達(dá)對于患有不同類型的腫瘤的患者具有預(yù)后價值[Takahashi，T.，Sano, B. , Nagata, T. , Kato, H. , Sugiyama, Y. , Kunieda, K. , Kimura, M. , Okano, Y.禾口 Saji, S. (2003) Cancer Science, 94,148-152 ；Tokumitsu, Y. , Mori, M. , Tanaka, S. , Akazawa, K., Nakano, S.禾口 Niho，Y. (1999) Int. J. Oncol.，15，687—692 ；Wolf, G. , Elez,R. , Doermer, A.， Holtrich, U. , Ackermann, H. , Stutte, H. J. , Altmannsberger, H. -M. , Riibsamen-ffaigmann, H.和 Strebhardt, K. (1997)Oncogene,14，543-549]。雖然已經(jīng)理解了藥理學(xué)PLK抑制的治療可能[Kraker，A. J.和Booher，R. N. (1999) In Annual Reports in Medicinal Chemistry(Vol. 34) (Doherty,A. M. ,ed.),pp.247-256, Academic Press]，但是至今幾乎沒有報導(dǎo)過涉及可用作藥物的小分子PLK抑制劑。至今 非常少的表征的生化PLK1抑制劑中的一個是scytonemin，一種對稱吲哚海洋天然產(chǎn)物 [Stevenson, C. S. , Capper, E. A. , Roshak, A. K. , Marquez, B. , Eichman, C. , Jackson, J. R., Mattern, M. , Gerwick, ff. H. , Jacobs, R. S.禾口 Marshall, L. A. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. ,303,858-866 ；Stevenson, C. S. , Capper, E. A. , Roshak, A. K. , Marquez, B. , Grace, K. , Gerwick, ff. H. , Jacobs, R. S.禾口 Marshall, L. A. (2002)Inflammation Research,51, 112-114]。Scytonemin通過重組PLK1抑制CDC25C的磷酸化，其IC5(1值為約2 y M(10 y M的 ATP濃度)。抑制是明顯可逆的，且機(jī)理關(guān)于混合-競爭型ATP。對于其它蛋白絲氨酸/蘇 氨酸_和雙重特異性細(xì)胞周期激酶(包括MYT1、CHK1、⑶K1/細(xì)胞周期蛋白B和PKC)觀察 到類似的效力。Scytonemin表現(xiàn)出對體外多種人細(xì)胞系的顯著的抗增殖作用。其它小分 子PLK抑制劑及其在治療增生性疾病中的用途描述于Cyclacel Limited的國際專利申請 W02004/067000 中。本發(fā)明為了尋求開發(fā)新的小分子PLK抑制劑。更具體的，本發(fā)明為了提供在治療 一系列的增生性疾病中具有治療作用的為了提供小分子PLK抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面涉及式VIII化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中X 為 NR7;Y 為 0 或 N_(CH2)nR19 ；n為 1、2或3;m為 1 或2;R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R19為H、烷基、芳基或環(huán)烷基；R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。本發(fā)明第二方面涉及式VI化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R18為H或烷基，其中所述烷基任選被R6取代；每個R6獨立地為OR8或鹵素；且
R7和R8各自獨立地為H或烷基。本發(fā)明第三方面涉及式VII化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。本發(fā)明第四方面涉及化合物，其選自 本發(fā)明第五方面涉及藥物組合物，其包含上述化合物，混合有可藥用稀釋劑、賦形 劑或載體。本發(fā)明第六方面涉及上述化合物在制備用于治療增生性疾病的藥物中的用途。本發(fā)明第七方面涉及一種治療增生性疾病的方法，所述方法包括向受試者給藥治 療有效量的上述化合物。本發(fā)明第八方面涉及一種治療PLK-依賴性疾病的方法，所述方法包括向受試者 給藥治療有效量的上述化合物。本發(fā)明第九方面涉及制備上述化合物的方法。發(fā)明詳述本文所用的術(shù)語“烷基”包括飽和的直鏈和支鏈烷基，其可被(單-或多_)取代 或未被取代。優(yōu)選地，烷基為C^烷基，更優(yōu)選為Ci_15烷基，更優(yōu)選為Ci_12烷基，更優(yōu)選為 (V6烷基，更優(yōu)選為cv3烷基。尤其優(yōu)選的烷基包括，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。適合取代基包括，例如，一個或多個R6基團(tuán)。優(yōu)選地，烷基未 被取代。本文所用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指環(huán)狀烷基，其可被(單-或多_)取代或未被取代。 優(yōu)選地，環(huán)烷基為c3_12環(huán)烷基，更優(yōu)選為c3_6環(huán)烷基。適合的取代基包括，例如，一個或多個
R6基團(tuán)。本文所用的術(shù)語“芳基”是指(6_12芳香基團(tuán)，其可被(單-或多_)取代或未被取 代。典型的實例包括苯基和萘基等。適合取代基包括，例如，一個或多個R6基團(tuán)。
式VIII化合物
如上所述，本發(fā)明一方面涉及式VIII化合物，或其可藥用鹽或酯。
在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及式villa化合物，或其可藥用鹽或酯，
NAr19

Me。
(Villa)
其中 X 為 NR7 ；
R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；
R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或
R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；
R19為H、烷基、芳基或環(huán)烷基；
R6為OR8或鹵素；且
R7和R8各自獨立地為H或烷基。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R19為H、烷基或環(huán)烷基。
優(yōu)選地，R1為H或烷基，更優(yōu)選為烷基。甚至更優(yōu)選，R1為甲基或乙基，更優(yōu)選為
優(yōu)選地，R2為環(huán)烷基，更優(yōu)選為C3_6環(huán)烷基。甚至更優(yōu)選，R2為環(huán)戊基或環(huán)己基，更 優(yōu)選為環(huán)戊基。優(yōu)選地，R7為H或烷基，更優(yōu)選為H或甲基，甚至更優(yōu)選為H。在一個優(yōu)選的實施方案中，R4和R4'之一為烷基，且另一個為H或烷基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'各自獨立地為烷基。更優(yōu)選，R4和R4'均為甲基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'均為H。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基，更優(yōu)選為螺C3_6環(huán)烷基。 甚至更優(yōu)選，R4和R4' —起形成螺C3或C4環(huán)烷基，更優(yōu)選為C3環(huán)烷基。

在一個優(yōu)選的實施方案中，R6為0R8，甚至更優(yōu)選為OMe。 優(yōu)選地，R19為環(huán)丙基。
在另一個尤其優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及式Vlllb化合物，或其可藥用鹽或酯，
其中R1、R2、R6、R4、R4'和X如上定義。
在另一個尤其優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及式VIIIc化合物，或其可藥用鹽或酯，
其中X、R1、R2、R6、R4、R4'和R19如上定義。
在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，所述式VIII化合物選自 及其可藥用鹽和酯。更優(yōu)選，式VIII化合物選自 或其可藥用鹽或酯。甚至更優(yōu)選，本發(fā)明的化合物為化合物[371]。式VII化合物本發(fā)明的一個方面涉及式VII化合物，或其可藥用鹽或酯，
(VII)其中
X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；且R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。優(yōu)選地，R1為烷基，更優(yōu)選為甲基。優(yōu)選地，R2為環(huán)烷基，更優(yōu)選為C3_6環(huán)烷基。甚至更優(yōu)選，R2為環(huán)戊基或環(huán)己基，更 優(yōu)選為環(huán)戊基。優(yōu)選地，R7為H或烷基，更優(yōu)選為H或甲基，甚至更優(yōu)選為H。在一個優(yōu)選的實施方案中，R4和R4'之一為烷基，且另一個為H或烷基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'各自獨立地為烷基。更優(yōu)選，R4和R4'均為甲基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'均為H。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基，更優(yōu)選為螺C3_6環(huán)烷基。 更優(yōu)選，R4和R4' —起形成螺C3或C4環(huán)烷基，甚至更優(yōu)選為C3環(huán)烷基。優(yōu)選地，R6為0R8，甚至更優(yōu)選為OMe。在一個優(yōu)選的實施方案中，式VII化合物選自 及其可藥用鹽和酯。式VI化合物本發(fā)明的一方面涉及式VI化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中X 為 NR7;R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'之一為烷基，且另一個為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R18為H或烷基，其中所述烷基任選被R6取代；每個R6獨立地為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。優(yōu)選地，R1為烷基，更優(yōu)選為甲基。優(yōu)選地，R2為環(huán)烷基，更優(yōu)選為C3_6環(huán)烷基。甚至更優(yōu)選，R2為環(huán)戊基或環(huán)己基，更 優(yōu)選為環(huán)戊基。優(yōu)選地，R7為H或烷基，更優(yōu)選為H或甲基，甚至更優(yōu)選為H。在一個優(yōu)選的實施方案中，R4和R4'之一為烷基，且另一個為H或烷基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'各自獨立地為烷基。更優(yōu)選，R4和R4'均為甲基。
在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4'均為H。在另一個優(yōu)選實施方案中，R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基，更優(yōu)選為螺C3_6環(huán)烷基。 甚至更優(yōu)選，R4和R4' —起形成螺C3或C4環(huán)烷基，甚至更優(yōu)選為C3環(huán)烷基。優(yōu)選地，R6為OMe或F。優(yōu)選地，R18為甲基或CH2CH20H。在一個優(yōu)選的實施方案中，式VI化合物選自 及其可藥用鹽和酯。在一個尤其優(yōu)選實施方案中，所述化合物為[254]，或其可藥用鹽或酯。在一個高度優(yōu)選實施方案中，所述化合物為化合物[254]的HCl鹽，即4_(9'-環(huán) 戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺.HC1。本發(fā)明的另一方面涉及化合物，其選自 及其可藥用鹽和酯。優(yōu)選地，所述化合物選自 及其可藥用鹽和酯。有利地，本發(fā)明的一些化合物與本領(lǐng)域以前已知的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物相比對一種 或多種激酶表現(xiàn)出改善的選擇性。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物對一種或多種激酶相比于一種或多種其 它激酶表現(xiàn)出選擇性。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物相比于一種或多種其它蛋白激酶 能夠優(yōu)先抑制PLK家族激酶；因此，所述化合物相比于一種或多種其它蛋白激酶能夠“選擇 性”抑制PLK家族激酶。本文所用的術(shù)語，“選擇性”是指相比于一種或多種其它蛋白激酶 對PLK具有選擇性的化合物。優(yōu)選地，對PLK家族激酶與一種或多種其它蛋白激酶的選擇性 比為大于約2 1，更優(yōu)選大于約5 1或約10 1，甚至更優(yōu)選大于約20 1，或50 1 或100 1。選擇性比可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物表現(xiàn)出對于PLK1的選擇性。因此， 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物相比于一種或多種其它蛋白激酶能夠優(yōu)先抑制 PLK1。優(yōu)選地，對于PLK1與一種或多種其它蛋白激酶的選擇性比為大于約2 1，更優(yōu)選大 于約5 1或約10 1，甚至更優(yōu)選大于約20 1，或50 1或100 1。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物相比于PLK2和/或PLK3表現(xiàn)出對于 PLK1的選擇性。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物相比于PLK2和/或PLK3能 夠優(yōu)選抑制PLK1。優(yōu)選地，對于PLK1與PLK2和/或PLK3的選擇性比為大于約2 1，更 優(yōu)選大于約5 1或約10 1，甚至更優(yōu)選大于約20 1，或50 1或100 1。示例性地列舉，化合物[218]與所選的現(xiàn)有技術(shù)化合物相比，相比于PLK2和PLK3 表現(xiàn)出對于PLK1的選擇性。例如，本發(fā)明化合物[218]與W0 07/095188的化合物[1_64] 相比對PLK1比PLK2的選擇性是2倍，與W0 07/095188的化合物[1_76]相比選擇性是約6 倍，與化合物[1-4]相比選擇性是約7倍。相似地，化合物[218]與W0 07/095188的化合 物[1-64]相比對PLK1比PLK3的選擇性是的5倍，與W0 07/095188的化合物[1-76]相比 選擇性是約12倍，且與化合物[1-4]相比選擇性是約5倍。根據(jù)下述實施例可發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步 的說明。在另一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)與本領(lǐng)域已經(jīng)已知的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物相比時，本 發(fā)明化合物表現(xiàn)出優(yōu)異的溶解度和/或藥代動力學(xué)性質(zhì)。例如，化合物[254]相比于W0 07/095188的實施例[1-76]和[1-253]表現(xiàn)出優(yōu) 異的溶解度和/或藥代動力學(xué)性質(zhì)，從而使得這些化合物更適于治療疾病。再次，這些比較研究的進(jìn)一步說明可見于下述實施例中。相似地，化合物[371]與本領(lǐng)域已知的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物相比，由于其全身暴露 和口服生物利用度表現(xiàn)出有利的藥代動力學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及一小組的化合物，其特征為通過ATP-結(jié)合盒 (ATP-bingding cassette, ABC)運載體(藥物-反流泵P_糖蛋白(P-gp))的細(xì)胞反流低。 已知P-gp反流物質(zhì)通常表現(xiàn)出較差的口服吸收，因為P-gp能夠?qū)⒈晃盏乃幬镞\回消化 道[Ambudkar S. V.，等人.(2003) Oncogene，22，7468-7485]。P_gp 也能通過促進(jìn)排泄到膽 汁和尿中來降低物質(zhì)的全身暴露。除了作為藥物反流泵，ABC運載體能夠通過升高的表達(dá) 使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。P-gp的表達(dá)是廣泛已知的，其機(jī)理為癌細(xì)胞能夠獲得多藥物耐受 (MDR) [Gottesman M.M.，等人.(2002) Nat. Rev. Cancer，2，48-58]。一些來自正常表達(dá) P_gp 的細(xì)胞的腫瘤能夠表現(xiàn)出固有的耐藥性[Ambudkar S.V.，等人.(2005)Trends Pharmacol. Sci.，26，385-387]?？焖龠\輸出細(xì)胞的藥物在運載體表達(dá)的細(xì)胞中累積水平不高，由于藥 物_靶點相互作用降低，限制了治療的成功。因此，表現(xiàn)出低細(xì)胞反流的化合物強效用于口服治療癌癥、治療上皮細(xì)胞源的腫 瘤和藥物耐受的惡性腫瘤，而且對于通過增加反流泵表達(dá)誘導(dǎo)耐藥性具有更低的可能。本 發(fā)明尤其優(yōu)選的化合物表現(xiàn)出低細(xì)胞反流，包括化合物[371]、[372]和[377]-[391]。細(xì) 胞存活測試和細(xì)胞反流研究的進(jìn)一步說明見于實施例9和附圖3中。此外，在細(xì)胞存活測試中表現(xiàn)低MDR/親代細(xì)胞不對稱的本發(fā)明化合物與現(xiàn)有技 術(shù)的化合物相比，在MDR腫瘤細(xì)胞中抑制PLK1更加有效。因此，這些化合物作為治療PLK 抑制劑更加有力。在A2780-A2780/ADR細(xì)胞系配對中檢測PLK1抑制的實驗說明在下述實 施例中闡述。治療用途已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物具有抗增殖活性，并因此相信可用于治療增生性疾病例如 癌癥、白血病和其他與細(xì)胞增殖失控有關(guān)的疾病，例如牛皮癬和再狹窄。因此，本發(fā)明的一方面涉及本發(fā)明化合物或其可藥用鹽在制備用于治療增生性疾 病的藥物中的用途。這里使用的術(shù)語“藥物制備”除了其用于篩選其他抗增殖劑的方法外，包括一個或 多個如上定義的化合物直接用作藥物或在制備這樣的藥物的任何階段中的用途。如在此所定義的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的抗增殖效果可以由在體外全細(xì)胞測試中抑 制細(xì)胞增殖的能力得到證明，例如使用AGS、H1299或SJSA-1中的任何一種細(xì)胞系來證明。 利用這些測試，可以確定化合物在本發(fā)明的意義上是否具有抗增殖性的特性。一個優(yōu)選的實施方案涉及一個或多個本發(fā)明化合物在治療增生性疾病中的用途。 優(yōu)選地，所述增生性疾病為癌癥或白血病。在此時用的術(shù)語增生性疾病在廣義上包括任何 需要控制細(xì)胞周期的疾病，例如心血管疾病，例如再狹窄和心臟??；自體免疫性疾病，例如 腎小球腎炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；皮膚病，例如牛皮癬；抗炎、抗真菌、抗寄生蟲性疾病，例如 瘧疾、肺氣腫和脫發(fā)癥。在這些疾病中，本發(fā)明化合物可以根據(jù)需要在所需細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡或者維持停滯。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為癌癥或白血病，更優(yōu)選癌癥。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述增生性疾病為實體瘤。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為血癌。優(yōu)選地，所述血癌為白血 病，更優(yōu)選，晚期白血病或骨髓增生異常綜合征(MDS)。其它實例包括急性骨髓性白血病 (AML)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)或慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為腎小球腎炎。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為牛皮癬。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述增生性疾病為慢性阻塞性肺病。本發(fā)明化合物可以抑制細(xì)胞周期中的任一步驟或階段，例如，核被膜的形成、從細(xì) 胞周期的靜止期(GO)退出、G1進(jìn)展、染色體解聚、核被膜破裂、START、DNA復(fù)制的引發(fā)、DNA 復(fù)制的進(jìn)展、DNA復(fù)制的終止、中心體復(fù)制、G2進(jìn)展、有絲分裂或減數(shù)分裂功能的激活、染 色體聚集、中心體分離、微管成核、紡錘體生成與功能、與微管動力蛋白的相互作用、染色單 體分離(separation)與隔開(segregation)、有絲分裂功能的失活、收縮環(huán)的生成和胞質(zhì) 分裂活動。具體地，本發(fā)明化合物可以影響某些基因功能，例如染色質(zhì)結(jié)合、復(fù)制復(fù)合體的 生成、復(fù)制許可、磷酸化或其它次級修飾活性、蛋白水解性降解、微管結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、 septin結(jié)合、微管組織中心成核活性和與細(xì)胞周期信號通路成分的結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明化合物以足以抑制至少一種PLK酶的量給 藥。本發(fā)明的另一方面涉及一種治療PLK-依賴性疾病的方法，所述方法包括向有此 治療需要的患者以足以抑制PLK的量給藥本發(fā)明化合物或其可藥用鹽。Polo-樣激酶(PLK)由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族組成。在polo位點的有絲分 裂果蠅melanogaster突變顯示出紡錘體異常[Sunkel等人，J. Cell Sci.，1988，89，25]，并 且發(fā)現(xiàn)polo編碼有絲分裂激酶[Llamazares等人，GenesDev.，1991，5，2153]。在人體中， 存在三種高度相關(guān)的PLK[Glover等人，Genes Dev.，1998，12，3777]。它們包含高度同源 的氨基_端催化性激酶結(jié)構(gòu)域并且其羧基端包含兩個或三個保守區(qū)域，polo盒。目前不完 全了解polo盒的功能，但是其參與將PLK靶向亞細(xì)胞區(qū)[Lee等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1998，95，9301 ；Leung 等人，Nat. Struct. Biol.，2002，9，719]、調(diào)節(jié)與其它蛋白的相互 作用[Kauselmann等人，EMB0 J.，1999，18，5528]或可構(gòu)成自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域部分[Nigg,Curr. Opin. Cell Biol.，1998，10，776]。此外，polo盒-依賴性PLK1活性對正確的中期/后期 轉(zhuǎn)換以及胞質(zhì)分裂是必須的[Yuan等人，Cancer Res.，2002，62，4186 ；Seong等人，J. Biol. Chem.，2002，277，32282]。研究表明人PLK調(diào)節(jié)有絲分裂的一些基本方面[Lane等人，J. Cell. Biol. , 1996, 135，1701 ;Cogswell 等人，Cell Growth Differ.，2000，11，615]。具體地，認(rèn)為 PLK1 活性 對G2期后期/前期早期中的中心體的功能性成熟以及隨后的雙極紡錘體的形成是必需的。 通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)消耗細(xì)胞PLK1也證明對于多重有絲分裂進(jìn)化成和胞質(zhì)分裂的 完成需要該蛋白[Liu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2002，99，8672]。在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物以足以抑制PLK1的量給藥。在三種人PLK中，PLK1得到最好的表征；其調(diào)節(jié)多種細(xì)胞裂分周期活性(cell division cycle effect)，包括有絲分裂的起始[Toyoshima-Morimoto 等人，Nature，2001， 410,215 ；Roshak 等人，Cell. Signalling，2000，12，405]、DNA_ 損害關(guān)卡激活[Smits 等人，Nat. Cell Biol. ,2000,2,672 ；van Vugt 等人，J. Biol. Chem.，2001，276，41656]、后期促進(jìn) 復(fù)合物的調(diào)節(jié)[Sumara 等人，Mol. Cell，2002，9，515 ；Golan 等人，J. Biol. Chem. ,2002,277, 15552 ；Kotani 等人，Mol. Cell，1998，1，371]、蛋白酶體的磷酸化[Feng 等人，Cell Growth Differ.，2001，12，29]以及中心體的復(fù)制以及成熟[Dai 等人，Oncogene，2002，21，6195]。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物為PLK1的ATP-拮抗抑制劑。在本發(fā)明中，ATP拮抗性指通過削弱或破壞ATP結(jié)合的方式可逆地或不可逆地在 酶活性位點結(jié)合，抑制劑化合物減少或防止PLK催化活性，即從ATP磷酸轉(zhuǎn)移至大分子PLK 底物的能力。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明化合物以足以抑制PLK2和/或PLK3的量給藥。本發(fā)明的另一方面涉及一種在細(xì)胞中抑制PLK的方法，包括使所述細(xì)胞與一定量 的式I化合物，或可藥用鹽接觸，使得在所述細(xì)胞中PLK被抑制。本發(fā)明的另一方面涉及一種治療增生性疾病的方法，包括通過向有此需要的受試 者給藥治療有效量的式I化合物，或可藥用鹽來抑制PLK，從而治愈所述增生性疾病。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明化合物以足以抑制至少一種aurora激酶的量 給藥優(yōu)選地,所述aurora激酶為aurora激酶A、aurora激酶B或aurora激酶C。本發(fā)明的另一方面涉及一種治療aurora激酶-依賴性疾病的方法，所述方法包括 向有此治療需要的患者以足以抑制aurora激酶的量給藥如上定義的本發(fā)明化合物或其可 藥用鹽。另一方面涉及本發(fā)明化合物在用于抑制蛋白激酶中的用途。本發(fā)明的另一方面涉及一種抑制蛋白激酶的方法，所述方法包括將所述蛋白激酶 與本發(fā)明化合物接觸。優(yōu)選地，所述蛋白激酶選自aurora激酶和PLK。更優(yōu)選，所述蛋白激酶為PLK，更 優(yōu)選為PLK1。藥物組合物本發(fā)明的其它方面涉及藥物組合物，其包括本發(fā)明化合物與一種或多種可藥用稀 釋劑、賦形劑或載體。盡管本發(fā)明化合物(包括其可藥用鹽、酯以及可藥用溶劑合物)可單 獨給藥，通常它們與可藥用載體、賦形劑或稀釋劑一起給藥，尤其是用于對人治療的時候。 藥物組合物可用于人和獸醫(yī)中人或動物使用。本發(fā)明所述的各種不同形式的藥物組合物的合適賦形劑的實例可見于“Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994)，由 A Wade 禾口 PJ Weller 編著。治療用途的可接受的載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域中公知的，例如描述于 Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R.Gennaro edit. 1985)中。適宜的載體的實例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨 醇等。適宜的稀釋劑的實例包括乙醇、甘油和水。藥用載體、賦形劑或稀釋劑可根據(jù)將要使用的給藥途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的制藥規(guī)范進(jìn)行 選擇。藥物組合物可包含作為或除了載體、賦形劑或稀釋劑以外的任何適宜的粘合劑、潤滑 劑、助懸劑、包衣劑、助溶劑。
適宜的粘合劑的實例包括淀粉、明膠、天然糖類如葡萄糖、無水乳糖、自由流動的 乳糖、乳糖、玉米甜料、天然和合成的樹膠，如阿拉伯樹膠、黃蓍樹膠或藻酸鈉、羧基甲基 纖維素和聚乙二醇。適宜的潤滑劑的實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。防腐劑、穩(wěn)定劑、色素以及甚至調(diào)味劑可提供在本發(fā)明的藥物組合物中。防腐劑的 實例包括苯甲酸鈉、山梨酸以及對羥基苯甲酸的酯類。也可使用抗氧化劑和助懸劑。鹽/ 酯本發(fā)明的化合物可以以鹽或酯的形式，尤其是可藥用的鹽或酯的形式提供。本發(fā)明化合物的可藥用鹽包括它們適宜的酸加成鹽或堿加成鹽。適宜的可藥用 鹽的評論可參見Berge等人的J. Pharm Sci，66，1-19 (1977)。例如，鹽為與以下酸形成的 鹽強無機(jī)酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫商酸；強有機(jī)羧酸，如未被取代或取代(如被 鹵代)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙 二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙 酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有機(jī)磺酸， 如未被取代或取代(如被鹵代)的(Ci-C；)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬帷?優(yōu)選地，所述鹽為HC1鹽。取決于被酯化的官能團(tuán)，使用有機(jī)酸或醇/氫氧化物形成酯。有機(jī)酸包括羧酸， 如未被取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和 的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?；輕基羧 酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨 酸；苯甲酸；或有機(jī)磺酸，如未被取代或取代(如被鹵代)的(Ci-C；)烷基磺酸或芳基磺酸， 如甲磺酸或?qū)妆交撬?。適宜的氫氧化物包括無機(jī)氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧 化鈣、氫氧化鋁。醇包括未被取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷醇。對映異構(gòu)體/互變異構(gòu)體在上述討論的本發(fā)明的所有方面中，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的全部對映異構(gòu)體 和互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認(rèn)識到具有光學(xué)性質(zhì)(一個或多個手性碳原子)或互 變異構(gòu)特征的化合物?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的方法分離/制備相應(yīng)的對映異構(gòu)體和/或互 變異構(gòu)體。立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體—些本發(fā)明的化合物可以以立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體的形式存在，例如其可 具有一個或多個不對稱和/或幾何中心，并因此可以以兩種或多種立體異構(gòu)和/或幾何形 式存在。本發(fā)明包括那些抑制劑試劑的所有單個立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體及其混合物的使 用。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式，只要所述形式保留適當(dāng)?shù)墓δ芑钚?但不必到 相同程度)。本發(fā)明還包括試劑或其可藥用鹽的所有適宜的同位素變體。本發(fā)明藥物或其可藥 用鹽的同位素變體定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量與自然界中 通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量不同的原子所取代的物質(zhì)?？杀粨饺氲剿幬锖推淇伤幱名}的同位素 的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36C1。本發(fā)明的藥物和其可藥用鹽的一些同位素變體，例如結(jié)合放射性同位素如 3H或14C的那些化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14 即14c同位素因其容易制備和可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因 較大的代謝穩(wěn)定性而提供特定的治療益處，例如體內(nèi)半衰期增加或劑量要求降低，并因此 可在一些情況下是優(yōu)選的。通?？墒褂煤线m試劑的適當(dāng)同位素變體，通過常規(guī)步驟制備本 發(fā)明藥物和其可藥用鹽的同位素變體。溶劑合物本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的溶劑合物形式。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式。多晶型物本發(fā)明還涉及本發(fā)明試劑的各種結(jié)晶形式、多晶型形式和無水(水合)形式。眾 所周知，在制藥工業(yè)中可通過稍微改變純化和或分離方法，從在合成制備此類化合物的溶 劑中，分離得到任一此類形式的化合物。前藥本發(fā)明進(jìn)一步包括前藥形式的本發(fā)明化合物。這些前藥通常為本發(fā)明化合物，其 中一個或多個適合的基團(tuán)被修飾使得當(dāng)向人或哺乳動物受試者給藥后該修飾可以被逆轉(zhuǎn)。 該逆轉(zhuǎn)通常通過這些受試者中天然存在的酶進(jìn)行，但也可以與該前藥同時給藥第二種試劑 以在體內(nèi)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)。這些修飾的實例包括酯(例如，上述描述的那些中任一種)，其中該逆 轉(zhuǎn)可以以酯酶等進(jìn)行。其它這些系統(tǒng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。給藥可調(diào)節(jié)本發(fā)明的藥物組合物，使其適于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動 脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻、口腔或舌下給藥途徑。對于口服給藥，特別利用壓縮片劑、藥丸、片劑、凝膠劑(gellules)、滴劑和膠囊 劑。優(yōu)選地，這些組合物每劑包含l_250mg的有效成分，更優(yōu)選包含10-100mg的有效成分。其它給藥形式包括溶液劑或乳劑，它們可經(jīng)靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹 膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥，并由無菌或可滅菌溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓 劑、混懸劑、乳劑、洗劑、軟膏、乳膏劑、凝膠、噴霧劑、溶液劑或撲粉(dusting powder)的形 式。經(jīng)皮給藥的替代方式是利用透皮貼片(skin patch)。例如，可將有效成分摻入到 由聚乙二醇含水乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內(nèi)。還可以1-lOwt %的濃度將有效成分摻入 到由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)與所需要的穩(wěn)定劑和防腐劑共同組成的軟膏內(nèi)?？勺⑸湫问矫縿┛砂?0-1000mg的有效成分，優(yōu)選10_250mg的有效成分。組合物可被配制成單位劑型，即包含單位劑量或單位劑量的多重單位或亞單位的 形式的離散部分。劑量本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需過度試驗就可容易地確定對患者給藥的本發(fā)明組合 物的適宜劑量。通常，醫(yī)師會確定對個體患者最適宜的實際劑量，并且根據(jù)多種因素包括使 用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩(wěn)定性以及作用時間的長短、病人的年齡、體重、一 般健康狀況、性別、飲食、給藥的方式以及時間、排泄速率、藥物組合以及具體疾病的嚴(yán)重程度以及接受治療的個體進(jìn)行調(diào)整。本文公開的劑量為一般情況的示例。當(dāng)然也可有有益的 較高或較低劑量范圍個別情況，這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)需要，可以以0. l_30mg/kg體重，如0. l_10mg/kg體重，更優(yōu)選2_20mg/kg體 重的劑量給藥所述藥物。在示例性的實施方案中，向患者給藥一個或多個劑量的10_150mg/天用于治療惡 性腫瘤。組合在特別優(yōu)選的實施方案中，一或多種本發(fā)明化合物與一或多種其它的活性劑(例 如，市場上提供的現(xiàn)有抗癌藥物)組合給藥。在這種情況下，本發(fā)明化合物可連續(xù)地，同時 地或依次地與一或多種活性劑組合給藥。抗癌癥藥通常在組合使用的時候更有效。尤其地，為避免主要毒性作用、作用機(jī)制 以及耐藥機(jī)制的重疊，組合療法是理想的。此外，也可以以最大耐受劑量并在這些劑量之間 以最小的時間間隔給藥大多數(shù)藥物也是理想的。化學(xué)治療藥物組合的主要優(yōu)勢在于可能通 過生化相互作用促進(jìn)加和的或可能的協(xié)同作用，并且也可能降低在早期腫瘤細(xì)胞中的耐藥 性的出現(xiàn)，后者響應(yīng)于用單藥進(jìn)行的初始化療。生化相互作用在選擇藥物組合時的用途的 實例通過下述事實得到證實施用亞葉酸增加5-氟尿嘧啶的活性細(xì)胞內(nèi)代謝物對其靶標(biāo) 胸苷酸合酶的結(jié)合，從而增加其細(xì)胞毒性活性。許多組合藥物目前已經(jīng)用于癌癥和白血病的治療中。醫(yī)學(xué)實踐的更廣泛的綜述可 見"Oncologic Therapies，，，由 E. E. Vokes 禾口 H. M. Golomb 編著，由 Springer 出版。通過研究受試化合物與已知的或認(rèn)為在最初治療具體的癌癥中或衍生自癌癥的 細(xì)胞系中有價值的化合物的抑制活性，從而可建議有利的組合。這種方法也可用于測定施 用藥物的順序，即，之前、同時或之后。所述的給藥方案可為這里鑒別的所有細(xì)胞周期作用 藥物的特征。方法另一方面涉及一種制備本發(fā)明化合物的方法，所述方法包括下述步驟(i)將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(IV)化合物，直接或經(jīng)過分離式(III)化合物；和(ii)將所述式(IV)化合物轉(zhuǎn)化為式(I)化合物
(II)(III)(IV)優(yōu)選地，步驟(i)包括在Et0H/H20中加熱所述式(II)化合物與NH4C1和Fe。本發(fā)明進(jìn)一步通過下述非限制性實施例進(jìn)行說明，且參考下述附圖，其中

圖1顯示的是對于所檢測的每種化合物，化合物A-H的血漿濃度對時間的曲線下 面積(AUC)。這些實驗中給予的溶媒保持恒定(靜脈內(nèi)=檸檬酸鹽緩沖液pH3，lmL/kg; 口服=DMA/PEG400/10mM 酒石酸鹽緩沖液，pH4(l 3 6)，5ml/kg)；圖2顯示的是與圖1相同的數(shù)據(jù)，除了是以每種化合物的口服生物利用度(％ F) 的形式。圖3顯示的是在親代和MDR腫瘤細(xì)胞中所選化合物與現(xiàn)有技術(shù)化合物A' -J'的 比較(表8中所定義)。不對稱比例(Asymmetry ratios)以相對于化合物[378]表示。
實施例通用實驗化學(xué)品和溶劑購自商業(yè)來源，且除非另有說明以得到狀態(tài)使用。除非另有說明，使 用無水MgSOjt為有機(jī)溶液的標(biāo)準(zhǔn)干燥劑。NMR譜使用Varian IN0VA-500儀器記錄?；瘜W(xué) 位移以相對于四甲基硅烷內(nèi)標(biāo)的百萬分之一報導(dǎo)。偶合常數(shù)(J)精確到0. 1Hz。使用下述縮 寫s，單峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；qu，五重峰；m，多重峰；和br，寬峰。質(zhì)譜使用 Waters ZQ2000單四級桿質(zhì)譜儀(帶有電噴霧離子化(ESI))而獲得。分析和制備RP-HPLC 使用 Vydac 218TP54 (250x4. 6mm)和 Vydac 218TP1022 (250x22mm)柱進(jìn)行，使用線性梯度的 水/乙腈系統(tǒng)洗脫液(含0. 1 %三氟乙酸)，流速lmL/分鐘(分析)和9mL/分鐘(制備)。
所用的分析梯度如下 或者Xbridge (100x4. 6mm)和Xbridge (100x19mm)柱使用線性梯度的水/乙腈系 統(tǒng)(含0. 1 %氫氧化銨)，流速為lmL/分鐘(分析)和20mL/分鐘(制備)。所用的分析梯度如下 對于快速色譜法，使用硅膠(EMKieselgel 60,0. 040-0. 063mm, Merck)或 I SOLUTE 預(yù)填充柱(Biotage)。縮寫DIPEA 二異丙基乙基胺
dcm二氯甲烷
dmf二甲基甲酰胺
dms0二甲亞砜
EtOAc乙酸乙酯
EtOH乙醇
hc1鹽酸
k2co3碳酸鉀
Mel碘甲烷
MeOH甲醇
MgS04硫酸鎂
NaH氫化鈉
NaCl氯化鈉
NH4C1氯化銨
RM反應(yīng)混合物
rt室溫
TBTU0-(苯并三唑-1-
tfa三氟乙酸
tfe2,2,2-三氟乙醇
thf四氫呋喃
實施例1
化合物[2] :4-(9-環(huán)戊基_[1,4]二氮雜革-2-基氨基)-N-(l-
1.亞硫酰氯(2. 1當(dāng)量)，MeOH，于0°C添加，回流2小時；2.環(huán)戊酮(0. 77當(dāng)量)， 乙酸鈉(0. 77當(dāng)量)，三乙酰氧基硼氫化鈉(1. 11當(dāng)量)，DCM，室溫16小時；3.2，4_ 二 氯-5-硝基嘧啶(1. 1當(dāng)量)，K2C03(1當(dāng)量)，丙酮，0°C -室溫16小時；4.NH4C1(8. 5當(dāng) 量)，F(xiàn)e(8 當(dāng)量)，Et0H/H20(4 1)，回流 2. 5 小時；-未分離 5. Mel (1. 18 當(dāng)量)，NaH(l. 07當(dāng)量)，DMF，-10°C -室溫，3小時；6. 4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1. 5當(dāng)量)，濃HC1，H20/ EtOH(4 1)，回流48小時；7.DIPEA(2當(dāng)量)，TBTU(1. 1當(dāng)量)，4_氨基甲基哌啶(1.2當(dāng) 量)，DCM，室溫16小時。步驟1 :3_氨基丙酸甲基酯將0 -丙氨酸(9. 37g，0. 105mol)添加到Me0H(50ml)中，且使用冰浴將混合物冷 卻至0°c，然后滴加亞硫酰氯[小心添加放熱]。添加完成后，將反應(yīng)溫?zé)嶂潦覝?，然后?流2小時。然后減壓下蒸發(fā)溶劑，且所得油狀物用叔丁基甲基醚處理，濾出所得結(jié)晶，并進(jìn) 一步在真空中干燥，得到白色晶體固體(llg，定量)；1H(DMS0-d6) 6 2. 73(dd，J = 7Hz,2H, CH2), 2. 98 (dd, J = 7Hz，2H，CH2)，3. 61(s，3H，CH3)，8. 28(bs，2H，NH2) ；MS+ve :104. 1。步驟2 :3_(環(huán)戊基氨基)丙酸甲基酯將3-氨基丙酸甲基酯(9. 37g，0.09mol)溶解于DCM(200ml)中，并加入環(huán)戊酮 (6. 43ml,0. 07mol)，乙酸鈉(5. 96g，0. 07mol)和三乙酰氧基硼氫化鈉(22g，0. lOmol)。反應(yīng) 在室溫攪拌16小時。然后添加20%碳酸氫鈉(100ml)和2M氫氧化鈉(50ml)，且產(chǎn)物使用 DCM/H20萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl洗滌，使用MgS04干燥，過濾，并將濾液在減壓 下蒸發(fā)，并在真空中進(jìn)一步干燥，得到產(chǎn)物，為淡黃色油狀物(8.90g，55%) ；MS+ve 172. 40步驟3 3-[環(huán)戊基(2-氯-5-硝基嘧啶_4_基)氨基]丙酸甲基酯將3-(環(huán)戊基氨基)丙酸甲基酯(838mg, 0. 005mol)和 K2C03 (676mg, 0. 005mol)添 加到丙酮(5ml)中，且使用冰浴將所得混合物冷卻至0°C，然后添加2，4_ 二氯-5-硝基嘧 啶(1.044g，l. 1當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物(RM)溫?zé)嶂潦覝兀⒃倮^續(xù)攪拌16小時，然后 再添加0.12當(dāng)量的嘧啶。然后再繼續(xù)攪拌3小時。然后減壓下蒸發(fā)反應(yīng)混合物，且產(chǎn)物使 用Et0Ac/H20萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl洗滌，使用MgS04干燥，過濾，并將濾液在 減壓下蒸發(fā)，并進(jìn)一步在真空中干燥，得到產(chǎn)物，為褐色油狀殘余物(1.04g，65%) ;Rt = 16 分鐘(Vydac 1) ；ME+ve 329. 1。步驟4 :2_氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-6H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜萆 -6-酮將3-[環(huán)戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯(1. 00g，0. 003mol) 和 NH4C1 (1. 38g，0. 025mol，8. 5 當(dāng)量)添加到 Et0H/H20(4 lml, 10ml)中，并將混合物加熱 至回流，然后分批添加鐵粉(1.36g，0.024mol，8當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物再回流2小時。 反應(yīng)過程通過HPLC監(jiān)測，且當(dāng)沒有存留的SM時，通過硅藻土趁熱過濾反應(yīng)混合物。硅藻土 用EtOAc(lOml)和EtOH(lOml)[都是熱的]洗滌，并將濾液在減壓下蒸發(fā)，并進(jìn)一步在真空 中干燥，得到產(chǎn)物，為褐色固體(350mg,43% ) ;Rt = 12分鐘(Vydac 1) ；MS+ve :267. 2。步驟5 :2_ 氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氫 _6H_ 嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二 氮雜革-6-酮將2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-6H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革_6_酮 (318mg,0. 0012mol)和 Mel (88 ii 1，0. 0014mol，1. 18 當(dāng)量)添力卩到 DMF(5ml)中，并使用丙 酮/干冰將溶液冷卻至-10°C，然后添加NaH(30mg，0. 0013mol, 1. 07當(dāng)量)。然后反應(yīng)混合 物于0°C攪拌30分鐘，并于室溫攪拌30分鐘。濃縮反應(yīng)混合物，且產(chǎn)物使用Et0Ac/H20萃 取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl洗滌，使用MgS04干燥，過濾，并將濾液在減壓下蒸發(fā)，并 進(jìn)一步在真空中干燥，得到產(chǎn)物，為紫色油狀殘余物(252mg，75%) ;Rt = 13分鐘(Vydacl)；MS+ve :281.2。步驟6 :(化合物[1]) 4-(9-環(huán)戊基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸偶聯(lián)方法A將2-氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氫_6H_嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革 -6-酮(248mg，0. 0009mol)和 4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(221mg，0. 0013mol, 1. 5 當(dāng)量)，濃 HC1 (152 u 1)和H20/Et0H(8 2ml)添加到RBF中，并將所得反應(yīng)混合物加熱至回流，持續(xù)4 小時。反應(yīng)進(jìn)程通過HPLC監(jiān)測，且當(dāng)沒有剩余起始原料時(4小時的反應(yīng)時間)，在減壓下 濃縮反應(yīng)混合物，且產(chǎn)物使用DCM/H20萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl洗滌，使用MgS04 干燥，過濾，并將濾液在減壓下蒸發(fā)，并進(jìn)一步在真空中干燥，得到褐色油狀殘余物。將幾 滴MeOH添加到殘余物中，且通過抽濾收集形成的固體ppt，用MeOH洗滌，并進(jìn)一步在真空 中干燥，得到產(chǎn)物，為紫色固體(51mg，14% ) ;Rt = 11. 2分鐘(0_60_20分鐘，純度100% )；
NMR(DMS0-d6) 8 1. 61 (bs，4H，環(huán)戊-H)，1. 72 (bs，2H，環(huán)戊-H)，1. 94 (bs，2H，環(huán)戊-H)，
2.59 (dd, J = 4. 5Hz,2H, CH2)，3. 18 (s, 3H, CH3)，3. 63 (dd, J = 4. 5Hz,2H, CH2)，3. 95 (s, 3H, CH3)，7. 51(s，lH)，7. 56 (d, J = 8Hz，1H，苯 _H)，7. 82(s，lH，8. 10(s，lH，8. 47 (d, J = 8. 5Hz, 1H，苯-H)，12. 64 (bs, 1H, NH) ；MS+ve -.412. 2。步驟7:(化合物[2]) :4_ (9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺將4_(9_ 環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代 _6，7，8，9_ 四氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸(35mg，0. 085mmol), DIPEA(28u 1,0. 17mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(30mg,0. 093mmol, 1. 1當(dāng)量)添加到3ml DCM中，并將所得溶液于室溫攪拌30分鐘， 然后添加4-氨基甲基哌啶(13iU，0. 10mmOl，1.2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪 拌16小時。濃縮反應(yīng)混合物，且產(chǎn)物使用DCM/H20萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl 洗滌，使用MgS04干燥，過濾，并將濾液在減壓下蒸發(fā)，并進(jìn)一步在真空中干燥，得到黃色 油狀殘余物(21mg,49% ) ;Rt = 9. 86 分鐘(0_60_20 分鐘，純度 100% ) ；1H NMR(CD30D) 8 1. 69-1. 75 (m, 6H)，1. 82 (bs,2H)，1. 96-1. 99 (m, 2H)，2. 03-2. 05 (bs,2H)，2. 18-2. 23 (m, 2H)，2. 34 (s，3H, CH3)，2. 68 (dd, J = 4. 5Hz,2H, CH2)，2. 95-2. 97 (m, 2H)，3. 28 (s, 3H, CH3)，
3.73 (dd, J = 4. 5Hz，2H，CH2)，3. 89-3. 94 (m，1H，CH)，4. 01 (s，3H，CH3)，4. 91-4. 96 (m，1H， CH)，7. 49-7. 51(m，2H)，8. 02(bs，lH)，8. 50(d，J = 8. 5Hz，1H，苯 _H) ；MS+ve :508. 2。氨基酯中間體下述中間體使用實施例1，步驟2中所述的方法制備3-環(huán)戊基氨基_ 丁酸甲基酯 MS+ve: 186. 3。3-環(huán)己基氨基-丁酸甲基酯 MS+ve:200. 3。3-環(huán)戊基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯 NMR (CDC13) 1. 18 (3H, d, J 7Hz, CH3)，1. 33 (2H，m, CH2)，1. 53 (2H，m, CH2)， 1. 67 (2H, m, CH2)，1. 82 (2H, m, CH2)，2. 63 (2H, m, CH2)，2. 87 (1H, m, CH)，3. 06 (1H, m, CH)， 3. 69 (3H, s, 0CH3)。3-環(huán)己基氨基-丙酸甲基酯 NMR (CDC13) 1. 18 (3H, d, J 7Hz, CH3)，1. 33 (2H，m, CH2)，1. 53 (2H，m, CH2)， 1. 67 (2H, m, CH2)，1. 82 (2H, m, CH2)，2. 63 (2H, m, CH2)，2. 87 (1H, m, CH)，3. 06 (1H, m, CH)， 3. 69 (3H, s, 0CH3)。3- (1-乙基-丙基氨基)-丙酸甲基酯 匪R(CDC13) 0. 89 (6H, t, J 8Hz, CH3)，1. 44 (4H, m, CH2CH3)，1. 77 (1H, bs, NH)， 2. 39 (1H, m, CH)，2. 53 (2H, m, CH2)，2. 89 (2H, m, CH2)，3. 69 (3H, s, 0CH3)。3-(四氫-吡喃-4-基氨基)_丙酸甲基酯 匪R(CDC13) :1.41(2H，m，CH2)，1.86(2H，m，CH2)，2. 54(2H，m，CH2)，2. 71(lH，m， CH)，2. 95 (2H，m，CH2)，3. 44 (2H，t，J 11 5Hz，CH2)，3. 71 (3H，s，0CH3)，3. 99 (2H，d，J 11Hz， CH2)。1-環(huán)戊基氨基甲基_環(huán)丙烷羧酸甲基酯MS+ve:186. 4。3-環(huán)戊基氨基-4-甲基_戊酸甲基酯 NMR(CDC13) 0. 84 (3H, t, J 7Hz，CH3)，1. 25 (4H，m，CH2)，1. 37 (2H，m，CH)， 1. 54 (2H, m, CH)，1. 70 (2H, m, CH)，1. 83 (2H, m, CH), 2. 71 (2H, s, CH2)，3. 10 (1H, m, CH)， 4. 16 (2H, q, J 7Hz, CH2CH3)。3-環(huán)戊基氨基-2，2-二甲基-丙酸乙基酯 NMR(CDC13) 1. 19 (6H, s, CH3)，1. 25 (3H，t, J 7Hz, CH3)，1. 28 (2H，m，CH)， 1. 49 (2H, m, CH)，1. 65 (2H, m, CH)，2. 64 (1H, s, CH2)，3. 01 (1H, m, CH), 4. 10 (2H, q, J 7. 5Hz, CH2)?？商娲苑椒ú襟E2a :3_氨基丙酸甲基酯 于-60°C(干冰，丙酮)，將丙烯酸甲基酯(4. 50ml，4. 302g，49. 97mmole，0. 99 當(dāng) 量)滴加到環(huán)戊基胺(5. 00ml,4. 315g，50. 68mmole)在甲醇(120ml)中的溶液中。將反應(yīng)混 合物溫?zé)嶂潦覝?，并攪拌過夜。移除溶劑(減壓，真空)得到產(chǎn)物，為油狀物(8.236g，96% 粗產(chǎn)率)。質(zhì)子NMR表明產(chǎn)物含有 25%的二烷基化的副產(chǎn)物。下述化合物通過相似方法制備。3-苯基氨基_丙酸乙基酯 NMR(CDC13) :1.29(3H，t，J 7. 5Hz，CH3)，2. 64 (2H，t，J 6. 5Hz，CH2)，3. 48 (2H， t，J 6. 5Hz，CH2)，4. 18 (2H, q, J 7Hz，CH2)，6. 65-6. 74 (5H，m，Ar_H)。硝基嘧啶中間體下述中間體也通過實施例1步驟3中描述的方法制備3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]_ 丁酸甲基酯 Rt = 18. 0 分鐘(0_60_20 分鐘)；MS+ve 343. 20。3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)己基-氨基]-丁酸甲基酯
3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]-2-甲基-丙酸甲基酯NMR(CDC13) 1. 22 (3H, d, J 12Hz, CH3)，1. 57 (2H，m, CH2)，1. 76 (2H，m, CH2)， 1. 93 (2H, m, CH2)，1. 98 (2H, m, CH2)，3. 18 (1H, s, CH)，3. 61 (3H, m, CH+CH2)，3. 68 (3H, s, 0CH3), 8. 74 (1H, s, Pyr-H)。3_[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)_環(huán)己基-氨基]-丙酸甲基酯 Rt = 17. 6 分鐘(Vydac 1) ；MS+ve 343. 1。3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基_氨基]_4_甲基-戊酸甲基酯 NMR(CDC13) 0. 94 (6H, t, J 7Hz)，1. 45-1. 82 (7H，m, 3x CH2+CH)，2. 17 (1H, m, CH)，2. 69 (2H, m, 2x CH)，3. 35 (2H, m, CH2)，2. 58 (1H, m, CH)，3. 73 (3H, s, 0CH3)，8. 64 (1H, s, Pyr-H)。 3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-(1-乙基-丙基)-氨基]-丙酸甲基酯
3-[(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)_(四氫-吡喃_4_基)_氨基]-丙酸甲基酯
MS (+ve)345. 1,347. 0 ；tR = 12. 62 分鐘(Vydac 1)。3-[芐基-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-氨基]-丙酸乙基酯 NMR(CDC13) 1. 26 (3H, t, J 7Hz, CH3)，2. 73 (2H，t, J 7Hz, CH2)，3. 85 (2H，m, CH2)，4. 16 (2H, q, J 7Hz, CH2)，4. 71 (2H, s, CH2)，7. 20 (2H, m, Ar-H)，7. 37 (3H, m, Ar-H)， 8. 69 (1H, s, Pyr-H)。3- [ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-苯基-氨基]-丙酸乙基酯 NMR(CDC13) :1.22(3H，t，J 7. 5Hz，CH3)，2. 73 (2H，t，J 7Hz, CH2) ,4. 09 (2H, q, J 7Hz, CH2), 4. 43 (2H, t, J 7Hz, CH2)，7. 14-7. 48 (5H, m, Ar-H), 8. 57 (1H, s, Pyr-H)。1-{[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基_氨基]-甲基}環(huán)丙烷羧酸乙基酯 MS (+ve)381. 1,383. 3 ；tR = 4. 80 分鐘(XBridge 1)。3_[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)_環(huán)戊基-氨基]_2，2_ 二甲基-丙酸乙基酯 MS (+ve)371. 1,373. 1 ；tR = 4. 67 分鐘(XBridge 1)。氨基嘧啶_酯得到氯嘧啶_ 二氮雜革下述化合物如實施例1，步驟4中所示由還原反應(yīng)中分離，為未環(huán)化的中間體。
3- [ (5-氨基-2-氯_嘧啶-4-基)_芐基-氨基]_丙酸乙基酯 NMR(CDC13) :1.26(3H，t，J 7. 5Hz，CH3)，2. 73 (2H，t，J 7Hz，CH2)，3. 86 (2H，t， J 7Hz, CH2)，4. 14 (2H, q, J 7Hz, CH2)，4. 86 (2H, s, CH2)，7. 26-7. 39 (5H, m, Ar-H)，7. 94 (1H, s, Pyr-H)。3- [ (5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-苯基-氨基]-丙酸乙基酯 MS (+ve) 321. 2, 323. 2 ；tR = 3. 54 分鐘(XBridge 1)。1-{[ (5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基_氨基]-甲基} _環(huán)丙烷羧酸乙基酯 MS (+ve) 339. 2，341. 2 ；tR = 4. 15 分鐘(XBridge 1)。3- [ (5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]_2，2_ 二甲基-丙酸乙基酯 MS (+ve) 341. 2，343. 2 ；tR = 4. 25 分鐘(XBridge 1)。然后上述化合物使用下述方法環(huán)化。將相關(guān)化合物(5mmol)在DMF(lOml)中加熱至140°C，保持2小時。在真空中蒸發(fā) 溶劑，加入乙酸乙酯(10ml)，且過濾所得固體，并在真空下干燥，得到下列化合物。注該反應(yīng)也可用DMSO/NaH進(jìn)行。9-芐基-2-氯-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革 _6_ 酮 NMR(DMSO) 2. 72 (2H, m, CH2)，3. 67 (2H, m, CH2)，4. 86 (2H, s, CH2)， 7. 26-7. 37 (5H，m，Ar-H)，7. 88 (1H, s, Pyr-H)，9. 77 (1H, s，NH)。2-氯-9-苯基-5，7，8，9-四 氫-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-6-酮 MS (+ve) 275. 2，277. 2 ；tR = 2. 80 分鐘(XBridge 1)。
2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革-7，1'-環(huán)丙 烷]-6-酮 MS (+ve) 293. 2, 295. 2 ；tR = 3. 48 分鐘(XBridge 1)。2-氯-9-環(huán)戊基-7，7-二甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革
-6-酮 MS (+ve)295. 1,297. 2 ；tR = 3. 58 分鐘(XBridge 1)。烷基化的二氮雜革酮下述中間體也通過實施例1，步驟5中所述的方法制備2-氯-9-環(huán)戊基-5，8-二甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革
-6-酮 Rt = 14. 6 分鐘(Vydac 1) ；MS+ve 295. 2。2-氯-9-環(huán)戊基-5，7-二甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革
-6-酮 MS (+ve)295. 1,297. 2 ；tR = 9. 11 分鐘(XBridge 2)。2-氯-9-環(huán)戊基-8-異丙基-5-甲基_5，7，8，9_四氫-嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二 氮雜革-6-酮 MS (+ve)323. 1,325. 1 ；tR = 10. 17 分鐘(XBridge 2)。2-氯-9-環(huán)戊基-5-乙基-7-甲基_5，7，8，9_四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮 雜革-6-酮
NMR (CDC13) 1. 08 (6H, m, 2x CH3)，1. 38 (1H，m, CH)，1. 55-1. 70 (5H, m, CH+CH2)， 1. 70 (1H, m, CH)，2. 10 (1H, m, CH)，2. 73 (1H, m, CH)，3. 48 (2H, m, CH2)，4. 03 (1H, m, CH)， 4. 72 (1H, m, CH)，7. 98 (1H, s, Pyr-H)。2-氯-9-(l-乙基-丙基)-5-甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮 雜革-6-酮
MS (+ve) 283. 2，285. 1 ； tR = 8. 44 分鐘(XBridge 2)。2-氯-9_(1-乙基-丙基)-5-乙基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮 雜革-6-酮
MS (+ve) 297. 12，299. 14 ；tR = 3. 67 分鐘(XBridge 2)。2-氯-5-甲基-9-(四氫-吡喃-4-基)-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二氮雜革-6-酮
MS (+ve)297. 1,299. 2 ；tR = 5. 74 分鐘(XBridge 2)。9-芐基-2-氯-5-甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革_6_酮 MS (+ve)303. 1,305. 2 ；tR = 13. 57 分鐘(Vydac 1)。2-氯-5-甲基-9-苯基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革_6_酮 MS (+ve)289. 1,291. 1 ；tR = 2. 93 分鐘(XBridge 2)。
2-氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜萆_7，
1'-環(huán)丙烷]-6-酮 MS (+ve)307. 1,309. 2 ；tR = 3. 67 分鐘(XBridge 2)。2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜 革,-6-酮 MS (+ve)309. 1,311. 2 ；tR = 3. 90 分鐘(XBridge 2)。偶聯(lián)的嘧啶二氮雜革酮下述通過實施例1，步驟6，偶聯(lián)方法A中所述的方法制備化合物[3] :4-(9_環(huán)戊基-8-甲基_6_氧代_6，7，8，9_四氫_5H_嘧啶并[4，5_b] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸 紫色固體(29%) ；1H NMR(DMS0-d6) 8 1. 33 (d, J = Hz，3H，CH3)，1. 52-1. 58 (m， 3H,環(huán)戊-H)，1. 70-1. 78 (m, 3H,環(huán)戊-H)，1. 87-1. 93 (m, 2H,環(huán)戊-H)，2. 97-3. 00 (m, 2H, CH2)， 3. 94(s，3H，CH3)，4. 15-4. 17 (m, 1H, CH)，4. 93-4. 97 (m, 1H, CH)，7. 59-7. 60(m，2H)，7. 82(1， 1H) ,8. 01 (d，J = 9Hz, 1H，苯-H)，9. 55 (bs, 1H，0H)，9. 96 (s, 1H) ；MS+ve :426. 2。Rt = 11. 08 分鐘(純度 100%，(Vydac 1))?；衔颷4] :4_ (9-環(huán)戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)_3_甲氧基-苯甲酸 紫色固體(67%)；1H 匪R(DMS0-d6) 8 1. 26 (d, J = Hz, 3H, CH3), 1. 43-1. 93 (m, 8H,環(huán)戊-H)，2. 52 (s, 3H, CH3)，2. 99-3. 02 (m, 2H, CH2)，3. 96 (s, 3H, CH3)，4. 13-4. 16 (m, 1H, CH) ,4. 65-4. 69 (m, 1H, CH)，7. 60-7. 61 (m，2H)，8. 06 (d，J = 9Hz，lH，苯 _H)，8. 17 (s, 1H), 9. 35 (bs, 1H) ；MS+ve :426. 2。Rt = 11. 59 分鐘(純度 96%，(Vydac 1))?；衔颷5] :4_ (9-環(huán)己基-8-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4, 5-b][1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基_苯甲酸
褐色固體(12%)；1H NMR(DMS0-d6) 8 1.27(d,J = 6. 5Hz, 3H, CH3), 1. 58-1. 87 (m, 10H,環(huán)己烷-H)，2. 85-2. 88(m，2H，CH2)，3. 94(s，3H，CH3)，4. 21-4. 23(m，1H，CH)， 4. 77 (bs, 1H, CH)，7. 03 (s, 1H)，7. 13 (s, 1H)，7. 23 (s, 1H)，7. 57-7. 58 (m, 2H)，7. 086 (s, 1H)， 8. 07-8. 08 (m, 1H) ,9. 89 (bs, 1H, NH) ；ME+ve :426. 2。Rt = 11. 58 分鐘(純度 90%, (Vydac 1))?；衔颷6]:4-(9_ 環(huán)戊基-6-氧代 _6，7，8，9-四氫-511-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二 氮雜革-2-基氨基)_3_甲氧基-苯甲酸紫色固體(13%) ；1H NMR(DMS0-d6) 8 1. 55-1. 86 (m，8H，環(huán)戊-H)，2. 70-2. 73 (m， 2H, CH2)，3. 70-3. 72 (m, 2H, CH2)，5. 02-5. 09 (m, 1H, CH)，7. 57-7. 59 (m, 2H)，7. 77 (s, 1H,嘧 啶 _H)，8. 06 (d, J = 8. 5Hz, 1H，苯 _H)，9. 54 (bs, 1H, OH), 9. 75 (s, 1H, NH) ；MS+ve :398. 2。Rt =10. 55 分鐘(純度 96%, (Vydac 1))?；衔颷7] :4-(9_環(huán)戊基-8-甲基_6_氧代_6，7，8，9_四氫_5H_嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸灰白色固體(10% ) ；1H 匪R(DMS0-d6) 8 1. 27 (d, J = 6.5Hz，3H，CH3)， 1. 46-1. 90 (m, 8H,環(huán)戊 _H)，2. 83-2. 86 (m, 2H, CH2)，4. 07-4. 09 (m, 1H, CH)，5. 04-5. 09 (m, 1H, CH)，7. 20 (dd, J = 3. 5 和 8. 5Hz,2H,苯 _H)，7. 79 (d, J = 2. 0Hz, 1H,嘧啶 _H)，7. 86 (d, J = 8. 5Hz，2H，苯-H)，9. 78(bs，1H，NH) ；MS+ve :382. 2。Rt = 10. 46 分鐘(純度 90%，(Vydac 1))?；衔颷8] :4_ (9-環(huán)戊基-5，8-二甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸
灰白色固體(25% ) ；1H 匪R(DMS0-d6) 8 1. 19 (d, J = 6. 0Hz,3H, CH3)， 1. 32-2. 10 (m, 8H,環(huán)戊 _H)，2. 73-2. 76 (m, 2H, CH2)，3. 22 (s, 3H, CH3)，4. 04 (m, 1H, CH, 4. 70-4. 75 (m, 1H, CH, 7. 78-7. 85 (m, 4H,苯 _H)，8. 12 (s, 1H,嘧啶 _H)，9. 68 (bs, 1H, NH)； MS+ve :394. 0。Rt = 11. 05 分鐘(純度 96%, (Vydacl))?；衔颷9]:4-(9_ 環(huán)己基-6-氧代 _6，7，8，9-四氫-511-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二 氮雜革-2-基氨基)_3_甲氧基-苯甲酸 褐色固體(15%) ；1H NMR(DMS0-d6) 8 1. 15-1. 86 (m，10H，環(huán)己烷-H)，2. 72 (dd，J =4. 5Hz，2H，CH2), 3. 75 (dd, J = 4. 5Hz，2H，CH2)，3. 96(s，3H，CH3), 4. 58-4. 63 (m, 1H, CH)， 7. 58-7. 60(m，2H)，7. 79 (s, 1H,嘧啶 _H)，8. 16 (d, J = 8. 5Hz, 1H,苯 _H)，9. 74 (bs, 1H, NH)； MS+ve :412. 20 Rt = 11. 19 分鐘(純度 100%，(Vydac 1))?；衔颷10] :9_環(huán)己基-2_(4-羥基-苯基氨基)-5，7，8，9_四氫-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-6-酮 紫色固體(7%)；1H NMR(DMS0-d6) S 1. 17-1. 87 (m，10H，環(huán)己烷_H)，2. 72 (bs，2H， CH2), 3. 72(bs，2H，CH2)，4. 62-4. 66 (m, 1H, CH)，6. 82 (d, J = 8. 5Hz，2H，苯 _H)，7. 13 (s，1H)， 7. 23 (s, 1H), 7. 34-7. 37 (m，3H，2x苯_H和NH) ；MS+ve :354. 2。Rt = 10. 63 分鐘(純度 100%, (Vydac 1))?；衔颷11] :9_環(huán)戊基-2-(4-羥基-苯基氨基)-7-甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶 并[4, 5-b] [1,4] 二氮雜革-6-酮 NMR(CD30D) :1. 18(3H，d，J 7Hz，CH3)，1. 52 (1H，m，CH)，1. 61-1. 84 (6H，m，CH)， 1. 99 (1H, m, CH)，2. 85 (1H, m, CH)，3. 53 (2H, m, CH)，5. 14 (1H, m, CH)，6. 74 (2H, m, Ar-H)， 7. 34 (2H, m, Ar-H), 7. 64 (1H, s, Pyr-H) ；MS (+ve) :354. 2 ；tR = 10. 85 分鐘(Vydac 1)。 化合物[12] :9_環(huán)戊基-2-(4_羥基-苯基氨基)_8_異丙基-5-甲基_5，7，8， 9-四氫-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-6-酮 NMR(DMSO) 0. 72 (3H, d, J 7Hz, CHCH3), 0. 85 (2H, d, J7Hz, CHCH3)，1. 29 (1H, m, CH)，1. 51 (4H, m, CH)，1. 60 (2H, m, CH)，1. 93 (1H, m, CH)，2. 08 (1H, m, CH)，2. 29 (2H, m, 2x CH)， 3. 13 (3H, s, N-CH3)，3. 82 (1H, m, CH)，4. 15 (1H, m, CH)，6. 65 (2H, d, J 6Hz, Ar-H), 7. 47 (2H, d, J 6Hz, Ar-H), 8. 14 (1H，s, Pyr-H) ,8. 99 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :396. 1 ；tR = 12. 54 分鐘 (Vydac 1)?；衔颷13] :9_環(huán)戊基-2_(4-羥基-苯基氨基)-5，8_二甲基-5，7，8，9_四氫-嘧 啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-6-酮 白色固體(27%)；1H NMR(DMS0-d6) 8 1.22(d,J = 6. 5Hz, 3H, CH3), 1. 38-1. 85 (m, 8H,環(huán)戊-H)，2. 49-2. 53 (m, 2H, CH2)，3. 18 (s, 3H, CH3)，4. 05-4. 10 (m, 1H, CH)，4. 51-4. 60 (m, 1H，CH)，6. 80(d, J = 9. 0Hz，2H，苯 _H)，7. 22(d,J = 9. 0Hz，2H，苯 _H)，7. 98 (s, 1H，嘧啶 _H)， 9. 53 (bs, 1H, OH)，10. 05 (bs, 1H, NH) ；MS+ve :368. 3。Rt = 10. 81 分鐘(純度 93%, (Vydac 1))?；衔颷14] :4-(9_芐基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4，5_b] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-苯甲酸 NMR (DMS0) 2. 72 (2H，m，CH2)，3. 68 (2H，m，CH2)，3. 90 (3H，s，0CH3)，4. 88 (2H，s， CH2)，7. 22-7. 44 (6H, m, Ar-H)，7. 44 (1H, s, Ar-H)，7. 77 (1H, s, Pyr-H)，8. 10 (1H, d, J 7Hz)， 8. 18 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :434. 2 ；tR = 10. 97 分鐘(Vydac 1)?；衔颷15] 4-(5-甲基-6-氧代-9-苯基-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸 NMR(DMSO) 2. 84 (2H, m, CH2)，3. 28 (3H，s, CH3) ,4. 08 (2H, m, CH2)，7. 24 (2H， d, J 8. 5Hz, Ar-H)，7. 35-7. 37 (3H, m, Ar-H)，7. 47-7. 52 (4H, m, Ar-H)，8. 29 (1H, s, Pyr-H)， 9. 77 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :390. 2 ；tR = 1. 93 分鐘(XBridge 2)?；衔颷16] :4-(9_環(huán)戊基-5，7，7_三甲基-6-氧代-6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-苯甲酸 NMR(DMSO) 1. 09 (6H, s, CH3)，1. 60 (4H, m, CH)，1. 74 (2H, m, CH)，1. 88 (2H, m, CH)，3. 19 (3H, s, N-CH3)，3. 37 (2H, s, CH2)，5. 23 (1H, s，CH)，7. 82 (4H, m, Ar-H)，7. 99 (1H, s, Pyr-H), 9. 57 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :410. 25 ；tR = 2. 25 分鐘(XBridge 2)。氨基-苯甲酰胺的制備和反應(yīng)4-氨基-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 向在二氯甲烷(50ml)中的4_氨基_3_甲氧基苯甲酸(1. 064g mg,6. 37mmol)中加 入 DIPEA(2. 22ul, 12. 74mmol)和 TBTU(2. 25g, 7. Ommol)，并攪拌混合物 10 分鐘。加入 4-氨 基-1-甲基哌啶(0. 872g，7. 65mmol)，并繼續(xù)攪拌16小時。過濾所得固體，并在真空下干燥 (1. 04g，3. 95mmol,62% )。NMR(DMSO) 1. 54 (2H, m, CH), 1. 68 (2H, m, CH), 1. 90 (2H, m, CH), 2. 15 (3H, s, N-CH3), 2. 76 (2H, d, J 11. 5Hz, CH)，3. 66(lH，m，CH)，3. 77 (3H, s, 0CH3), 6. 56 (1H, m, Ar-H)， 7. 26 (1H, m, Ar-H)，7. 75 (1H, d, J 7. 5Hz) ；MS (+ve) 264. 4 ； tR = 7. 45 分鐘(Vydac 2)。下述氨基_苯甲酰胺通過相似方法制備4-氨基-N_(l-甲基-哌啶-4-基)_苯甲酰胺，經(jīng)由[4-(1-甲基-哌啶-4-基氨
基甲?；?-苯基]-氨基甲酸叔丁基酯 [4-(1_甲基-哌啶-4-基氨基甲酰基)_苯基]-氨基甲酸叔丁基酯1H NMR(DMSO) 1. 44 (9H, s, C(CH3)3)，1. 52 (2H, m, CH)，1. 71 (2H, m, CH)，1. 92 (2H, m, CH)，1. 92 (3H, s, N-CH3)，2. 74 (2H, m, CH)，3. 68 (1H, m, N_CH)，7. 47 (2H, d, J 8. 5Hz, Ar-H)，7. 72 (2H, d, J 8. 5Hz, Ar-H), 8. 00 (1H, d, J 7. 5Hz, NH)，9. 54 (1H, s, NH)。
當(dāng)使用偶聯(lián)方法B (下述)時，使用該化合物而沒有預(yù)先脫保護(hù)。偶聯(lián)方法B化合物[17] :4-(9_環(huán)戊基-5，7_ 二甲基-6-氧代-6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 將苯胺(149mg，0.57mmol)，嘧啶(53mg,0. 19mmol)和 TFA(109 ii 1，0. 95mmol)在 2，2，2-三氟乙醇(5ml)中加熱至回流，保持18小時。蒸發(fā)溶劑，加入乙酸乙酯(10ml)，并 用飽和NaHC03，用鹽水洗滌，蒸發(fā)溶劑。加入乙酸乙酯(10ml)，并過濾所得固體，并在真空 下干燥(30mg, 0. 06mmol, 30% ) NMR(DMSO) 1. 06 (3H, d, J 7Hz, CHCH3)，1. 52-1. 78 (10H，m，烷基 CH+CH2)，
2.01 (2H, m, CH)，2. 36 (3H, s, N-CH3)，2. 73 (1H, m, CH)，2. 85 (2H, m, CH)，3. 45 (1H, m, CH)，
3.71 (1H, m, CH)，3. 94 (3H, s, 0CH3)，5. 06 (1H, m, CH)，7. 46 (2H, m, Ar_h)，7. 61 (1H, s, Ar-H)， 7. 77(1H, s, NH),8. 10(1H, d, J8Hz, Ar-H),8. 36(1H, d, J 8Hz)，Ar-H),9. 44(1H, s, NH)； MS (+ve) :508. 2 ；tR = 7. 30 分鐘(XBridge 2)。下述化合物以與上述實施例相似的方法制備化合物[18] :4-(9_環(huán)戊基-7-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 NMR(DMSO) 1. 08 (3H, d, J 7Hz, CHCH3)，1. 53-1. 80 (10H，m，烷基 CH+CH2)，
2.01 (2H, m, CH)，2. 12 (2H, m, CH)，2. 29 (3H, s, N-CH3)，2. 75 (1H, m, CH)，2. 90 (2H, m, CH)，
3.48 (1H, m, CH)，3. 77 (1H, m, CH)，5. 11 (1H, m, CH)，7. 78 (4H, m, Ar-H)，8. 04 (1H, d, J 7. 5Hz, NH)，9. 35 (1H, s, CONH)，9. 43 (1H, s, C0NH) ；MS (+ve) :478. 2 ；tR = 6. 74 分鐘(XBridge 2)?；衔颷19] :4_ (9-環(huán)戊基-8-異丙基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 NMR(CD30D) 0. 92 (3H, d, J 6. 5Hz, CHCH3), 1. 04 (3H, d, J 6Hz, CHCH3)，
1.65-1. 97(14H，m，烷基 CH+CH2)，2. 25 (2H, dd, J 11. 5Hz, 11. 5Hz, CH), 2. 36 (3H, s，N_CH3)，
2.67 (1H, m, CH)，3. 03 (3H, m, CH+CH2)，3. 51 (1H, m, CH)，3. 95 (1H, m, CH)，4. 02 (3H, s, 0CH3)，5. 09 (1H, m, CH) ,7. 59 (2H, m, Ar-H), 7. 87 (1H, s, pyr-H-H) ,8. 46 (1H, d, J 7Hz, Ar-H)； MS (+ve) :536. 3 ；tR = 7. 68 分鐘(XBridge 2)。 化合物[20] :4-(9-環(huán)戊基-5，7_ 二甲基-6-氧代-6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺NMR(DMSO) 1. 02 (3H, d, J 6. 5Hz, CHCH3)，1. 54-1. 80(12H, m,烷基 CH+CH2)， 2. 10 (3H, m, (CH+CH2)，2. 27 (3H, s, N-CH3)，2. 84 (3H, m, CH3)，3. 15 (3H, s, CH3)，3. 46 (1H, m, CH)，3. 80 (1H, m, N-CH)，3. 95 (3H, s, 0CH3)，4. 76 (1H, m, CH)，7. 50 (2H, m, Ar-H)，7. 75 (1H, s, Ar-H), 8. 10 (1H, s, NH)，8. 14 (1H，d, J 7. 5Hz, Ar-H) ,8. 40 (1H, d, J 8Hz, Ar-H) ；MS (+ve) 522. 3 ；tR = 7. 76 分鐘(XBridge 2)?；衔颷21] :4-[9_(l-乙基-丙基)-6_氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基]-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺NMR(DMSO) :0.85(6H，d，J 7Hz，CH2CH3)，1. 59 (4H，m，CH2CH3)，1. 66 (2H，m，CH)， 1. 83 (2H, m, CH)，2. 37 (3H, s, N-CH3)，2. 65 (2H, m, CH2)，2. 98 (2H, m, CH)，3. 50 (2H, m, CH2)， 3. 83 (1H, m, N-CH)，3. 94 (3H, s, 0CH3)，4. 93 (1H, s，CH)，4. ；49 (2H, m, Ar-H+NH)，7. 57 (1H, s, NH)，7. 79 (1H, s, Ar-H), 8. 15 (1H, d, J 6. 5Hz，Ar_H)，8. 37 (1H, d, J 8. 5Hz, Ar-H), 9. 41 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :496. 2 ；tR = 6. 73 分鐘(XBridge 2)?；衔颷22] :4-[9_(l-乙基-丙基)-6_氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基]-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺NMR(DMSO) :0. 86(6H，d，J 7Hz，CH2CH3)，1. 56 (4H，m，CH2CH3)，1. 62 (2H，m，CH)， 1. 76 (2H, m, CH)，2. 52 (3H, s, N-CH3)，2. 63 (2H, m, CH2)，3. 22 (2H, m, CH)，3. 49 (2H, m, CH2)， 3. 92 (1H, m, CH)，4. 97 (1H, m, CH)，7. 78 (4H, m, Ar-H)，8. 15 (1H, s, Pyr-H)，9. 31 (1H, s，NH)， 9. 39 (1H, s, NH) ；MS (+ve) :466. 3 ；tR = 6. 26 分鐘(XBridge 2)?；衔颷23] :4_ (9-環(huán)戊基-8-異丙基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧 啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰 胺 NMR(CD30D) 0. 83 (3H, d, J 7Hz, CHCH3), 0. 93 (3H, d, J 7Hz, CHCH3)，1. 41 (2H, m, CH)，1. 65 (4H, m, CH)，1. 79 (2H, M, CH)，1. 91 (2H, m, CH)，2. 17 (2H, m, CH)，2. 41 (2H, m, 2x CH)，2. 71 (4H, m, CH3+CH)，2. 91 (2H, m, CH)，3. 35 (3H, s, CH3)，3. 90 (1H, m, CH)，3. 94 (3H, s, 0CH3)，4. 21 (1H, m, CH)，4. 27 (1H, m, CH)，7. 18 (2H, m, Ar-H)，8. 23 (1H, s, Pyr-H)，8. 56 (1H, d, J 8. 5Hz, Ar-H) ；MS (+ve) :550. 3 ；tR = 8. 40 分鐘(XBridge 2)。化合物[24] :4-[9-(l-乙基-丙基)-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基]-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 NMR(DMSO) 0. 85 (6H, t, J 7. 5，CH2CH3)，1. 62 (8H, m, CH+CH2)，1. 76 (2H, d, J 7Hz, CH)，1. 94 (2H, dd, J 10Hz, 10Hz, CH)，2. 17 (3H, s, N-CH3)，2. 64 (2H, m, CH2)，2. 80 (2H, d, J 11Hz, CH), 3. 18 (3H, s, N-CH3)，3. 49 (2H, m, CH2)，3. 75 (1H, m, CH)，3. 95 (3H, s, 0CH3)， 4. 65 (1H, m, CH)，7. 49 (2H, m, Ar-H)，7. 69 (1H, s, Pyr-H)，8. 07 (1H, s，NH)，8. 10 (1H, d, J 9Hz, Ar-H), 8. 37 (1H, d, J 9Hz, Ar-H) ；MS (+ve) :510. 3 ；tR = 8. 35 分鐘(XBridge 2)?；衔颷25] :3-甲氧基-N_(l-甲基-哌啶-4-基)-4_[6-氧代-9_(四氫-吡 喃-4-基)-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革_2_基氨基]-苯甲酰胺
NMR(CD30D) 1. 60 (2H, m, CH), 1. 69 (2H, d, J 11Hz, CH), 1. 93 (2H, d, J 12Hz, CH)，1. 97 (2H, dd, J 12Hz, 12Hz, CH)，2. 18 (3H, s, N-CH3)，2. 61 (2H, m, CH2)，2. 80 (2H, d, J 10. 5Hz, CH), 3. 48 (2H, dd, J 11Hz, CH)，3. 62 (2H, m, CH2)，3. 75 (1H, m, CH)，3. 95 (3H, s, 0CH3), 4. 04 (2H, d, J 8Hz, CH), 4. 85 (1H, s, CH)，7. 49 (2H, m, Ar-H), 7. 66 (1H, s, NH)， 7. 81 (1H, s, Pyr-H)，8. 11 (1H, d, J7. 5Hz, Ar-H)，8. 33 (1H, d, J 8Hz,Ar-H)，9. 45 (1H, s，NH)； MS (+ve) :510. 1 ；tR = 5. 34 分鐘(XBridge 2)。化合物[26] :3-甲氧基-4-[5-甲基-6-氧代-9-(四氫-吡喃-4-基)-6，7，8， 9-四氫-5H-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基]-N-(l-甲基-哌啶-4-基)-苯 甲酰胺 1H NMR(CD30D) :1· 73 (2H, ddd, J 3Hz, 12Hz, 18Hz, CH)，1. 84 (2H, d, J 11Hz, CH)，
1.98 (4H, m，燒基 CH)，2. 19 (2H, dd, J 10. 5Hz, 10. 5Hz, CH)，2. 33 (3H，s, N-CH3)，2. 71 (2H， m, CH2), 2. 97 (2H, d, J 12Hz, CH)，3. 65 (2H, dd, Jl IHz，CH)，3. 75 (2H, m, CH2)，3. 92 (1H, m, CH)，4. 02 (3H, s, 0CH3), 4. 12 (1H, dd, J 4Hz, 11Hz, CH)，4. 78(lH，m，CH)，7. 53 (2H, m, Ar-H)， 8. 04 (1H, s, Pyr-H), 8. 45 (1H, d, J 9Hz, Ar-H) ；MS (+ve) :524. 3 ；tR = 5. 71 分鐘(XBridge 2)?；衔颷27] :4-[5-乙基-9-(l-乙基-丙基)-6_氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基]-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 1H NMR(DMSO) 0. 86 (6H, t, J 7. 5Hz, CH3) ,0. 94 (3H, d, J 7Hz，CH3)，1. 63 (6H，m， 燒基 CH+CH2)，1. 78(2H，d, J 11Hz, CH), 1. 94 (2H, dd, J 11. 5Hz, CH), 2. 18 (3H, s, N-CH3)，
2.57 (2H, m, CH2)，2. 80 (2H, m, CH2)，3. 47 (2H, m, CH2)，3. 77 (3H, m, CH+CH2)，3. 96 (3H, s, 0CH3), 4. 59 (1H, m, CH)，7. 50 (2H, m, Ar-H), 7. 24 (1H, s, NH) ,8. 01 (2H, m, Ar-H+Pyr-H), 8. 39 (1H, d, J 9Hz, Ar-H) ；MS (+ve) :524· 3 ；tR = 7. 56 分鐘(XBridge 2)?；衔颷29] :4-(9-芐基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4, 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(l-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 1H NMR(DMSO) 1. 58 (2H, ddd, J 4Hz, 12. 5Hz,24. 5Hz, CH), 1. 73 (2Η, d, Jll. 5Hz, CH)，1. 93 (2Η, dd, J 15Hz,CH)，2. 17 (3H, s, N-CH3)，2. 69 (2H，m，CH2)，2. 78 (2H, d, J 11. 5Hz, CH)，3. 22 (3H, s, N-CH3)，3. 63 (2H, m, CH2)，3. 72 (1H, m, CH)，3. 91 (3H, s, 0CH3)，4. 87 (2H, s, CH2)，7. 23-7. 32 (4H, m, Ar-H)，7. 35-7. 43 (2H, m, Ar-H)，7. 44 (1H, d, J 2Hz,Ar-H)，7. 72 (1H, s, Pyr-H), 8. 04 (1H, d, J 7. 5Hz, Ar-H), 8. 12 (1H, d, J 8. 5Ηζ)，8· 16 (1Η, s, NH) ；MS (+ve) 530. 4 ；tR = 4. 55 分鐘(XBridge 2)?；衔颷30] :3-甲氧基-4-(5-甲基-6-氧代-9-苯基-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺
1H NMR (DMSO) 1. 56 (2H, dd, J 11. 5Hz，20. 5Hz，CH), 1. 75 (2H, d, JlOHz，CH)， 1. 95 (2H, m, CH)，2. 18 (3H, s, N—CH3)，2. 83 (3H, m, CH+CH2)，3. 16 (1H, s，CH)，3. 27 (3H, s, N-CH3)，3· 71(lH，m，N-CH)，3· 88 (3Η，s，0CH3)，4. 06(2H，m，CH2) ；MS (+ve) :516· 3 ；tR = 2. 72 分鐘(XBridge 2)?；衔颷31] :4-(9_環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-螺[嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-3，1 ‘-環(huán)丙烷]-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲 酰胺 1H NMR(DMSO) 0. 66 (2H, d, J 6Hz，環(huán)丙基-CH)，0. 91 (2H，d, J 6Hz，環(huán)丙基-CH)，
1.50 (2H, m, CH)，1. 58 (4H, m, CH)，1. 69 (2H, m, CH)，1. 77 (2H, m, CH)，1. 95 (4H, m, CH)，
2.16 (3H, s, N-CH3), 2. 73 (1H, s, CH)，2. 79 (2H, d, JllHz, CH)，2. 89 (1H, s, CH)，3. 16 (3H, s, N-CH3)，3. 47 (2H, s, CH2)，3. 72 (1H, m, CH)，3. 94 (3H, s, 0CH3)，4. 86 (1H, m, CH)，7. 46 (2H, m, Ar-H), 7. 67 (1H, s, NH)，7. 95 (1H, s, Pyr-H), 8. 07 (1H, d, J 8Hz, Ar-H), 8. 38 (1H, d, J 8Hz, Ar-H) ；MS (+ve) :534· 3 ；tR = 3. 05 分鐘(XBridge 2)?；衔颷32] :4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 1H NMR(DMSO) 1. 09 (6H, s, CH3)，1. 58 (6H, m, CH2)，1. 74 (4H, m, CJ)，1. 95 (4H, m, CH)，2. 16 (3H, s, NCH3), 2. 73 (2H, d, J 11. 5Hz, CH)，3. 18 (3H, s, NCH3)，3. 37 (2H, s, CH2)，
3.74 (1H, m, CH)，3. 94 (3H, s, 0CH3)，5. 19 (1H, m, CH)，7. 46 (2H, m, Ar-H)，7. 67 (1H, s，NH)， 7. 98 (1H，s，Pyr-H)，8. 07 (1H，d，J8Hz，Ar-H)，8. 36 (1H，d，J 8Hz) ；MS (+ve) 536. 40 ；tR =3. 32 分鐘(XBridge2)。酰胺偶聯(lián)下述也通過實施例1，步驟7中所述的方法制備化合物[33] :4-(9-環(huán)戊基-5，8_ 二甲基-6-氧代-6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺
黃色固體(31%) ο 1H NMR(CD3OD) δ 1. 24 (d, J = 6. 5Ηζ，3Η，CH3)，1. 36-2. 17 (m, 16Η, 8χ 環(huán)戊-H 和 4χ 哌啶-H)，2· 51 (s，3H, CH3)，3. 14-3. 16 (m, 2H, CH2)，3. 28 (s, 3H, CH3)， 4. 00 (s，3H, CH3)，4. 04-4. 06 (m, 1H, CH)，4. 71-4. 74 (m, 1H, CH)，7. 49-7. 52 (m, 2H)，7. 99 (s, 1H)，8. 41(d，J = 8. 5Hz，1H，苯-H) ；MS+ve :522· 4。Rt = 10. 03 分鐘(純度 97%，Vydac 1)化合物[34] :4-(9_環(huán)戊基-8-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5Η_嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 黃色固體(38%) ；MS+ve 508. 3。Rt = 9. 53 分鐘(純度 97%, Vydac 1)化合物[35] :4-(9_環(huán)己基-8-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 灰白色固體(33% ) ；1H NMR(CD3OD) δ 1. 34-1. 41(m，2H)，1. 44 (d, J = 6. 5Hz, 3H, CH3)，1. 60-1. 99 (m, 8H)，2. 22-2. 26 (m, 2H)，2. 73-2. 77 (m, 1H)，2. 91 (s,3H, CH3)， 2. 96-3. 25 (m, 5H)，3. 61-3. 63 (m, 2H, CH2)，4. 01 (s, 3H, CH3)，4. 17-4. 21 (m, 1H, CH)，
4.33-4. 36 (m, 1H, CH)，7. 59 (dd，J = 2. 0 和 8. 5Hz，1H,苯-H)，7. 63 (d，J = 2. OHz，1H,苯-H)， 7. 69 (s，1H，嘧啶-H)，8.00 (d，J = 8. 5Hz，1H，苯-H) ；MS+ve :522· 2。Rt = 10. 17 分鐘(純 度 100%, Vydacl)?；衔颷36]:4-(9_ 環(huán)戊基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5Η-嘧啶并[4, 5-b] [1,4]
二氮雜革-2-基氨基)-3_甲氧基-N-(l-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺 紫色固體(40%)；1H NMR(CD3OD) δ 1. 65-2. 25 (m，8H，環(huán)戊-H)，2. 34 (s，3H，CH3)， 2. 73-2. 75 (m, 2H, CH2)，3. 69-3. 71 (m, 2H, CH2)，3. 90-3. 94 (m, 1H, CH)，4. 01 (s,3H, CH3)，
5.22-5. 25 (m, 1H, CH)，7. 48-7. 51 (m, 2H, 2x 苯-H)，7. 76 (s, 1H,嘧啶-H)，8. 47 (s, 1H, NH)；MS+ve 493. 4。Rt = 9. 21 分鐘(純度 92%, Vydac 1)。 化合物[37] :4-(9-環(huán)戊基-5，8_ 二甲基-6-氧代-6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并 [4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺
灰白色固體(45% ) ；1H 匪R(DMS0-d6) 8 1. 17 (d, J = 6. 0Hz,3H, CH3)， 1. 29-2. 10 (m, 16H, 8x 環(huán)戊 _H 禾口 8x 哌啶 _H)，2. 21 (bs，3H, CH3)，2. 81-2. 83 (m, 2H, CH2)， 3. 21 (s, 3H, CH3)，3. 73-3. 76 (m, 1H, CH)，4. 03-4. 05 (m, 1H, CH, 4. 68-4. 72 (m, 1H, CH)， 7. 74-7. 79(m，4H，苯-H)，8. 11 (s，1H，嘧啶 _H)，9. 47 (bs，1H，NH) ；MS+ve :492. 3。Rt = 9. 70 分鐘(純度 92%，Vydac 1)?；衔颷38] :4-(9-環(huán)戊基-8-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N- (1-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺
灰白色固體(15% ) ；1H 匪R(DMS0-d6) 8 1. 25 (d, J = 7. 0Hz,3H, CH3)， 1. 51-2. 04 (m, 10H) , 2. 09(s，3H，CH3) , 2. 55-2. 66 (m,6H) , 2. 78-2. 79 (m，2H，CH2)， 3. 05-3. 15 (m, 1H, CH)，3. 95-4. 04 (m, 1H, CH)，5. 13-5. 15 (m, 1H, CH)，7. 75 (dd, J = 8. 5Hz, 4H,苯-H)，7. 81(s，1H,嘧啶-H)，8. 24 (d, J = 7Hz, 1H, NH)，9. 48 (s, 1H, NH)，9. 66 (bs, 1H, NH) ；MS+ve :478. 3。Rt = 9. 28 分鐘(純度 100%, Vydac 1)?；衔颷39]:4-(9_ 環(huán)己基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4, 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)_3_甲氧基-N-(l-甲基-哌啶-4-基)-苯甲酰胺
灰白色固體(19%)；1H NMR(DMS0-d6) S 1. 16-1. 98 (m，18H，10x 環(huán)己烷 _H)和 8x 哌啶-H), 2. 18(s，3H，CH3), 2. 60 (dd, J = 5Hz，2H，CH2)，3. 60 (dd，J = 5Hz，2H，CH2)， 3. 73-3. 76 (m, 1H, CH)，3. 95 (s, 3H, CH3)，4. 58-4. 63 (m, 1H, CH)，7. 46 (dd, J = 2. 0 和 8. 0Hz, 1H,苯-H)，7. 49 (d, J = 2Hz, 1H,苯 _H)，7. 60 (s, 1H)，7. 78 (s, 1H)，8. 10 (d, J = 8. 0Hz, 1H, NH) ,8. 37 (d, J = 8. 0Hz，lH，苯-H)，9. 41(bs，lH，NH) ；MS+ve :508. 4。Rt = 9. 70 分鐘(純 度 95%，Vydacl)。實施例2通用實驗分析和制備RP-HPLC-MS 使用 Waters XBridge (50x4. 6mm C183. 5 ii m 或 100x4. 6mmC183. 5μπι)和XBridge (100x19mm C185 μ m)柱進(jìn)行，使用線性梯度的溶劑A (水，含0. 1 % 氫氧化銨和5%乙腈)/溶劑B (乙腈)系統(tǒng)。制備RP-HPLC使用Apex Prepsil ODS 10 μ 柱(22x250mm)進(jìn)行，使用線性梯度的溶劑A (水，含0. 1 % TFA) /溶劑B (乙腈)。質(zhì)譜使用 WatersZQ2000單四級桿質(zhì)譜儀(電噴霧離子化(ESI))獲得。所用的梯度如下 中間體1 :2_氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-8，9-二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮 雜簞-6(7H)_酮 1.亞硫酰氯(2. 1當(dāng)量)，MeOH，于0°C添力Π，回流2小時；2.環(huán)戊酮(0. 77當(dāng)量)，乙 酸鈉(0. 77當(dāng)量)，三乙酰氧基硼氫化鈉(1. 11當(dāng)量)，DCM，室溫16小時；3. 2，4-二氯-5-硝 基嘧啶(1. 1當(dāng)量)，K2CO3 (1當(dāng)量)，丙酮，0°C -室溫16小時；4. NH4Cl (8. 5當(dāng)量)，F(xiàn)e (8當(dāng) 量)，Et0H/H20 (4 1)，回流 2. 5 小時；5. MeI (1. 18 當(dāng)量)，NaH(l. 07 當(dāng)量)，DMF，_10°C -室 溫，3小時。步驟1 :3_氨基丙酸甲基酯將β -丙氨酸(9. 37g，0. 105mol, 1. O當(dāng)量)加入到MeOH (50mL)中，并將混合物冷 卻至O°c，然后滴加亞硫酰氯(16mL，0. 221mol,2. 1當(dāng)量)[小心添加放熱]。將反應(yīng)溫?zé)?至室溫，然后加熱回流2小時。溶液在真空中濃縮，用叔丁基甲基醚處理，并通過過濾移出 所得結(jié)晶。產(chǎn)物為白色晶態(tài)固體(Hg, 100% ) ；1H(DMS0-d6) δ 2. 73(2H，dd，J = 7Hz,CH2), 2. 98 (2H, dd, J = 7Hz, CH2), 3. 61 (3H, s, CH3), 8. 28 (2Η, bs, NH2) ；MS+ve :104· 1。步驟2 :3-(環(huán)戊基氨基)丙酸甲基酯將3-氨基丙酸甲基酯(9. 37g，0. 09mol)溶于DCM (200mL)中。加入環(huán)戊酮 (6. 43mL,0. 07mol,0. 77當(dāng)量)，乙酸鈉(5. 96g,0. 07mol,0. 77當(dāng)量)和三乙酰氧基硼氫化 鈉(22g，0. IOmoia. 11當(dāng)量)，然后將反應(yīng)在室溫攪拌16小時。添加20%碳酸氫鈉(IOOmL) 和2M氫氧化鈉(50mL)，且產(chǎn)物使用DCM/H20萃取。合并有機(jī)萃取液，用飽和NaCl洗滌，干燥(MgSO4),然后在減壓下蒸發(fā)，得到產(chǎn)物，為淡黃色油狀物(8.90g，55%) ；MS+ve :172.4。步驟3 3-[環(huán)戊基(2-氯-5-硝基嘧啶_4_基)氨基]丙酸甲基酯將3-(環(huán)戊基氨基)丙酸甲基酯(0. 838g，0. 005mol，l當(dāng)量)和K2CO3(0. 676g，
0.005mol，l當(dāng)量)添加到丙酮(5mL)中，并將所得混合物冷卻至0°C，然后滴加2，4_二 氯-5-硝基嘧啶(1. 04g，0. 0055mol, 1. 1當(dāng)量)。將反應(yīng)混合物(RM)溫?zé)嶂潦覝?，并再繼 續(xù)攪拌16小時，然后再添加0.12當(dāng)量的嘧啶。再繼續(xù)攪拌3小時。反應(yīng)混合物在減壓下 蒸發(fā)，且產(chǎn)物使用Et0AC/H20萃取。有機(jī)萃取液用飽和NaCl洗滌，干燥(MgSO4)，并在減壓 下蒸發(fā)，得到產(chǎn)物，為褐色油狀殘余物(1.04g,65%) ；MS+ve:329.2;Rt = 3·78分鐘(分析 _1)。步驟4 :2_氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-6H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革 -6-酮將3_[環(huán)戊基(2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基]丙酸甲基酯(1. Og, 0. 003mol, 1 當(dāng)量)和 NH4Cl (1. 38g，0. 025mol，8. 5 當(dāng)量)添加到 Et0H/H20(4 1，IOmL)中，并將混合 物加熱至回流。分批加入鐵粉(1.36g，0.024mol，8當(dāng)量)，且2小時后，將反應(yīng)混合物趁熱 通過硅藻土過濾，用EtOAc(IOmL)和EtOH(IOmL)[都是熱的]洗滌。溶劑在減壓下蒸發(fā)， 得到產(chǎn)物，為褐色固體(0. 35g,43% ) ；1H(DMSO-Cl6) δ 1. 55 (4Η, m，2CH2)，1. 7 (2Η，m, CH2),
1.83 (2Η, m, CH2)，2. 66 (2H, t, J = 5Hz, CH2)，3. 57 (2H, t, J = 5Hz, CH2)，5. 01 (1H, m, CH)， 7. 83 (1H, s, CH) ,9. 71 (1H, s, NH) ；MS+ve 267. 2 ；Rt = 2. 87 分鐘(分析 _1)。步驟5 :2_氯-9-環(huán)戊基-5-甲基_8，9_ 二氫_5H_嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜 革-6(7H)_ 酮將2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-6H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革_6_酮 (0. 318g,0. 0012mol)和 MeI (0. 088mL，0. 0014mol，1· 18 當(dāng)量)添力卩到 DMF(5mL)中，并將溶 液冷卻到-IO0C0加入NaH(0. 03g，0. 0013mol, 1. 07當(dāng)量)，且反應(yīng)混合物在0°C攪拌30分 鐘，并在室溫攪拌30分鐘。減壓下蒸發(fā)溶劑，且產(chǎn)物使用Et0AC/H20萃取。合并有機(jī)萃取液， 用飽和NaCl洗滌，干燥(MgSO4)，并在減壓下蒸發(fā)，得到產(chǎn)物，為紫色油狀殘余物(0. 25g， 75% ) ；1H(DMS0-d6) δ 1. 55 (4Η, m, 2CH2)，1. 7(2H，m，CH2)，1. 9 (2H，m，CH2)，2. 63 (2H, t, J = 5Hz, CH2), 3. 17 (3Η, s, CH3), 3. 65 (2Η, t, J = 5Hz, CH2), 4. 74 (1Η, m, CH), 8. 14 (1Η，s, CH)； MS+ve :281. 2 ;Rt = 3· 11 分鐘(分析 _1)。使用與對于上述中間體1所述相似的方法，制備下述中間體2-4 中間體2:2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基,9' - 二氫螺[環(huán)丙烷_1， 7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜萆]-6' (5' H)-酮1-氨基甲基-環(huán)丙烷羧酸乙基酯與環(huán)戊酮、乙酸鈉和三乙酰氧基硼氫化鈉在DCM 中反應(yīng)，得到1-環(huán)戊基氨基甲基-環(huán)丙烷羧酸乙基酯 1H NMR(CDCl3) 0. 84 (3H, t, J 7Hz, CH3)，1. 25 (4H，m, CH2)，1. 37 (2H，m, CH)， 1. 54 (2H, m, CH)，1. 70 (2H, m, CH)，1. 83 (2H, m, CH)，2. 71 (2H, s, CH2)，3. 10 (1H, m, CH)， 4. 16 (2H, q, J 7Hz, CH2CH3)。
1-環(huán)戊基氨基甲基-環(huán)丙烷羧酸乙基酯與2，4- 二氯-5-硝基嘧啶和K2CO3在丙酮 中反應(yīng)，得到1- {[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]-甲基}環(huán)丙烷羧酸乙基 酯。用NH4Cl和鐵粉在乙醇中處理，得到1- {[ (5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨 基]-甲基}_環(huán)丙烷羧酸乙基酯 MS (+ve) 339. 2，341. 2 ；Rt = 4. 15 分鐘(分析 _2)。上述化合物在DMF中加熱至140°C，保持2小時。溶劑在真空中蒸發(fā)，加入乙酸乙 酯，且過濾所得固體，并在真空下干燥得到2'-氯-9'-環(huán)戊基-8' ,9' _ 二氫螺[環(huán)丙 烷 _1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮 MS (+ve) :293. 2，295. 2 ;Rt = 3. 48 分鐘(分析 _2)。2-氯 _9_ 環(huán)戊基 _5，7，8， 9-四氫-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-7，1'-環(huán)丙烷]-6-酮和MeI和NaH在DMF中 反應(yīng)，得到2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8'，9' - 二氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并 [4，5-b][l，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮 MS (+ve) 307. 1,309. 2 ；Rt = 3. 67 分鐘(分析 _3)。中間體3 :2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，7_三甲基-8，9-二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l， 4] 二氮雜簞-6 (7H)_酮3-氨基-2，2- 二甲基-丙酸乙基酯與環(huán)戊酮、乙酸鈉和三乙酰氧基硼氫化鈉在 DCM中反應(yīng)，得到3-環(huán)戊基氨基-2，2- 二甲基-丙酸乙基酯 1H NMR(CDC13) 1. 19 (6H, s, CH3)，1. 25 (3H，t, J 7Hz, CH3)，1. 28 (2H，m，CH)， 1. 49 (2H, m, CH)，1. 65 (2H, m, CH)，2. 64 (1H, s, CH2)，3. 01 (1H, m, CH)，4. 10 (2H, q, J 7. 5Hz, CH2)3-環(huán)戊基氨基-2，2- 二甲基-丙酸乙基酯與2，4- 二氯_5_硝基嘧啶和K2CO3在 丙酮中反應(yīng)，得到3-[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]_2，2- 二甲基-丙酸
乙基酯
MS (+ve) 371. 1,373. 1 ；Rt = 4. 67 分鐘(分析 _2)。3_[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)_環(huán)戊基-氨基]_2，2_ 二甲基-丙酸乙基酯與 NH4C1和鐵粉在乙醇中反應(yīng)，得到3-[(5_氨基-2-氯-嘧啶-4-基)_環(huán)戊基-氨基]_2， 2-二甲基-丙酸乙基酯 MS (+ve) 341. 2，343. 2 ；Rt = 4. 25 分鐘(分析 _2)。3- [ (5-氨基-2-氯-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]_2，2_ 二甲基-丙酸乙基酯在 DMF中加熱至140°C，保持2小時。溶劑在真空中蒸發(fā)，加入乙酸乙酯，且過濾所得固體，并 在真空下干燥，得到2-氯-9-環(huán)戊基-7，7- 二甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-6-酮 MS (+ve) 295. 1,297. 2 ；Rt = 3. 58 分鐘(分析 _2)。2-氯-9-環(huán)戊基-7，7-二甲基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革 -6-酮與Me I和NaH在DMF中反應(yīng)，得到2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-8，9- 二氫-5H-嘧 啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-6(7H)_ 酮 MS(+ve) :309. 1，311.2 ;Rt = 3. 90 分鐘(分析 _3)。中間體 4:2'-氯 _9'-環(huán) 戊基-5'-甲基-8'，9' - 二氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革 ]-6' (5' H)-酮1-氨基甲基_環(huán)丁烷羧酸甲基酯與環(huán)戊酮、乙酸鈉和三乙酰氧基硼氫化鈉在DCM 中反應(yīng)，得到1-環(huán)戊基氨基甲基-環(huán)丁烷羧酸甲基酯 1H NMR(CDC13) 1. 36 (2H，m，CH2)，1. 51 (2H，m，CH2)，1. 66 (2H，m，CH2)，1. 95 (4H，m， 2xCH2)，2. 15 (2H, m, CH2)，2. 43 (4H, m, 2xCH2)，2. 93 (2H, s, CH2)，3. 21 (1H, m, CH)，3. 76 (3H, s, CH3)。1-環(huán)戊基氨基甲基-環(huán)丁烷羧酸甲基酯與2，4- 二氯-5-硝基嘧啶和K2CO3在丙 酮中反應(yīng)，得到1- {[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基-氨基]-甲基} _環(huán)丁烷羧酸 甲基酯 MS (+ve) 369. 2,371. 2 ；Rt = 3. 48 分鐘(分析 _1)。1-{[ (2-氯-5-硝基-嘧啶-4-基)-環(huán)戊基_氨基]-甲基} _環(huán)丁烷羧酸甲基酯 與NH4C1和鐵粉在乙醇中反應(yīng)，得到2'-氯-9'-環(huán)戊基-8'，9' - 二氫螺[環(huán)丁烷_1， 7' _嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革(5' H)-酮，直接分離。 MS (+ve) 307. 2，309. 2 ；Rt = 3. 48 分鐘(分析 _1)。2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，8，9-四氫-嘧啶并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革-7，Γ -環(huán) 丁烷]-6-酮與MeI和NaH在DMF中反應(yīng)，得到2'-氯_9 ‘-環(huán)戊基-甲基， 9' _ 二氫螺[環(huán)丁烷 _1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮 MS (+ve) :321· 2，323. 3 ；Rt = 3. 77 分鐘(分析 _1)。中間體5:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺 [環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丙烷_1，7 ‘-嘧 啶并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體2) (0. 70g，2. 5mmol，l 當(dāng)量)，4_ 氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.25g，7. 5mmol,3 當(dāng)量)和 TFA(1. 43g, 12. 5mmol,5 當(dāng)量)在 TFE(25mL)中加熱至回流，保持18小時。溶劑在真空中蒸發(fā)，且所得殘余物用MeOH研磨， 得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1， 7' _嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(0.81g，74%)。
Rt = 1. 88 分鐘(分析 _l)MS(+ve) 438. 4，MS(_ve) 436. 5。中間體6 :4-(9_環(huán)戊基_5，7，7_三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸將2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮 雜革-6 (7H)-酮(中間體3) (0. 35g，1. 14mmol, 1當(dāng)量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(0. 57g， 3. 42mmol,3 當(dāng)量)和 TFA(0. 42mL，5. 7mmol，5 當(dāng)量)在 TFE(lOmL)中加熱至回流，保持 36 小時。在真空中蒸發(fā)溶劑，且所得殘余物用EtOAc研磨，得到4-(9_環(huán)戊基-5，7，7-三甲 基-6-氧代_6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革_2_基氨基)-3-甲氧基 苯甲酸(0. 38g，76% )。 MS (+ve) 440. 3，MS (-ve) 438. 5。中間體7:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺 [環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丁烷_1，7 ‘-嘧 啶并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體 4) (1.02g，3. 18mmol，l 當(dāng)量)， 4_氨基-3-甲氧基苯甲酸(1.6g，9. 5mmol,3當(dāng)量)禾P TFA(1. 2mL，15. 9匪ol，5當(dāng)量)在 TFE(40mL)中加熱至回流，保持24小時。在真空中蒸發(fā)溶劑，且所得殘余物用EtOAc研磨， 得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丁烷_1， 7' _嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(1.08g，75%)。
Rt = 2. 10 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 452. 3，MS (-ve) 450. 4。
中間體8 :4-(9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸將2-氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-8，9-二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜 萆-6(7H)_酮(中間體1) (0. 70g，2. 5mmol,l當(dāng)量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(1. 25g， 7. 5mmol,3 當(dāng)量)和 TFA(0. 93mL，12. 5mmol，5 當(dāng)量)在 TFE(25mL)中加熱至回流，持續(xù) 20 小時。在真空中蒸發(fā)溶劑，且所得殘余物用MeOH研磨，得到'4-(9_環(huán)戊基-5-甲基_6_氧 代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革_2_基氨基)-3-甲氧基苯甲酸 (0. 66g,64% )。 Rt= 1.88 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) :412· 4，MS (_ve) :410· 5。中間體9:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺 [環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_氟苯甲酸將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體 2) (0.42g，L36mmol，l 當(dāng)量)，4_ 氨 基-3-氟苯甲酸(0. 63g，4. Immol，3 當(dāng)量)和 TFA(0. 5ImL, 6. 8mmol,5 當(dāng)量)在 TFE (IOmL) 中加熱至回流，保持36小時。再加入4-氨基-3-氟苯甲酸(0.63g，4. lmmol,3當(dāng)量)和 TFA(0. 51mL, 6. 8mmol,5當(dāng)量)，且反應(yīng)再次加熱至回流，保持4天。在真空中蒸發(fā)溶劑，且 所得殘余物用EtOAc研磨，得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代_5 ‘，6'，8'， 9' _四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-氟苯 甲酸(0.41g，71% )。 Rt = 1. 93 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 426. 3中間體10:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺 [環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜萆]-2'-基氨基)-3_氟苯甲酸將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶 并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體 4) (0.20g，0.63mmol，l 當(dāng)量)，4_ 氨 基-3-氟苯甲酸(0. 30g，1.9mmol，3 當(dāng)量)和 TFA (0. 24mL，3. 2mmol，5 當(dāng)量)在 TFE 中加熱 至回流，保持18小時。再加入4-氨基-3-氟苯甲酸(0.20g)和TFA(0. ImL)，且將反應(yīng)再 次加熱至回流，保持2天。再加入TFA(0.24mL)，且將反應(yīng)再次加熱至回流，保持3天。真 空中蒸發(fā)溶劑，且所得殘余物用EtOAc研磨，得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基 氨基)_3_氟苯甲酸(0. 15g，55% )。
Rt = 2. 02 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 440. 3 ；MS(_ve) 438. 4中間體11 :4_氨基-N-(反_4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪基)環(huán)己基)_3_甲氧
基苯甲酰胺 4-氨基-N-(反-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺 為本領(lǐng)域中已知的化合物，且通過WO 2007/090844A1中描述的方法制備。中間體12 :4-(9_環(huán)戊基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9_四氫_5H_嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺將4-(9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫 _5H_ 嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二 氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體8) (0. 49g,1.2mmol,l當(dāng)量)，TBTU(0. 42g， 1. 3mmol, 1. 1 當(dāng)量)和 DIPEA(0. 40mL，2. 4mmol，2 當(dāng)量)在 DCM(25mL)中一起攪拌 30 分鐘， 然后加入4-氨基-1-B0C-哌啶(0. 29g，1. 4mmol, 1. 2當(dāng)量)。反應(yīng)混合物于室溫攪拌20小 時，然后用DCM(30mL)稀釋，并依次用水(2xl5mL)，50 %飽和碳酸氫鈉水溶液(lx20mL)，碳 酸鉀水溶液(lx20mL)和飽和鹽水(lx20mL)洗滌。在真空中濃縮，分離4-(9-環(huán)戊基-5-甲 基-6-氧代_6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧 基-N-(1-B0C-哌啶-4-基)苯甲酰胺，其沒有進(jìn)一步純化即使用(0.71g)。Rt = 3.58分 鐘(分析_1)。加入鹽酸甲醇溶液，并將溶液在室溫攪拌4小時。真空中濃縮，得到4_(9_環(huán) 戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革_2_基氨 基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺的鹽酸鹽。將該鹽分配于DCM和pH 8的碳酸 鉀水溶液之間。分離DCM層，水層用DCM和EtOAc萃取。將合并的有機(jī)層干燥(MgS04)，并 在真空中濃縮，得到4- (9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺，為游離堿(0.51g)。 Rt = 2. 78 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 494 ；MS (-ve) :492。化合物[254]:4-(9'-環(huán)戊基 -甲基 -氧代 ,6' ,8' ,9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲 基哌嗪-1-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代_5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體5) (22mg，0. 05mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA (17 μ 1,0. IOmmol，2 當(dāng)量)和 TBTU(18mg，0. 055mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到0.5mL DMF中，且將所得溶液在室溫攪拌30分鐘，然后添加1-氨基-4-甲 基哌嗪(12μ 1，0. lmmol，2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物在室溫攪拌4小時，然后通過制備 RP-HPLC-MS(制備_1)純化，得到4-(9‘-環(huán)戊基-甲基-6'-氧代,6' ,8'， 9' _四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧 基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(白色固體，8mg，30% )。 Rt = 2. 63 分鐘(分析 _l)MS(+ve) 535. 5 ；MS (-ve) 533. 6 ； IH NMR(DMS0_d6) δ ppm :0. 63-0. 70 (2H, m)，0. 87-0. 94 (2H, m)，1. 43-1. 54 (2H, m) , 1. 55-1. 63 (2H, m)， 1. 64-1. 73 (2H, m)，1. 83-1. 94 (2H, m)，2. 18 (3H, s)，2. 31-2. 48 (4H, m)，2. 92 (4H, m)， 3. 16 (3H, s)，3. 47 (2H, s)，3. 94 (3H, s)，4. 78-4. 91 (1H, m)，7. 35-7. 48 (2H, m)，7. 68 (1H, s)， 7. 98 (1H, s)，8. 39 (1H, d, J = 8. 3Hz)，9. 31 (1H, s)?；衔颷218] (士)-4_(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6 ‘-氧代 _5'，6'，8'， 9' _四氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧 基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丁 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基苯甲酸(中間體 7) (15mg，0. 033mmol)，DIPEA(12 μ 1,0. 066mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(12mg，0. 036mmol, 1. 1 當(dāng) 量)添加到0.5mL DMF中，且所得溶液在室溫攪拌5分鐘，然后添加3-氨基奎寧環(huán)二鹽酸 鹽(8mg，0.04mmOl，1.2當(dāng)量)^P DIPEA (13 μ L) 0然后反應(yīng)混合物在室溫攪拌3小時，然后 通過制備RP-HPLC-MS (制備_2)純化，得到(士)-4-(9 ‘-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧 代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基
氨基)-3_甲氧基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺。 Rt = 3. 26 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 560. 4 ； IH NMR(DMS0_d6) δ ppm :8· 37(d, J = 8. 3Hz, 1H)，8· 08 (d, J = 6. 8Hz, 1H)，8· 05 (s, 1H)，7· 73 (s, 1Η)，7· 45-7. 53(m，2H)，4· 82 (五 重峰，J = 8. 3Hz，lH)，3.84-4.01(m，4H)，3.64(s，2H)，3. 18(s，3H)，3.04-3. 14(m，lH)， 2. 88 (t, J = 9. 8Hz, 1H)，2· 58-2. 75 (m，4H)，2· 21-2. 33 (m，2H)，2. 07(s，2H)，1. 97 (br. s.， 2H)，1. 87 (br. s.，2H)，1. 76 (d, J = 4. 9Hz，2H)，1. 56-1. 70(m，8H)，1. 30 (br. s.，1H)化合物[195] :4-(9_環(huán)戊基-5，7，7_三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- (4-甲基-哌嗪-1-基)-苯甲酰胺將4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4, 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體6) (20mg,0. 046mmol,l當(dāng)量)， DIPEA (16 μ 1,0. 091mmol，2 當(dāng)量)和 TBTU (16mg，0. 05mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到 0. 5mL DMF 中， 且所得溶液在室溫攪拌5分鐘，然后添加1-氨基-4-甲基哌嗪(7mg)。然后將反應(yīng)混合物于 室溫攪拌16小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化，得到4- (9-環(huán)戊基_5，7，7-三 甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧 基-N-(4-甲基-哌嗪-1-基)_苯甲酰胺。Rt = 2. 81 分鐘(分析_1) ；MS (+ve) 537. 5 ； IH NMR(DMS0_d6) δ ppm 1. 09 (6H, s), 1. 61 (4H, m)，1. 73 (2H, m)，1. 87 (2H, m)，2. 19 (3H, s)，2. 42 (2H, m)，2. 92 (4H, m)，3. 29 (3H, s)， 3. 37 (3H, m)，3. 93 (3H, s)，3. 17 (1H, m)，7. 40 (2H, m)，7. 68 (1H, s)，7. 98 (1H, s)，8. 37 (1H, d, J 7Hz),9. 30(1H, s)。化合物[221]:4-(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲 基哌嗪-1-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丁 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基苯甲酸(中間體 7) (15mg，0. 033mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(12 μ 1,0. 066mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(12mg，0. 036mmol, 1. 1當(dāng)量)添加到0. 5mL DMF中，且所得溶液在室溫攪拌5分鐘，然后添加1_氨基_4_甲 基哌嗪(5mg)和DIPEA(13yL)。然后反應(yīng)混合物在室溫攪拌3小時，然后通過制備 RP-HPLC-MS(制備_2)純化，得到4-(9‘-環(huán)戊基-甲基-6'-氧代,6' ,8'， 9' _四氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺。
Rt = 2. 79 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 549. 5 ；IH 匪R(DMS0_d6) δ ppm :9· 31 (s, 1H)，8· 37 (d, J = 8. 3Hz, 1Η)，8· 05 (s，1Η)，7· 72 (s, 1Η)，7· 37-7. 47(m，2H)，4· 73-4. 86 (m, 1Η)，3. 93 (s，3Η)，3. 64 (s,2H)，3. 18 (s,3H)，2. 92 (br. s.，4H)，2. 36 (br. s.，4H)，2. 27 (d, J = 9. 3Hz,2H)，2. 18 (s,3H)，1. 97 (br. s.，2H)，1. 79-1. 91 (m, 1H)，1. 76 (br. s.，2H)， 1. 54-1. 72(m，7H)?；衔颷371]:4-(9'-環(huán)戊基 -甲基 -氧代 ,6' ,8' ,9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán) 丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶 并[4，5-b] [1，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體 2) (0. 14g，0.45mmol，l 當(dāng)量)，4_ 氨 基-N-(反-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺(中間體11) (0. 26g,0. 67mmol, 1. 5 當(dāng)量)和 TFA(0. 17mL,2. 2mmol,5 當(dāng)量)在 TFE(3mL)中一起在 80°C 加熱18小時。進(jìn)一步加入定量的中間體2(0. 14g)，且反應(yīng)進(jìn)一步加熱48小時。反應(yīng)混 合物在真空中濃縮，且殘余物通過硅膠快速柱色譜法純化，用0 — 20%氨/MeOH/DCM梯度 洗脫，然后通過制備HPLC (制備_4)純化，最后通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化，得到 4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7‘-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪基) 環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺(0. llg，25% )。 Rt = 3. 18 分鐘(分析 _1) ；ES(+ve) 657. 6 ；ES(-ve) 655. 7 ；IH NMR(DMS0_d6) δ ppm :0. 05 (d, J = 4. 20Hz,3H) ,0. 44 (d, J = 7. 74Hz,2H) ,0. 67 (d, J = 1. 61Hz,2H),
0.74-0. 85 (m, 1H)，0. 90(s，2H)，1. 23-1. 44(m，3H)，1. 44-1. 55 (m, 2H)，1. 54-1. 64 (m, 2H)，
1.64-1. 74 (m, 2H)，1. 88 (br. s.，5H)，2. 08 (s, 3H)，2. 13 (d, J = 6. 45Hz,2H)，2. 17-2. 28 (m, 1H)，2. 29-2. 47 (m, 3H)，2. 60-2. 67 (m, 1H)，3. 06-3. 23 (m, 5H)，3. 47 (s,2H)，3. 65-3. 79 (m, 1H) ,3. 94(s，2H)，4· 05-4. 13 (m, 1H) ,4. 78-4. 91 (m, 1H), 7. 48(s，2H)，7· 67 (s, 1H) ,7. 98 (s， 1H)，8. 00-8. 07 (m, 1H)，8. 31-8. 45 (m, 1H)?；衔颷372] :4-(9_環(huán)戊基-5，7，7_三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪基)環(huán) 己基)-3_甲氧基苯甲酰胺
將 2-氯-9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-8，9-二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮 雜革-6(7H)_酮(中間體3) (0. 13g，0. 43mmol，l當(dāng)量)，4_氨基-N-(反-4-(4-(環(huán)丙基甲 基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(中間體11) (0. 26g，0.67mmol，L5當(dāng)量) 和TFA(0. 17mL，2. 2mmol，5當(dāng)量)在TFE(3mL)中于80°C —起加熱18小時。再加入定量的 中間體6(0. 13g)，且反應(yīng)進(jìn)一步加熱48小時。反應(yīng)混合物在真空中濃縮，且殘余物通過硅 膠快速柱色譜法純化，用0 — 20%氨/MeOH/DCM梯度洗脫，然后通過制備HPLC (制備_4) 純化，最后通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化，得到4- (9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧 代-6，7，8，9-四氫-511-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革 _2_ 基氨基)_N_ ((反)-4-(4-(環(huán) 丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺(0.03g，7%)。Rt = 3. 38 分鐘(分析 _1) ；ES(+ve) 659. 6 ；ES(-ve) 657. 7 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 05 (d，J = 3. 86Hz，3H)，0. 40-0. 48(m，3H)，0. 73-0. 84(m，2H)，1. 03-1. 13 (m, 10H), 1. 18 (s, 1H), 1. 24-1. 43 (m, 6H) ,1.61 (br. s.，3H)，1.74(d，J = 9. 65Hz,2H), 1. 88 (br. s.，5H)，2. 08(s，5H)，2. 13 (d，J = 6. 75Hz，2H)，2. 17-2. 25 (m, 1H)，2. 36 (br. s.，3H)， 2. 60-2. 67 (m, 1H) ,3. 14-3. 22(m，2H)，3. 37 (s，1H) ,3. 51 (s, 1H)，3. 94(s，2H)，5. 18 (t，J =8. 52Hz, 1H) ,7. 43-7. 50 (m, 1H), 7. 67 (s, 1H) ,7. 98 (s, 1H) ,8. 03 (d, J = 7. 72Hz，lH)， 8. 35 (d, J = 8. 36Hz, 1H)?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員將理解實施例5、6能夠通過中間體5或6與已知化合物 反-4-(4-環(huán)丙基甲基-哌嗪-1-基)-環(huán)己基胺(如US 6，861，422B2中所述)使用標(biāo)準(zhǔn) 酰胺鍵形成條件(如實施例1中所述的那些)的反應(yīng)合成。化合物[345] :4-(9_環(huán)戊基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4， 5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N- [ 1-(四氫-吡喃-4-基)-哌啶-4-基]-苯 甲酰胺將4-(9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫 _5H_ 嘧啶并[4, 5-b] [1，4] 二 氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺(中間體12) (35mg，0. 07mmol, 1當(dāng)量)和三乙酰氧基硼氫化鈉(18mg，0. 084mmol, 1. 2當(dāng)量)在DCM(0. 5mL)中與四氫吡 喃-4-酮(6. 5 ii L，0. 07mmol, 1當(dāng)量)在室溫反應(yīng)2天。再加入三乙酰氧基硼氫化鈉(18mg， 1.2當(dāng)量)和四氫吡喃-4-酮(6.5yL，l當(dāng)量)，及乙酸(4yL，l當(dāng)量)。2天后，反應(yīng)混合 物用DCM稀釋，用水洗滌，且有機(jī)層在真空中濃縮。所得殘余物通過制備RP-HPLC-MS (制備 _1)純化，得到4- (9-環(huán)戊基-5-甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)_3_甲氧基-N-[l-(四氫-吡喃-4-基)_哌啶-4-基]-苯甲酰胺 (10mg,25% )。
Rt = 2. 74 分鐘(分析 _1) ；ES(+ve) :578· 5 ；ES(-ve) :576· 7?；衔颷373]:4-(9'-環(huán)戊基 -甲基 -氧代 ,6' ,8' ,9'-四氫 螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基 哌嗪-1-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丁 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-基氨基)-3_氟苯甲酸(中間體10) (100mg，0. 23mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(80 μ 1,0. 46mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(80mg,0. 25mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到ImL DMF中，且所得溶液在室溫攪拌10分鐘，然后加入1_氨基_4_甲基哌嗪 (33 μ L，0. 27mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物在室溫攪拌1小時，然后分成2等份，并 通過制備RP-HPLC-MS (制備_3)純化，得到4-(9 ‘-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代， 6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨 基)-3-氟-N- (4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(0. 05g, 41% )0 Rt = 2. 74 分鐘(分析 _1) ；MS(+ve) 537. 5 ；IH NMR(DMS0_d6) δ ppm
1.55-1. 65 (8H, m)，1. 71 (2H, m)，1. 88 (2H, m)，2. 18 (3H, s)，2. 28 (2H, q, J 10. 5Hz)，
2.41-2. 52 (4H, m), 2. 89 (4H, m), 3. 18 (3H, s), 3. 61 (2H, s), 4. 76 (1H,五重峰，8. 5Hz)， 7. 61 (2H, m) ,8. 03 (1H, s) ,8. 12 (1H, dd, J 8Hz，8. 5Hz)，8. 76 (1H, s)，9. 36 (1H, s)?；衔颷374]:4-(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-氟-N-(4-甲基 哌嗪-1-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_氟苯甲酸(中間體9) (0. 27g，0. 63mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(0. 2ImL, 1. 26mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(0. 22g，0. 69mmol, 1. 1當(dāng)量)添加到5mL DCM中，并將所得溶液于室溫攪拌30分鐘，然后添加1_氨基_4_甲基 哌嗪(91 μ 1，0. 75mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后反應(yīng)混合物在室溫攪拌4小時，然后用水洗滌，在 真空中濃縮，且殘余物通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化，得到4-(9‘-環(huán)戊基-5'-甲 基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 革]-2' _基氨基)-3-氟-N-(4-甲基哌嗪-1-基)苯甲酰胺(0. 14g，44% )。
0674] Rt = 2. 58 分鐘(分析 _1) ；MS(+ve) 523. 4 ；IH NMR(DMS0_d6) δ ppm
0.65-0. 67 (2H, s, CH2)，0. 85-0. 95 (2H, m, CH2)，1. 23-1. 82 (8H, m，烷基-H)，2. 18 (3H, s, CH3), 2. 36-2. 41 (4H, m，烷基-H)，2. 88 (4H，s, -H), 3. 16 (3H, s, CH3)，3. 44 (2H，s，烷 基-H)，4. 77-4. 80 (1H, m, CH)，7. 6 (2H, m,芳基-H)，7. 96 (1H, s,芳基-H)，8. 16 (1H, t, J = 8Hz，芳基-H)，8. 70 (1H, s, NH) ,9. 35 (1H, s，NH)。化合物[194]:(士)-4-(9_ 環(huán)戊基-5，7，7_ 三甲基 _6_ 氧代 _6，7，8，9_ 四 氫-5H-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯甲 酰胺將4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體6) (20mg,0. 046mmol,l當(dāng)量)， DIPEA(16 μ 1,0. 091mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(16mg，0. 05mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加至Ij 0. 5mL DMF 中，并將所得溶液于室溫攪拌5分鐘，然后添加3-氨基奎寧環(huán)二鹽酸鹽(llmg，0. 055mmol,
1.1當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌16小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_1) 純化，得到(士)-4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺(8mg，32%)。 Rt = 3· 28 分鐘(分析_1) ；MS (+ve) 548. 5 ；IH NMR(DMS0_d6) δ ppm 8. 37(lH,d, J 8Hz)，8. 07 (1H, d, J 6. 5Hz)，7. 98 (1H, s)，7. 69 (1H, s)，7. 47-7. 50 (2H, m)，5. 19 (1H,五重峰， J 8Hz)，3. 95 (4H, m)，3. 37 (2H, s)，3. 18 (3H, s)，3. 11 (1H, m)，2. 89 (1H, m)，2. 65-2. 72 (4H, m)，1. 88 (2H, m)，1. 73-1. 87 (4H, m)，1. 57-1. 61 (6H, m)，1. 31 (1H, m)，1. 09 (6H, s)。化合物[186] (士)-4_(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6 ‘-氧代 _5'，6'，8'， 9' _四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧 基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (25mg, 0. 057mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA (20 μ L，0. 1 Immol, 2 當(dāng)量)禾口 TBTU (20mg, 0. 063mmol, 1. 1當(dāng)量)添加到0. 5mL DMF中，且所得溶液在室溫攪拌15分鐘，然后添加3-氨基奎寧環(huán) 二鹽酸鹽(llmg，0. 055mmol, 1. 1當(dāng)量)和DIPEA(40 μ L)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌 16小時，然后通過制備RP-HPLC-MS(制備_1)純化，得到(士)-4-(9'-環(huán)戊基_5'-甲
基-6'-氧代，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 革]-2' _基氨基)_3_甲氧基-N_(奎寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺。Rt = 3. 02 分鐘(分析_1) ；MS (+ve) 546. 4 ； 1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 8. 40(lH,d, J 8Hz)，8. 08 (1H, d, J 7Hz)，7. 98 (1H, s)，7. 69 (1H, s)，7. 47-7. 50 (2H, m)，4. 87 (1H,五重峰，J 9Hz)，4. 10 (1H, q, J 5. 5Hz)，3. 95 (4H, m)，3. 47 (2H, s)，3. 27 (3H, s)，3. 07 (1H, m)，2. 08 (1H, m)，2. 63-2. 86 (4H, m)，1. 88 (3H, m)，1. 78 (1H, m)，1. 68 (2H, m)，1. 50-1. 62 (5H, m)，1. 32 (1H, m)，0. 90 (2H, m)，0. 66 (2H, m)。化合物[375]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-(4-(2-羥基乙 基)哌嗪-1-基)_3_甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (48mg, 0. 1 lmmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA (36 u L, 0. 22mmol, 2 當(dāng)量)禾口 TBTU (39mg, 0. 12mmol, 1. 1當(dāng)量)添加到5mL DCM中，并將所得溶液于室溫攪拌15分鐘，然后添加2-(4-氨基哌 嗪-1-基)乙醇(19mg，0. 13mm0l，1.2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌16小時，然 后在真空中濃縮，并通過制備RP-HPLC-MS(制備_1)純化，得到4-(9'-環(huán)戊基_5'-甲 基-6'-氧代，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 簞]-2'-基氨基)-N-(4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基)-3-甲氧基苯甲酰胺(24mg，39%)。Rt = 2. 48 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 565. 4 ； lHNMR(DMSO) 8 ppm 0. 66-0. 67 (2H, m, CH2)，0. 88-0. 90 (2H, m, CH2)，1. 23-1. 90 (8H, m，烷基-H)，2. 34-2. 41 (4H, m，烷基-H)， 2. 91 (4H, t, J =他，烷基書，3. 16 (3H, s, CH3)，3. 46-3. 51 (4H，m, )，3. 93 (3H，s, CH3)， 4. 38-4. 45 (1H, m, ) 4. 81-4. 87 (1H, m, CH)，7. 40 (2H, d, J = 10. 5Hz，芳基 _H)，7. 67 (1H, s)， 7. 98 (1H, s)，8. 39 (1H, d, J = 8Hz，芳基 _H)，9. 30 (1H, s, NH)?；衔颷376]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基-N-嗎啉 代苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (50mg，0. llmmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(38 ii L，0. 23mmol，2 當(dāng)量)禾口 TBTU(40mg，0. 12mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到5mL DCM中，并將所得溶液于室溫攪拌15分鐘，然后添加4-氨基嗎啉(12mg， 0. 14mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后反應(yīng)混合物在室溫攪拌16小時，然后在真空中濃縮，并通過制備 RP-HPLC-MS(制備_1)純化，得到4-(9'-環(huán)戊基-甲基-6'-氧代,6' ,8'， 9' _四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧 基-N-嗎啉代苯甲酰胺(26mg，44% )。
Rt = 2. 72 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 522. 4 ； 1H NMR(DMSO) 8 ppm 0. 65-0. 71 (2H, m, CH2)，0. 85-0. 91(2H，m, CH2)，1. 23-1. 88 (8H，m，燒基 _H)，2. 92(4H，t, J = 4Hz,燒 基-H)，3. 16 (3H, s, CH3)，3. 47 (2H, s，燒基 _H)，3. 66 (4H, t, J = 4. 5Hz)，3. 94 (3H, s, CH3)， 4. 81-4. 87 (1H, m, CH)，7. 41 (2H, d, J = 9. 5Hz)，7. 69 (1H, s)，7. 98 (1H, s)，8. 40 (1H, d, J = 8Hz)，9. 41(1H，s，NH)?；衔颷347]:(R)-4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基_6'-氧代_5'，6'，8'，9'-四 氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基-N-(奎 寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜簞]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (0. llg，0. 25mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(0. 17mL)和 TBTU(88mg，0. 28mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到 5mLDCM中，且將所得溶液于室溫攪拌30分鐘，然后添加(R) _ (+) _3_氨基奎寧環(huán)二鹽酸鹽 (60mg，0. 30mmOl，1.2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌16小時，然后用DCM稀釋， 并依次用水(x2)，50%飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌。將有 機(jī)層干燥(MgS04)，并在真空中濃縮。殘余物溶解于最少量的EtOAc，然后添加正庚烷以沉 淀(R)-4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1， 7' _嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯 甲酰胺(白色固體，0. 13g，96% )。
Rt = 3. 07 分鐘(分析 _1) ；MS(+ve) 546. 5 ；MS(_ve) 544. 6 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 62-0. 72 (2H, m)，0. 87-0. 94 (2H, m)，1. 20-1. 38 (1H, m) , 1. 44-1. 54 (2H, m)， 1. 54-1. 64 (4H, m)，1. 64-1. 74 (2H, m)，1. 75-1. 85 (1H, m)，1. 85-1. 95 (3H, m)，2. 65-2. 79 (4H, m)，2. 83-3. 01 (1H, m)，3. 11-3. 21 (4H, m)，3. 47 (2H, s)，3. 95 (4H, s)，4. 77-4. 93 (1H, m)，7.42-7. 54 (2H, m)，7. 69 (1H, s)，7. 98 (1H, s)，8. 10 (1H, d, J = 6. 3Hz)，8. 39 (1H, d, J =
8.3Hz)?；衔颷348]:(S)-4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基_6'-氧代_5'，6'，8'，9'-四 氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基-N-(奎 寧環(huán)-3-基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (0. llg，0. 25mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(0. 17mL)和 TBTU(88mg，0. 28mmol, 1. 1 當(dāng)量)添力口 到5mLDCM中，并將所得溶液于室溫攪拌30分鐘，然后添加(S) - (-)-3-氨基奎寧環(huán)二鹽酸 鹽(60mg，0. 30mmOl，1.2當(dāng)量)。然后反應(yīng)混合物在室溫攪拌16小時，然后用DCM稀釋， 并依次用水(x2)，50 %飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌。將有 機(jī)層干燥(MgS04)，并在真空中濃縮。殘余物溶于最少量的EtOAc中，然后添加正庚烷以沉 淀(S)-4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1， 7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3_甲氧基-N-(奎寧環(huán)-3-基)苯 甲酰胺(白色固體，0. 075g,55% ) Rt = 3. 04 分鐘(分析 _1) ；MS (+ve) 546. 5 ；MS(_ve) 544. 6 ；1H 匪R(DMS0_d6) 8 ppm 0. 59-0. 74 (2H, m)，0. 86-0. 97 (2H, m)，1. 20-1. 43 (1H, m) , 1. 45-1. 75 (7H, m)， 1. 76-1. 98 (4H, m)，2. 66-2. 86 (3H, m)，2. 89-3. 07 (1H, m)，3. 17 (3H, s)，3. 47 (3H, s)， 3. 89-4. 02 (4H, m)，4. 76-4. 96 (1H, m)，7. 42-7. 59 (2H, m)，7. 70 (1H，s)，7. 98 (1H, s)， 8. 14 (1H, d, J = 6. 3Hz)，8. 40 (1H, d, J = 7. 8Hz)?；衔颷377]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán) 丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺將2'-氯-9'-環(huán)戊基-5'-甲基-8' ,9' - 二氫螺[環(huán)丁烷_1，7'-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-6' (5' H)-酮(中間體 4) (0.065g，0.2mmol，l 當(dāng)量)，4_ 氨 基-N-(反_4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺(中間體11) (0. 24g,0. 6mmol,3 當(dāng)量)禾口 TFA(75 ii L，lmmol，5 當(dāng)量)在 TFE(6mL)中一起加熱至回流 40 小時。反應(yīng)混合物在真空中濃縮，且將殘余物分配于EtOAc和飽和碳酸氫鈉中。分離有機(jī) 層，用飽和鹽水洗滌，并在真空中濃縮得到殘余物，其通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化， 得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丁烷_1， 7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌
嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺。 Rt = 3. 41 分鐘(分析 _1) ；ES(+ve) :671· 6 ；ES(-ve) :669· 7 ；IH NMR(DMS0_d6) δ ppm :0. 03(2H, dd,J 9. 5Hz,5Hz)，0. 41(2H,dd,J 10Hz，5Hz)，0. 79(1H,m)，1. 20-1. 37 (4H, m)，1. 55-1. 94 (18H, m)，2. 04 (2H, d, J 6. 5Hz)，2. 16-2. 46 (8H, m)，3. 15 (3H, s)，3. 32 (2H, s)， 3. 69 (1H, m)，3. 90 (3H, s)，4. 79 (1H, m)，7. 44 (2H, m)，7. 68 (1H, s)，8. 01 (2H, m)，8. 34 (1H, d, J 8. 5Hz)?；衔颷378] :4-(9_環(huán)戊基-5-甲基_6_氧代_6，7，8，9-四氫_5H_嘧啶并[4， 5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-N-((反)-4-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪-1-基)環(huán)己 基)-3_甲氧基苯甲酰胺將2-氯-9-環(huán)戊基-5-甲基-8，9_ 二氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜簞 -6(7H)_ 酮(中間體 1) (0. 13g，0. 43mmol,l 當(dāng)量)，4-氨基-N-(反-4-(4-(環(huán)丙基甲基) 哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺(中間體11) (0. 26g，0.67mmol，L5當(dāng)量)和 TFA(0. 17mL,2. 2mmol,5當(dāng)量)在TFE(3mL)于80°C —起加熱18小時。再加入定量的中間 體1 (0. IOg)，且反應(yīng)進(jìn)一步加熱48小時。反應(yīng)混合物在真空中濃縮，且殘余物通過硅膠快 速柱色譜法純化，用0 — 20%氨/MeOH/DCM梯度洗脫，然后通過制備HPLC (制備_4)純化， 最后通過制備RP-HPLC-MS (制備_1)純化，得到4-(9-環(huán)戊基-5-甲基_6_氧代-6，7，8， 9-四氫-5H-嘧啶并[4，5-b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-N-((反)-4- (4-(環(huán)丙基甲基) 哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺(0. llg，26% )。 Rt = 2. 88 分鐘(分析 1) ；ES(+ve) 631. 5 ；ES(-ve) 629. 6 ；IH 匪R(DMS0_d6) δ ppm -O. 15-0. ll(m，2H)，0. 40(d，J = 8. 06Ηζ，2Η)，0· 63-0. 85(m，lH)，l. 11-1. 41 (m，3H)， 1. 57 (br. s.，2H)，1. 69 (d, J = 17. 73Hz，2H)，1. 74-1. 95(m，6H)，2· 04(s，2H)，2· 09 (d, J =
6.45Ηζ，2Η)，2· 16 (d, J = 9. 67Hz, 1Η)，2· 32 (br. s.，2Η)，2· 49 (br. s.，1Η)，2· 51-2. 59 (m, 2Η)，2. 59 (br. s.，1Η)，3. 07-3. 17 (m, 3Η)，3. 27 (s,5H)，3. 53-3. 62 (m, 2H)，3. 67 (dd, J =
7.41，3. 55Hz, 1H)，3. 89(s，2H)，4· 04 (q, J = 5. 37Hz, 1Η)，4· 76 (五重峰，J = 8. 22Hz, 1Η)， 7. 38-7. 48 (m, 2Η)，7. 68 (s, 1H)，7. 99 (d, J = 7. 74Hz, 1H)，8. 03 (s, 1H)，8. 33 (d, J = 8. 06Hz, 1H)。中間體13-19 :4_(胺-取代的)環(huán)己胺 1.[類似于 Abdel-Magid Α. F.等人.(1996) J. Org. Chem.，61，3849-3862 中的方法 III]三乙酰氧基硼氫化鈉(1.5當(dāng)量)，乙酸(1當(dāng)量)，胺(1. 1當(dāng)量)，THF，室溫20小時； 2.H2，10%Pd/C，60°C，甲醇，流動氫化；3.碘化鈉(4當(dāng)量)，三甲基氯硅烷(4當(dāng)量)，乙腈， 0°C -室溫，18小時。步驟1: 將N-芐基氧基羰基-4-氨基環(huán)己酮(本領(lǐng)域[W02007/002181A2]中已知的化合 物)(通常Immol的范圍)與乙酸和三乙酰氧基硼氫化鈉一起加入到含THF (5mL)、適宜取代 的_哌嗪、_高哌嗪或嗎啉的反應(yīng)管中。反應(yīng)在環(huán)境溫度攪拌20小時。反應(yīng)用NaHCO3溶液 (2mL)終止，然后用IN HCl溶液酸化至pH2?；旌衔镉肊tOAc洗滌，然后分離水層，并用2N NaOH溶液堿化至pHIO。產(chǎn)物萃取到EtOAc中，其用飽和NaCl洗滌，干燥(MgSO4)，并在減壓 下蒸發(fā)，得到所需的4-(胺-取代的)環(huán)己基氨基甲酸芐基酯。步驟2:將各個4_(胺-取代的)環(huán)己基氨基甲酸芐基酯溶于甲醇中，濃度為0.05M。使用 下述條件進(jìn)行氫化H-CubeTM(ThalesNano Inc.)流動反應(yīng)器，ImL/分鐘的流速，經(jīng)加熱至 60°C的10% Pd/C催化劑，在完全氫模式(fullhydrogen mode)下。減壓下濃縮，得到所需 的4-(胺-取代的)環(huán)己烷胺產(chǎn)物，為固體。固體鹽酸鹽能夠通過用HCl乙醚溶液攪拌得 到。當(dāng)需要在N-芐基存在下選擇性脫保護(hù)芐基氨基甲酸酯(中間體16&18)時，使用 步驟3代替步驟2。步驟3:將碘化鈉(1.5mm0l，4當(dāng)量)溶于無水乙腈(5mL)中，并攪拌，同時加入三甲基氯 娃烷(1.5mm0l，4當(dāng)量)。5分鐘后，將該混合物緩慢加入到4-(胺-取代的)環(huán)己烷胺溶于 無水乙腈(2mL)的溶液(在冰水浴中冷卻)中。1小時后，移除冷卻浴，且反應(yīng)混合物在環(huán) 境溫度攪拌18小時。反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，并再溶于水/甲醇溶液中?；旌衔镂?附到SCX II柱上，用甲醇洗滌，并用氨/甲醇洗脫。在真空中濃縮，得到所需的4-(胺-取 代的)環(huán)己烷胺。
Rt = 3. 00 分鐘(分析 _1)MS(+ve)631. 6 ；MS(_ve)629. 7 ；Rt = 3. 00 分鐘 (分析 _1) MS (+ve) 631.6 ；MS (-ve) 629. 7 ； IH NMR (DMS0-d6) δ ppm 0. 59-0. 72 (2H, m)，
0.81-0. 92 (2H, m)，0. 97 (3H, t, J = 7. IHz)，1. 20-1. 42 (4H, m)，1. 42-1. 55 (2H, m)，
1.54-1. 64 (2H, m)，1. 64-1. 73 (2H, m)，1. 83 (2H, d, J = 11. 7Hz)，1. 89 (4H, d, J = 7. 8Hz)，
2.14-2. 42 (7H, m)，3. 16 (3H, s)，3. 47 (2H, s)，3. 64-3. 79 (1H, m)，3. 94 (3H, s)，4. 84 (1H,五 重峰，J = 8. 7Hz)，7. 40-7. 54 (2H, m)，7. 67 (1H, s)，7. 98 (1H, s)，8. 03 (1H, d, J = 7. 8Hz)， 8. 38 (1H, d, J = 8. 3Hz)?；衔颷380]:4-(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((順)-4-(4_乙 基哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺從化合物[379]的合成和純化分離單個化合物4_(9'-環(huán)戊基_5'-甲 基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 革]-2'-基氨基)-N-((順)-4-(4_乙基哌嗪-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺(無 色玻璃狀，27mg，29% )。 Rt = 3. 13 分鐘(分析 _1)MS (+ve) 631. 6 ;MS (_ve) 629. 7 ；屯匪R(DMS0_d6) δ ppm :0. 60-0. 72 (2H, m)，0. 83-0. 93 (2H, m)，0. 98 (3H, t, J = 7. 1Hz)，1. 38-1. 55 (6H, m)， 1. 55-1. 63 (2H, m)，1. 63-1. 80 (4H, m)，1. 80-1. 96 (4H, m)，2. 02-2. 17 (1H, m)，2. 16-2. 44 (7H, m), 3. 16 (3H, s), 3. 47 (2H, s), 3. 79-3. 92 (1H, m), 3. 94 (3H, s), 4. 84 (1H,五重峰，J = 8. 5Hz)，7. 44-7. 58 (2H, m)，7. 67 (1H, s)，7. 98 (1H, s)，8. 03 (1H, d, J = 7. 3Hz)，8. 37 (2H, d, J = 8. 8Hz)?；衔颷381]:4-(9'-環(huán)戊基 -甲基 -氧代 ,6' ,8' ,9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-(4-(4-(環(huán)丙基 甲基)-1，4- 二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜萆]-2'-基氨基)-3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (88mg，0. 2mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA (70 μ 1,0. 4mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(72mg，0. 24mmol, 1. 2 當(dāng)量)添加到2mL DMF中，且將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后添加4-(4-(環(huán)丙基甲 基)-1，4- 二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己烷胺(中間體14) (60mg, 0. 24mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后將 反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_2)純化，得到4- (9 ‘-環(huán) 戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5_b][1,4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-(4-(4-(環(huán)丙基甲基)-l，4-二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)
己基)-3_甲氧基苯甲酰胺，為順式和反式異構(gòu)體的混合物(灰白色固體，67mg，50% )。 Rt = 4. 12 分鐘(寬峰)(分析_1)MS (+ve) 671. 6 ；MS (_ve) 669. 7 ；1H NMR(DMS0_d6) δ ppm :0. 01 (2Η, d, J = 4. 4Ηζ)，0. 40 (2Η, d, J = 7. 3Ηζ)，0. 63 (2Η, br. s.)，0· 71-0. 83 (1Η,
m)，0. 87 (2Η, br. s.)，1. 02 (1Η, t, J = 7. IHz)，1. 25-1. 38 (2. 5H, m)，1. 39-1. 52 (3. 5H, m)，
1.52-1. 61 (2H, m)，1. 65 (4H, d, J = 5. 9Hz)，1. 70-1. 80 (3H, m)，1. 85 (3H, d, J = 4. 4Hz)，
2.21-2. 31 (1H, m)，2. 55-2. 83 (8H, m)，3. 13 (3. 5H, s)，3. 35-3. 55 (3H, m)，3. 69 (0. 5H, br. s.)，3. 91 (3. 5H, s)，4. 31 (0. 5H, t, J = 5. IHz)，4. 81 (1H, t, J = 8. 5Hz)，7. 25-7. 54 (2H, m)，7. 64 (1H, s)，7. 84-8. 16 (2H, m)，8. 35 (1H, d, J = 8. 3Hz)?；衔颷382]:4-(9'-環(huán)戊基 _5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-(4-(4-乙基-1， 4_ 二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體5) (44mg，0. Immol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(35 μ 1,0. 2mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(36mg，0. 12mmol, 1· 2 當(dāng) 量)添加到ImL DMF中，且所得溶液在室溫攪拌20分鐘，然后添加4-(4_乙基-1，4-二氮雜 環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己烷胺(中間體15)三鹽酸鹽(32mg，0. lmmol，l當(dāng)量)和DIPEA(53yL，
0.3mmol,3當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備 _2)純化，得到4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-(4-(4-乙基-1，4-二氮雜 環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己基)-3_甲氧基苯甲酰胺，為順式和反式異構(gòu)體的混合物(白色固體， IOmg, 16% ) ο Rt = 3. 98 分鐘，4. 18 分鐘(寬峰)(分析 _1)MS (+ve)645. 6 ；MS (-ve)643. 7 ； 1H NMR (DMS0-d6) δ ppm 0. 57-0. 74 (2H, m) , 0. 82-0. 93(2H, m) ,0. 95-1. 09 (3Η, m)，
1.30-1. 42 (2Η, m)，1. 42-1. 54 (3. 5H, m)，1. 58 (2H, d，J = 4. 4Hz)，1. 63-1. 75 (3. 5H, m)，1. 75-1. 83 (1. 5H, m)，1. 88 (3. 5H, br. s. )，1. 98-2. 16 (1. 5H, m)，2. 59-2. 86 (4H, m)，
3.17 (4H, s)，3. 41-3. 53 (3. 5H, m)，3. 78 (2. 5H, m)，3. 88-4. 02 (3. 5H, m)，4. 06-4. 38 (1H, m)，
4.76-4. 91 (1H, m)，7. 39-7. 57 (2H, m)，7. 59-7. 78 (1H, m)，7. 98 (2H, s)，8. 31-8. 45 (1H, m)
化合物[383] :N- (4_ (4_芐基-1，4_ 二氮雜環(huán)庚烷基)環(huán)己基)_4_ (9 ‘-環(huán) 戊基-5'-甲基-6'-氧代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二氮雜革]-2' _基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (66mg，0. 15mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(52u 1,0. 3mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(54mg，0. 17mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到lmL DMF中，并將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后添加溶于DMF (0. 5mL)的 4-(4-芐基-1，4-二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己烷胺(中間體16) (54mg，0. 19mmol，l. 27當(dāng) 量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_5)純化，得到 N-(4-(4-芐基-1，4-二氮雜環(huán)庚烷-1-基)環(huán)己基)-4-(9‘-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧 代-5'，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基 氨基)-3_甲氧基苯甲酰胺，為順式和反式異構(gòu)體的混合物(灰白色固體，33mg，31% )。Rt = 4. 40 分鐘(分析 _1)MS (+ve) 707. 6 ；MS (_ve) 705. 7 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 73 (2H, br. s.)，0. 96 (2H, br. s. ), 1. 22-2. 22 (19H, m)，2. 64-2. 91 (4H, m)，3. 23 (5H, s)， 3. 53 (8H, s)，3. 89-4. 24 (4H, m)，4. 91 (1H, t, J = 8. 5Hz)，5. 82 (OH, s)，7. 23-8. 54 (10H, m)。化合物[384]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 -氧代 ,6' ,8' ,9'-四氫 螺[環(huán)丙烷-1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4_甲 基哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酸(中間體 5) (66mg，0. 15mmol, 1 當(dāng)量)，DIPEA(52u 1,0. 3mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(54mg，0. 17mmol, 1. 1 當(dāng)量)添加到lmL DMF中，并將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后加入溶于DMF(0.5mL) 的4-(4-甲基哌嗪-1-基)環(huán)己烷胺(中間體17) (35mg,0. 18mmol，1. 2當(dāng)量)。然后將 反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_2和制備_3)純化，得到 4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧 啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜萆]-2'-基氨基)-N-((反)-4-(4_甲基哌嗪-1-基)環(huán)己 基)-3_甲氧基苯甲酰胺(白色固體，17mg，18% )0 Rt = 2. 85 分鐘(分 |/f _1)MS(+ve)617. 5 ；MS(-ve)615. 6 ；1H NMR(DMS0_d6)
8 ppm 0. 61-0. 76 (2H, m)，0. 89 (1H, t, J = 6. 8Hz)，0. 92-0. 98 (2H, m)，1. 22-1. 47 (5H, m)， 1. 47-1. 79 (6H, m)，1. 81-2. 02 (5H, m)，2. 07-2. 20 (3H, m)，2. 20-2. 42 (4H, m)，3. 20 (4H, s)， 3. 34 (3H, s)，3. 51 (2H, s)，3. 67-3. 82 (1H, m)，3. 98 (3H, s)，4. 88 (1H,五重峰，J = 8. 5Hz)， 化合物[385]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 _6'-氧代 _5'，6'，8'，9'-四氫 螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-N-((順)-4-(4_甲 基哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺從化合物[384]的合成和純化分離單個化合物4_(9'-環(huán)戊基_5'-甲 基-6'-氧代，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 革]-2' _基氨基)_N-((順)-4-(4_甲基哌嗪-1-基)環(huán)己基)_3_甲氧基苯甲酰胺(白 色固體，34mg，37% )。Rt = 2. 93 分鐘(分 |/f _1)MS(+ve)617. 5 ；MS(-ve)615. 6 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 62-0. 80 (2H, m)，0. 84-1. 02 (4H, m)，1. 18-1. 36 (4H, m)，1. 43-1. 84 (12H，m)， 1. 84-2. 03 (4H, m)，2. 09-2. 22 (4H, m)，2. 41 (4H, br. s. ) ,3. 21 (3H, s)，3. 52 (2H, s)， 3. 89-3. 97 (1H, m)，3. 99 (3H, s)，4. 89 (1H,五重峰，J = 8. 5Hz)，7. 47-7. 61 (2H, m)，7. 72 (1H, s)，8. 03 (1H, s)，8. 08 (1H, d, J = 7. 3Hz)，8. 43 (1H, d, J = 9. 3Hz)?；衔颷386] :N_((反)-4_(4-芐基哌嗪-1-基)環(huán)己基)-4_(9 ‘-環(huán)戊 基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體5) (66mg，0. 15mmol, 1 當(dāng)量),DIPEA(52u 1,0. 3mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(54mg，0. 17mmol, 1. 1 當(dāng) 量)添加到lmL DMF中，并將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后添加溶于DMF (0. 5mL)中的 4-(4-芐基哌嗪-1-基)環(huán)己烷胺(中間體18) (35mg,0. 18mmol，1. 2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混 合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制備_2)純化，得到N-((反)-4- (4-芐 基哌嗪-1-基)環(huán)己基)-4-(9‘-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四 氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酰 胺(白色固體，13mg，13% )。 Rt = 3. 64 分鐘(分析 _1) MS (+ve) 693. 6 ；MS (-ve)691. 7 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 62-0. 79 (2H, m)，0. 85-1. 02 (2H, m)，1. 20-1. 46 (4H, m)，1. 46-1. 58 (2H, m)，1. 59-1. 67 (2H, m)，1. 67-1. 78 (2H, m)，1. 80-2. 02 (6H, m)，2. 12 (1H, s)，2. 18-2. 46 (6H, m)，3. 20 (3H, s)，3. 43-3. 56 (5H, m)，3. 67-3. 84 (1H, m)，3. 97 (3H, s)，4. 88 (1H,五重峰，J = 8. 4Hz)，
7.22-7. 42 (6H, m)，7. 44-7. 59 (2H, m)，7. 71 (1H, s)，8. 02 (1H, s)，8. 08 (1H, d, J = 7. 8Hz)，
8.42 (1H, d, J = 7. 8Hz)?；衔颷387] :N_((順)-4_(4-芐基哌嗪-1-基)環(huán)己基)-4_(9 ‘-環(huán)戊 基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5_b] [1，4] 二氮雜革]-2' _基氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺從化合物[386]的合成和純化分離單個化合物N-((順)~4~ (4_芐基哌嗪基) 環(huán)己基)-4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代-5' ,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1， V -嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基苯甲酰胺(白色固體， 20mg, 19% )。 Rt = 3. 85 分鐘(分析 1)MS(+ve)693. 6 ；MS(-ve)691. 7 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 62-0. 79 (2H, m)，0. 87-1. 01 (2H, m)，1. 43-1. 59 (5H, m)，1. 59-1. 67 (2H, m)，1. 66-1. 74 (2H, m)，1. 75-1. 84 (2H, m)，1. 92 (4H, br. s.)，2. 07-2. 29 (2H, m)，2. 41 (4H, br. s.)，3. 20 (3H, s)， 3. 51 (4H, s)，3. 87-4. 05 (4H, m)，4. 74-4. 99 (1H, m)，7. 24-7. 39 (5H, m)，7. 50-7. 56 (2H, m)， 7. 71 (1H, s)，8. 02 (1H, s)，8. 07 (1H, d, J = 6. 8Hz)，8. 42 (1H, d, J = 8. 8Hz)。化合物[388] :4-(9_環(huán)戊基-5，7，7_三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3_甲氧基-N-((反)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰 胺將4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4，5_b] [1,4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體6) (66mg，0. 15mmol,l當(dāng)量)， DIPEA(52u 1,0. 3mmol,2 當(dāng)量)禾口 TBTU(54mg，0. 17mmol, 1. 1 當(dāng)量)添力口 到 1. 5mL DMF 中，并將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后添加4-嗎啉代環(huán)己烷胺(中間體16) (33mg, 0. 18mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過制備RP-HPLC-MS (制 備_2)純化，得到4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶并[4， 5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3_甲氧基-N-((反)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺(灰 白色固體，10mg，ll% )。
Rt = 3. 16 分鐘(分析 _1)MS (+ve) 606. 4 ；MS (_ve) 604. 5 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm 1. 07-1. 18 (7H, m)，1. 24-1. 49 (4H, m)，1. 58-1. 71 (4H, m)，1. 71-1. 84 (2H, m)，1. 83-2. 03 (6H, m)，2. 23 (1H, t, J = 10. 5Hz)，2. 43-2. 51 (3H, m)，3. 17-3. 28 (4H, m)，3. 42 (3H, br. s.)， 3. 60 (4H, br. s. )，3. 64 (1H, br. s. )，3. 71-3. 83 (1H, m)，3. 98 (3H, s)，5. 23 (1H，t，J = 8. 3Hz)，7. 44-7. 60 (2H, m)，7. 72 (1H, s)，8. 02 (1H, s)，8. 09 (1H, d, J = 7. 8Hz)，8. 40 (1H, d, J = 8. 3Hz)?；衔颷389] :4-(9-環(huán)戊基-5，7，7-三甲基-6-氧代-6，7，8，9-四氫-5H-嘧啶 并[4，5-b][l，4] 二氮雜簞-2-基氨基)-3-甲氧基-N-((順)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰 胺從化合物[388]的合成和純化分離單個化合物4_(9_環(huán)戊基_5，7，7_三甲 基-6-氧代_6，7，8，9_四氫-5H-嘧啶并[4，5_b][l，4] 二氮雜革-2-基氨基)-3-甲氧 基-N-((順)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺(白色固體，22mg，24% )。 Rt = 3. 31 分鐘(分析 _l)MS(+ve)606. 4 ；MS (-ve)604. 5 ；1H NMR(DMS0_d6) 8 ppm
1.13 (6H, s)，1. 39-1. 60 (4H, m)，1. 60-1. 71 (4H, m)，1. 71-1. 85 (4H, m)，1. 85-2. 01 (4H, m)，
2.07-2. 22 (2H, m)，2. 42-2. 48 (4H, m)，3. 22 (4H, s)，3. 64 (4H, br. s. )，3. 87-4. 05 (4H, m)， 5. 14-5. 31 (1H, m)，7. 45-7. 62 (2H, m)，7. 71 (1H, s)，8. 02 (1H, s)，8. 09 (1H, d, J = 7. 3Hz)， 8. 39 (1H, d, J = 8. 3Hz)?；衔颷390]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 -氧代 _5 ‘ ,6' ,8' ,9'-四 氫螺[環(huán)丙烷-1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2 ‘-基氨基)_3_甲氧 基-N-((反)_4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺將4_(9'-環(huán)戊基-5'-甲基-6'-氧代,6' ,8' ,9'-四氫螺[環(huán)丙 烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)-3-甲氧基苯甲酸(中間體5) (66mg，0. 15mmol, 1 當(dāng)量),DIPEA(52u 1,0. 3mmol,2 當(dāng)量)和 TBTU(54mg，0. 17mmol, 1. 1 當(dāng) 量)添加到1.5mL DMF中，并將所得溶液于室溫攪拌20分鐘，然后添加4-嗎啉代環(huán)己烷胺 (中間體16) (33mg,0. 18mmol, 1. 2當(dāng)量)。然后將反應(yīng)混合物于室溫攪拌2小時，然后通過 制備RP-HPLC-MS (制備_2)純化，得到4-(9'-環(huán)戊基-甲基-6'-氧代，6'， 8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜革]-2'-基氨基)_3_甲氧基-N-((反)_4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺(灰白色固體，13mg，14% )。
Rt = 2. 96 分鐘(分析 _1)MS (+ve) 604. 4 ;MS (_ve) 602. 5 ；屯 NMR(DMS0_d6) 8 ppm 0. 72 (2H, s)，0. 95 (2H, s)，1. 24-1. 49 (4H, m)，1. 49-1. 60 (2H, m)，1. 60-1. 69 (2H, m)，1. 69-1. 82 (2H, m)，1. 82-2. 03 (6H, m)，2. 14 (1H，s)，2. 17-2. 32 (1H, m)，3. 22 (4H, s)， 3. 53 (2H, s) ,3. 61 (4H, br. s.)，3. 71-3. 84 (1H, m)，4. 00 (3H, s)，4. 90 (1H,五重峰，J = 8. 5Hz)，7. 43-7. 61 (2H, m)，7. 73 (1H, s)，8. 04 (1H, s)，8. 10 (1H, d, J = 7. 8Hz)，8. 44 (1H, d, J = 8. 3Hz)?；衔颷391]:4-(9'-環(huán)戊基-5'-甲基 _6'-氧代 _5 ‘，6'，8'，9'-四 氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜簞]-2 ‘-基氨基)_3_甲氧 基-N-((順)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺從化合物[390]的合成和純化分離單個化合物4_(9'-環(huán)戊基_5'-甲 基-6'-氧代，6'，8'，9'-四氫螺[環(huán)丙烷_1，7'-嘧啶并[4，5-b][l，4] 二氮雜 革]-2'-基氨基)_3_甲氧基-N-((順)-4_嗎啉代環(huán)己基)苯甲酰胺(白色固體，27mg， 30% )。 Rt = 3. 10 分鐘(分析 _l)MS(+ve)604. 4 ;MS(_ve)602. 5 /H 匪R(DMS0_d6) 8 ppm 0. 66-0. 81 (2H, m)，0. 88-1. 03 (2H, m)，1. 45-1. 86 (12H, m)，1. 87-2. 02 (4H, m)，
2.10-2. 21 (1H, m) ,2. 47 (4H, br. s. ) , 3. 22 (3H, s)，3. 52 (2H, s) ,3. 65 (4H, br. s.)，
3.89-4. 05 (4H, m)，4. 90 (1H,五重峰，J = 8. 5Hz)，7. 50-7. 63 (2H, m)，7. 73 (1H, s)，8. 03 (1H, s)，8. 10 (1H, d, J = 7. 3Hz)，8. 43 (1H)。實施例3通過PCR分離由HeLa mRNA分離全長人CDC25C克隆體，并在BamHI_HindIII片段 上插入到pRsetA中。從該載體上切下⑶C25C的氨基末端片段(編碼殘基1_300)，并插入到 pET28a (Ncol和BamHI位點之間)。在T7啟動子的控制下表達(dá)，編碼蛋白在羧基末端帶His6 標(biāo)記物。將載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌株BRL(DE3)pLysS中用于表達(dá)實驗。CDC25C在BL21 (DE3) RIL細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，在LB培養(yǎng)基中于37°C生長，直到00_ 為0.6。表達(dá)用ImM IPTG誘 導(dǎo)，并將細(xì)菌培養(yǎng)物再生長3小時。通過離心收集細(xì)菌，并將細(xì)胞沉淀物再懸于50mM Tris pH7. 5和10%蔗糖中，快速冷凍，并存儲于-70°C直到使用。⑶C25C蛋白從大腸桿菌包含體 中純化。包含體在緩沖液(50mM Tris pH8. 0,2mM EDTA, lOOmM NaCl,0. 5% triton X-100)中分離。在6M尿素存在下變性后，蛋白通過緩慢滲析尿素而再折疊。將該蛋白存儲于25mM Tris pH8. 0,100mM NaCl, ImM DTT, ImM EDTA 禾P 10%甘油(_70°C )中，直到使用。來自胎肺cDNA庫，利用引物插入到限制酶位點的方法來擴(kuò)增全長人 PLK1 (XM_047240)(氨基酸 1_60；3)克隆體。5，弓丨物(gccgctagcgacgatgacgataagat gagtgctgcagtgactgcagggaagc)在ATG起始密碼子之前具有Nhel位點。將3，引物 (ggaattcttaggaggccttgagacgg)插入到EcoRl位點前的終止密碼子。將PCR產(chǎn)克隆到桿狀 病毒表達(dá)載體PSSP1的Nhel/EcoRl位點?？寺〉皆撦d體導(dǎo)致在PLK1構(gòu)建體的氨基末端帶 有His6標(biāo)記物融合。將傳代數(shù)小于20的Sf9細(xì)胞分離，得到300mL培養(yǎng)體積，細(xì)胞密度為 1.5xl06細(xì)胞/mL。細(xì)胞僅用于對數(shù)生長期中的表達(dá)。加入PLK1桿狀病毒(來自P2擴(kuò)增)， 得到傳染倍數(shù)為3，即相當(dāng)于每個昆蟲細(xì)胞3個病毒顆粒。燒瓶在27°C培養(yǎng)，同時以100r. p. m.振搖48小時。收集后，檢測細(xì)胞密度和存活率，培養(yǎng)物以2500r. p. m.旋轉(zhuǎn)5分鐘，并 用冰冷的磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌。洗滌液以相同速度再旋轉(zhuǎn)，且沉淀物快速冷凍。PLK1蛋 白在金屬親和柱上純化。昆蟲細(xì)胞沉淀物在緩沖液(10mMTris-HCl pH8. 0，150mM NaCl,5mM
巰基乙醇，ImM PMSF，lmM芐脒，20mM咪唑和蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma)中裂解，且將 預(yù)清除的上清液負(fù)載于NiNTA-瓊脂糖(Qiagen)上。該親和柱用裂解緩沖液洗滌，且結(jié)合 的蛋白用在相同緩沖液中的250mM咪唑洗脫。對25mM Tris HC1, pH7. 5, lOOmM NaCl, ImM DTT, ImM PMSF，ImM芐脒，蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma)和10%甘油滲析過夜后，純化的蛋 白存儲于-70°C直到使用。實施例4PLK1蛋白激酶測試使用96-孔板形式通過在20mM Tris/HCl緩沖液pH7. 5 (補 充有 25mM 3 -甘油磷酸酯，5mM EGTA, ImM DTT 和 lmMNaV03)中培養(yǎng) CDC25C(2 ii g/ 孔)和 PLKl(liig/孔)進(jìn)行。加入在測試緩沖液中的一系列稀釋的測試化合物。反應(yīng)通過加入 100 uM ATP和0. 5iiCi的[y」2P]_ATP引發(fā)。反應(yīng)混合物在30°C培養(yǎng)1小時，然后用75mM 正磷酸水溶液終止，轉(zhuǎn)移至96-孔P81過濾板(Whatman)中，干燥，且⑶C25C磷酸化的程度 使用Packard TopCoimt板讀取器通過閃爍計數(shù)評估。原始實驗數(shù)據(jù)通過非線性回歸分析 參數(shù)進(jìn)行分析，且IC5(I值使用下述方程確定y = A+ ((B-A) / (1+ ((C/x) ~D)))，其中y為％抑 制，A為最小抑制，B為最大抑制，C為EC5(1，且D為斜率因子。細(xì)胞增殖測試使用人腫瘤細(xì)胞系(獲自American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manessas, VA 20110-2209，USA)進(jìn)行。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) 72_h MTT (噻唑基藍(lán)；3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鐺溴化物)實驗(Loveland 等人，Biochem. Int.，1992，27，501 ；Haselsberger 等人，Anticancer Drugs, 1996，7,331) 簡言之根據(jù)倍增時間，將細(xì)胞接種于96-孔板中，并在37°C培養(yǎng)過夜。將測試化合物溶 解于DMS0中，在100 yL細(xì)胞培養(yǎng)基中制備1/3系列稀釋液，加入到細(xì)胞中(一式三份)， 并在37°C培養(yǎng)72小時。將MTT溶液于細(xì)胞培養(yǎng)基中，作為5mg/mL的儲備液，并過濾滅菌。 從細(xì)胞中移出培養(yǎng)基，然后用200 yL PBS洗滌。然后加入MTT溶液，每孔20 yL，并在黑暗 處37°C培養(yǎng)4小時。移除MTT溶液，且細(xì)胞再次用200 u L PBS洗滌。MTT染料用DMS0 (每 孔200iiL)溶解，同時攪拌。在540nm讀取吸光度，并使用曲線擬合軟件(GraphPad Prism 3. 00 版，用于 Windows，GraphPad Software, San Diego California USA)分析以確定 IC50 值(抑制細(xì)胞生長50%的測試化合物的濃度)。
實施例5PLK選擇性表4顯示的是與所選的現(xiàn)有技術(shù)化合物相比，相對于PLK2和PLK3，化合物[218] 對PLKl具有選擇性。為了說明，本發(fā)明的化合物[218]對PLKl比PLK2的選擇性是WO 07/095188的化合物[1-64]的2倍，是W007/095188的化合物[1-76]的約6-倍，且是化合 物[1-4]的7-倍。相似地，化合物[218]對PLKl比PLK3的選擇性是WO 07/095188的化 合物[1-64]的5倍，是WO 07/095188的化合物[1_76]的約12-倍，且是化合物[1_4]的 5倍。實施例6溶解度研究表5表明當(dāng)與現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)已知的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物相比時，化合物[254](下
圖框中的結(jié)構(gòu))具有優(yōu)異的溶解度和/或藥代動力學(xué)性質(zhì)。 W007/095188WO 07/095188中的實施例1-76 化合物[254] 中的實施例1-253WO 08/002958中的實施例246比濁度研究如果將水溶性化合物的DMSO溶液加入到水性緩沖液中，混合物保持澄清，除非達(dá) 到水溶解度極限。在溶解度極限以上，出現(xiàn)沉淀，且通過渾濁的混懸液的光被散射。散射光 的強度測量是濁度溶解度檢測的基礎(chǔ)。所選的化合物利用比濁計篩選以鑒定濁度出現(xiàn)時的濃度，由此得到動態(tài)溶解度指 數(shù)。通過濁度法(2% DMS0:98%磷酸鹽緩沖的鹽水pH7. 5)，化合物[254]在200μΜ(> 0. llmg/mL)是隨意可溶的，其在該測試中是最高的濃度。相反，在相同的濁度法測試中，現(xiàn) 有技術(shù)WO 07/095188的實施例[1-253]的最大可溶濃度測定為75 μ M (表6)。這表明化合 物[254]在用于研究體外化合物活性的濃度范圍于水性緩沖液中更加可溶。藥代動力學(xué)研究為了體內(nèi)研究化合物，通常需要更高的濃度。為了獲得更高的濃度，通常使用鹽形 式的化合物?；衔颷254]和WO 07/095188的實施例[1_76]在多種藥學(xué)相關(guān)溶劑混合物(可 以用于將化合物給予活生物體)中以游離堿和鹽酸鹽進(jìn)行研究。通過在溶劑中加熱溶解化 合物，將溶液冷卻至25°C，并觀察。冷卻后沒有形成沉淀，過飽和混合物易于形成凝膠狀中 間相，其不適合或不方便用于給藥。從表5中所示數(shù)據(jù)可以清楚地看出化合物[254]及其 HCl鹽與實施例[1-76]及其相關(guān)HCl鹽相比具有一貫地更好的溶解特性。向小鼠通過靜脈注射給藥實施例[1-76]的HCl鹽，其為在3% DMA 97%水中的溶液。通過達(dá)到化合物在穩(wěn)定溶液中的最大濃度，判斷最大耐受劑量。在最大耐受劑量，沒有觀察到異種移植物抗腫瘤作用(qdx7給藥)，因為給藥的化合物濃度不足。相反，水溶性明 顯更高的化合物[254]及其鹽能夠在更能夠產(chǎn)生治療疾病效果的濃度進(jìn)行注射。實施例8化合物[371]的藥代動力學(xué)性質(zhì)(a)方法學(xué)所選化合物藥代動力學(xué)的初步研究在禁食的有意識CD-I小鼠(25_30g)中進(jìn)行。 化合物以lmg/kg通過靜脈給藥或5-10mg/kg通過口服途徑給藥。每種給藥途徑21只雄性 小鼠(每個時間點η = 3只小鼠)通過在尾靜脈單次推注或通過口飼法給藥溶液。血液樣 品通過心臟穿刺在靜脈內(nèi)給藥后5、15、30、60、120、240和360分鐘收集，以及在口服給藥后 30、60、120、240、360、480和1440分鐘收集。將血液樣品收集到含抗凝血肝素鋰的管中，混 合，并迅速放在碎冰上。通過離心從全血獲得血漿，冷凍并存儲于-80°C，待分析用。血漿 濃度通過液相色譜-聯(lián)用電噴霧陽離子模式的質(zhì)譜(ESI LC/MS/MS)進(jìn)行檢測，使用在適合 基質(zhì)中制備的校準(zhǔn)曲線。在所有情況中較低水平定量(lower level of quantification) (LLOQ)為約5ng/mL。血漿濃度-時間數(shù)據(jù)使用電腦程序WinNonLin 5. 2版進(jìn)行處理，從 中通過非-區(qū)劃(non-compartmental)分析利用 Model 201 (IV_bolus 輸入)或 Model 200 (Extravascular輸出)計算血漿濃度-時間曲線下面積(AUCall)。(b)化合物[371]和[378]與所選的現(xiàn)有技術(shù)化合物的比較將化合物[371]和[378]與一系列相關(guān)類似物比較進(jìn)行進(jìn)一步的藥代動力學(xué)分析 (參見表7 ；化合物[371]，相應(yīng)于化合物H ；化合物[378]，相應(yīng)于化合物I)。圖1表明了每種測試化合物的血漿濃度對時間的曲線下面積(AUC)。這些實驗中 給予的溶媒保持恒定(靜脈=檸檬酸鹽緩沖液PH3，lmL/kg ； 口服=DMA/PEG400/10mM酒石 酸鹽緩沖液，pH4(l 3 6)，5ml/kg)。圖2表示對于每種化合物口服生物利用度形式(％ F)的相同數(shù)據(jù)。結(jié)果表明化合物H和I與化合物A-G相比表現(xiàn)出明顯更優(yōu)的全身暴露和口服生物 利用度。實施例9(a)細(xì)胞流量數(shù)據(jù)使用體外細(xì)胞存活測試以檢測藥物在配對的親代和藥物抵抗腫瘤細(xì)胞系中的累 積。所用的配對為人卵巢癌A2780系與其MDR對應(yīng)體(counterpart) A2780/ADR，和人子宮肉 瘤 MES-SA 系與其 MDR 對應(yīng)體 MES-SA/Dx5 [Wesolowska 0.，等人.(2005) Anticancer Res., 25,383-389]。方法將卵巢細(xì)胞系Α2780及其多柔比星-抵抗配對A2780/ADR，以及子宮細(xì)胞系 MES-SA及其多柔比星-抵抗配對MES-SA/DX5的培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞以每孔3000細(xì)胞接種于 Nunc 96-孔組織培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1，于含10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng) 基中。在每板中第一欄的孔中裝有100 μ 1 DMEM培養(yǎng)基代替細(xì)胞以提供對于Alamar Blue 的空白對照。將細(xì)胞在37°C和5% CO2培養(yǎng)過夜。將溶于DMSO的感興趣的化合物以不同 濃度加入到細(xì)胞中。化合物的稀釋液首先在DMEM制備，濃度為最終所需濃度的2倍，并將 100μ1該稀釋液加入到細(xì)胞中。每類化合物在每種細(xì)胞系中一式三份進(jìn)行測試。培養(yǎng)72小時后，將20 ill Alamar Blue試劑(AbD Serotec)添加到每孔中，并培養(yǎng)3小時。然后在 544/595nm 讀板。反應(yīng)的Alamar Blue試劑的量表示細(xì)胞的代謝活性。計算相對細(xì)胞活性，表示為 對照(無化合物的細(xì)胞)的百分比，并獲得活性化合物抑制細(xì)胞50% (IC50)的濃度。該值 從3個單獨檢測的平均值計算得到，并以空白校正(僅有培養(yǎng)基的對照)。該測試在Biomek FxP(來自Beckman Coulter的自動化平臺)上進(jìn)行。在配有 Beckman Coulter的Paradigm板讀數(shù)器上讀板。計算不對稱比(Asymmetry ratios)，表示 為化合物在藥物抵抗的細(xì)胞中的IC5(I值除以在親代細(xì)胞中的IC5(I值。圖3顯示的是所選化 合物與現(xiàn)有技術(shù)化合物A' -J'(表8中限定的)在親代和MDR腫瘤細(xì)胞中的比較。不對 稱比以相對于化合物[378]表示。(b)PLKl 的抑制此外，與現(xiàn)有技術(shù)的化合物相比，在細(xì)胞存活測試中表現(xiàn)出低MDR/親代細(xì)胞不對 稱的本發(fā)明化合物在抑制MDR腫瘤細(xì)胞中PLK1也更加有效。因此，它們作為治療性PLK抑 制劑更有效。中間體纖絲蛋白波形蛋白為PLK1磷酸化的細(xì)胞靶點。PLK1的抑制與磷酸-波 形蛋白的降低相關(guān)。這已在A2780-A2780/ADR細(xì)胞系配對中進(jìn)行了檢測。方法將A2780細(xì)胞和A2780/ADR細(xì)胞置于獨立的96-孔板(PerkinElmer)中， 密度為20000細(xì)胞/孔，并在37°C和5% C02培養(yǎng)過夜。以一系列的濃度將測試化合物 添加到細(xì)胞中，對于每種濃度的孔一式三份(細(xì)胞中DMS0的最高濃度為0. )。培 養(yǎng)7小時后，將細(xì)胞固定在冰冷的3. 7%甲醛中，保持10分鐘。細(xì)胞在PBS中洗滌，然 后在冷甲醇中滲透10分鐘。細(xì)胞再次在PBS中洗滌，然后用含0. Triton X-100的 PBS培養(yǎng)5分鐘。細(xì)胞用含牛血清白蛋白的PBS(Sigma)洗滌，然后用對于磷酸-組 蛋白 H3-Serl0(l 4000 ;Millipore)和磷酸-波形蛋白-Ser82 (1 1000;MBL)的抗 體在牛血清白蛋白中培養(yǎng)3小時。抗體使用綴合至Alexafluor 488的山羊抗-小 鼠 IgG (Invitrogen)和綴合至 Alexafluor 546 山羊抗-兔 IgG (Invitrogen)，于具有 300nM DAPI 的 牛血清白蛋白(CambridgeBiosciences)中進(jìn)行檢測。板在 Cellomics Arrayscan II HCS Reader (Cellomics)上使用 10X物鏡掃描。使用 Cell Health Profiling V2 Bioapplication(Cellomics)獲得和分析成像。僅在有絲分裂細(xì)胞(通過磷酸-組蛋 白H3的存在限定)中檢測磷酸_波形蛋白染色，強度高于用戶限定的閾值，且對于每板報 導(dǎo)每個有絲分裂細(xì)胞的平均染色強度。IC5(I值為使用3個一式三份的孔的平均值獲得。計 算不對稱比，表示為在藥物抵抗的A2780/ADR細(xì)胞中的化合物的IC5(1值除以在親代A2780 細(xì)胞中的IC5(1值。圖3顯示的是在親代和MDR腫瘤細(xì)胞中所選化合物與現(xiàn)有技術(shù)化合物 A' -J'的比較(表8中限定的)。如上所述，不對稱比以相對化合物[378]表示。本發(fā)明所述方面的多種改變和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的沒有背離本發(fā) 明的范圍和精神。雖然本發(fā)明結(jié)合具體優(yōu)選的實施方案進(jìn)行描述，但應(yīng)該理解本發(fā)明不應(yīng) 限于這些具體的實施方案。事實上，進(jìn)行本發(fā)明所述的方式的多種改變對于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù) 人員是明顯的，且包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。表1 對于所選的本發(fā)明化合物的PLK 1。50值(UM) ； ***表示<0. li!MIC5。廣表示 < 1. OuM IC50 ；* 表示 < 10. 0 ii M IC5。

〔0831|__|
〔0848〕
〔0861U 表4 化合物[218]相對于所選現(xiàn)有技術(shù)化合物的PLK活性數(shù)據(jù) WO 07/095188 的化合物[1-76]化合物[254] ( = WO 08/003958 的實施例 246)表6 本發(fā)明化合物[254]相對于WO 07/095188的化合物[1_253]的濁度法最大
溶解濃度 表7 藥代動力學(xué)研究中檢測的化合物；化合物H =化合物[371]；化合物I =化 合物[378]；化合物A-G用于比較目的
權(quán)利要求
式VIII化合物，或其可藥用鹽或酯，其中X為NR7；Y為O或N-(CH2)nR19；n為1、2或3；m為1或2；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4′各自獨立地為H或烷基；或R4和R4′一起形成螺環(huán)烷基；R19為H、烷基、芳基或環(huán)烷基；R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。FPA00001142270900011.tif
2.權(quán)利要求1的化合物，其為式Villa，或其可藥用鹽或酯， 其中 X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R19為H、烷基、芳基或環(huán)烷基；R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中R1為H或烷基，更優(yōu)選為甲基。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的化合物，其中R2為環(huán)烷基，更優(yōu)選為環(huán)戊基或環(huán)己基,
5.前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R7為H或烷基，更優(yōu)選為H。
6.前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R4和R4'各自獨立地為烷基，更優(yōu)選為甲基。
7.權(quán)利要求1-5中任一項的化合物，其中R4和R4'—起形成螺環(huán)烷基，更優(yōu)選為螺C3環(huán)烷基。
8 前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R6為0R8，更優(yōu)選為OMe。
9.前述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R19為環(huán)丙基。
10.權(quán)利要求1的化合物，其選自 及其可藥用鹽和酯。
11.式VI化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中 X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基；R18為H或烷基，其中所述烷基任選被R6取代；每個R6獨立地為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。
12.式VII化合物，或其可藥用鹽或酯， 其中 X 為 NR7 ；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基； R4和R4'各自獨立地為H或烷基；或 R4和R4' —起形成螺環(huán)烷基； R6為OR8或鹵素；且 R7和R8各自獨立地為H或烷基。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的化合物，其中R1、R2、R4、R4'、R6、R7和R8如權(quán)利要求 3-8中任一項所定義。
14.權(quán)利要求11的化合物，其選自
15.權(quán)利要求12的化合物，其選自
16.化合物，其選自 <
17.藥物組合物，其包含前述權(quán)利要求中任一項的化合物，混合有可藥用稀釋劑、賦形劑或載體。
18.權(quán)利要求1-16中任一項的化合物在制備用于治療增生性疾病的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述增生性疾病為癌癥或白血病。
20.權(quán)利要求18的用途，其中所述增生性疾病為腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬 或慢性阻塞性肺病。
21.一種治療增生性疾病的方法，所述方法包括向受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求 1-16中任一項定義的化合物。
22.—種治療PLK-依賴性疾病的方法，所述方法包括向受試者給藥治療有效量的權(quán)利 要求1-16中任一項定義的化合物。
23.一種制備權(quán)利要求1-16中任一項定義的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(i)將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(IV)化合物，直接進(jìn)行或經(jīng)過分離式(III)化合物；和(ii)將所述式(IV)化合物轉(zhuǎn)化為權(quán)利要求1-16中任一項的化合物 (II)(III)(IV)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中步驟(i)包括在Et0H/H20中加熱所述式(II)化合物以 及 NH4C1 禾口 Fe。
25.權(quán)利要求1-16中任一項的化合物，其用于醫(yī)藥。
26.權(quán)利要求1-16中任一項的化合物，其用于治療增生性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及式VIII化合物，或其可藥用鹽或酯，其中X為NR7；Y為O或N-(CH2)nR19；n為1、2或3；m為1或2；R1和R2各自獨立地為H、烷基或環(huán)烷基；R4和R4′各自獨立地為H或烷基；或R4和R4′一起形成螺環(huán)烷基；R19為H、烷基、芳基或環(huán)烷基；R6為OR8或鹵素；且R7和R8各自獨立地為H或烷基。其它方面涉及包含所述化合物的藥物組合物，及由此在治療增生性疾病等中的用途。
文檔編號A61K31/551GK101878216SQ200880118290
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者喬納森·J·霍利克, 克萊爾·J·弗林, 斯圖爾特·D·瓊斯, 邁克爾·G·托馬斯 申請人:西克拉塞爾有限公司