專利名稱：α-促黑激素(α-MSH)和心房利尿鈉蛋白(ANP)的雙功能融合蛋白以及在高血壓和急性腎損 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及顯示激素活性的新的化合物和其用途，并且特別地涉及顯示雙功 能激素活性的新的化合物和其用途，例如用于預(yù)防和/或治療腎相關(guān)的疾病或病況諸如急 性腎衰竭(ARF)或急性腎損傷(AKI)。
背景技術(shù)：
急性腎衰竭(ARF)是數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)通過尿排出量上的減少表現(xiàn)出的腎功能上 的突然衰退。含氮排泄物累積導(dǎo)致電解質(zhì)和液體動態(tài)平衡上的顯著變化。急性腎衰竭可由 誘導(dǎo)缺血性損傷或直接的中毒性腎損傷的多種臨床病況和藥療法所引起。較大的手術(shù)操 作、感染、休克、產(chǎn)后出血和腎臟灌注不足可導(dǎo)致尿排出量下降。急性腎衰竭通過血清肌酸 酐上升來診斷。在危重病人中，高分解代謝狀態(tài)能導(dǎo)致含氮排泄物的迅速升高(通過血尿 素氮(BUN)的升高來反映)以及導(dǎo)致液體過剩的液體平衡上的嚴(yán)重偏移。具有對鑒定用于腎相關(guān)的疾病或病況例如ARF的預(yù)防和治療的產(chǎn)品和方法的持 續(xù)的需求。本說明書提及大量文獻(xiàn)，其內(nèi)容通過引用全文并入本文。發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及顯示激素活性的新的化合物和其用途，并且特別地涉及顯示雙功 能激素活性的新的化合物和其用途。在第一方面，本發(fā)明提供雙功能激素，其包含(a)第一結(jié)構(gòu)域，其包含α _MSH肽或其片段、變體或片段的變體，所述片段、變體 或片段的變體具有α -MSH相關(guān)的激素活性；和(b)與所述第一結(jié)構(gòu)域共價連接的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含利尿鈉肽或 其片段、變體或片段的變體，所述片段、變體或片段的變體具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性。在一個實施方案中，當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)構(gòu)域是SEQ ID N0:1的α-MSH肽時，第二結(jié)構(gòu)域是 具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性的片段、變體或片段的變體，而當(dāng)?shù)诙Y(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO 2、3、4或5的利尿鈉肽時，第一結(jié)構(gòu)域是具有α -MSH相關(guān)的激素活性的片段、變體或片段的 變體。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO 1的肽的至少4個氨 基酸的片段，或與所述片段具有至少75%同源性的所述片段的變體。在另一個實施方案中，上文提到的α -MSH肽的變體包含與SEQ ID NO :1的氨基酸 序列具有至少75%同源性的氨基酸序列。
在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域包含式I (SEQ ID NO 47)的氨基酸序 列X2-H-X1-R-W-X3(I)其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe ；X2是E、M-E或者不存在；X3 是 G-K-P-X4、G-K-P, G_K、G 或者不存在；X4 是 Μ、V 或 Nle。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域包含(i) H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO 48)；(ii) M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 17)；(Iii)H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 49)；(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO :50)；(ν) H-X1-R-KSEQ ID NO :20)；或者其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe,并且 X4 是 Μ、V 或 Nle。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域包含(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQ ID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQ ID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle (SEQ ID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQ ID NO :54)；(ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO :56)；(ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或(iv) H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域由下列組成(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQ ID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQ ID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle (SEQ ID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQ ID NO :54)；(ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W (SEQ ID NO :56)；(ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或(iv) H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。在一個實施方案中，上文提到的第二結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO :5的至少15個氨基酸的片段，或與所述片段具有至少75%同源性的所述片段的變體。在一個實施方案中，上文提到的利尿鈉肽的變體包含與SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少75%的同源性的氨基酸序列。在一個實施方案中，上文提到的第二結(jié)構(gòu)域包含式II (SEQ ID NO 58)的氨基酸序 列X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II)其中X5 是 M、Nle、R-R-S-S, S-L-R-R-S-S 或者不存在；X6 是 C ；X7是H或者不存在；X8 是 M 或 Nle;X9 是 S-C-Y-R 或 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y ；其中X6的C殘基與X9的C殘基形成二硫橋；并且當(dāng)X5是Nle時，所述第一結(jié)構(gòu)域在所述第二結(jié)構(gòu)域的N端。在一個實施方案中，上文提到的第二結(jié)構(gòu)域包含(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 殘基形成二硫橋 (SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 殘基形成 二硫橋(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的 C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 25)；(v) R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于位置 5 和21的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 26)；(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于 位置7和23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 59)；或者(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 60)。在一個實施方案中，上文提到的第二結(jié)構(gòu)域由下列組成(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 殘基形成二硫橋 (SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 2 和 13 的 C 殘基形成 二硫橋(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的 C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 1 和 17 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 25)；
(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和21的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 26)；(vi) S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位于 位置7和23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 59)；或者(vii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 60)。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域在所述第二結(jié)構(gòu)域的N端。在一個實施方案中，上文提到的雙功能激素的氨基末端被C3-C16酰基基團(tuán)乙?；?或酰基化。在一個實施方案中，上文提到的雙功能激素的羧基末端殘基被酰胺化。在一個實施方案中，上文提到的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域通過肽鍵共價連接。在一個實施方案中，上文提到的雙功能激素含有(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C 殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 61)；(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中 位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 62)；(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 63)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y， 其中位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 64)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y, 其中位于位置12和28的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 65)；(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 66)； (vii)H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 67)；(viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-W，其中位于位置7和23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 68)；或者(i x)E-H-f-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y, 其中位于位置11和27的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 69)；其中f是D-苯丙氨酸。在一個實施方案中，上文提到的雙功能激素由下列組成(i) Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置 9 和 20的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 31)；(ii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 33)；(iii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,其中位于 位置9和20的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 34)；(iv)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 35)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置12和28的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 36)；(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 38)；(vii)Ac-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y -NH2,其中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 39)；(Viii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-H-f-R-ff -NH2,其中位于位置7和23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 40)；或者(iX)Ac-E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置11和27的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 42)；其中Ac代表氨基末端乙?；籒H2代表羧基末端酰胺化；并且f是D-苯丙氨酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有上文提到的雙功能激素以及藥學(xué)上可接受的載 體的組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和 到的雙功能激素。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和 到的雙功能激素。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和 合物，其含有上文提到的雙功能激素和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和 合物，其含有上文提到的雙功能激素和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的方法， 其包括向所述受治療者施用有效量的下列物質(zhì)中的至少一種(a)上文提到的雙功能激 素，或者(b)上文提到的組合物。在一個實施方案中，上文提到的施用通過靜脈內(nèi)輸注。在又一個實施方案中，上文 提到的靜脈內(nèi)輸注是以約lng/kg/min至約10 μ g/kg/min的速率。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的方法， 其包括向所述受治療者施用有效量的下列物質(zhì)中的至少一種(a)上文提到的雙功能激 素，或者(b)上文提到的組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了(a)上文提到的雙功能激素或者(b)上文提到的組 合物中的至少一種在用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的藥物的制備中的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了(a)上文提到的雙功能激素或者(b)上文提到的組 合物中的至少一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了(a)上文提到的雙功能激素，或者(b)上文提到的組 合物中的至少一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的用途。
/或治療腎病癥的上文提 /或治療高血壓的上文提 /或治療腎病癥的藥物組 /或治療高血壓的藥物組
在另一個方面，本發(fā)明提供了(a)上文提到的雙功能激素，或者(b)上文提到的組 合物中的至少一種在用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的藥物的制備中的用途。在一個實施方案中，上文提到的腎病癥是急性腎損傷。在另一個實施方案中，上文提到的腎病癥是手術(shù)后腎損傷或功能障礙。在又一個實施方案中，上文提到的手術(shù)后腎損傷或功能障礙是由用于瓣膜修復(fù)的 心肺旁路手術(shù)、主動脈瘤、器官移植、開心手術(shù)或冠狀動脈移植所引起的。在一個實施方案中，上文提到的雙功能激素或組合物適合通過靜脈內(nèi)輸注來施 用。在又一個實施方案中，上文提到的靜脈內(nèi)輸注是以約lng/kg/min至約10 μ g/kg/min 的速率。本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和特征在閱讀其具體實施方案的下列非限制性描述時將 變得更加明顯，其中所述具體實施方案通過僅引用附圖的實施例的方式給出。附圖簡述在所附的附圖中

圖1顯示(A)以推注劑量靜脈內(nèi)注射逐漸增加的劑量的肽(SEQ ID NO 2和33) 對血壓的作用。數(shù)據(jù)被繪制為從基線平均動脈壓(MAP)(在圖IA中用“B”表示)的百分比 變化。(B)單一劑量(30yg/kg/h輸注)的肽對血壓的作用。在一小時內(nèi)記錄MAP。數(shù)據(jù) 被繪制為作為時間(分)的函數(shù)的從基礎(chǔ)MAP的百分比變化。#2=天然ANP (SEQ ID NO 2)，#33 = SEQID NO 33的雙功能激素；圖2顯示在SD大鼠中雙功能激素對高血壓的作用。數(shù)據(jù)被繪制為從基礎(chǔ)血壓的 百分比變化；圖3顯示使用雙功能激素的預(yù)防性處理對腎缺血后的急性腎功能障礙的作用；在 腎動脈夾緊前和夾緊后以15 μ g/kg/h輸注肽#2或#33 —小時。在不同的時間測定血漿肌 酸酐和尿素。通過兩因素方差分析(two wayANOVA)使用Bonferroni檢驗分析數(shù)據(jù)對鹽水 處理組的顯著性(每組η = 3 ；鹽水組η = 6)。圖4顯示使用雙功能激素的治療性(即損傷后)處理對腎缺血后的急性腎功能障 礙的作用。在腎缺血的大鼠模型中在除掉腎夾之后輸注肽#2和#332小時。在指定的時間 收集血液樣品并測定血漿肌酸酐和尿素。通過兩因素方差分析使用Bonferroni檢驗分析 數(shù)據(jù)對鹽水處理組的顯著性(每組η = 3 ；鹽水組η = 6)；圖5顯示雙功能激素的長期輸注對腎缺血后的急性腎功能障礙的作用。在除掉腎 動脈夾之后，使用腹膜內(nèi)植入式Alzet 微型泵以兩個劑量輸注肽#2或#33 (2ML1 ；輸送速 率10μ Ι/h)。在指定時間測定血漿肌酸酐和BUN。通過兩因素方差分析使用Bonferroni 檢驗分析數(shù)據(jù)對鹽水處理組的顯著性(每組η = 3 ；鹽水組η = 6)；以及圖6顯示在經(jīng)歷30分鐘腎缺血的大鼠的腎臟中嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志物(⑶11 b)、腎 小管損傷標(biāo)志物(KIM-I)和炎性細(xì)胞因子(IL-Ιβ)以及蛋白上樣標(biāo)志物(β-肌動蛋白) 的免疫化學(xué)鑒別。使用Alzet 微型泵以15 μ g/kg/h的輸注速率輸注雙功能激素#33 24 小時。用特異性抗體鑒別蛋白。(A)蛋白質(zhì)印跡。(B)柱狀圖顯示標(biāo)志物的相對豐度。發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明涉及新的雙功能激素以及其用途，例如用于預(yù)防和/或治療腎相關(guān)的疾病 或病況諸如急性腎衰竭(ARF)或急性腎損傷(AKI)。雙功能激素顯示出對α _MSH(a -促黑激素)受體的生物活性和對利尿鈉肽受體中的至少一種的生物活性。相應(yīng)地，在一個方面，本發(fā)明提供了雙功能激素，其包含(a)第一結(jié)構(gòu)域，其包含α-MSH肽或其片段、變體或片段的變體，所述片段、變體 或片段的變體具有α -MSH相關(guān)的激素活性；和(b)與所述第一結(jié)構(gòu)域共價連接的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含利尿鈉肽或 其片段、變體或片段的變體，所述片段、變體或片段的變體具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性。在一個實施方案中，其中當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO :1的α -MSH肽時，第二結(jié)構(gòu) 域是具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性的片段、變體或片段的變體，而如果第二結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO :2、3、4或5的利尿鈉肽，第一結(jié)構(gòu)域是具有α-MSH相關(guān)的激素活性的片段、變體或 片段的變體。本發(fā)明還提供了雙功能激素，其包含與具有利尿鈉肽相關(guān)生物活性的第二結(jié)構(gòu)域 共價連接的具有α-MSH相關(guān)生物活性的第一結(jié)構(gòu)域，其中(i)所述第一結(jié)構(gòu)域不是全長 (即天然的)α -MSH肽，(ii)所述第二結(jié)構(gòu)域不是全長(即天然的)利尿鈉肽，或者(iii) ⑴和(ii)兩者。黑皮質(zhì)素是阿黑皮素原衍生的哺乳動物的肽激素，其包括促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH(1_39))、α-促黑激素((α-MSH (1-13))和包括β-和Y-MSH的相關(guān)的氨基酸序列。 黑皮質(zhì)素肽具有強(qiáng)效的抗-炎性/抗細(xì)胞因子活性(Lipton和Catania，Immunol. Today 18:140-145,1997)。黑皮質(zhì)素經(jīng)由刺激黑皮質(zhì)素受體(MCR)提供它們的活性中的至少一 些。促黑激素(MSH)活性部分歸因于1至5型黑皮質(zhì)素受體(MCR1-MCR5)的結(jié)合和激活。α -MSH以大的親和力與已知在幾種組織和細(xì)胞中表達(dá)的1型受體(MCRl)結(jié)合。 β -MSH、y -MSH和ACTH也與MCRl結(jié)合但親和力較低。已報道MCR2僅結(jié)合ACTH而不與MSH 肽中的任何一個結(jié)合。Y -MSH以高親和力與MCR3受體結(jié)合而β -MSH以高親和力與MCR4 受體結(jié)合。α -MSH已經(jīng)顯示出抑制炎癥過程的主要形式(Lipton和Catania，Immunol Today, 18 140-145，1997)，其包括1-嗜中性粒細(xì)胞趨化活性的抑制(Catania, Α. N.等人，Peptides, 17 :675-679,
1996)；2-由LPS處理誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(IL-1，TNF- α )釋放的抑制；3-響應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素的 TNF-α 的抑制(Wong, K. Y.等人，Neuroimmunomodulation， 4:37-41,1997)；4-實驗性炎性腸病中的炎癥減少(Rajora，N.等人P印tides，18 :381_385，
1997)；5-缺血誘導(dǎo)的急性腎衰竭(Star，R. Α.等人 Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α，92 8016-8020,1995)；6-來自皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的IL-8釋放的增加(Hartmeyer，Μ. Τ.，J. Immunol, 159 :1930-1937,1997)；α -MSH作用通過在包括巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和腎小管的各種細(xì)胞類型中表達(dá) 的黑皮質(zhì)素受體介導(dǎo)。利尿鈉肽是由三種不同基因合成的肽家族中的一部分(Flyrm TG. Pro. Soc. Exp.Biol. Med. 213 :98-104,1996 ；Levin ER 等人· N Eng J. Med339 :321-328,1998 ；Ogawa Y 等 人.Clin Exp Pharmacol physioi. 22 :49-53,1995 ；Rosenzweig A., Annu Rev Biochem 60 =229-255,1991)并且之后被儲存為三種不同激素原[即1 氨基酸的ANP、108氨基 酸的腦利尿鈉肽(BNP)和126-氨基酸的C-型利尿鈉肽(CNP)激素原](Levin ER等人， N Eng J. Med 339 :321-328, Vesely DL Atrial Natriuretic Hormones ( 素).Englewood Cliffs, NJ =Prentice Hall，1992，1—256)。在動物和人類中，126-氨基酸的ANP激素原中有四個肽激素，具有降低血壓、利尿 鈉、利尿和/或利尿鉀特性。通過從激素原的N端末端開始的以它們的氨基酸序列編號的 這些肽激素如下-激素原的殘基1-30長效利尿鈉肽(LANP)；-激素原的殘基31-67血管舒張劑；-激素原的殘基79-98利尿鉀肽；以及-激素原的殘基99-1 :ANP。在另一方面，BNP和CNP基因看起來每種在它們各自的激素原中合成僅一種肽激 素艮口 BNP禾口 CNP。心房利尿鈉肽(ANP)，主要來源于心房肌細(xì)胞的一種循環(huán)激素，在鹽和水的動態(tài)平 衡以及血壓的控制中起作用。此外，ANP是血管舒張劑并且也對腎臟具有直接作用，包括腎 小球濾過增加、鈉再吸收抑制和促進(jìn)尿鈉增多和利尿的腎血流重分布。尿舒張素是利尿鈉肽家族中的腎源性成員并且從相同的ANP激素原形成并由氨 基酸序列95-1 組成。除了 N端的4個氨基酸，其與ANP相同(99-126)。尿舒張素看起來 是腎臟中鈉和水處理的重要調(diào)節(jié)劑，以及患有充血性心力衰竭(CHF)的患者中鈉排出的介 質(zhì)。BNP在健康人類中產(chǎn)生與ANP相似的生物學(xué)作用。在正常男性中輸注BNP產(chǎn)生鈉 排出上兩倍的增加，血漿腎素、血管緊張素II和醛固酮分泌上50%的減少。從BNP原的C 端末端切割32個氨基酸的序列產(chǎn)生為在血漿中生理活性形式的人類BNP (77-108)。CNP誘導(dǎo)與其他利尿鈉肽相似的心血管作用。從CNP原切割末端氨基酸序列 105-126以產(chǎn)生CNP的生物學(xué)活性形式。ANP和BNP的大多數(shù)生物學(xué)作用是由鳥苷酸環(huán)化酶偶合的細(xì)胞表面受體A-受體 (NPR-A)介導(dǎo)的(Garbers，DL，Cell 1992，71 1-4)。CNP是另一種鳥苷酸環(huán)化酶偶合的NP 受體 B-受體(NPR-B)的特異性配體(Maack T, Ann. Rev. physioi. 1992,54:11-27)。第三 種受體，所謂的NP清除受體(NPR-C)，結(jié)合ANP、BNP和CNP。除了在整個機(jī)體中NP清除上 的主要作用(Maack T, Ann. Rev. physioi. 1992,54 :11-27)，也報道過ANP的幾種作用是經(jīng) 由 NPR-C 受體介導(dǎo)的(Maack T, Kidney Int 1996，49 1732-1737)。除了與 NP 受體結(jié)合，利 尿鈉肽還借助中性內(nèi)肽酶通過蛋白質(zhì)水解被清除。利尿鈉肽受體的所有三個亞型(NPR-A、 NPR-B和NPR-C)已經(jīng)被證實在包括腎系統(tǒng)和心臟的不同組織中表達(dá)(Nunez，DJR等人， J.ClinInvest. 1992,90 :1966-1971)。α -MSH、ANP、尿舒張素、BNP和CNP的天然氨基酸序列在下文表1中給出。表 權(quán)利要求
1.一種雙功能激素，其包括(a)第一結(jié)構(gòu)域，其包含α-MSH肽或其片段、變體或片段的變體，所述片段、變體或片 段的變體具有α-MSH相關(guān)的激素活性；和(b)與所述第一結(jié)構(gòu)域共價連接的第二結(jié)構(gòu)域，所述第二結(jié)構(gòu)域包含利尿鈉肽或其片 段、變體或片段的變體，所述片段、變體或片段的變體具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能激素，其中當(dāng)所述第一結(jié)構(gòu)域是SEQIDN0:1的 α-MSH肽時，所述第二結(jié)構(gòu)域是具有利尿鈉肽相關(guān)的激素活性的所述片段、變體或片段的 變體，而如果所述第二結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO :2、3、4或5的利尿鈉肽，所述第一結(jié)構(gòu)域是具有 α -MSH相關(guān)的激素活性的所述片段、變體或片段的變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO 1的肽的 至少4個氨基酸的片段，或與所述片段具有至少75%同源性的所述片段的變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能激素，其中α-MSH肽的所述變體包含與SEQID NO 1的氨基酸序列具有至少75%同源性的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域包含式I(SEQ ID NO 47)的氨基酸序列X2-H-X1-R-W-X3 (I) 其中X1 是 L-Phe 或 D-Phe ； X2是E、M-E或者不存在； X3 是 G-K-P-X4、G-K-P, G-K、G 或者不存在； X4 是 M、V 或 Nle。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域包含(i)H-X1-R-W-G-K-P-X4 (SEQ ID NO 48)；(ii)M-E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 17)； (Iii)H-X1-R-W-G (SEQ ID NO 49)；(iv) E-H-X1-R-W-G (SEQ ID NO :50)；或者(ν) H-X1-R-KSEQ ID NO :20)；或者其中X1是L-Phe或D-Phe,并且X4是Μ、V或Nle。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域包含(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQID NO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle(SEQID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQID NO :54)； (ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQ ID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W(SEQID NO :56)； (ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或 (iv)H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域由下列組成(i)H-f-R-ff-G-K-P-V(SEQID NO :51)；(ii)H-f-R-ff-G-K-P-M(SEQIDNO :52)；(iii)H-f-R-ff-G-K-P-Nle(SEQID NO :53)；(iv)H-f-R-ff-G-K-P(SEQID NO :54)； (ν)M-E-H-F-R-W-G(SEQ ID NO :11)；(vi)H-f-R-ff-G(SEQID NO :55)；(vii)E-H-F-R-W(SEQID NO :56)； (ix) E-H-f-R-ff-G (SEQ ID NO :57)；或 (iv)H-f-R-ff(SEQ ID NO :6)；其中f是D-苯丙氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述第二結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的至少15個氨基酸的片段，或與所 述片段具有至少75%同源性的所述片段的變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述利尿鈉肽的變體 包含與SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少 75%的同源性的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述第二結(jié)構(gòu)域包含 式II (SEQ ID NO 58)的氨基酸序列X5-X6-X7-F-G-G-R-X8-D-R-I-X9 (II) 其中X5 是 M、Nle、R-R-S-S、S-L-R-R-S-S 或者不存在； X6是C;X7是H或者不存在； X8 是 M 或 Nle ；X9 是 S-C-Y-R 或 G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y ；其中 X6的C殘基與X9的C殘基形成二硫橋；并且 當(dāng)X5是Nle時，所述第一結(jié)構(gòu)域在所述第二結(jié)構(gòu)域的N端。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙功能激素，其中所述第二結(jié)構(gòu)域包含(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2 和 13 的 C 殘基形成二硫 橋(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 殘 基形成二硫橋(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 25)；(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和 21 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 26)；(vi)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 7 和 23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 59)；或者(vi i)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 2 和 18 的 C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 60)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的雙功能激素，其中所述第二結(jié)構(gòu)域由下列組成(i)M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2和13的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 22)；(ii)Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R，其中位于位置2 和 13 的 C 殘基形成二硫 橋(SEQ ID NO 23)；(iii)C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 殘 基形成二硫橋(SEQ ID NO 24)；(iv)C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置1 和 17 的 C 殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 25)；(v)R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 5 和 21 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 26)；(vii)S-L-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置 7 和 23的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 59)；或者(viii)M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于位置2 和 18 的 C殘基形成二硫橋(SEQ ID N0:60)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域在所 述第二結(jié)構(gòu)域的N端。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述雙功能激素的氨 基末端殘基被C2-C16?；鶊F(tuán)?；?。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雙功能激素，其中所述雙功能激素的氨基末端殘基被乙?；?。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述雙功能激素的羧 基末端殘基被酰胺化。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述第一結(jié)構(gòu)域和第 二結(jié)構(gòu)域通過肽鍵共價連接。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中的任何一項所述的雙功能激素，其中所述雙功能激素包含(i)H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C 殘基 形成二硫橋(SEQ ID NO 61)；(ii)H-f-R-W-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位于 位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 62)；(iii)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-1-S-C-Y-R，其中位于位置 9 和 20 的 C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 63)；(iv)H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中 位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 64)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中 位于位置12和28的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 65)；(vi)H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y，其中位 于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 66)；(vii)H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其中位 于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 67)；或者(viii)E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y,其 中位于位置11和27的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 69)；其中f是D-苯丙氨酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的雙功能激素，其中所述雙功能激素由下列組成(i)Ac-H-f-R-W-G-K-P-M-C-H-F-G-G-R-M-D-R-I-S-C-Y-R-NH2，其中位于位置9 和 20 的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 31)；(ii)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-M-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其 中位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 33)；(iii)c-H-f-R-W-G-K-P-Nle-C-H-F-G-G-R-Nle-D-R-I-S-C-Y-R-NH2,其中位于位置 9 和20的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 34)；(iv)Ac-H-f-R-ff-G-K-P-Nle-C-F-G-G-R-Nle-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置9和25的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 35)；(v)M-E-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2， 其中位于位置12和28的C殘基形成二硫橋(SEQ IDNO 36)；(vi)Ac-H-F-R-W-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-1-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2， 其中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 38)；(vii)Ac-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH 2，其中位于位置10和沈的C殘基形成二硫橋(SEQ ID NO 39)；或者(viii)Ac-E-H-f-R-ff-G-R-R-S-S-C-F-G-G-R-M-D-R-I-G-A-Q-S-G-L-G-C-N-S-F-R-Y-NH2,其中位于位置11和27的C殘基形成二硫橋(SEQ IDNO 42)；其中Ac代表氨基末端乙?；?；NH2代表羧基末端酰胺化；并且f是D-苯丙氨酸。
21.一種組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素和藥學(xué) 上可接受的載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，其用于在受治療者中預(yù)防 和/或治療腎病癥。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，其用于在受治療者中預(yù)防 和/或治療高血壓。
24.一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要 求1至20中的任何一項所述的雙功能激素和藥學(xué)上可接受的載體。
25.一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要 求1至20中的任何一項所述的雙功能激素和藥學(xué)上可接受的載體。
26.一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的方法，其包括向所述受治療者施 用有效量的下列物質(zhì)中的至少一種(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能 激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述腎病癥是急性腎損傷。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述腎病癥是手術(shù)后腎損傷或功能障礙。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述手術(shù)后腎損傷或功能障礙是由瓣膜修復(fù)的 心肺旁路手術(shù)、主動脈瘤、器官移植、開心手術(shù)或冠狀動脈移植所引起的。
30.根據(jù)權(quán)利要求沈至四中的任何一項所述的方法，其中所述施用經(jīng)由靜脈內(nèi)輸注。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述靜脈內(nèi)輸注是以約lng/kg/min至約 10 μ g/kg/min 的速率。
32.一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的方法，其包括向所述受治療者施 用有效量的下列物質(zhì)中的至少一種(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能 激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物。
33.(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要 求21所述的組合物中的至少一種在用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的藥物的制 備中的用途。
34.(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要求 21所述的組合物中的至少一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療腎病癥的用途。
35.(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要求 21所述的組合物中的至少一種用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的用途。
36.(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要 求21所述的組合物中的至少一種在用于在受治療者中預(yù)防和/或治療高血壓的藥物的制 備中的用途。
37.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的用途，其中所述腎病癥是急性腎損傷。
38.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的用途，其中所述腎病癥是手術(shù)后腎損傷或功能障礙。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的用途，其中所述手術(shù)后腎損傷或功能障礙是由瓣膜修復(fù)的 心肺旁路手術(shù)、主動脈瘤、器官移植、開心手術(shù)或冠狀動脈移植所引起的。
40.根據(jù)權(quán)利要求33至39中的任何一項所述的用途，其中所述雙功能激素或組合物適 合于通過靜脈內(nèi)輸注施用。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的用途，其中所述雙功能激素或組合物適合于通過靜脈內(nèi)輸 注以約lng/kg/min至約10 μ g/kg/min的速率施用。
42.(a)根據(jù)權(quán)利要求1至20中的任何一項所述的雙功能激素，或者(b)根據(jù)權(quán)利要求 21所述的組合物中的至少一種在藥物的制備中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了顯示α-MSH活性和利尿鈉肽活性的雙功能激素。雙功能激素包含例如與具有利尿鈉肽相關(guān)激素活性的第二結(jié)構(gòu)域共價連接的具有α-MSH相關(guān)激素活性的第一結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的雙功能激素被用于例如腎相關(guān)疾病或病況諸如急性腎衰竭(ARF)或急性腎損傷(AKI)的預(yù)防和/或治療。
文檔編號A61P13/12GK102066421SQ200880022924
公開日2011年5月18日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者克里希納·佩里, 阿卜德爾卡里姆·哈比 申請人:瑟瑞技術(shù)公司