專利名稱：高純度血促性素的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域中生物制藥領域，具體為高純度血促性素的生產方法。
背景技術：
血促性素(PMSG)是孕馬子宮胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素。PMSG自1943年發(fā)現以來，對此進行了廣泛的工藝技術研究和應用試驗。60年代，美國的D.Gospodarowicz及Papkoff建立了較簡單的純化分離技術，同時開展了治療家畜不孕癥和不育癥的應用試驗，取得了很好的療效。荷蘭Intervet公司于60年代中期開始了工業(yè)化生產研究，并于70年代正式應用于獸醫(yī)臨床。70年代末，隨著生物技術的發(fā)展，又廣泛地應用于超數排卵和同期發(fā)情，隨后日本歐美其它國家也開始生產PMSG。到了90年代，隨著化妝品工業(yè)的發(fā)展，法國的Biotherm公司開始研究促性腺激素化妝品對婦女的美容和保健作用，發(fā)現PMSG對推遲婦女更年期的作用比人絨促性素的作用更好，到90年代末成功地把PMSG應用于化妝品工業(yè)。
我國PMSG的產品在70年代末建立了第一個獸藥質量標準，但要求極低，效價要求僅為100u/mg以上，目前生產的PMSG也基本上是這個水平。歐美國家的標準幾乎每五年提高一個檔次，從70年代初的200u/mg提高到二十一世紀的2000-3000單位(u)/mg。我國的標準與國際標準差異很大，隨著全球一體化進程的加快，我國的標準與國際接軌已成為必然的趨勢。
我國PMSG的生產工藝技術還處于較原始狀態(tài)，其生產過程通常為孕馬血清經偏磷酸調PH，去除部分雜蛋白；然后用硫酸銨鹽析，再經乙醇分級分離得到PMSG粗制品，其生物活性在100u/mg左右。經乙醇分級分離得到的PMSG粗制品再經凝膠過濾層析，可得到效價在800u/mg左右的PMSG粗制品。另外，還有關于SE-Sephadx C-50純化PMSG的研究報導，但SE-Sephadx C-50本身已經被淘汰。
另外，澳大利亞專利AU545819B公開了一種PMSG的純化方法，其是先用麥芽凝集素(wheat germ lectin)吸附含PMSG的物質，然后用N-乙酰氨基葡萄糖或其低聚物進行洗脫。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術現狀而提供一種高純度血促性素的生產方法。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為該高純度血促性素的生產方法，其特征在于其以DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析柱的層析介質，包括以下步驟a、上樣；用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液將PMSG粗制品溶解后上樣；b、預洗脫；上樣完成后用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行預洗脫以除去雜質；c、洗脫；用pH為6.5～8.5濃度為0.15～0.3mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，洗脫的同時進行檢測，并收集主峰洗脫液得收集液；d、收集液經透析凍干即得精制品。
所述預洗脫步驟中采用了兩個梯度的乙酸鈉緩沖溶液進行預洗脫，其中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.015mol/L，第二梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.025～0.07mol/L。
所述上樣步驟中乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.015mol/L。
所述上樣步驟中乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.01mol/L，所述第一梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.01mol/L，所述第二梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.05mol/L，所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.2mol/L。
所述預洗脫步驟中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液、第二梯度乙酸鈉緩沖溶液以及所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的用量均為所述層析柱柱體積的2～4倍。
所述預洗脫步驟中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液、第二梯度乙酸鈉緩沖溶液以及所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的用量均為所述層析柱柱體積的3倍。
所述PMSG粗制品的效價為650～860u/mg。
所述層析柱的規(guī)格為φ50mm×300～500mm。
所述PMSG粗制品的上樣量為2～3g，流速為10ml/min。
所述的檢測采用的是核酸蛋白檢測儀，檢測波長為280nm。
另外，在純化生產過程中，宜采用注射用水和在潔凈的環(huán)境中純化，可保持產品無菌、無熱原。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、DEAE-Sephadx A-50純化血促性素還未見報導。
2、該生產工藝方法簡單，僅用兩到三個梯度就能完成純化過程。
3、該生產工藝純化效率高，所得精制品效價達3000u/mg以上，以粗制品為800u/mg計，純化后可達4000u/mg。
4、該生產工藝損失少，回收率可達76.08％。
5、該生產工藝適用PH值范圍廣，PH值在6.5-8.5均適用，工藝易掌握，利于大生產。
6、由于DEAE-Sephadex A-50離子交換劑起交換作用的是二乙氨基乙基，基質比較結實、牢固、其流速也較快，易達到規(guī)?；a的要求。


圖1為本發(fā)明實施例的生產工藝流程示意圖；具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述一、以下先介紹PMSG粗制品的提取。
血促性素(PMSG)粗制品的提取技術已相當成熟，不作重點研究，僅作一個完整的介紹。
1.1.血促性素(PMSG)粗制品的提取1.1.1.選擇效價相近的孕馬血清邊攪拌邊向血清中緩緩加入血清量1/10(v/v)的4.4％苯酚溶液，用虹吸法將冷卻的3％HPO3緩緩加入血清中并充分攪拌，調pH2.40-2.50，沉淀液即在濾槽過濾，濾出的清液待透明后收集。
1.1.2.HPO3濾液用硫酸銨加至40％鹽析沉淀，再放置2小時，將硫酸銨沉淀在濾糟中過濾，壓干、稱重量即可A品。
1.1.3.將A品的干餅用約10倍離子交換水溶解，量取體積。降溫至5℃左右，加95％乙醇至溶液為50％濃度，充分攪拌調pH至4.0-4.2，保持在+5℃1小時，離心收集上清。沉渣在0-5℃，用相當于A品5倍量左右的含50％乙醇離子交換水將沉渣充分溶解，洗滌，離心，收集上清與上述的清液合并。合并后的清液，加入95％冷乙醇至75％，攪拌1小時，靜置過夜。次日虹吸上清，桶底沉淀物離心，得較干的濕沉淀，為B品。
1.1.4.稱B品重量，用冷55％緩沖乙醇溶解至體積為沉淀物重的10-15倍。滴加3N NaOH至pH6.0-6.2，攪拌1小時，溫度0-5℃。離心收集上清，上補加乙醇至75％，攪拌1小時，靜置過夜。次日虹吸上清，離心收集沉淀，透析除鹽至電導率在103以下時，調pH至中性后，除菌過濾，冷凍干燥，即得C品也就是提取的PMSG粗制品，用大白鼠卵巢增重法測定其生物活性。
1.2.血促性素的中壓凝膠過濾層析1.2.1TSK凝膠柱對C品中各種成份的分子量分析利用凝膠柱通用緩沖液---PH6.9的0.05M磷酸鹽緩沖液(含0.05M NaCl)為流動相，用同樣緩沖液溶解C品，使其濃度為10mg/ml，然后進樣，進樣量為20μl，流速為1.8ml/min，檢測波長為280nm，用白蛋白(牛)(MW＝67000)和戈那瑞林(MW＝1182.31)為分子量參照品。
1.2.2根據TSK凝膠柱對C品中各種成份的分子量分析結果，選取TSK剛性凝膠懸漿用PH6.9的0.05M磷酸緩沖液(含0.05M NaCl)多次換液浸泡，然后裝中壓柱(10cm×40cm)，淋洗至平衡，同時，用同樣緩沖液溶解C品，使其濃度為20mg/ml，然后上樣，上樣量為100ml?？刂屏魉偌s100ml/min，用同樣緩沖液淋洗至出峰，收集主峰。
繼續(xù)上樣，上樣量為100ml，如此可連續(xù)不斷的層析操作。經若干次層析后，收集的主峰合并，經透析、凍干后得到得D品，也就是純度比上述C品更高的PMSG粗制品。
二、以下為本發(fā)明實施例描述1.試驗方法1.1生產工藝a、生產工藝流程參見附圖1。
b、生產工藝過程DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析介質，先用注射用水浸泡24小時，然后用初始緩沖溶液(pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.015mol/L乙酸鈉緩沖溶液)平衡至pH值與初始緩沖溶液pH值一致，平衡好后裝柱，柱為φ50mm×300～500mm，再次用初始緩沖溶液平衡后上樣，上樣量約為200萬U粗制品(PMSG)(效價約為800單位/mg)，按質量計算約為2～3g，體積約100ml，溶解PMSG粗制品采用初始緩沖溶液。本實施例的預洗脫采用了兩個梯度的乙酸鈉緩沖溶液，其中第一梯度緩沖溶液與初始緩沖溶液相同，第二梯度緩沖溶液為pH為6.5～8.5濃度為0.025～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液。本實施例中，將洗脫步驟采用的pH為6.5～8.5濃度為0.15～0.3mol/L的乙酸鈉緩沖溶液稱為第三梯度緩沖溶液。上樣完成后，在流速10ml/min，檢測波長為280nm，每一梯度洗脫液量為柱體積的2～4倍的條件下，依次洗脫，收集第三梯度主峰，收集液經透析凍干后得精制品。
1.2DEAE-Sephadex A-50離子交換劑的適用pH值的選擇試驗采用試管小試法，在同一0.01mol/L乙酸鈉溶液不同pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的緩沖液條件下，經充分平衡后，取自然濾干的濕離子交換劑各1克加入試管中，然后加入相對應的緩沖液各4ml，再后加入含D品PMSG10000u(ELISA法測定)的1ml水溶液，混合后放置5-10分鐘；使離子交換劑沉降，濾取上清液并用適量同一緩沖液洗滌，然后用ELISA法測定PMSG的含量與活性。
1.3洗脫液離子強度的選擇在pH7的條件下，配制一系列的不同濃度的緩沖液(最佳吸附pH值)，其濃度分別為0.025mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L。采用柱層法，用ELISA測定法確定最佳洗脫梯度及各緩沖液的離子強度。柱為φ25mm×150～250mm，上樣量為最佳吸附時的25％即40萬u，上樣后每一梯度洗脫液量為柱體積的3倍，收集每一梯度的洗脫液，用ELISA測定PMSG含量，同時根據洗脫液用分光光度法測定其蛋白質濃度，推算出u/mg。
1.4洗脫液量大小對純化結果的影響優(yōu)化后的工藝條件下，每一梯度洗脫液量分別為柱體積的2、3、4倍。
1.5優(yōu)化后的生產工藝的生產試驗根據1.3和1.4的試驗結果，優(yōu)化生產工藝為初始緩沖液為pH7.0的0.01mol/L乙酸鈉緩沖液，第二梯度緩沖液為pH7.0的0.05mol/L乙酸鈉緩沖液，第三梯度緩沖液為pH7.0的0.2mol/L乙酸鈉緩沖液，然后進行生產性試驗。柱為φ50mm×300～500mm，上樣量約為200萬u，上樣后每一梯度洗脫液量為柱體積的3倍，收集主峰，收集液經透析凍干后得產品。試驗前后效價測定均為生物測定。
2.試驗結果2.1DEAE-Sephadex A-50離子交換劑的適用PH值的試驗結果在同一0.01M乙酸鈉溶液不同PH值對過量PMSG吸附能力的測定結果見表1。
表1 DEAE-Sephadex A-50離子交換劑對過量PMSG吸附能力的測定結果

根據表1的結果分析，DEAE-Sephadex A-50在同一0.01mol/L乙酸鈉溶液，在pH值6.5～8.5時對PMSG吸附能力基本一致，同時每克濕重(約相當于1ml柱體積)DEAE-Sephadex A-50約能吸附7000u的PMSG。
2.2洗脫離子強度選擇的試驗結果對DEAE-Sephadex A-50進行洗脫離子強度試驗，其結果見表2.。
表2、不同濃度的緩沖液其洗脫試驗結果

從表2中可以看出，用0.01mol/L起始緩沖液洗時，僅有5.6％的PMSG被洗脫，說明大量雜蛋白被洗脫；緩沖液濃度為0.025mol/L和0.05mol/L時，僅有2.9％PMSG被洗脫，說明洗脫的以雜蛋白為主；當達到0.1mol/L時，有15.5％的PMSG被洗脫下來，雜蛋白和PMSG都有；主峰出現在0.2mol/L這一梯度，回收率為63.6％，此峰主要含PMSG；六個梯度總收率為91.8％?？紤]到純化目標和回收率因素，選擇0.01mol/L為緩沖液起始濃度，0.05mol/L為階段淋洗緩沖液濃度，0.2mol/L為PMSG產品洗脫液濃度。
2.3洗脫液量大小對純化結果的影響采用優(yōu)化后的生產工藝，柱為φ25mm×150～250mm，上樣量約為40萬u。每一梯度洗脫液量大小對純化結果的影響見表3。
表3 洗脫液量大小對純化結果的影響

由表3看出，每一梯度洗脫液量分別為柱體積的2、3、4倍時，隨著洗脫液量的增加，每mg效價逐步增加，而回收率逐步減少，但還可以接受，最大相差6.01個百分點。
2.4優(yōu)化后的生產工藝的生產試驗結果優(yōu)化后的生產工藝是選擇0.01mol/L為緩沖液起始濃度(第一梯度)，0.05mol/L為階段淋洗緩沖液濃度(第二梯度)，0.2mol/L為PMSG產品洗脫液濃度(第三梯度)，每一梯度洗脫液量為柱體積的3倍。試驗結果見表4。
表4、優(yōu)化后的生產工藝的生產試驗結果

由表4看出，其純化后產品的PMSG生物活性平均為3785(u/mg)，回收率為76.08％。
制備例一DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析介質，先用注射用水浸泡24小時，然后用初始緩沖液(pH7.0的0.01mol/L乙酸鈉緩沖液)平衡至pH7.0，平衡好后裝柱，柱為φ50mm×500mm，再次用初始緩沖液平衡。
上樣量約為200萬u粗制品(效價約為800單位/mg)，粗制品用100ml pH7.0的0.01mol/L乙酸鈉緩沖液溶解，待完全溶解后緩慢滴加上樣。
每一梯度洗脫液量為柱體積的3倍，在流速10ml/min和檢測波長為280nm的條件下，依次用第一梯度洗脫液(pH7.0的0.01mol/L乙酸鈉緩沖液)、第二梯度緩沖液(pH7.0的0.05mol/L乙酸鈉緩沖液)和第三梯度緩沖液(pH7.0的0.2mol/L乙酸鈉緩沖液)洗脫過程中，經核酸蛋白檢測儀檢測，收集第三梯度主峰的流出液。
收集第三梯度主峰的流出液裝入半透膜在注射用水中透析，透析后冷凍干燥得產品。所得產品的效價為3840u/mg，回收率為75.3％。
制備例二DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析介質，先用注射用水浸泡24小時，然后用初始緩沖溶液(pH6.5的0.005mol/L乙酸鈉緩沖溶液)平衡至pH6.5，平衡好后裝柱，柱為φ50mm×500mm，再次用初始緩沖溶液平衡。
上樣量約為150萬u粗制品(效價約為650單位/mg)，粗制品用初始緩沖溶液溶解，待完全溶解后緩慢滴加上樣。
每一梯度洗脫液量為柱體積的4倍，在流速10ml/min和檢測波長為280nm的條件下，依次用第一梯度洗脫液(初始緩沖溶液)、第二梯度緩沖液(pH6.5的0.07mol/L乙酸鈉緩沖液)和第三梯度緩沖液(pH6.5的0.3mol/L乙酸鈉緩沖液)洗脫過程中，經核酸蛋白檢測儀檢測，收集第三梯度主峰的流出液。
收集第三梯度主峰的流出液裝入半透膜在注射用水中透析，透析后冷凍干燥得產品。所得產品的效價為3450u/mg，回收率為76.2％。
制備例三DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析介質，先用注射用水浸泡24小時，然后用初始緩沖溶液(pH8.5的0.015mol/L乙酸鈉緩沖溶液)平衡至pH8.5，平衡好后裝柱，柱為φ50mm×300mm，再次用初始緩沖溶液平衡。
上樣量約為200萬u粗制品(效價約為860單位/mg)，粗制品用初始緩沖溶液溶解，待完全溶解后緩慢滴加上樣。
每一梯度洗脫液量為柱體積的2倍，在流速10ml/min和檢測波長為280nm的條件下，依次用第一梯度洗脫液(初始緩沖溶液)、第二梯度緩沖液(pH8.5的0.025mol/L乙酸鈉緩沖液)和第三梯度緩沖液(pH8.5的0.15mol/L乙酸鈉緩沖液)洗脫過程中，經核酸蛋白檢測儀檢測，收集第三梯度主峰的流出液。
收集第三梯度主峰的流出液裝入半透膜在注射用水中透析，透析后冷凍干燥得產品。所得產品的效價為4250u/mg，回收率為70.2％。
制備例四DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析介質，先用注射用水浸泡24小時，然后用初始緩沖溶液(pH7的0.015mol/L乙酸鈉緩沖溶液)平衡至pH7，平衡好后裝柱，柱為φ50mm×300mm，再次用初始緩沖溶液平衡。
上樣量約為200萬u粗制品(效價約為860單位/mg)，粗制品用初始緩沖溶液溶解，待完全溶解后緩慢滴加上樣。
每一梯度洗脫液量為柱體積的3倍，在流速10ml/min和檢測波長為280nm的條件下，依次用第一梯度洗脫液(初始緩沖溶液)、第二梯度緩沖液(pH7的0.07mol/L乙酸鈉緩沖液)和第三梯度緩沖液(pH7的0.3mol/L乙酸鈉緩沖液)洗脫過程中，經核酸蛋白檢測儀檢測，收集第三梯度主峰的流出液。
收集第三梯度主峰的流出液裝入半透膜在注射用水中透析，透析后冷凍干燥得產品。所得產品的效價為4050u/mg，回收率為77.3％。
權利要求
1.一種高純度血促性素的生產方法，其特征在于其以DEAE-Sephadex A-50為離子交換層析柱的層析介質，包括以下步驟a、上樣；用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液將PMSG粗制品溶解后上樣；b、預洗脫；上樣完成后用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行預洗脫以除去雜質；c、洗脫；用pH為6.5～8.5濃度為0.15～0.3mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，洗脫的同時進行檢測，并收集主峰洗脫液得收集液；d、收集液經透析凍干即得精制品。
2.根據權利要求1所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述預洗脫步驟中采用了兩個梯度的乙酸鈉緩沖溶液進行預洗脫，其中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.015mol/L，第二梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.025～0.07mol/L。
3.根據權利要求2所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述上樣步驟中乙酸鈉緩沖溶液的pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.015mol/L。
4.根據權利要求2所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述上樣步驟中乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.01mol/L，所述第一梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.01mol/L，所述第二梯度乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.05mol/L，所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的pH為7濃度為0.2mol/L。
5.根據權利要求2所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述預洗脫步驟中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液、第二梯度乙酸鈉緩沖溶液以及所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的用量均為所述層析柱柱體積的2～4倍。
6.根據權利要求5所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述預洗脫步驟中第一梯度乙酸鈉緩沖溶液、第二梯度乙酸鈉緩沖溶液以及所述洗脫步驟中的乙酸鈉緩沖溶液的用量均為所述層析柱柱體積的3倍。
7.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述PMSG粗制品的效價為650～860u/mg。
8.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述層析柱的規(guī)格為φ50mm×300～500mm。
9.根據權利要求8所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述PMSG粗制品的上樣量為2～3g，流速為10ml/min。
10.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的高純度血促性素的生產方法，其特征在于所述的檢測采用的是核酸蛋白檢測儀，檢測波長為280nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高純度血促性素的生產方法，其特征在于其以DEAE－SephadexA－50為離子交換層析柱的層析介質，先用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液將PMSG粗制品溶解后上樣，然后用pH為6.5～8.5濃度為0.005～0.07mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行預洗脫以除去雜質，再用pH為6.5～8.5濃度為0.15～0.3mol/L的乙酸鈉緩沖溶液進行洗脫，洗脫的同時進行檢測，并收集主峰洗脫液得收集液，收集液經透析凍干即得精制品。該生產方法簡單，僅用兩到三個梯度就能完成工藝過程，純化效率高，所得精制品效價達3000u/mg以上，生產工藝損失少，回收率可達76.08％，適用pH值范圍廣，工藝易掌握，利于規(guī)?；a。
文檔編號C07K14/435GK1919864SQ20061005346
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月20日 優(yōu)先權日2006年9月20日
發(fā)明者俞通泰, 徐震宇, 翁士喬, 曾宏杰 申請人:寧波市三生藥業(yè)有限公司