專利名稱：糖免疫原的制作方法
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糖免疫原 相關(guān)申請(qǐng)抗-碳水化合物識(shí)別代表了適應(yīng)性免疫和先天免疫的主要 組成部分。然而，針對(duì)表面碳水化合物的抗體的保護(hù)性質(zhì)只在有限的 情況中被用于疫苗設(shè)計(jì)。
00041糖基化的抗原作用在人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的情 況中具有特殊的意義。HIV-1的表面被大的、柔性的和免疫原性差的 N聯(lián)糖所覆蓋，所述N聯(lián)糖形成了促進(jìn)體液免疫逃避的'進(jìn)化的聚糖防 護(hù)罩，(參見(jiàn)，例戈口， X. Wd等人，"Antibody neutralization and escape by HIV-l"， Nature, 422(6929), pp. 307-312， 2003，所述文獻(xiàn)被全文并 入本文作為參考)。已經(jīng)提出了關(guān)于HIV聚糖的免疫原性差的三個(gè)主 要的解釋。第一，與HIV連接的聚糖是由宿主細(xì)胞合成的，因此是"自 體，，免疫的。第二，蛋白質(zhì)對(duì)碳水化合物的結(jié)合通常是弱的，因此限制 了高親合力抗碳水化合物抗體的潛力。最后，有多種不同的糖形可以 連接于任何給定的N-聯(lián)接的附著位點(diǎn)，由此產(chǎn)生潛在抗原的高度非均 質(zhì)混合物。有多種復(fù)雜的、低聚甘露糖和混合型聚糖都存在于HIV上， 低聚甘露糖聚糖緊密地聚集在gpl20的暴露的外部結(jié)構(gòu)域上。然而， 在感染期間通常沒(méi)有觀察到HIV碳水化合物的抗體。盡管免疫原設(shè)計(jì)的合成方法可能是強(qiáng)大的，但是免疫原的
'合理，設(shè)計(jì)具有顯著的挑戰(zhàn)。非常期望開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)碳水化合物免疫原的 可供選擇的方法。

發(fā)明內(nèi)容
0011公開(kāi)了用于誘導(dǎo)針對(duì)包括低聚-D-甘露糖部分的抗原的免 疫原性應(yīng)答的藥物組合物和藥包。還公開(kāi)了使用所述組合物誘導(dǎo)免疫 原性應(yīng)答的方法和制備所述藥物組合物的方法。典型地，所述藥物組 合物包括(a)有效濃度的包括被取代的低聚-D-甘露糖部分的抗原， 其中所述抗原的低聚-D-甘露糖部分的至少 一個(gè)D-甘露糖殘基被至少 一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘基代替；和(b)載體(例如，賦形劑、稀釋劑、 和/或佐劑)。
0012在一些實(shí)施方案中，所述非-D-甘露糖單糖殘基包括D-甘 露糖的結(jié)構(gòu)模擬物或類似物。所述非-D-甘露糖單糖殘基可以包括在給 予所述藥物組合物的受試者(例如，人)中為抗原性的單糖殘基。所述 非-D-甘露糖單糖殘基可以包括在受試者(例如，人)中非天然產(chǎn)生或觀察到的單糖殘基。所述非-D-甘露糖單糖殘基可以包括D-或L-型單糖。 典型地，所述非-D-甘露糖單糖殘基具有五個(gè)或六個(gè)碳并且任選地在碳 或羥基位置被取代。非-D-甘露糖單糖殘基的實(shí)例可以包括選自以下的 單糖殘基脫氧單糖(例如，鼠李糖)、卣素取代的單糖或卣素取代的 脫氧單糖(例如，6-脫氧-6-氟-D-葡萄糖)、硝基取代的單糖、氨基取代 的單糖(例如，野尻霉素和脫氧野尻霉素)、硫取代的單糖、磷取代的 單糖、和芳基取代的單糖(例如，l-對(duì)硝基苯基-D-鼠李糖)。所述低聚-D-甘露糖部分包括直鏈或分支的低聚-D-甘露糖 低聚糖。在一些實(shí)施方案中，所述低聚-D-甘露糖部分包括約5-12個(gè) 甘露糖殘基(例如，Man9GlcNAc2、 Man8GlcNAc2、 Man7GlcNAc2、 或Man6GlcNAc2)。
0015低聚-D-甘露糖部分的甘露糖殘基可以通過(guò)減少的羥基和 任何其它適合的羥基連接。在一些實(shí)施方案中，低聚-D-甘露糖部分的 甘露糖殘基可以通過(guò)1—2鍵(例如，al+2鍵)、通過(guò)l+3鍵(例如， al^3鍵)、通過(guò)1->6鍵(例如，al+6鍵)、或其組合來(lái)連接。取代的 低聚-D-甘露糖部分的非-D-甘露糖殘基可以通過(guò)任何適合的鍵連接 (例如，通過(guò)al">2鍵、通過(guò)al">3鍵、或通過(guò)al+6鍵，優(yōu)選通過(guò)al"^2所述抗原可以是與低聚-D-甘露糖部分(例如， Man9GlcNAc2)連接的具有十(10)個(gè)以上連續(xù)氨基酸的HIV糖蛋白或 其片段。所述抗原可以包括HIV糖蛋白120(gpl20)或HIV糖蛋白 41(gp41)。在一些實(shí)施方案中，所述HIV糖蛋白是gp120，所述低聚 -D-甘露糖部分是在Asn332或Asn392處作為N-聚糖連接的低聚-D-甘露糖部分。對(duì)gpl20的免疫應(yīng)答通常由對(duì)所述蛋白質(zhì)核心特異性的抗 體控制。在抗體識(shí)別中，N-聯(lián)聚糖通常不起到直接的作用。為了消除 對(duì)所述蛋白質(zhì)部分的免疫應(yīng)答和受到所述蛋白質(zhì)部分的免疫調(diào)節(jié)，可 以將"自體"蛋白質(zhì)用作"非自體"低聚甘露糖聚簇的支架。
00611重組的'自體，糖蛋白的表達(dá)可以提供模擬2G12表位的具 有低聚甘露糖型聚糖的支架。例如，可以修飾重組的'自體，糖蛋白， 以便包括修飾的糖基化(例如，取代的低聚-D-甘露糖部分)。這種方法 的優(yōu)點(diǎn)可以是2G12表位可以存在于免疫沉默的蛋白質(zhì)支架中，而任 何抗體應(yīng)答只是直接針對(duì)取代的低聚-D-甘露糖部分。修飾的糖蛋白和甘露聚糖作為免疫原的用途實(shí)施方案5.實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗原 性糖是D-鼠李糖。實(shí)施方案8.實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的方法，其中將抗原性 糖引入到低聚甘露糖支架中是通過(guò)使用糖苷酶的催化活性進(jìn)行縮合 (反向水解)實(shí)現(xiàn)的。
0077實(shí)施方案9.實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述糖苷 酶是甘露糖苷酶。實(shí)施方案IO.實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述反 向水解通過(guò)具有離去基團(tuán)的供體糖的置換來(lái)幫助完成。
0079實(shí)施方案ll.實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述離
去基團(tuán)是對(duì)硝基酚。
[00801實(shí)施方案12.實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述甘 露糖苷酶是保留酶，所述供體糖在a-端基異構(gòu)構(gòu)型中被取代。[0081實(shí)施方案13.實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述保 留酶是刀豆甘露糖苷酶。
[0082實(shí)施方案14.實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述甘 露糖苷酶是轉(zhuǎn)化酶，所述供體糖在p-端基異構(gòu)構(gòu)型中被取代。
[0083實(shí)施方案15.實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn) 化酶是第I類ER外切甘露糖苷酶。
[0084通過(guò)參考以下實(shí)施例更容易地理解上述描述的本發(fā)明，提 供所述實(shí)施例只是用于例證而不用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例
[0085在一個(gè)實(shí)施例中，將Man9GlcNAc2用外切甘露糖苷酶處 理，裂解中心的D2單糖，得到Man8(B)GlcNAc2(參見(jiàn)圖2)。隨后使 用刀豆甘露糖苷酶(JBM)進(jìn)行反向水解，使用對(duì)硝基苯基-a-D-鼠李糖 作為供體單糖，得到新的化合物RhamlMan8GlcNAc2。這個(gè)反應(yīng)的 進(jìn)展可以通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOFF質(zhì)i普分析來(lái)測(cè)定(圖3)。
[0086本說(shuō)明書中提及的所有的出版物、專利申請(qǐng)、公布的專利、 和其它文獻(xiàn)都被并入本文作為參考，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利申 請(qǐng)、7>布的專利、和其它文獻(xiàn)都凈皮明確地和分別地指明被全文并入本 文作為參考一樣。被并入本文作為參考的本文中所包含的定義在它們 與本文中的定義抵觸的情況下被排除在外。
權(quán)利要求
1.用于誘導(dǎo)針對(duì)人類免疫缺陷病毒1型(HIV)的低聚-D-甘露糖部分的免疫原性應(yīng)答的藥物組合物，所述組合物包括(a)有效量的抗原，所述抗原包括HIV的低聚-D-甘露糖部分，其中所述HIV的低聚-D-甘露糖部分的至少一個(gè)D-甘露糖殘基被至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘基代替；和(b)載體。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括D-甘露糖的結(jié)構(gòu)模擬物。
3. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括在受試者中為抗原性的單糖殘基。
4. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括對(duì)于人來(lái)說(shuō)是非天然的單糖殘基。
5. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括選自以下的單糖殘基脫氧單糖、卣素取代的單糖、硝基取代 的單糖、氨基取代的單糖、硫取代的單糖、和磷取代的單糖。
6. 權(quán)利要求5的組合物，其中所述脫氧單糖包括鼠李糖。
7. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述抗原包括糖蛋白、糖綴合物 支架、或樹(shù)枝型聚合物。
8. 權(quán)利要求7的組合物，其中所述抗原是糖蛋白，其包括作為 N-聚糖連接的取代的低聚-D-甘露糖部分。
9. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述取代的低聚-D-甘露糖部分具 有選自下述的式子<formula>formula see original document page 3</formula>其中"Man，，是甘露糖，"GkNAc"是N-乙酰半乳糖胺，和"X"是 非-D-甘露糖單糖殘基。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中X是鼠李糖。
11. 權(quán)利要求1的組合物，其中HIV的低聚-D-甘露糖部分存在 于HIV糖蛋白120(gpl20)或HIV糖蛋白41(gp41)中。
12. 權(quán)利要求11的組合物，其中HIV的低聚-D-甘露糖部分是在 gpl20的Asn332或Asn392處作為N-聚糖連接的低聚-D-甘露糖部分。
13. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述免疫原性應(yīng)答是包括特異性 地結(jié)合于HIV的低聚-D-甘露糖部分的抗體的產(chǎn)生在內(nèi)的體液應(yīng)答。
14. 誘導(dǎo)針對(duì)包括低聚-D-甘露糖部分的抗原的免疫原性應(yīng)答的 方法，所述方法包括對(duì)有此需要的受試者給予權(quán)利要求1的組合物。
15. 用于誘導(dǎo)針對(duì)HIV的免疫原性應(yīng)答的抗原的制備方法，所述 方法包括(a) 用第一糖苷酶處理HIV低聚-D-甘露糖部分，以除去至少一 個(gè)D-甘露糖殘基；和(b) 使經(jīng)過(guò)處理的低聚-D-甘露糖部分與至少一個(gè)非-D-甘露糖單 糖殘基在第二糖普酶的存在下反應(yīng)，以便提供取代的低聚-D-甘露糖部 分，由此制備用于誘導(dǎo)針對(duì)HIV的免疫原性應(yīng)答的抗原。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖部分存在 于HIV gpl20或HIV gp41中。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖部分存在 于HIV gpl20中。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖部分為 Man9GlcNAc2。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中所述低聚-D-甘露糖部分為連接于 gpl20的Asn332或Asn392的N-聚糖。
20. 權(quán)利要求15的方法，其中所迷第一糖苷酶是甘露糖苷酶。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述甘露糖普酶是外切甘露糖苷
22. 權(quán)利要求15的方法，其中所述第二糖苷酶是甘露糖苷酶。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述甘露糖苷酶是保留酶，并且所 述非-D-甘露糖單糖殘基具有a-端基異構(gòu)構(gòu)型。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述保留酶是刀豆甘露糖苷酶。
25. 權(quán)利要求22的方法，其中所述甘露糖苷酶是轉(zhuǎn)化酶，并且所 述非-D-甘露糖單糖殘基具有p-端基異構(gòu)構(gòu)型。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述轉(zhuǎn)化酶是第I類ER外切甘露 糖苷酶。
27. 權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括D-甘露糖的結(jié)構(gòu)模擬物。
28. 權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘基包括在人類中為抗原性的單糖殘基。
29. 權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括在人類中為非天然的單糖殘基。
30. 權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一個(gè)非-D-甘露糖單糖殘 基包括選自以下的單糖殘基脫氧單糖、卣素取代的單糖、硝基取代 的單糖、氨基取代的單糖、硫取代的單糖、磷取代的單糖、和對(duì)硝基 苯基取代的單糖。
31. 權(quán)利要求15的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖部分是糖 蛋白、糖綴合物支架、或樹(shù)枝型聚合物的一部分。
32. 權(quán)利要求15的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖是糖蛋白 的一部分，所述糖蛋白包括作為N-聚糖連接的低聚-D-甘露糖部分。
33. 權(quán)利要求15的方法，其中所述取代的低聚-D-甘露糖部分具 有選自以下的式子RhamlMan8GlcNAc2、 RhamlMan7GlcNAc2、 和RhamlMan6GlcNAc2。
34. 權(quán)利要求15的方法，其中所述HIV低聚-D-甘露糖部分是 HIV糖蛋白的一部分。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述HIV糖蛋白是gpl20或gp41 。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述HIV糖蛋白是gp120，并且 所述低聚-D-甘露糖部分作為N-聚糖連接在Asn332或Asn392處。
37. 權(quán)利要求15的方法，其中所述取代的低聚-D-甘露糖部分是 RhamlMan8GlcNAc2。
38. 權(quán)利要求15的方法，其中所述非-D-甘露糖單糖殘基包括在 羥基位置的取代。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述取代包括離去基團(tuán)。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述離去基團(tuán)為對(duì)硝基苯基基團(tuán)。
41. 權(quán)利要求15的方法，其中所述非-D-甘露糖單糖殘基包括對(duì) 硝基苯基-a-D-鼠李糖。
42. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法制備的包括取代的低聚-D-甘露糖部 分的抗原。
43. 包括權(quán)利要求42的抗原和載體的藥物組合物。
44. 權(quán)利要求43的組合物，其中所述抗原以有效誘導(dǎo)針對(duì)HIV 的免疫原性應(yīng)答的濃度存在于組合物中。
全文摘要
公開(kāi)了可用于誘導(dǎo)受試者或宿主的免疫原性應(yīng)答的組合物和方法。具體地，所述組合物和方法可以涉及碳水化合物HIV疫苗和涉及通過(guò)將抗原性糖引入到HIV包膜糖蛋白gp120和gp41的聚糖模擬物中來(lái)生產(chǎn)碳水化合物HIV疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61K39/21GK101622010SQ200880006145
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月29日
發(fā)明者C·斯坎倫, D·C·登洛普, F·M·曼薩伯, N·齊茲曼, P·溫特沃斯, R·A·德維克, S·E·涂里 申請(qǐng)人:聯(lián)合治療公司