專利名稱：一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從乙型肝炎病毒(HBV)表面抗體(HBsAb)陽性的人胎盤中提取的、針對(duì)乙型肝炎病毒的特異免疫活性因子，即抗乙肝胎盤特異因子提取物及其制備工藝。
背景技術(shù)：
胎盤又名“紫河車”，其性溫、味甘咸，入肺、肝、腎三經(jīng)，有養(yǎng)血益精的功效，民間常用其煮爛食之，治療虛損、贏瘦、咳喘、盜汗、遺精、陽痿等多種病癥。在現(xiàn)代臨床免疫學(xué)上有增強(qiáng)抵抗力和調(diào)節(jié)免疫力的作用。Y.KaTo曾報(bào)道用HbsAb陽性供者的白細(xì)胞制成特異性轉(zhuǎn)移因子治療慢性乙型肝炎取得較好療效。
人胎盤屬人體的臨時(shí)性器官，簡(jiǎn)單易得，提取工藝簡(jiǎn)單。提取物主要成份為多肽及核苷酸，特異免疫活性明顯，質(zhì)量穩(wěn)定、可控，無毒副作用，臨床效果好。
我國HBV感染較為普遍，據(jù)有關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，HbsAg攜帶者占總?cè)丝跀?shù)的8％。發(fā)病總?cè)藬?shù)達(dá)3000萬人，是危害人民健康的重要疾病。該發(fā)明轉(zhuǎn)換有較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于從HbsAb陽性胎盤中提取一種具有高效價(jià)特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物，作為藥品用于治療乙型肝炎。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物的制備工藝。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟(1)選用HBsAb陽性、丙肝抗體(抗-HCV)、艾滋病抗體(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝指標(biāo)(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均為陰性的正常胎盤；(2)取上述胎盤用膠體磨勻漿；(3)將上述勻漿直接連續(xù)均勻加熱滅活；(4)離心，收集上清液；再超濾收獲濾液即為具有特異免疫活性的原液。
本發(fā)明的具體步驟為1、選用HbsAb陽性，丙肝抗體、(抗-HCV)艾滋病抗體(抗-HIV)，梅毒及其它乙肝標(biāo)(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均為陰性正常的胎盤；2、初加工取胎盤去除筋膜、臍帶，將胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干、剪碎、稱重，置無菌容器內(nèi)，-20℃凍存；3、勻漿調(diào)配取上述胎盤組織解凍，用膠體磨勻漿，加注射用水沖洗膠體磨，沖洗液與組織勻漿混合，再與1.8％氯化鈉液或水混勻，使氯化鈉含量達(dá)0.9％，胎盤組織與水之比為1∶2～5；4、病毒滅活將上述勻漿置60℃±1.0℃，連續(xù)均勻水浴10小時(shí)，滅活；5、離心澄清勻漿滅活后經(jīng)3000～10000rpm，離心30～70min收集上清液；6、超濾將上清液經(jīng)100kD的中空纖維柱超濾，濾出液再用10kD的中空纖維柱超濾，收獲濾液即為具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子原液。
本發(fā)明將所得的原液以生理鹽水或注射用水調(diào)配，并以0.22μm的微孔濾膜除菌，其收獲液為半成品；分裝入瓶即為成品。
上述制備工藝提取的具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物，為澄清液體，其平均非粘附細(xì)胞指數(shù)≥50％；其HPLC指紋圖譜顯示出本提取物在10.0～28min保留時(shí)間內(nèi)應(yīng)有三個(gè)連續(xù)組份；以峰面積計(jì)算，這三個(gè)連續(xù)組份總含量≥90％；其中第三組份以峰面積計(jì)算的含量為55±10％；無分子量大于10kD的成份出現(xiàn)。
采用乙肝標(biāo)志物全陰性胎盤提取的正常胎盤因子為對(duì)照藥物，經(jīng)體內(nèi)及離體實(shí)驗(yàn)均能觀察到用上述工藝提取的抗乙肝胎盤特異因子具有特異及非特異免疫活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(一)對(duì)小鼠免疫器官和免疫細(xì)胞的影響材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Balb/C純系小鼠30只，雄性，隨機(jī)分成3組，分別為特異因子組和HBsAg+特異因子組及生理鹽水對(duì)照組。
2.給藥 按上述分組在注射特異因子前3天一次給小鼠注射HBsAg 1μg，然后每天分別給小鼠腹腔注射不同藥物或生理鹽水，劑量為0.2ml/只，共給七次，第八天實(shí)驗(yàn)。
3.細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 動(dòng)物稱重，眼眶取血，在2小時(shí)內(nèi)計(jì)數(shù)白細(xì)胞并分類，用脂酶(ANAE)染色作T細(xì)胞計(jì)數(shù)。胞漿中有紫紅色顆粒者為ANAE陽性細(xì)胞，即T細(xì)胞。以有1～3個(gè)明顯顆粒者為T-樣細(xì)胞(主要代表CD4)，有彌散細(xì)點(diǎn)者為Thy-樣細(xì)胞(主要代表CD8)。
4.胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的計(jì)算取小鼠胸腺和脾臟，用分析天平稱重。比較各組間胸腺和脾臟的重量及胸腺指數(shù)(胸腺重mg/體重g)和脾指數(shù)(脾重mg/體重g)。
5.實(shí)驗(yàn)和結(jié)果(1)胸腺 特異因子組的胸腺重量和胸腺指數(shù)均較對(duì)照組高，尤以HBsAg+特異因子明顯，而且重量與指數(shù)相一致，見表1。
表1 特異因子對(duì)小鼠胸腺的影響組別 動(dòng)物數(shù)胸腺重(mg) 胸腺指數(shù)生理鹽水 10 49.7±16.9 2.38±0.51特異因子 10 68.5±20.1 2.91±0.71HBsAg+特異因子 10 74.3±18.5*3.43±0.67**P＜0.01(2)脾臟 特異因子和HBsAg+特異因子組的脾重和脾指數(shù)與對(duì)照組無差別，見表2。
表2特異因子對(duì)小鼠脾臟的影響組別動(dòng)物數(shù)脾重(mg) 脾指數(shù)生理鹽水 10 132.4±35.55.57±1.42特異因子 10 133.9±37.75.43±1.66HBsAg+特異因子10 129.1±32.15.55±1.31(3)白細(xì)胞數(shù) 特異因子和HBsAg+特異因子組的白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞均較生理鹽水對(duì)照組高，特別是HBsAg+特異因子組淋巴細(xì)胞增加較明顯，見表3。
表3特異因子對(duì)小鼠血白細(xì)胞數(shù)的影響組別動(dòng)物數(shù)白細(xì)胞數(shù) 淋巴細(xì)胞數(shù)生理鹽水 10 4487±1489 3255±991特異因子 10 5454±1130 3875±1301HBsAg+特異因子10 5577±1356 4773±1008*
*P＜0.01(4)特異因子對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的影響HBsAg+特異因子組的小鼠血中ANAE陽性細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多，而且增多的主要是CD4細(xì)胞，而CD8細(xì)胞無明顯變化。HBsAg+特異因子組的CD4細(xì)胞顯著高于單純特異因子組及生理鹽水組P＜0.01，見表4。
表4小鼠淋巴細(xì)胞亞群的變化組 別 動(dòng)物數(shù)淋巴細(xì)胞總數(shù)陽性數(shù) T-樣 Thy-樣生理鹽水 10 3287±532 2043±3911089±157 955±193特異因子 10 3792±597 2602±4191427±125 1175±224HBsAg+特異因子10 4520±504*3799±437*2844±207*955±210*P＜0.016.結(jié)論小鼠經(jīng)HBsAg刺激，再注射特異因子后，可使外周淋巴細(xì)胞增多，主要是T-樣細(xì)胞增多，特異因子對(duì)免疫小鼠胸腺作用明顯，但脾重及脾指數(shù)則無變化，表明了特異因子的非特異免疫及針對(duì)HBV的特異免疫活性。
(二)特異因子對(duì)特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Balb/C純系小鼠，8周齡，雄性。隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射特異因子，劑量為0.2ml/日/只，連續(xù)7天給藥；對(duì)照組腹腔注射正常胎盤因子和生理鹽水，第10天實(shí)驗(yàn)。
2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)無菌條件下取小鼠脾臟，每組3只小鼠脾臟混合、磨碎，以含有10％小牛血清的培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為8.0×106/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100ul，分別用不同劑量HBsAg或HBsAg和ConA共同刺激，于37℃，5％CO2孵箱溫育。在3、5、7天加入MTT(四甲基偶氮唑蘭)染料，2小時(shí)后加入助溶劑，再溫育12～18小時(shí)后用酶聯(lián)儀測(cè)定，結(jié)果以O(shè)D值表示。
3.抗原刺激劑量的選擇采用經(jīng)HBsAg腹腔免疫三次的小鼠脾細(xì)胞作為致敏的淋巴細(xì)胞，用不同劑量HBsAg刺激進(jìn)行淋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，找出最適抗原刺激劑量用于試驗(yàn)。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)抗原刺激劑量的選擇 選擇不同濃度的HBsAg刺激致敏小鼠脾細(xì)胞5天，結(jié)果見表5。
表5抗原劑量與淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化HbsAg濃度(μg/ml)組 別 0.0 0.1 1.0 2.0實(shí)驗(yàn)組 0.464±0.029 0.473±0.019 0.547±0.038 0.661±0.033*對(duì)照組 0.418±0.037 0.403±0.037 0.431±0.047 0.422±0.021注n＝3*免疫鼠的0.0組與2.0μg組相比P＜0.05結(jié)論免疫小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化在抗原劑量為2.0μg/ml時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而正常鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與刺激原(HBsAg)無關(guān)。因而，選擇2.0μg/ml為實(shí)驗(yàn)用抗原刺激量。
(2)特異因子對(duì)小鼠特異性淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響以2.0μg/ml的HBsAg為刺激原，比較注射特異因子(特異)和注射正常胎盤因子(正常)及生理鹽水(生鹽)小鼠的淋巴細(xì)胞在不同時(shí)間的轉(zhuǎn)化值，并計(jì)算刺激指數(shù)(SI)，結(jié)果見表6。
表6特異因子對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化的影響組別 刺激時(shí)間(天) 對(duì)照組 抗原組 SI生鹽 0.293±0.083 0.308±0.0241.05正常30.342±0.039 0.371±0.0171.08特異 0.377±0.018 0.444±0.0221.17生鹽 0.493±0.032 0.517±0.0421.05正常50.665±0.028 0.735±0.0611.15特異 0.720±0.017 1.494±0.0552.08生鹽 0.422±0.014 0.441±0.0361.05正常70.478±0.021 0.485±0.0231.01特異 0.450±0.031 0.853±0.0421.90注n＝3
結(jié)論注射特異因子的小鼠，其脾細(xì)胞在HBsAg刺激下，5～7天后表現(xiàn)出抗原特異的淋轉(zhuǎn)活性(SI為1.90～2.08)。而注射正常胎盤因子的小鼠，其脾細(xì)胞則無該現(xiàn)象，表明了特異因子的HBV特異免疫活性。
(3)特異因子對(duì)非特異激原(ConA)刺激小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響將注射特異因子和正常胎盤因子的小鼠淋巴細(xì)胞用定量HBsAg與ConA(1μg/ml)共同刺激，孵育3天后觀察結(jié)果，見表7。
表7特異因子對(duì)ConA刺激小鼠淋轉(zhuǎn)的影響HBsAg劑量(μg/ml)組別 0.0 2.0 4.0鹽水組0.691±0.027 0.717±0.032 0.713±0.025正常組0.736±0.042 0.742±0.010 0.745±0.035特異組1.433±0.037*1.451±0.023*1.429±0.027*注n＝3*與正常組及鹽水組比較P＜0.01結(jié)論特異因子使小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)明顯增強(qiáng)，表明其具有較強(qiáng)的非特異免疫活性。特異因子是由HBsAb陽性胎盤提取的一種免疫調(diào)節(jié)劑，小鼠經(jīng)注射后可使其淋巴細(xì)胞再次接觸HBsAg時(shí)，發(fā)生特異性轉(zhuǎn)化增殖反應(yīng)。表明特異因子能將對(duì)HBsAg特異細(xì)胞免疫活性轉(zhuǎn)移給正常受體，使后者獲得抗乙肝病毒的免疫信息。
(三)白細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥方法Balb/C純系小鼠12只，8周齡，雄性，隨機(jī)分為3組，腹腔注射特異因子，劑量為0.2ml/只/日，連續(xù)給藥7天。
2.瓊脂平板的配制取1.0g瓊脂糖加Hank’s液90.0ml，煮沸溶化、待冷至47℃左右，加入已預(yù)熱到40℃的滅活小牛血清10ml，混勻，即約為1％的瓊脂糖，迅速取5ml注入備好的無菌平皿(直徑為5cm)中。待瓊脂凝固后用直徑為3.0mm的打孔器在平皿中打孔。
3.試驗(yàn)方法將小鼠斷頸處死，用新潔爾滅消毒皮膚，打開腹腔，注入Hank’s液與10U/ml的肝素5～10ml，洗吸腹腔巨噬細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞)，1000rpm離心5min，棄上清，用Hank’s液洗2～3次，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1.0×107/ml，冰浴保存。同時(shí)取小鼠脾臟研磨制成1.0×107/ml淋巴細(xì)胞懸液，兩種細(xì)胞懸液等量混合后分成三等份，分別加入等量的培養(yǎng)液極其配制的HbsAg，使HbsAg的濃度分別為0、2、4μg/ml，混勻后加入瓊脂糖孔內(nèi)，每孔10ul，每組3個(gè)復(fù)孔。將瓊脂糖板放入濕盒，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中，孵育24小時(shí)。慢慢浸入沸水中3～5分鐘，取出浸入冷蒸餾水中將瓊脂糖漂洗干凈，溫箱干燥，于鏡下測(cè)量每孔細(xì)胞移動(dòng)的直徑(每孔2～4條直徑的均值)。
4.計(jì)算方法 5.結(jié)果以2.0μg/ml與4.0μg/ml HBsAg刺激無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但二者M(jìn)I均小于40％，結(jié)果見表8。
表8特異因子體內(nèi)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子測(cè)定結(jié)果HBsAg濃度移動(dòng)直徑(mm) MI(％)(μg/ml)06.23±0.404 021.27±0.153 20.3±1.1441.33±0.252 21.4±3.476.結(jié)論正常小鼠腹腔注射特異因子，其淋巴細(xì)胞用HBsAg刺激，可釋放出移動(dòng)抑制因子，使巨噬細(xì)胞的移動(dòng)明顯受抑，表明特異因子具有對(duì)HBV抗原的特異免疫活性。
(四)特異因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞的粘附抑制反應(yīng)1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及給藥方法
Balb/C純系小鼠12只，8周齡，雄性，隨機(jī)分為3組，腹腔注射特異因子，劑量為0.2ml/只/日，連續(xù)給藥7天。
2.方法(1)體內(nèi)給藥法小鼠斷頸處死后消毒，用Hank’s液洗出腹腔巨噬細(xì)胞，再取出脾臟制成單細(xì)胞懸液。用Tris-NH4Cl溶解紅細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將兩種細(xì)胞液等濃度混合后配成1.0×107/ml單細(xì)胞懸液，接種入平底小瓶，每瓶0.1ml；加不同濃度HBsAg0.1ml；最后加1640營(yíng)養(yǎng)液補(bǔ)足到0.4ml，每組設(shè)3個(gè)復(fù)瓶，直立放置在37℃CO2％孵箱內(nèi)。1小時(shí)后，吸取上層細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)未粘附的細(xì)胞。按下列公式計(jì)算白細(xì)胞粘附抑制指數(shù)(LAI) (2)體外過繼法 收集正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及脾細(xì)胞，配成1×107/ml，選擇不同稀釋倍數(shù)的特異因子體外過繼，37℃孵育1小時(shí)后，用培養(yǎng)液洗去特異因子，以2μg/ml的HBsAg刺激，重新懸浮并按(1)方法進(jìn)行。
3.結(jié)果(1)體內(nèi)注射特異因子的小鼠巨噬細(xì)胞粘附抑制結(jié)果 用不同濃度抗原刺激，每劑量3個(gè)復(fù)瓶，以3個(gè)不加抗原瓶的平均值為對(duì)照，選擇1～4μg/ml抗原均可顯示對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞粘附的抑制作用，見表9。
表9 特異因子體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞粘附抑制因子的結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均數(shù)對(duì)照組細(xì)胞均數(shù) LAI細(xì)胞指數(shù)HBsAg(μg/ml)(×104/ml) (×104/ml)1 11.3 4.7 140.42 18.7297.94 9.7 106.4(2)特異因子體外對(duì)產(chǎn)生白細(xì)胞粘附抑制的影響用2倍或4倍稀釋的特異因子體外過繼的淋巴細(xì)胞，在抗原刺激下可以產(chǎn)生粘附抑制作用，抑制指數(shù)大于30。原液可能對(duì)細(xì)胞的活性有影響，結(jié)果見表10。
表10特異因子體外對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞粘附抑制因子的影響實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均數(shù)對(duì)照組細(xì)胞均數(shù)指數(shù)特異因子(×104/ml) (×104/ml)原液37.731.7 18.92×39.39.0 336.74×35.38.3 325.34.結(jié)論結(jié)果表明不論是體內(nèi)還是體外，特異因子均可致敏正常小鼠淋巴細(xì)胞，遇到HBgAg時(shí)產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)。進(jìn)一步表明了特異因子針對(duì)HBV的特異免疫活性。
(五)特異因子對(duì)HBsAg誘生γ-干擾素的影響1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組取Balb/c純系雄性小鼠，8周齡，隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射特異因子，劑量為0.2ml/只/日，對(duì)照組以生理鹽水代替特異因子，連續(xù)給藥7天，第8天試驗(yàn)。
2.γ-干擾素的誘生無菌條件下取脾臟制成8.0×106/ml脾細(xì)胞懸液，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1ml，同時(shí)將1640培養(yǎng)液、ConA(4.0μg/ml)液、HBsAg(4.0μg/ml)液和ConA與HBsAg混合液等四種刺激原各1ml分別加到不同孔內(nèi)，使其刺激原的終濃度分別為0、ConA2.0μg/ml、、HbsAg2.0μg/ml及ConA與HbsAg各2.0μg/ml，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)，于第48h和第72h各收集部分上清液，置于-20℃冰箱內(nèi)，供測(cè)干擾素。
3.γ-干擾素測(cè)定將培養(yǎng)24～48h的L929細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于48孔細(xì)胞板，100μl/孔，分別加入對(duì)倍稀釋的鼠標(biāo)準(zhǔn)γ-干擾素和待測(cè)樣品，100μl/孔。37℃CO2孵箱培養(yǎng)長(zhǎng)成單層后(約2～3h)，用1∶200稀釋VSV病毒攻擊，100μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24～48h，待未加干擾素的對(duì)照孔里細(xì)胞全部死亡后，用結(jié)晶紫溶液染色，肉眼觀察結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)干擾素比較并換算出每毫升待測(cè)樣品中干擾素的單位數(shù)。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)HBsAg誘導(dǎo)對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素 選擇不同刺激原對(duì)鹽水組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激48h和72h，收取上清液測(cè)定其誘生干擾素的含量。結(jié)果顯示HBsAg不能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素，反而抑制ConA誘生干擾素，見表11。
表11 對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞誘生γ-干擾素的水平測(cè)定結(jié)果(u/ml)組別刺激原 1 23 4 x±s P值0 18.513.5 8.2 16.814.3±4.5｝＞0.05誘 HBsAg 6.7 18.2 0.0 12.49.3±7.8生 ConA250.0 250.0124.0 73.7174.4±89.648h｝＜0.05ConA+HBsAg 55.732.0 133.0 125.086.4±50.20 13.56.7 0.0 15.7 9.0±7.1}＞0.05誘 HBsAg 0.0 21.6 7.5 0.0 7.3±10.2生 ConA75.3129.0189.5 153.0136.7±47.972h ｝＜0.05ConA+HBsAg 48.063.6 40.069.0 55.1±13.5(2)HbsAg誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素 選擇不同刺激原對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激48h和72h，收取上清液測(cè)定其誘生干擾素的含量。結(jié)果顯示以HbsAg誘導(dǎo)48h對(duì)ConA誘生細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素?zé)o影響；誘導(dǎo)72h可產(chǎn)生γ-干擾素且明顯高于無刺激原組。HbsAg對(duì)ConA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素具有明顯地協(xié)同作用(表12)。
表12實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞誘生γ-干擾素的水平測(cè)定結(jié)果(u/ml)組別刺激原 1234 x±s P值0 11.7 26.6 112.034.0 23.1±9.5｝＞0.05誘HBsAg 32.4 13.2 21.8 24.7 23.0±7.9生ConA 125.052.7 137.448.9 91.0±46.748h ｝＞0.05ConA+HBsAg96.0 267.140.0 39.6 110.7±107.50 14.9 12.5 5.6 8.0 10.3±4.2}＜0.01誘HBsAg 49.0 22.4 36.7 23.3 32.9±12.6生ConA 31.4 28.7 46.6 22.5 32.3±10.272h }＜0.01ConA+HBsAg95.4 112.0110.0105.4105.7±7.4實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞以HBsAg誘導(dǎo)72h可以產(chǎn)生γ-干擾素，并且HbsAg對(duì)ConA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素具有明顯地協(xié)同作用；而對(duì)照組則不能。也表明了胎盤特異因子針對(duì)HBV的特異免疫活性。
本發(fā)明采用膠體磨胎盤勻漿；并將勻漿直接60±1.0℃連續(xù)均勻加熱滅活，而不影響制品活性；所提取的抗乙肝胎盤特異因子具有特異免疫活性，可用作治療乙肝的藥物。


圖1為本發(fā)明提取物抗乙肝胎盤特異因子的HPLC指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式
1、選用HBsAb陽性，丙肝抗體(抗-HCV)、艾滋病抗體(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝標(biāo)(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均為陰性正常的胎盤；2、初加工取胎盤去除筋膜、臍帶，將胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干、剪碎、稱重，置無菌容器內(nèi)，-20℃凍存；3、勻漿調(diào)配取上述胎盤組織解凍，用膠體磨勻漿，加注射用水沖洗膠體磨，沖洗液與組織勻漿混合，再與1.8％氯化鈉液或水混勻，使氯化鈉含量達(dá)0.9％，胎盤組織與水之比為1∶3；4、病毒滅活將上述勻漿置60℃，連續(xù)均勻水浴10小時(shí)，滅活；
5、離心澄清勻漿滅活后經(jīng)3000-10000rpm，4℃離心60min收集上清液；6、超濾將上清液經(jīng)100kD的中空纖維柱超濾，濾出液再用10kD的中空纖維柱超濾，收獲濾液即為具有特異免疫活性的原液。
將所得的原液以生理鹽水或注射用水調(diào)配，使其符合以下參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，其中PH為6.5～7.5；蛋白質(zhì)反應(yīng)為陰性；多肽含量≥0.5mg/ml；核糖含量≥80μg/ml；特異免疫活性即平均非粘附細(xì)胞指數(shù)≥50％；并以0.22μm的微孔濾膜除菌，其收獲液為半成品；對(duì)半成品進(jìn)行檢定無菌試驗(yàn)為陰性；內(nèi)毒素測(cè)定＜10EU/ml。
將半成品分裝2mL/支，即為成品。每支裝量2ml，多肽含量≥0.5mg/ml。
對(duì)成品進(jìn)行檢定1、外觀應(yīng)為澄明液體，不應(yīng)有異物、渾濁或沉淀。
2、化學(xué)檢定PH為6.5～7.5；蛋白質(zhì)反應(yīng)為陰性；多肽含量≥0.5mg/ml；核糖含量≥80μg/ml。
3、無菌試驗(yàn)合格4、熱原質(zhì)試驗(yàn)家兔注射劑量為3ml/kg體重，合格。
5、異常毒性(小鼠試驗(yàn))合格。
6、HbsAg檢測(cè)陰性。
7、免疫活性平均非粘附細(xì)胞指數(shù)≥50％。
8、HPLC指紋圖譜(見圖1)條件Pack Doil-200(8.0×300mm)色譜柱，以0.1M PB-0.1M Na2SO4-0.05％NaN3pH7.0的緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，流速0.6mL/min，靈敏度0.08AUFS，對(duì)樣品稀釋20倍。
HPLC指紋圖譜顯示①本品在10.0～28min保留時(shí)間內(nèi)定有三個(gè)連續(xù)組份；②3組份總含量≥90％(以峰面積計(jì)算)；③第三組份含量為55±10％(以峰面積計(jì)算)；④沒有出現(xiàn)分子量大于10kD的成份。
權(quán)利要求
1.一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物的制備工藝，其特征在于包括以下步驟(1)選用HBsAb陽性、丙肝抗體(抗-HCV)、艾滋病抗體(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝指標(biāo)(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均為陰性的正常胎盤；(2)取上述胎盤用膠體磨勻漿；(3)將上述勻漿直接連續(xù)均勻加熱滅活；(4)離心澄清收集上清液；再超濾收獲濾液即為具有特異免疫活性的原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物的制備工藝，其特征在于包括以下的具體步驟(1)選用HBsAb陽性，丙肝抗體(抗-HCV)艾滋病抗體(抗-HIV)，梅毒及其它乙肝標(biāo)(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均為陰性的正常胎盤；(2)初加工取胎盤去除筋膜、臍帶，將胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干、剪碎、稱重，置無菌容器內(nèi)，-20℃凍存；(3)勻漿調(diào)配取上述胎盤組織解凍，用膠體磨勻漿，加注射用水，沖洗膠體磨的沖洗液與組織勻漿混合再與1.8％氯化鈉液或注射用水混勻，使氯化鈉含量達(dá)0.9％，胎盤組織與水之比為1∶2～5；(4)病毒滅活將上述勻漿置60℃±1.0℃，連續(xù)均勻水浴10小時(shí)，滅活；(5)離心澄清勻漿滅活后經(jīng)3000-10000rpm，4℃離心50min-70min收集上清液；(6)超濾將上清液經(jīng)100kD的中空纖維柱超濾，濾出液再用10kD的中空纖維柱超濾，收獲濾液即為具有特異免疫活性的原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物的制備工藝，其特征在于以生理鹽水或注射用水調(diào)配所得的原液，以0.22μm的微孔濾膜除菌，其收獲液為半成品；將半成品分批，并分裝入瓶即為成品。
4.權(quán)利要求1所述的制備工藝提取的具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物，其特征在于為澄清液體，其特異免疫活性指標(biāo)平均非粘附細(xì)胞指數(shù)≥50％；其HPLC指紋圖譜顯示出本提取物在10.0-28min保留時(shí)間內(nèi)定有三個(gè)連續(xù)組份；以峰面積計(jì)算，這三個(gè)連續(xù)組份總含量≥90％；其中第三組份以峰面積計(jì)算的含量為55±10％；另外無分子量大于10kD的成份出現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物的制備工藝，(1)選用HbsAb陽性、其它各種指標(biāo)均為陰性的正常胎盤；(2)取上述胎盤用膠體磨勻漿；(3)將上述勻漿直接連續(xù)均勻加熱滅活；(4)離心澄清收集上清液；再超濾收獲濾液即為具有特異免疫活性的原液。本發(fā)明采用膠體磨胎盤勻漿；并將勻漿直接連續(xù)均勻加熱滅活，而不影響制品活性；所提取的抗乙肝胎盤特異因子具有特異免疫活性，可用作治療乙肝的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1554363SQ20031011752
公開日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者劉春莉, 孫學(xué)治 申請(qǐng)人:劉春莉, 孫學(xué)治