專利名稱：從雷公藤多苷中分離雷公藤內酯醇化合物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii)中提取、分離和純化雷公藤內酯醇(triptolide)和相關分子如雷公藤羥內酯(tripdiolide)和16-羥基雷公藤內酯醇的方法。
參考文獻Z.Cheng et al.，“Research on extraction technologh of Tripterygium”，Chinese J.of Pharmaceuticals 21(10)435-436(1990).
S.M.Kupchan et al.，“Triptolide and tripdiolide，novel antileukemicditerpenoid triepoxides from Tripterygium wilfordii”，J.Am.Chem.Soc.94(20)7194-7195(1972).
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C.P.Zhang et al.，“Studies on diterpenoids form leaves ofTripterygium wilfordii”，Acta Pharmaceutica Sinica 28(2)110-115(1993).
背景技術：
經(jīng)證明，從中國藥用植物雷公藤(TW)(Tripterygium wilfordii)衍生出的化合物具有有用的醫(yī)療價值，特別是具有免疫抑制活性和抗癌活性。這些化合物包括雷公藤內酯醇、雷公藤羥內酯和16-羥基雷公藤內酯醇。這些化合物的合成衍生物和前藥也被證明具有醫(yī)療活性，并往往具有改進的藥理學性質。例如，見美國專利Nos.5,468,772(tripterinin化合物及方法)、5,648,376(免疫抑制劑去萜烯化合物)、5,663,335(免疫抑制化合物及方法)、5,759,550(抑制異種移植物排斥的方法)、5,843,452(免疫治療組合物和方法)、5,962,516(免疫抑制化合物及方法)、6,150,539(具有高水溶性的雷公藤內酯醇前藥)、6,294,546(二萜三環(huán)氧化合物作為抗增生藥物的用途)、6,537,984(二萜三環(huán)氧化合物作為抗增生藥物的用途)、6,548,537(具有高水溶性的雷公藤內酯醇前藥)、6,569,893(作為免疫分子和抗癌藥物的雷公藤內酯醇化合物的氨基酸衍生物)、6,599,499(作為抗增生藥物的二萜三環(huán)氧化合物)和6,620,843(利用雷公藤內酯醇前藥進行的抗癌治療)，這些文獻在此通過引用并入本文。
這之前，從植物原料中分離天然化合物典型地需要費力的提取和純化步驟。在Kupchan et al.(1972，1977)描述的方法中，將根原料用乙醇提取，將所得固態(tài)提取物溶解在乙酸乙酯中并用水分層，將乙酸乙酯部分進行硅膠層析。在Cheng et al.(1993)描述的方法中，第一次提取用熱水，然后加入乙醇，過濾，然后除去乙醇，用氯仿分層，進行硅膠層析。Lipsky et al描述的方法(1996)采用氯仿、甲醇和甲苯相繼提取，其中在每一次提取后都除去溶劑，然后先后在氧化鋁和硅膠上進行色層析。Wiedmann et al.(1998)描述的方法中將根原料用回流的乙醇水溶液提取，所得固體提取物在二氯甲烷和水間分層，將二氯甲烷相濃縮并經(jīng)硅膠層析。Ken et al.(2004)描述的方法中將所述的根用乙醇反復提取，所得提取物經(jīng)濃縮并用氯仿反復提取，然后層析純化。
在之前所述的分離方法中，經(jīng)提取步驟提取后通常會得到仍然含有大量不需要的物質的提取物，這些物質必須經(jīng)色層析除去，這就需要投入大量的時間和材料。鑒于這些化合物的醫(yī)療用途，急需更高效率的分離和純化方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及從雷公藤多苷(TW)植物原料中分離雷公藤內酯醇及其相關化合物如雷公藤羥內酯和16-羥基雷公藤內酯醇的改進方法。根據(jù)所述方法，先形成含有這些化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物，然后進行純化。提出物的初始形成是通過(a)用乙醇水溶液提取TW植物原料，優(yōu)選為根原料，并濃縮得到殘余物；和(b)在有機溶劑中形成這個殘余物的漿狀物，所述有機溶劑優(yōu)選為氯化烴溶劑，如氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物；
用水將所述漿狀物分層約10分鐘-10小時；然后除去水。
典型地，步驟(a)的提取包括用回流乙醇進行的三次提取，每一次優(yōu)選每克植物原料用4-5ml乙醇，然后將提取物和并；相對于殘余物的體積，步驟(b)形成的漿狀物包括8-12體積的有機溶劑；相對于漿狀物的體積，步驟(b)的分層使用1/2到2體積的水。
接下來進行的純化包括的步驟為進一步用堿的水溶液分層漿狀物，除去堿的水溶液，并從漿狀物中除去有機溶劑的至少一部分；用親脂性溶劑洗滌殘余物；和從硅膠吸附劑上洗脫殘余物。
在一個實施方案中，該純化在上述步驟(a)和步驟(b)之后還包括(c)用堿的水溶液分層漿狀物，然后除去水溶液，然后再除去有機溶劑，得到另一殘余物；(d)用烴溶劑洗滌所得的另一殘余物，得到固體產(chǎn)物；和(e)用硅膠層析純化所得固體產(chǎn)物。
在另一個實施方案中，所述純化在上述步驟(a)和(b)之后還包括(c)用堿的水溶液分層殘余物的漿狀物，除去水溶液，并除去有機溶劑的一部分，得到濃縮的漿狀物；(d)向濃縮的漿狀物中加入硅膠，加入的量為可有效吸收雷公藤內酯醇和其相關化合物；(e)用烴溶劑洗滌殘余物和硅膠；和(f)從硅膠上洗脫雷公藤內酯醇和其相關化合物。
在另一個實施方案中，在上述步驟(a)和(b)之后還包括(c)從殘余物的漿狀物中除去有機溶劑；(d)用烴溶劑洗滌殘余物；(e)在有機溶劑中形成另一經(jīng)洗滌的殘余物的漿狀物，所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物；(f)用堿的水溶液分層所述另一漿狀物，然后除去水溶液，然后除去有機溶劑，就得到固態(tài)產(chǎn)物；和(g)用硅膠色層析純化所得固態(tài)產(chǎn)物。
在所述堿的水溶液中，所述的堿優(yōu)選為帶有平衡離子(counterion)的水溶性氫氧化物、碳酸鹽或重碳酸鹽，所述平衡離子選自鋰、鈉、鉀、銫、銨或四烷基銨，其中所述烷基優(yōu)選為C1-C4烷基。合適的堿包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。相應地，所述溶液可選自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。堿分層通常要在經(jīng)過一段時間(如，5-20分鐘，典型地為約10分鐘)的攪拌后進行約2天。任選地，在除去堿的水溶液之后，在除去所有或部分有機溶劑之前，將所述的有機溶劑用稀釋的酸性水溶液洗滌。
所述的親脂性溶劑優(yōu)選為烴溶劑，所述的烴溶劑選自具有5-7個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴，或它們的混合物；例子包括己烷和環(huán)己烷。在一個實施方案中，所述的烴溶劑為己烷。硅膠色層析優(yōu)選使用含有非極性溶劑如己烷的流動相，并與另外的極性溶劑如乙酸乙酯結合。
發(fā)明詳述I.綜述本發(fā)明涉及純化含有雷公藤內酯醇及其相關化合物如雷公藤羥內酯和/或16-羥基雷公藤內酯醇的雷公藤多苷植物原料提取物的方法，及分離這些化合物的方法。其它有用的化合物如雷公藤內酯三醇、雷公藤氯內酯醇和雷公藤內酯酮也可被分離出來。
如下面要進一步進行說明的那樣，所述方法包括用堿的水溶液處理初始有機提取物，該處理會在整個過程的開始階段除去大量的不純物質，從而提高產(chǎn)率并減少生產(chǎn)成本。堿處理可有效地從有機TW提取物中除去酸或弱酸化合物(如雷公藤紅素、雷藤萜甲A、雷藤萜甲G、3-羥基齊墩果酸、polpunonic酸、tripterygic酸A和酚類化合物如雷酚萜、山海棠素、雷酚內酯和triptonodial)。堿處理也能通過皂化和/或水解從提取物中除去“油性”不純物。這一步驟已經(jīng)被證明能從提取物中除去不純物質的約70％，包括油性物質，該物質的去除在現(xiàn)有技術中會典型地造成后續(xù)純化成本的大量消耗。
本發(fā)明的方法也包括用親脂溶劑提取的步驟，所述親脂溶劑如環(huán)己烷或類似的烴基溶劑，如己烷、戊烷、石油醚，等等，以從提取物中除去極性較小的不純物。這一步驟進一步簡化了其后色層析純化步驟，否則通過該步驟除去的物質要專門經(jīng)層析除去。
II.提取步驟雷公藤多苷(TW)提取物最初是通過以下步驟形成的(i)用乙醇水溶液提取經(jīng)磨碎的、剁碎的或精細切割的TW植物原料，濃縮所得的液體提取物就得到殘余物；(ii)形成該殘余物在有機溶劑中的漿狀物，所述有機溶劑優(yōu)選為氯化烴溶劑，典型地選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物；(iii)用水分層所得的漿狀物約10分鐘到10小時；和(iv)從漿狀物中除去水。
所述的植物原料包括雷公藤多苷的根、莖和葉；優(yōu)選地，使用根原料。TW植物來自中國的福建省或其它南方省市。TW植物原料通?？稍谥袊硟全@得，或可在美國通過商業(yè)渠道獲得。
優(yōu)選地，乙醇提取(i)包括用回流乙醇進行的三次提取，每一次對每克植物原料用4-5ml乙醇，然后將提取物合并。步驟(ii)中使用的有機溶劑(典型地為氯仿或二氯甲烷)的量通常為步驟(i)所得殘余物體積的8-12倍。分層步驟(iii)通常使用相對于漿狀物體積1/2到2體積的水。
此處使用的兩種不相溶液體混合物的“分層”通常指短時間的攪拌，如約10-30分鐘，更優(yōu)選為10-15分鐘，然后將所述混合物放置一段時間，典型地為幾小時到幾天。在這種情況下，將有機漿狀物和水首先攪拌在一起，即攪拌約10分鐘，然后放置約10分鐘-10小時，優(yōu)選約2小時。
III.純化步驟根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中用堿的水溶液來分層從上述步驟(iv)得到的漿狀物。在這個過程中，將漿狀物和溶液先攪拌在一起，即攪拌約10分鐘，然后放置一段約10分鐘-10天，優(yōu)選約1-4天，更優(yōu)選約2天。所述的堿優(yōu)選為氫氧化物、帶有平衡離子的碳酸鹽或重碳酸鹽，所述平衡離子選自鋰、鈉、鉀、銫或銨。合適的堿包括如NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3和K2CO3。在優(yōu)選的實施方案中，所述堿溶液選自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
除去堿的水溶液，然后任選地用稀釋的酸水溶液如1％HCl洗滌有機溶劑。這樣就將有機溶劑的至少一部分從漿狀物中除去。
然后將所得的可能基本為固體或經(jīng)濃縮的漿狀物的殘余物用親脂溶劑洗滌，隨后從硅膠吸附劑中洗脫。優(yōu)選地，所述親脂溶劑為烴溶劑，優(yōu)選為飽和烴，選自具有5-7個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)烴，或它們的混合物。在一個實施方案中，溶劑為環(huán)己烷。
需要注意的是步驟中的一些變化中(如下所述)，純化過程中某些處理步驟的順序可以改變。
從硅膠吸附劑中洗脫時優(yōu)選使用含有非極性溶劑的溶劑混合物或流動相，所述非極性溶劑如烴、烷基醚，或它們的混合物，該非極性溶劑與另外的極性溶劑結合使用，所述極性溶劑如酯或酮溶劑。所述的非極性溶劑包括如己烷、環(huán)己烷、石油醚，或THF。所述的極性溶劑包括如乙酸乙酯、丙酮，或甲基乙基酮(MEK)。在一個實施方案中，溶劑混合物包括環(huán)己烷和乙酸乙酯。也可以根據(jù)已知的方法采用溶劑梯度。
IV.純化步驟中的變化在一個實施方案中，除去堿的水溶液后，將幾乎所有的有機溶劑都從漿狀物中除去，就得到了固體或基本為固體的殘余物。接著用親脂溶劑洗滌該殘余物就得到固體產(chǎn)物，該固體產(chǎn)物然后經(jīng)硅膠層析純化，如上所述。
在另一個實施方案中，除去堿的水溶液后，僅將有機溶劑的一部分從漿狀物中除去，就得到了濃縮的漿狀物。接著向濃縮的漿狀物中加入硅膠，加入的量可有效吸收雷公藤內酯醇及其相關化合物(如，雷公藤羥內酯和/或16-羥基雷公藤內酯醇)。然后將所得的混合物用親脂溶劑洗滌，并使雷公藤內酯醇及其相關化合物從硅膠上洗脫下來。
在另一個實施方案中，用親脂溶劑提取這一步驟可在堿處理之前進行。相應地，在用堿分層之前，將有機溶劑從上述步驟(iv)得到的漿狀物中除去，所得殘余物用親脂溶劑洗滌。然后再在一種有機溶劑中形成經(jīng)洗滌的殘余物的另外的漿狀物，所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物，然后如上所述將這個漿狀物用堿的水溶液分層10分鐘到10天，優(yōu)選為約2天。將堿的水溶液除去，將幾乎所有的有機溶劑除去，就得到基本為固體的殘余物，然后經(jīng)層析純化。
V.示例性步驟下面是根據(jù)本發(fā)明實施方案進行的示例性分離步驟。該步驟是用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
A.提取1.將干燥的TW生物質(biomass)磨碎成小塊(對于根心和莖來說為1×0.1cm-5×0.5cm(長×直徑)；對于根皮來說尺寸為0.1-2.0cm(薄片狀))。將磨碎的TW生物質用50-95％(優(yōu)選90％)乙醇回流2-5(優(yōu)選3)小時，2-5(優(yōu)選為3)次，對于第一次提取，固體/乙醇的重量/體積比率為1∶4-6(優(yōu)選為1∶5)，而對于接下來的提取，該比率可為1∶3-5(優(yōu)選為1∶4)。
2.將提取物合并，然后減壓下除去乙醇，得到黑色漿狀物。
B.分離(包括堿處理和烴提取)1.將漿狀物懸浮在8-12，優(yōu)選10體積氯仿或二氯乙烷中；2.向懸浮液中以1/2-2體積，優(yōu)選1/2體積的量加入水。將混合物攪拌10分鐘，并放置1-10小時，優(yōu)選為2小時。
3.將水層除去，將1/2-1體積，優(yōu)選1/2體積的0.1-2.5N，優(yōu)選0.5N的NaOH或KOH溶液，或10-15％NaHCO3加入到有機相中。將所得混合物輕微攪拌10分鐘，然后放置1-10天，優(yōu)選4-天，使層分開。
4.除去水相。
5.向有機相中以1/4-1體積，優(yōu)選1/4體積的量加入水。將所得混合物攪拌約10分鐘，放置1-3小時。任選地，所得混合物可在該階段用1％HCl洗滌兩次。
6.將水相除去，向有機相中加入干燥劑如Na2SO4或MgSO4(3g/100ml)。將混合物攪拌過濾除去干燥劑。
7.減壓下徹底除去有機溶劑。
8.向所得的固體中加入環(huán)己烷，攪拌混合物一定時間如10分鐘，以使固體懸浮。
9.通過過濾除去固體，在40-60℃下減壓干燥得到黃色粉末狀中間產(chǎn)物。
C.進一步純化(硅膠層析)1.將所得粉末溶解在1∶1環(huán)己烷∶乙酸乙酯中，濃度為0.5-1.0g/mL，優(yōu)選為0.75g/mL。
2.將溶解的物質裝在預先裝備好的硅膠柱上(200-300目，100×1-20cm)，每1-3g，優(yōu)選每2g粉末狀中間物使用約100g硅膠。
3.使用相同的溶劑混合物以10-30ml/hr的流動速度洗脫產(chǎn)物，優(yōu)選為18ml/小時。收集富含雷公藤內酯醇的組分，用TLC或HPLC檢測。
4.合并富含雷公藤內酯醇的組分，除去溶劑。
典型地，通過調整溫度和/或溶劑(如丙酮或乙酸乙酯)，將雷公藤內酯醇和/或相關化合物從所得的產(chǎn)物中結晶。任選地，將柱層析和/或結晶重復進行。
權利要求
1.一種純化含有雷公藤內酯醇及其相關化合物的雷公藤多苷植物原料的提取物的方法，其中所述提取物是通過下述步驟形成的(a)用乙醇水溶液提取植物原料，并濃縮得到殘余物；和(b)在氯化有機溶劑中形成所述殘余物的漿狀物；用水將所述漿狀物分層約10分鐘-10小時；然后除去水；且所述的純化包括的步驟為進一步用堿的水溶液分層漿狀物，從漿狀物中除去堿的水溶液，和所述有機溶劑的至少一部分；用親脂溶劑洗滌殘余物；和從硅膠吸附劑洗脫所得的殘余物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述純化包括下述步驟(c)用堿的水溶液分層所述漿狀物，然后除去水溶液，接著除去有機溶劑，得到另一殘余物；(d)用烴溶劑洗滌所述的另一殘余物，得到固體產(chǎn)物；和(e)通過硅膠層析純化所得的固體產(chǎn)物。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中將含有環(huán)己烷和乙酸乙酯的流動相用于所述硅膠層析中。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的純化包括以下步驟(c)用堿的水溶液分層所述漿狀物，除去水溶液，除去有機溶劑的一部分，得到濃縮的漿狀物；(d)向所述的濃縮的漿狀物中加入硅膠，加入的量為能有效地吸收雷公藤內酯醇和相關化合物；(e)用烴溶劑洗滌殘余物和硅膠；和(f)從硅膠中洗脫雷公藤內酯醇及相關化合物。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的純化包括以下步驟(c)從殘余物的漿狀物中除去有機溶劑；(d)用烴溶劑洗滌殘余物；(e)在一種有機溶劑中形成經(jīng)洗滌的殘余物的另一漿狀物，所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物；(f)用堿的水溶液分層所述另一漿狀物，然后除去水溶液，然后除去有機溶劑，得到固態(tài)產(chǎn)物；和(g)用硅膠層析純化所得固態(tài)產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(a)的提取包括用回流乙醇進行三次提取，其中，每次每克植物原料用4-5mL乙醇，然后合并提取物。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述氯化有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷或它們的混合物。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(b)形成的漿狀物包括相對于殘余物8-12體積的有機溶劑，且步驟(b)的分層使用相對于漿狀物1/2到2體積的水。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的堿為帶有平衡離子的水溶性氫氧化物、碳酸鹽或重碳酸鹽，所述平衡離子選自鋰、鈉、鉀銫、銨或四烷基銨。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述的堿選自NaOH、KOH、NaHCO3、KHCO3、Na2CO3或K2CO3。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述堿的水溶液選自0.1N-2.5N的NaOH水溶液、0.1N-2.5N的KOH水溶液、10％-15％NaHCO3水溶液或12％-18％KHCO3水溶液。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中用堿的水溶液進行的分層進行了約2天。
13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在除去堿的水溶液之后，在除去有機溶劑至少一部分之前，用稀釋的酸性水溶液洗滌所述有機溶劑。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的烴溶劑選自含有5-7個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)烴，或它們的混合物。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述烴溶劑為環(huán)己烷。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的植物原料包括根原料。
17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的相關化合物包括雷公藤羥內酯和/或16-羥基雷公藤內酯醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及從雷公藤多苷中提取、分離和純化具有醫(yī)療用途的化合物的方法。經(jīng)證明，分別使用堿的水溶液和烴溶劑的提取步驟可提高該方法的效率，并減少了必須經(jīng)層析除去的物質的量。
文檔編號A61K36/36GK1917893SQ200580004463
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月7日 優(yōu)先權日2004年2月9日
發(fā)明者J·安, R·徐, J·H·馬瑟 申請人:美國泛華醫(yī)藥公司