專利名稱：一種表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法，尤其涉及一種在腫瘤中表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞中包含有大量的基因突變，約11000突變/細(xì)胞，因而每一種腫瘤均有其獨(dú)特的抗原肽，具有潛在的引起腫瘤免疫反應(yīng)的功能。然而一般情況下腫瘤細(xì)胞并不能引起足夠的免疫反應(yīng)，其中很重要的一個原因是因?yàn)榭乖f呈細(xì)胞功能不足或不適。因此提高腫瘤抗原的遞呈，可能引起有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
熱休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)家族成員，如HSP 70，HSP 90，具有分子伴侶(chaperon)的功能，輔助新合成蛋白質(zhì)完成二、三級結(jié)構(gòu)。因此分子伴侶結(jié)構(gòu)相對保守，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能有非常重要的作用。同時，它還具有誘導(dǎo)激活抗原遞呈細(xì)胞遞呈抗原，并誘導(dǎo)CD8+或/和CD4+T-細(xì)胞活性的作用。近年來，以HSP作免疫治療在動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用上的研究受到眾多研究者的熱切關(guān)注。
糖調(diào)節(jié)蛋白(Glucose-Regulated Protein)為HSP90家族的一員，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其功能與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊與裝配密切相關(guān)。同時它也具有遞呈抗原肽，刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的功能。糖調(diào)節(jié)蛋白與抗原遞呈細(xì)胞(APC)結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的成熟，一方面其分泌出的I型IFN、IL-12及其它細(xì)胞因子，可激活NK，NKT和γδT細(xì)胞的活性，殺傷或裂解腫瘤細(xì)胞；另一方面，其產(chǎn)生的化學(xué)因子如NO等，也參與腫瘤細(xì)胞的裂解。被殺傷裂解的腫瘤釋放出的腫瘤特異性抗原，又可經(jīng)糖調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)激活的樹突狀細(xì)胞(DC)通過MHC-I路徑激活腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞，引發(fā)適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)。
目前對HSP應(yīng)用于腫瘤免疫治療的研究，一般采用的方法是從腫瘤組織中提取HSP作為疫苗，注射回體內(nèi)。這一方法已取得了較為滿意的效果，有研究表明，以腫瘤自身來源糖調(diào)節(jié)蛋白作疫苗，可在約50％的治療病人中引起抗腫瘤免疫反應(yīng)。但是，從腫瘤組織中提取HSP在實(shí)際應(yīng)用中有較大的局限性。如純化過程對腫瘤抗原肽的丟失，HSP提取量受腫瘤大小的限制。并且針對每種腫瘤提取HSP，費(fèi)用昂貴，不易建立標(biāo)準(zhǔn)化的方案，在臨床應(yīng)用上有一定的難度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種新的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)分泌型的糖調(diào)節(jié)蛋白的方法。
本發(fā)明通過將糖調(diào)節(jié)蛋白基因經(jīng)改造成為可分泌型蛋白，裝載于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，制備腫瘤疫苗，刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫功。同時，在腫瘤中直接注射表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白基因的腺病毒，感染腫瘤細(xì)胞，表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白，并與化療及放射治療相結(jié)合，達(dá)到治療腫瘤的目的。
本發(fā)明采用腺病毒載體表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白，利用腺病毒對腫瘤細(xì)胞感染效率高的特點(diǎn)，獲得較大量的蛋白。同時，本發(fā)明將糖調(diào)節(jié)蛋白基因改造為分泌型，使其能在腫瘤細(xì)胞中合成后分泌到細(xì)胞外，結(jié)合并遞呈腫瘤抗原肽至抗原遞呈細(xì)胞，加上糖調(diào)節(jié)蛋白本身具有的激活機(jī)體先天性免疫功能的作用，因而能取得更好的效果，為有效的治療方案提供基礎(chǔ)。
由于糖調(diào)節(jié)蛋白位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，現(xiàn)有的治療研究多是從腫瘤組織中提取。本發(fā)明采用帶分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白基因的腺病毒感染腫瘤細(xì)胞，使其表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白。一方面糖調(diào)節(jié)蛋白在分泌出細(xì)胞的過程中可攜帶特異性腫瘤抗原，刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫反映；另一方面，糖調(diào)節(jié)蛋白引起機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)，對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用。
本發(fā)明的目的通過下述方法和步驟實(shí)現(xiàn)
1.采用PCR或其他方法分離并克隆糖調(diào)節(jié)蛋白基因，在引物設(shè)計(jì)時去掉編碼蛋白質(zhì)C末端氨基酸KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)的序列。
所述其他分離并克隆糖調(diào)節(jié)蛋白基因的方法還可選用篩選cDNA文庫或人工合成DNA片段的方法。
糖調(diào)節(jié)蛋白為位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)C末端含有將其固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一段氨基酸序列，稱為“錨”(anchor)，即KDEL短肽。本發(fā)明用基因克隆的方法，在克隆基因時，去掉上述一段序列，使細(xì)胞在合成糖調(diào)節(jié)蛋白后分泌到細(xì)胞外。
本發(fā)明采用序列1的人糖調(diào)節(jié)蛋白基因和序列2的小鼠糖調(diào)節(jié)蛋白基因。
擴(kuò)增人的糖調(diào)節(jié)蛋白基因所用引物序列為上游引物5′ACGCGTCGACATCGAAGGGGACTTGAGACTC 3′下游引物5′ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGCTGTAGATTCCTTTGC 3′擴(kuò)增小鼠的糖調(diào)節(jié)蛋白基因所用引物序列為2.將擴(kuò)增的分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白基因插入到包裝復(fù)制缺陷型腺病毒的質(zhì)粒載體中，然后在病毒包裝細(xì)胞中生產(chǎn)可表達(dá)分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白的腺病毒。
3.利用該腺病毒對實(shí)驗(yàn)動物腫瘤組織或細(xì)胞的進(jìn)行以下方式實(shí)驗(yàn)A.將病毒直接注入實(shí)驗(yàn)動物腫瘤組織中；或B.用病毒感染體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞后，經(jīng)致死劑量的放射線照射，或化學(xué)藥物處理，細(xì)胞不再分裂但可表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)胞，經(jīng)腹腔注射，進(jìn)行免疫治療。
4.將上述方案與放療或化療，或其他物理療法相結(jié)合。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.腺病毒對腫瘤細(xì)胞感染效率高，可使分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白蛋白大量表達(dá)。
2.分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白可在分泌出細(xì)胞時遞呈腫瘤抗原，刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；并且其本身也引起機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)，對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用。
3.糖調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)的全身免疫反應(yīng)，不僅對局部腫瘤產(chǎn)生作用，對腫瘤轉(zhuǎn)移也有抑制作用。
圖1.帶分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白基因的復(fù)制缺陷型腺病毒結(jié)構(gòu)示意圖，其中，分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白基因去掉了將蛋白質(zhì)固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的C端KDEL序列，與綠色熒光蛋白(GFP)基因構(gòu)成融合基因，由巨細(xì)胞病毒CMV啟動子控制。
圖2.腺病毒介導(dǎo)的分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白在小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1中的表達(dá)，其中，病毒感染4T1細(xì)胞，24小時后用放射線照射(第0天)，繼續(xù)培養(yǎng)，每天收集培養(yǎng)上清液，用Weastern Blot方法進(jìn)行檢測。陰性對照為AdGFP感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清。陽性對照為AdsGRP-GFP感染的Ad293細(xì)胞裂解液。抗糖調(diào)節(jié)蛋白抗體購自StressGen公司。
圖3.分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白原位表達(dá)引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)，其中，A.4T1細(xì)胞以40MOI的AdsGRP-GFP病毒或AdGFP病毒感染后，按每只小鼠1×105細(xì)胞接種于同源的BALB/c小鼠背部皮下，隔日測量腫瘤體積。與對照組相比，糖調(diào)節(jié)蛋白病毒感染組腫瘤生長明顯滯后(P＜0.05)。
B.來自A中不同處理組腫瘤切片H&E染色結(jié)果，深染的小細(xì)胞提示淋巴細(xì)胞侵潤。
圖4.分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白預(yù)防性接種引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)，4T1細(xì)胞經(jīng)AdsGRP-GFP(治療組))或AdGFP(對照組)病毒感染后，致死劑量照射，按每只5×106細(xì)胞接種于小鼠皮下，經(jīng)4次免疫后，A)于皮下接種1×1074T1細(xì)胞，觀察及測量腫瘤體積。圖中可見，糖調(diào)節(jié)蛋白免疫組可完全防止4T1腫瘤細(xì)胞的生長；B)取脾細(xì)胞體外激活后，用ELISpot方法檢測干擾素IFN-γ分泌，糖調(diào)節(jié)蛋白免疫組明顯高于對照組(P＜0.05)；C)取脾細(xì)胞體外激活后，與4T1細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測抗腫瘤細(xì)胞活性，當(dāng)脾細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例為50∶1以上時，糖調(diào)節(jié)蛋白免疫組脾淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性裂解活性明顯高于對照組(P＜0.01)。
圖5.分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)對小鼠腫瘤的治療作用，將1×105個4T1細(xì)胞接種于小鼠后腿皮下，待腫瘤長至直徑約4～5mm時，按以下方式進(jìn)行治療瘤體內(nèi)注射病毒1×108pfu，3次；腹腔注射照射過的感染病毒的4T1細(xì)胞，5×106，4次；放射線照射腫瘤10Gy，2次。A)測量腫瘤體積，AdsGRP-GEP治療組腫瘤受到明顯抑制。B)Kaplan-Meier生存率曲線，AdsGRP-GEP治療組生存率顯著提高，其中2只(20％)小鼠腫瘤完全治愈。RT放射治療。
圖6分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)對小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用上述不同處理組中，尾靜脈注入1×106熒光素標(biāo)記的4T1細(xì)胞，用XenogenIVIS系統(tǒng)觀察肺部腫瘤生長。A)左為熒光觀察示意圖，上右為小鼠肺部直接解剖證實(shí)腫瘤生長。B)為Kaplan-Meier曲線示意腫瘤在肺部出現(xiàn)情況。糖調(diào)節(jié)蛋白治療組在整個觀察過程中無腫瘤轉(zhuǎn)移。
具體實(shí)施例方式
以下為將本發(fā)明應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動物腫瘤實(shí)驗(yàn)的實(shí)例。在下面的實(shí)例中，本發(fā)明以抗原性弱，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1為模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用同源BALB/c小鼠皮下接種的4T1細(xì)胞腫瘤為模型。
實(shí)施例11.PCR擴(kuò)增小鼠糖調(diào)節(jié)蛋白基因以4T1細(xì)胞DNA為模板，采用以下引物，PCR擴(kuò)增糖調(diào)節(jié)蛋白基因，去掉C端編碼KDEL氨基酸序列(AAA GAT GAA TTA)，稱為分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白(sGRP)。
上游引物5′GCGTCGACACGCACCATGAGGGTCCTGTG 3′下游引物5′ATAGTTTAGCGGCCGCTTACTCTGTAGATTCCTTTTCTG 3′2.PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotI酶切后與從質(zhì)粒pEGFPN1(Clontech)上經(jīng)PCR擴(kuò)增的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因經(jīng)NotI位點(diǎn)連接為融合基因(sGRP-GFP)，這樣可利用熒光蛋白的表達(dá)作為糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的標(biāo)志，便于直接觀察。
3.融合基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和BamHI酶切后，連接到腺病毒包裝質(zhì)粒載體pDC515(Microbix公司)的多克隆位點(diǎn)處。
4.將質(zhì)pDC515-sGRP-GFP與另一輔助質(zhì)粒(helper)pFLP(Microbix公司)用脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Ad293。待細(xì)胞出現(xiàn)病變后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，再次感染細(xì)胞，經(jīng)3輪空斑篩選，選出復(fù)制效率高的腺病毒AdsGRP-GFP。其DNA結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
5.用Ad293細(xì)胞大量擴(kuò)增腺病毒AdsGRP-GFP。氯化銫密度梯度離心分離純化病毒，病毒量達(dá)1～10×1011pfu/ml。
在以下的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對照組病毒均采用帶GFP基因的腺病毒AdGFP。
6.分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的檢測腺病毒按20～40MOI(multiplicity of infection)感染小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1，感染24小時后用熒光顯微鏡即觀察到綠色熒光，提示有分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白合成。用致死劑量100Gy射線照射細(xì)胞，再繼續(xù)培養(yǎng)。每天收集培養(yǎng)上清液，持續(xù)6天。用Western Blot方法檢測糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖2所示。糖調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)從第2天起便達(dá)到高峰，并能穩(wěn)定表達(dá)至少6天。
7.糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)1)腫瘤細(xì)胞原位表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白引起的免疫反應(yīng)用糖調(diào)節(jié)蛋白病毒感染4T1細(xì)胞后，按每只小鼠1×105個細(xì)胞接種于BALB/c小鼠后腿皮下，觀察并測量腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長情況。如圖3A所示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長明顯滯后于對照組(P＜0.05)。其中有2例腫瘤被完全排斥，再次對該2例小鼠接種1×1074T1細(xì)胞，腫瘤仍不能生長。
取接種病毒感染的腫瘤細(xì)胞2周后的腫瘤組織進(jìn)行切片，作HE染色。實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中可見大量小淋巴細(xì)胞侵潤，而對照組中只可見少量淋巴細(xì)胞。(圖3B)2)預(yù)防性接種糖調(diào)節(jié)蛋白引起的保護(hù)性免疫反應(yīng)用病毒感染體外培養(yǎng)的4T1細(xì)胞，經(jīng)100Gy的放射線照射后，按5×106/只注射于小鼠背部皮下，每周一次，共免疫4次。一周后再接種4T1細(xì)胞(1×10７/只)，觀察其生長情況。結(jié)果見圖4A。AdsGRP-GFP感染細(xì)胞免疫的小鼠可以完全抑制4T1細(xì)胞在體內(nèi)生長。
3)糖調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌及特異性細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)經(jīng)上述同樣方式免疫的小鼠，取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子分泌檢測及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖4B，C。糖調(diào)節(jié)蛋白免疫的脾細(xì)胞經(jīng)體外刺激后，干擾素IFN-γ的分泌顯著高于對照組(P＜0.05)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示其對4T1細(xì)胞的特異性裂解明顯高于對照(P＜0.05)。
8.腺病毒介導(dǎo)的分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)對小鼠腫瘤的抑制作用在BALB/c小鼠后腿皮下接種1×105個4T1細(xì)胞，一周以后，待腫瘤長至直徑約3～5mm時，進(jìn)行治療。治療方式包括放射線照射局部腫瘤，向腫瘤組織內(nèi)直接注射病毒(1×108pfu/只)，用病毒感染的細(xì)胞經(jīng)致死劑量射線照射后腹腔注射(5×106細(xì)胞/只)，AdsGRP-GFP免疫治療與放射治療相結(jié)合，明顯抑制腫瘤生長(P＜0.05)，并明顯提高生存率(P＜0.05)，在該組小鼠中，有2只小鼠(20％)完全治愈，無瘤存活1年以上，結(jié)果如圖5A，B所示。
9.腺病毒介導(dǎo)的分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)對小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用為評價AdsGRP-GFP對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，本發(fā)明采用熒光素酶基因標(biāo)記4T1細(xì)胞(4T1-Luc)，使體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長可以用儀器(Xenogen IVIS系統(tǒng))進(jìn)行動態(tài)觀察而不需處死實(shí)驗(yàn)小鼠。在上述不同處理組小鼠中，從尾靜脈注射1×106個4T1-Luc細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞在肺部生長情況。如圖6A，B所示，AdsGRP-GFP實(shí)驗(yàn)組在整個觀察過程中完全沒有肺部腫瘤轉(zhuǎn)移。
SEQUENCE LISTING<110>李川源劉珊玲<120>一種表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法及其應(yīng)用<130>11<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2409<212>DNA<213>人類<400>1atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga60gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa120ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga180ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc240gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc300ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg360actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag420gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt480aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa540gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat600tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatactcag660cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact720ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa780
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權(quán)利要求
1.一種表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征是將糖調(diào)節(jié)蛋白基因改造成可分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白，采用腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)所述糖調(diào)節(jié)蛋白。
2.按權(quán)利要求1所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征是所述的糖調(diào)節(jié)蛋白選自序列1的人糖調(diào)節(jié)蛋白基因和/或序列2的小鼠糖調(diào)節(jié)蛋白基因；所述的可分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白是通過分離并克隆上述糖調(diào)節(jié)蛋白基因，引物設(shè)計(jì)時去掉C端編碼KDEL氨基酸序列AAA GAT GAA TTA，得分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白，擴(kuò)增人的糖調(diào)節(jié)蛋白基因所用引物序列為上游引物5′ACGCGTCGACATCGAAGGGGACTTGAGACTC 3′下游引物5′ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGCTGTAGATTCCTTTGC 3′擴(kuò)增小鼠的糖調(diào)節(jié)蛋白基因所用引物序列為上游引物5′GCGTCGACACGCACCATGAGGGTCCTGTG 3′下游引物5′ATAGTTTAGCGGCCGCTTACTCTGTAGATTCCTTTTCTG 3′。
3.按權(quán)利要求1所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征是所述的腺病毒載體是上述擴(kuò)增的分泌型糖調(diào)節(jié)蛋白基因插入包裝復(fù)制缺陷型腺病毒的質(zhì)粒載體。.4、按權(quán)利要求3所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征是所述的腺病毒載體是綠色熒光蛋白融合基因連接的腺病毒包裝質(zhì)粒載體pDC515-sGRP-GFP。
5.權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法在制備腫瘤疫苗中的用途。
6.權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法與放射治療結(jié)合的用途。
7.權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法與化學(xué)治療結(jié)合的用途。
8.權(quán)利要求1或2或3所述的表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法與熱療結(jié)合的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過將糖調(diào)節(jié)蛋白基因經(jīng)改造成為可分泌型蛋白，裝載于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白，刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，可制備腫瘤疫苗，對腫瘤進(jìn)行免疫治療。同時，在腫瘤中直接注射表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白基因的腺病毒，感染腫瘤細(xì)胞，表達(dá)糖調(diào)節(jié)蛋白，并與化療及放射治療相結(jié)合，達(dá)到治療腫瘤的目的。
文檔編號A61K39/00GK1804037SQ20051011057
公開日2006年7月19日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日
發(fā)明者李川源, 劉珊玲 申請人:李川源, 劉珊玲