專利名稱：提高治療的葡聚糖的制作方法
本申請是2003年7月16日提交的美國系列號No.10/621,027的部分繼續(xù)申請，其內(nèi)容在此以其整體引入本申請中作為參考。
貫穿本申請，引用了各種參考文獻(xiàn)。這些出版物的公開內(nèi)容在此以其整體引入本申請中作為參考，來更全面地描述本發(fā)明所屬的現(xiàn)有技術(shù)狀況。
背景技術(shù)：
該公開涉及將物質(zhì)引入細(xì)胞的方法，該方法包括使含有口服給藥的β-葡聚糖的組合物接觸所述細(xì)胞。本發(fā)明的一方面提供了將物質(zhì)引入患者的方法，包括將有效量的上述組合物給藥于患者?？梢钥诜f送的物質(zhì)包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑和質(zhì)粒。也可以使用其它小分子和化合物。本發(fā)明的另一方面是含有能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的β-葡聚糖的組合物。
源自酵母細(xì)胞壁的葡聚糖可以用于上述組合物中，酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或美國專利No.5,250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法來制備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考?？梢酝ㄟ^美國專利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法來制備適于口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。
在小鼠中測試β-葡聚糖用于腫瘤治療已有近40年了1，2。在日本臨床使用幾種形式的源自蘑菇的β-葡聚糖來治療癌癥，包括PSK(來自云芝(Coriolus versicolor))、香菇多糖和裂裥菌素。日本的隨機(jī)試驗(yàn)中，PSK在一些癌癥試驗(yàn)中胃切除術(shù)3，4，結(jié)直腸手術(shù)5，6和食管切除7來除去原發(fā)性腫瘤后具有適度地，但顯著提高的存活率。在乳癌8，9和白血病10中的結(jié)果較少鼓舞人心。裂裥菌素對患有可行手術(shù)的胃癌11，不宜動手術(shù)的胃癌12，13和宮頸癌14的患者具有提高的存活率。此外，盡管組之間的存活差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的，但是這些提高是適度的。雖然β-葡聚糖沒有得到西方腫瘤學(xué)家的廣泛使用，但含有β-葡聚糖的植物藥物如Reishi和maitake15是美國癌癥患者廣泛使用的，來作為替換/輔助癌癥治療。尋找β-葡聚糖治療作用的這些之前的研究，沒有將治療性單克隆抗體(MoAb)的共同給藥引入作為實(shí)驗(yàn)方案的一部分。存在越來越多的證據(jù)抗體是沉積作為人腫瘤有效淀素的iC3b所必需的。當(dāng)給藥β-葡聚糖而沒有共同給藥MoAb時(shí)，其腫瘤細(xì)胞毒性作用需要在患者中甚至在實(shí)驗(yàn)小鼠中是非?？勺兊奶烊簧煽鼓[瘤抗體的存在。
之前描述了當(dāng)結(jié)合癌癥特異性抗體時(shí)的β-葡聚糖的抗腫瘤作用。之前的研究已經(jīng)顯示了源自大麥或燕麥的口服β-葡聚糖在異種移植模型中可以極大地提高抗腫瘤單克隆抗體的抗腫瘤活性。參見Therapy-Enhancing Glucan，國際申請No.PCT/US02/01276，2002年1月15日申請。Cheung等，口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖與抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD2單克隆抗體3F8在成神經(jīng)細(xì)胞瘤治療中的協(xié)同作用。ClinCancer Res.2002；81217-1223。Cheung NK等，口服給藥的β-葡聚糖提高單克隆抗體的抗腫瘤效果。Cancer Immunol Immunother.2002；51557-564。I期臨床試驗(yàn)支持大麥β-葡聚糖可以提高抗體對轉(zhuǎn)移性癌癥作用的預(yù)測。如前所述的，香菇多糖和昆布多糖，都為(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖，沒有和大麥葡聚糖一樣有效16。此外，在(1→3)，(1→4)-β-D葡聚糖中，小分子量制劑和地衣多糖也沒有效果。β-葡聚糖的分子大小和精細(xì)結(jié)構(gòu)對針對腫瘤的抗體的協(xié)同作用具有實(shí)質(zhì)性影響。
在歐洲和美國，尤其是來自面包酵母的β-葡聚糖作為動物的飼料添加劑、作為人的膳食補(bǔ)充物17、在治療創(chuàng)傷中18和作為皮膚霜劑中的活性成分已經(jīng)使用很長時(shí)間了。β-葡聚糖中的基本結(jié)構(gòu)單位是β(1→3)連接的葡糖基單位。根據(jù)來源和分離的方法，β-葡聚糖具有各種程度的支化和側(cè)鏈中的連接。側(cè)鏈的出現(xiàn)率和鉸鏈結(jié)構(gòu)決定了其免疫調(diào)節(jié)的效果。真菌和酵母來源的β-葡聚糖通常不溶于水中，但是可以通過酸水解或通過將帶電荷的基團(tuán)如-磷酸鹽、-硫酸鹽、-胺、-羧甲基等等引入分子中的衍生作用來制得可溶性的β-葡聚糖19，20。
從面包酵母、釀酒酵母中分離出具有以下分子結(jié)構(gòu)的可溶性葡聚糖 其中(1→3)-β-D-葡聚糖單位形成主鏈，帶有由位于(1→6)-β-D-葡聚糖鉸鏈的(1→3)-β-D-葡聚糖單位構(gòu)成的支鏈。獲得高分子量部分并在腫瘤模型中測試與單克隆抗體的協(xié)同作用。如下詳述的當(dāng)結(jié)合人癌癥特異性單克隆抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)可溶性酵母β-葡聚糖的抗腫瘤效果與可溶性大麥β-葡聚糖的抗腫瘤效果類似。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了將物質(zhì)引入細(xì)胞的方法，該方法包括使含有口服給藥的β-葡聚糖的組合物接觸所述的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是將物質(zhì)引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥于患者?？梢钥诜f送的物質(zhì)包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑和質(zhì)粒。還可以使用其它小分子和化合物。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是含有能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的β-葡聚糖的組合物。


圖1.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療患者轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
在患有多次量化療難醫(yī)治的轉(zhuǎn)移性成神經(jīng)細(xì)胞瘤的患者治療之前和之后進(jìn)行MIBG掃描?；颊呓邮莒o脈內(nèi)抗GD2抗體3F8(10mg/m2/天)，總共10天，在相同的時(shí)間段內(nèi)加口服大麥β-葡聚糖。圖1A顯示了患者的基線MIBG掃描。在股骨、腓骨、骨盆、肋骨、左肩胛骨、右鎖骨、肱骨、顱骨和脊柱中可以看到大范圍的骨轉(zhuǎn)移。心臟、肝臟、胃和結(jié)腸吸收是生理性的。圖1B顯示了用3F8加葡聚糖單循環(huán)治療后的同一患者2個(gè)月后的MIBG掃描。轉(zhuǎn)移的面積得到顯著改善。
圖2.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療SCID小鼠中異種移植的皮下人淋巴瘤。
具有建立的皮下Daudi(n＝9)(圖2A)、Hs445(n＝5)(圖2B)、EBV-衍生的LCL(n＝9)(圖2C)和RPMI 6666(n＝10；數(shù)據(jù)未顯示)異種移植物的SCID小鼠，用200μg靜脈內(nèi)美羅華每周兩次，共8劑(■)，每日通過胃內(nèi)管飼口服給藥400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(△)或美羅華和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的組合(×)治療，或留下未治療(◆)。在y軸上標(biāo)出腫瘤生長的百分比，治療后的天數(shù)開始于x軸上。誤差直方圖表示SEM并僅顯示了美羅華單獨(dú)和組合組。對于所有的異種移植物，只有組合治療與腫瘤生長的降低相關(guān)。與美羅華單獨(dú)相比較，除了美羅華以外接受β-葡聚糖的組中每天腫瘤生長降低，對Daudi是2.0％(95％CI 1.3-2.7％；p＜0.0005)，對EBV-衍生的LCL為0.8％(95％CI 0.4-1.2％；p＜＝0.01)，對Hs445為2.2％(95％C.I.1.2-3.2％；p＝0.0009)，對RPMI 6666為1.8％(95％CI 1.0-2.7％；p＜0.0002；數(shù)據(jù)未顯示)。
圖3.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療SCID小鼠中異種移植的彌散性人淋巴瘤。
將100μl生理鹽水中的5×106個(gè)Daudi(圖3A)或Hs445(圖3B)細(xì)胞靜脈內(nèi)注射(IV)進(jìn)SCID小鼠中。腫瘤植入后10天開始，用200μg靜脈內(nèi)美羅華每周兩次，共8劑(---)，每天通過胃內(nèi)管飼口服給藥400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(…)或美羅華和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的組合(—)來治療小鼠，或留下未治療 腫瘤全身生長，當(dāng)腫瘤細(xì)胞浸潤脊椎管時(shí)小鼠變得癱瘓，導(dǎo)致后腿癱瘓。在癱瘓發(fā)作時(shí)或當(dāng)動物體重減輕10％時(shí)將小鼠處死。各組的Kaplan-Mailer存活曲線顯示于圖2A(Daudi)和2B(Hs445)中。與所有其它治療組(對于Daudi p＜0.0005，對于Hs445 p＝0.001)相比較時(shí)或與美羅華單獨(dú)相比較時(shí)(對于Daudi p＜0.0005，對于Hs445p＝0.01)，用(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖和美羅華組合治療的小鼠具有顯著提高的存活。沒有治療、美羅華單獨(dú)、BG和美羅華+BG組小鼠的中值存活天數(shù)對于Daudi異種移植物各自為27、71、43和124天，而對于Hs445異種移植物各自為12、16、31和243天。
圖4.在大麥β-葡聚糖存在下3G6(抗GD2 IgM抗體)在治療人成神經(jīng)細(xì)胞瘤中的劑量反應(yīng)。
將兩百萬LAN1成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5只小鼠，在腫瘤植入2周后可見腫瘤達(dá)到0.7-0.8cm直徑時(shí)開始治療。3G6組(實(shí)心方塊)通過后眼眶叢用200μg靜脈內(nèi)注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)。3G6+BG組用每周兩次200μgi.v.3G6加每日管飼400μg口服β-葡聚糖(BG)共治療14-18天。以3個(gè)不同的劑量給藥3G6(空心三角每劑8μg，空心方塊40μg，空心圓200μg)。BG組(實(shí)心圓)僅接受400μg口服β-葡聚糖。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然BG單獨(dú)和3G6單獨(dú)顯示出沒有抗腫瘤效果，但BG+200μg 3G6組顯示出高度顯著的3G6劑量依賴性的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖5.在酵母(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖存在下使用3G6(抗GD2IgM抗體)治療人成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
將兩百萬LAN1成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5只小鼠，腫瘤植入2周后可見腫瘤達(dá)到0.7-0.8cm直徑時(shí)開始治療。3G6組(實(shí)心方塊)通過后眼眶叢用200μg靜脈內(nèi)注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)。微粒酵母葡聚糖組(實(shí)心三角)單獨(dú)接受400μg口服微粒酵母葡聚糖。3G6+整個(gè)酵母顆粒(空心菱形)用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg酵母顆粒共治療14-18天。3G6+可溶酵母葡聚糖組用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg可溶酵母葡聚糖共治療14-18天。3G6+顆粒酵母葡聚糖組用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg顆粒酵母葡聚糖共治療14-18天。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然葡聚糖單獨(dú)和3G6單獨(dú)顯示出沒有抗腫瘤效果，但可溶性和顆粒酵母葡聚糖與3G6結(jié)合時(shí)的組顯示出高度顯著的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖6.在大麥和酵母β-葡聚糖存在下使用3F8(抗GD2 IgG抗體)來治療人成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
將兩百萬LAN1成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5只小鼠，腫瘤植入2周后可見腫瘤達(dá)到0.7-0.8cm直徑時(shí)開始治療。3F8組(實(shí)心方塊)通過后眼眶叢用200μg靜脈內(nèi)注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)，共5劑。大麥葡聚糖組(實(shí)心方塊)接受單獨(dú)的400μg大麥葡聚糖。3F8+大麥葡聚糖組(空心菱形)用每周兩次200μg i.v.3F8加每日管飼400μg大麥葡聚糖共治療14-18天。3F8+可溶酵母葡聚糖組(空心方塊)用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg可溶酵母葡聚糖共治療14-18天。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然葡聚糖單獨(dú)和3F8單獨(dú)顯示出沒有抗腫瘤效果，但可溶性和顆粒酵母葡聚糖與3G6結(jié)合時(shí)的組顯示出高度顯著的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖7.使用Rituxan和大麥或酵母β-葡聚糖來治療SCID小鼠中的彌散性人淋巴瘤。
將100μl生理鹽水中的5×106個(gè)Daudi細(xì)胞靜脈注射(IV)入SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當(dāng)腫瘤細(xì)胞浸潤脊椎管時(shí)小鼠變得癱瘓，導(dǎo)致后腿癱瘓。在癱瘓發(fā)作時(shí)或當(dāng)動物體重減輕10％時(shí)將小鼠處死。注射腫瘤細(xì)胞10天后開始治療。每周兩次靜脈注射40μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次，每日通過胃內(nèi)管飼口服給藥400μg葡聚糖29天。每周稱重小鼠并至少每日一次臨床觀察。接受rituxan加大麥葡聚糖或rituxan加酵母可溶性葡聚糖的小鼠具有高度顯著延長的存活(p＜0.05)。
圖8說明了從BD Biosciences(Palo Alto，CA)購買的pEGP-C1載體。
圖9顯示了葡聚糖有助于基因轉(zhuǎn)移進(jìn)單核細(xì)胞中。
圖10說明了較高分子量的β-葡聚糖和基因轉(zhuǎn)移。
圖11說明了循環(huán)單核細(xì)胞中GFP mRNA的存在。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于口服攝取物質(zhì)的組合物，該組合物包括合適量的糖類。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖類是葡聚糖。
當(dāng)口服給藥時(shí)，葡聚糖通過巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞吸收，這些細(xì)胞攜帶這些糖類至骨髓和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)，從那以適當(dāng)加工的形式釋放至包括嗜中性白細(xì)胞的骨髓細(xì)胞上和包括自然殺傷(NK)細(xì)胞的淋巴樣細(xì)胞上。該加工過的葡聚糖結(jié)合這些嗜中性白細(xì)胞和NK細(xì)胞上的CR3，在腫瘤特異性抗體存在下激活它們在腫瘤中的細(xì)胞毒性。
由于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞從消化道攝取葡聚糖(不管是可溶的、凝膠還是顆粒)，因此葡聚糖是用于基因治療的潛在通道。與蛋白質(zhì)不一樣，DNA和質(zhì)粒是相對熱穩(wěn)定的，且可以容易地?fù)饺霚責(zé)岬目扇苄源篼溒暇厶侵?，并?dāng)冷卻至室溫或體溫時(shí)形成凝膠。當(dāng)給小鼠喂食這些DNA-葡聚糖復(fù)合物時(shí)，數(shù)天內(nèi)在外周血單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中可以檢測到報(bào)道基因。更重要的是在攝取這些DNA復(fù)合物數(shù)天后，這些報(bào)道基因在這些細(xì)胞中報(bào)道表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)具有潛在的生物學(xué)含義。葡聚糖和相似的糖類可以是DNA或質(zhì)粒進(jìn)入人體的通道?？诜暇厶强梢允怯糜诟恼奘杉?xì)胞/單核細(xì)胞的遺傳缺陷或給藥遺傳疫苗的便捷載體。
同樣本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識到，可以鑒定能夠和葡聚糖一樣起作用的其它糖類并以相似的方式來使用。使用葡聚糖作為陽性對照可以建立一種容易地篩選這樣的糖類的方法。
葡聚糖包括但不限于β(1-3)和β(1-4)混合鍵的葡聚糖，且葡聚糖具有高分子量。葡聚糖還可以具有β(1-3)和β(1-6)鍵。
本發(fā)明還提供了用于將物質(zhì)引入細(xì)胞的方法，該方法包括使上述組合物接觸所述細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用報(bào)道基因或其它標(biāo)記來測定所述引入的效率。報(bào)道基因或標(biāo)記是分子生物學(xué)領(lǐng)域公知的。此外，本發(fā)明提供了用于將物質(zhì)引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥于患者。
本發(fā)明提供了用于口服遞送一種和多種物質(zhì)的組合物，該組合物包括有效量的口服給藥的β-葡聚糖和一種或多種化療劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合鍵，或1，3-1，6和1，3-1，4混合鍵的混合物。在另一實(shí)施方案中，葡聚糖提高了化療劑或抗癌抗體的功效。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麥、真菌、小麥或海藻。葡聚糖可以具有高分子量。葡聚糖的分子量可以至少為10,000道爾頓。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA、質(zhì)?；蚧焺?。如在此所用的，化療劑包括抗擊動物體內(nèi)疾病的化學(xué)藥品或用于治療各種形式癌癥的藥物。
本發(fā)明提供將物質(zhì)引入細(xì)胞的方法，該方法包括使上述組合物接觸所述細(xì)胞。
可以口服遞送的物質(zhì)包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA和質(zhì)粒。也可以使用其它小分子和化合物。
本發(fā)明提供治療患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥于患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括所述物質(zhì)。
本發(fā)明提供了治療患有遺傳疾病患者的方法，該方法包括將治療有效量的上述組合物和能夠矯正所述遺傳疾病的物質(zhì)給藥于患者。所述物質(zhì)包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA、質(zhì)粒以及其它小分子和化合物。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高I gM抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。源自酵母細(xì)胞壁的葡聚糖可以用于上述組合物中，酵母如釀酒酵母或美國專利No.5,250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考?？梢酝ㄟ^美國專利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法來制備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法來制備適于口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體，或針對癌癥或腫瘤細(xì)胞的抗體，其包括但不限于抗CEA抗體、抗CD20抗體、抗CD25抗體、抗CD22抗體、抗HER2抗體、抗結(jié)合腕蛋白抗體、MoAb M195、Dacluzimab、抗TAG72抗體、R24、赫賽汀、美羅華、528、IgG、IgM、IgA、C225、依帕珠單抗和MoAb 3F8。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是腫瘤結(jié)合抗體。
此外，所述抗體能夠激活補(bǔ)體和/或激活抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體調(diào)節(jié)T-細(xì)胞或B-細(xì)胞的功能。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗體瞄準(zhǔn)表皮生長因子受體、神經(jīng)節(jié)苷脂如GD3和GD2。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗體是有效對抗癌癥的，癌癥包括成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、愛潑斯坦-巴爾相關(guān)的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌、腦瘤、白血病、表皮樣癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌或其它胃腸道癌。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述組合物是在藥物學(xué)上可接受載體中的。
本發(fā)明提供了治療患者的方法，該方法包括將上述組合物給藥于患者。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高疫苗功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗是對抗癌癥或傳染物的，如細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高天然抗體或傳染物功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高宿主免疫力的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發(fā)明提供了含有有效量的能夠提高藥劑預(yù)防組織排異作用的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織是移植的組織或移植的器官或如患有移植物抗宿主疾病的宿主。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述組合物的葡聚糖具有高分子量。葡聚糖的分子量至少為10,000道爾頓。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述葡聚糖源自大麥、燕麥、蘑菇、海藻、真菌、酵母、小麥或苔蘚。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述葡聚糖是對熱處理穩(wěn)定的。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，上述組合物在煮沸3小時(shí)后是穩(wěn)定的。上述組合物的有效劑量是約＞＝25mg/kg/天，一周五天，共2-4周。
具體實(shí)施例方式
通過參考以下實(shí)驗(yàn)詳述將更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于認(rèn)識到詳述的具體實(shí)驗(yàn)僅僅是說明性的，并不意味著限制在此所述的本發(fā)明，本發(fā)明是通過此后的權(quán)利要求來限定的。
實(shí)施例I大麥β-葡聚糖與抗GD2抗體聯(lián)用在4期成神經(jīng)細(xì)胞瘤中的I期研究。
總共研究了24名患者。這些患者全部是兒童或青少年，患有轉(zhuǎn)移至骨、骨髓或遠(yuǎn)端淋巴結(jié)的復(fù)發(fā)或難愈的4期成神經(jīng)細(xì)胞瘤，一些帶有大的軟組織塊。β-葡聚糖具有很好的耐受性，無劑量限制毒性。記錄骨髓疾病(組織學(xué)、MIBG掃描)、軟組織腫瘤(CT)以及生化標(biāo)記(尿VMA和HVA腫瘤標(biāo)記)的抗腫瘤反應(yīng)。腫瘤反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例顯示于圖1A和圖1B中131I-間碘苯甲基胍(MIBG)掃描顯示了3F8加β-葡聚糖的一個(gè)治療循環(huán)后，大范圍轉(zhuǎn)移接近完全的消退。這些反應(yīng)在用3F8單獨(dú)或3F8結(jié)合細(xì)胞因子治療的患有難愈或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性4期NB的患者中是罕見的。迄今為止對3F8最好的反應(yīng)率是II期試驗(yàn)中3F8加GMCSF結(jié)合中33名兒童中的7名(21％)獲得了MIBG改善。相反，62％(21名中13名)可評價(jià)的患者對3F8+β-葡聚糖具有MIBG改善，接近3倍的反應(yīng)率(通過χ2p＝0.008)。此外，患有骨髓疾病的15名患者中，5名獲得了完全的骨髓緩解(30％)，和8名骨髓疾病穩(wěn)定。(參見圖1)。
實(shí)施例II美羅華激活了補(bǔ)體介導(dǎo)的和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，且有效對抗B-細(xì)胞淋巴瘤。β-葡聚糖是結(jié)合CR3凝集素結(jié)構(gòu)域的天然生成葡萄糖聚合物，CR3是在淋巴細(xì)胞中廣泛表達(dá)的受體，激發(fā)其來結(jié)合被抗體激活的iC3b。大麥衍生的(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖(BG)，當(dāng)口服給藥時(shí)(400μg每天×29天)，和低于治療劑量的靜脈內(nèi)美羅華(200μg兩次/周×8劑)在治療CD20-陽性人淋巴瘤中具有強(qiáng)烈的協(xié)同作用。當(dāng)與用美羅華或BG單獨(dú)治療的小鼠相比較時(shí)，異種移植入SCID小鼠中建立的皮下非霍金奇淋巴瘤(NHL)(Daudi和EBV-衍生的B-NHL)或霍金奇疾病(Hs445或RPMI6666)的生長得到了顯著抑制。患有彌散性淋巴瘤(Daudi和Hs445)小鼠的存活顯著提高。治療動物中沒有體重減輕或臨床毒性。該BG加美羅華的治療效果和無毒性支持進(jìn)一步研究其臨床用途。
介紹在數(shù)量日益增加的疾病中有待評價(jià)嵌合抗CD20抗體美羅華。最初證明了對抗復(fù)發(fā)和難愈的濾泡/輕度非霍金奇淋巴瘤的臨床效果后1，已經(jīng)報(bào)道了其它惡性和非惡性B-細(xì)胞疾病中對美羅華的反應(yīng)2。已經(jīng)提出了幾種作用機(jī)理，包括凋亡(apoptotic)途徑的激活3，細(xì)胞因子的詳細(xì)闡明4，宿主補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的激發(fā)5。盡管許多患有B-細(xì)胞疾病的患者對美羅華作出反應(yīng)，但緩解通常是暫時(shí)的6。美羅華治療后高于50％的淋巴瘤復(fù)發(fā)未能第二次作出反應(yīng)7。對美羅華抗藥性的機(jī)理還不清楚，可能包括靶抗原的缺少或丟失8、各個(gè)患者之間藥物動力學(xué)的改變、FcR多態(tài)性9、對補(bǔ)體活性的抗藥性10，或淋巴瘤的內(nèi)在基因表達(dá)11。
β-葡聚糖是葡萄糖的復(fù)合聚合物，帶有對白細(xì)胞上CR3受體的凝集素位點(diǎn)的親和性12。帶有結(jié)合的β-葡聚糖，通過補(bǔ)體激活抗體激發(fā)CR3(CD11b)結(jié)合沉積于細(xì)胞上的iC3b片段。該受體介導(dǎo)白細(xì)胞通過內(nèi)皮的血細(xì)胞滲出并刺激吞噬作用、去粒和腫瘤細(xì)胞毒性。許多真菌在其細(xì)胞表面上呈現(xiàn)β-葡聚糖或β-葡聚糖樣CR3結(jié)合配體。因此，當(dāng)發(fā)生iC3b沉積時(shí)，CD11b和凝集素位點(diǎn)都變成結(jié)合的，并激發(fā)了吞噬作用和呼吸爆發(fā)13。相反，腫瘤細(xì)胞缺少這樣的分子，甚至當(dāng)被覆iC3b時(shí)，通常也不激活CR3且不能激活白細(xì)胞?？扇苄问降摩?葡聚糖結(jié)合凝集素位點(diǎn)并激發(fā)吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞兩者來殺滅iC3b被覆的腫瘤靶14。
(1→3)，(1→4)-D-β-葡聚糖(BG)，一種可溶的、源自大麥的β-葡聚糖比之前研究的(1→3)，(1→6)-β-葡聚糖有利，尤其是當(dāng)口服給藥時(shí)的效果和良好的安全特征15。BG和補(bǔ)體固定抗體3F8對抗人成神經(jīng)細(xì)胞瘤異種移植物的體內(nèi)協(xié)同作用15，16是最近證明的。BG和美羅華對抗淋巴瘤的協(xié)同作用是現(xiàn)在報(bào)道的。
研究設(shè)計(jì)細(xì)胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)購買人伯基特淋巴瘤細(xì)胞系，Daudi，以及霍金奇疾病(HD)細(xì)胞系Hs445和RPMI 6666。使用之前所述的方法建立人HBV-BLCL17。
小鼠在制度允許的準(zhǔn)則和試驗(yàn)方案下飼養(yǎng)Fox Chase ICR SCID小鼠(Taconic，White Plains，NY)。
腫瘤模型通過將懸浮于0.1ml Matrigel(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)中的5×106個(gè)細(xì)胞注射入小鼠的橫腹部中來建立皮下腫瘤。一周測量腫瘤尺寸兩到三次，并以兩個(gè)最大直徑的乘積來計(jì)算腫瘤大小。當(dāng)最大腫瘤尺寸超過20mm時(shí)將小鼠處死。如之前所述的在SCID小鼠中建立彌散性腫瘤模型18。簡言之，將100μl生理鹽水中的5×106個(gè)Daudi或Hs445細(xì)胞靜脈內(nèi)注射入SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當(dāng)腫瘤細(xì)胞浸潤脊髓時(shí)小鼠變得癱瘓，導(dǎo)致后腿癱瘓。癱瘓發(fā)作時(shí)或當(dāng)動物體重減輕10％時(shí)將小鼠處死。
治療方案對于具有皮下腫瘤的小鼠，腫瘤建立(7-8mm直徑)后開始治療。對于彌散性腫瘤模型，注射腫瘤細(xì)胞十天后開始治療。每個(gè)治療方案至少5只小鼠一組，接受美羅華或BG，或兩者都不接受或兩者都接受。每周兩次靜脈內(nèi)注射200μg美羅華(Genetech，San Francisco，CA)，共注射八次，每天通過胃內(nèi)管飼口服給藥400μg BG(Sigma，St.Louis，MO)29天。動物每周稱重，且每天至少臨床觀察一次。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使每只單獨(dú)小鼠的回歸斜率適于腫瘤大小的對數(shù)轉(zhuǎn)化值來計(jì)算腫瘤生長。使用之前所述的用于檢查觀察的方法使用t-測試來比較組之間的斜率19。使用Kaplan-Meier分析來比較患有彌散性疾病小鼠中的存活和通過Fisher’s精確的χ2測試來比較死亡的比例。使用STATA7來進(jìn)行分析。
結(jié)果和討論所有皮下異種移植模型中，注意到美羅華和BG聯(lián)合治療的小鼠中腫瘤生長的顯著降低。用美羅華單獨(dú)治療的小鼠中顯示出腫瘤生長的普通降低，而用BG單獨(dú)治療的或留下未治療的小鼠具有未減輕的腫瘤生長(圖1A、1B、1C)。除了用聯(lián)合治療治療的小鼠之外，所有腫瘤生長都超過20mm大小，小鼠不得不被處死。甚至在停止治療后，聯(lián)合治療的小鼠具有持久穩(wěn)固的腫瘤抑制。腫瘤生長率的多變量線性模型中，使用治療的啞變量，BG和美羅華之間的相互作用是正向的和顯著的，證明是協(xié)同作用。
對于彌散性異種移植，NHL和HD模型兩者的組合和對照組之間的存活存在顯著差異(p＜0.005，按照對數(shù)-等級)(圖2)。用結(jié)合BG和美羅華治療患有彌散性Daudi和Hs445腫瘤的小鼠各自有5/38和2/8小鼠在停止治療后存活＞12個(gè)月，表明了疾病的完全根除。相反，各自組中接受單獨(dú)美羅華的有0/29和0/8小鼠存活(15％對0％存活；χ2＝0.01)。沒有顯著體重減輕或其它明顯的臨床副作用?？梢詮南铝惺聦?shí)推斷出BG被吸收通過免疫熒光可以在固定和滲透的外周血白細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)檢測到BG(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些研究中，BG和美羅華之間的協(xié)同作用是非常顯著的，與CD-20陽性淋巴瘤的類型無關(guān)。Daudi異種移植中與Hs445相比較提高的反應(yīng)可以歸因于前者中較高的CD20表達(dá)(對于Daudi 241和對于Hs445184相比較的平均幾何熒光通道)。當(dāng)通過單細(xì)胞懸浮液的免疫熒光研究或冰凍切片的間接免疫組織化學(xué)來檢查發(fā)展腫瘤的CD20表達(dá)時(shí)，沒有注意到用美羅華、BG單獨(dú)或美羅華+BG治療的組之間的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)，表明了美羅華+BG的治療與CD20的丟失無關(guān)。
其它補(bǔ)體激活單克隆抗體和BG之間的協(xié)同作用15，16是之前證明的?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)將該觀察擴(kuò)展到美羅華。認(rèn)為CDC對于美羅華細(xì)胞毒性是重要的機(jī)理。侵蝕性補(bǔ)體通過人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(mCRP)沒有得到有效抑制。因此，CDC在異種移植模型中是有效的抗腫瘤機(jī)理。然而在研究中，低于治療劑量的抗體，美羅華介導(dǎo)的ADCC和CDC對實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞殺滅是不夠的。由于BG對ADCC沒有直接作用20，該協(xié)同作用是iC3b介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性的最可能結(jié)果。淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)mCRP包括CD46、CD55和CD5910，21。然而，iC3b介導(dǎo)的細(xì)胞毒性沒有受到CD59存在的影響，其僅影響了MAC介導(dǎo)的補(bǔ)體細(xì)胞毒性22。因此，人乳癌腫瘤中，盡管存在mCRP，已經(jīng)證明了iC3b的沉積23，表明了與其對MAC的抑制作用不同，對iC3b介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性的作用不是絕對的。
如果該協(xié)同作用在人中可以安全地再現(xiàn)，iC3b介導(dǎo)的細(xì)胞毒性可以是克服患有B-細(xì)胞惡性腫瘤患者中美羅華抗藥性的潛在策略。由于T或B細(xì)胞都不是這種協(xié)同作用所需要的，因此甚至在免疫缺失的淋巴瘤患者中BG也可能具有潛在的作用。此外，患有自體免疫疾病的患者中，可以用該非毒性口服治療來提高B-細(xì)胞耗竭。相反地，β-葡聚糖可以提高細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6的釋放24，且因?yàn)槊懒_華的急性細(xì)胞毒性還與繼發(fā)于補(bǔ)體激活的細(xì)胞因子釋放相關(guān)25，所以當(dāng)BG和美羅華聯(lián)合使用時(shí)，存在增加毒性的可能性。謹(jǐn)慎地設(shè)計(jì)I期研究是必要的，為了確定在B-細(xì)胞疾病治療中和其它癌癥基于抗體的治療中開發(fā)BG作為美羅華治療輔劑的安全性和有效性。
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實(shí)施例III的參考文獻(xiàn)1.David K，Ollert MW，Juhl H，等通過健康人的天然IgM來阻止無胸腺大鼠中異種移植的實(shí)體人成神經(jīng)細(xì)胞瘤的生長(Growtharrest of solid human neuroblastoma xenografts in nude rats bynatural IgM from healthy humans).Nat Med 2686-9，19962.Ollert MW，David K，Schmitt C，等正常人血清含有對人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞為細(xì)胞毒性的天然IgM抗體(Normal human serumcontains a natural IgM antibody cytotoxic for humanneuroblastoma cells).Proc Natl Acad Sci USA 934498-503，19963.Ollert MW，David K，Vollmert C，等人天然IgM體內(nèi)抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤活性的機(jī)理(Mechanisms of in vivoanti-neuroblatoma activity of human natural IgM).Eur J Cancer331942-8，19974.Engler S，Thiel C，F(xiàn)orster K，等一種反應(yīng)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤臨床表現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)移性動物模型通過天然的、細(xì)胞毒性的人免疫球蛋白M抗體來阻止常位腫瘤的生長(A novel metastatic animalmodel reflecting the clinical appearance of human neuroblastomagrowth arrest of orthotopic tumors by natural，cytotoxic humanimmunoglobulin M antibodies).Cancer Res 612968-73，20015.Erttmann R，Schmitt C，Ollert MW，等健康人和NB患者中對抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤(NB)細(xì)胞的天然生成體液細(xì)胞毒性(Naturallyoccurring humoral cytotoxicity against neuroblastoma(NB)cells in healthy persons and NB patients).Pediatr Hematol Oncol13545-8，19966.Cheung N，Modak S成神經(jīng)細(xì)胞瘤治療中口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖與抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD2單克隆抗體3F8的協(xié)同作用(Oral(1-3)，(1-4)-beta-glucan syngergizes with anti-ganglioside GD2monoclonal antibody 3F8 in the therapy of neuroblastoma).ClinCancer Res 81217-1223，2002實(shí)施例IV源自面包酵母(源自釀酒酵母)的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖對提高癌癥的抗體治療也是有效的皮下植入100μl Matrigel(Sigma)中的(2×106細(xì)胞)LAN-1腫瘤細(xì)胞。用游標(biāo)卡尺每周測量腫瘤尺寸兩到三次，以兩個(gè)最大的垂直直徑的乘積來計(jì)算腫瘤大小。每組4-5只小鼠，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到0.7-0.8cm時(shí)所有治療研究開始。小鼠接受抗體(3F8或3G6)治療(200μg每天)i.v.(通過尾靜脈注射)每周兩次×5劑，和每天胃內(nèi)注射口服β-葡聚糖(400μg每天)共14-18天。(參見圖5和6)源自酵母細(xì)胞壁的葡聚糖可以用于上述組合物中，酵母如釀酒酵母或美國專利No.5.250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考?？梢酝ㄟ^美國專利No.5,233,491和4,810,646中所述的方法來制備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考?？梢酝ㄟ^美國專利No.4,810,646和5,519,009中所述的方法來制備適于口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。也可以使用β-葡聚糖如可溶性β-1，3/1，6葡聚糖或Biotec Pharmacon(Norway)制得的SBG。
在相似的實(shí)驗(yàn)中研究了皮下淋巴瘤模型。在此將懸浮于0.1mlMatrigel(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中的5×106個(gè)細(xì)胞植入小鼠橫腹部中。一周測量腫瘤尺寸兩到三次，以兩個(gè)最大直徑的乘積來計(jì)算腫瘤大小。當(dāng)最大的腫瘤尺寸超過20mm時(shí)小鼠死亡。每周靜脈內(nèi)注射200μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)兩次，共注射八次，每天通過胃內(nèi)管飼口服400μg葡聚糖29天。每周將小鼠稱重并每天至少臨床觀察一次。大麥葡聚糖和酵母葡聚糖的腫瘤響應(yīng)率和獲得完全緩解的小鼠百分比是可比較的。這些系列的皮下腫瘤模型顯示了大分子量(＞10,000道爾頓)可溶性酵母(1→3)，(1→6)β-葡聚糖具有和大麥(1→3)，(1→4)β-葡聚糖同樣有效。此外，酵母葡聚糖的來源和物理形式可以形成顯著差異。
還研究了轉(zhuǎn)移性淋巴瘤模型。如之前所述的在SCID小鼠中建立彌散性腫瘤的模型。(1)簡言之，將100μl生理鹽水中的5×106個(gè)細(xì)胞靜脈內(nèi)(i.v.)注射進(jìn)SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當(dāng)腫瘤細(xì)胞浸潤脊髓時(shí)小鼠變得癱瘓，導(dǎo)致后腿癱瘓。在癱瘓發(fā)作時(shí)或當(dāng)動物體重減輕10％時(shí)，將小鼠處死。腫瘤細(xì)胞注射后十天開始治療。每周兩次靜脈內(nèi)注射40μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次。每日通過胃內(nèi)管飼口服400μg葡聚糖29天。將小鼠每周稱重并至少每天臨床觀察一次。(參見圖7)此外，和美羅華聯(lián)合使用時(shí)，大麥葡聚糖和酵母葡聚糖兩者顯示出類似的作用。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)，大麥葡聚糖和酵母葡聚糖對存活都沒有任何作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例IV的參考文獻(xiàn)1.Wei BR，Ghrtie MA，Vitetta ES聯(lián)合使用免疫毒素和放射性免疫綴合物來治療免疫缺陷小鼠中的彌散性人B-細(xì)胞淋巴瘤(Thecombined use of an immunotoxin and a radioimmunoconjugate totreat disseminated human B-cell lymphoma in immunodeficientmice).Clin Cancer Res 6631-642，2000實(shí)施例V口服給藥的β-葡聚糖與抗腫瘤單克隆抗體一同起作用來介導(dǎo)腫瘤退化的機(jī)理。(1)使用野生型(WT)C57B1/6小鼠對CR3-缺乏(CD11b-/-)或C3-缺乏(C3-/-)C57B1/6小鼠的同系腫瘤(GD2+RMA-S)，MoAb單獨(dú)沒有引起腫瘤退化，而結(jié)合i.v.抗GD2MoAb和口服大麥或酵母β-葡聚糖在WT中引起顯著退化，但在CR3-缺乏小鼠中沒有。此外，用i.v.MoAb和口服β-葡聚糖的聯(lián)合治療在WT小鼠中產(chǎn)生了60-100％的無腫瘤生存者，但是在CR3-缺乏小鼠中僅有0-20％存活。這些實(shí)驗(yàn)證明了對于抗腫瘤效果對白細(xì)胞CR3接近絕對的需要，尤其當(dāng)口服大麥β-葡聚糖和抗腫瘤MoAb一起給藥時(shí)。比較WT對C3-缺乏小鼠的實(shí)驗(yàn)方案相似地顯示出口服β-葡聚糖需要血清C3。當(dāng)用熒光素(BG-F和YG-F)標(biāo)記大麥β-葡聚糖和酵母β-葡聚糖并通過胃內(nèi)注射給藥于小鼠時(shí)，跟隨β-葡聚糖的運(yùn)行。在BG-F或YG-F每日口服給藥的三天內(nèi)，脾和淋巴結(jié)內(nèi)的巨噬細(xì)胞含有熒光素標(biāo)記的β-葡聚糖。4天后，還在骨髓的巨噬細(xì)胞中觀察到Y(jié)G-F和BG-F。當(dāng)比較WT對CR3缺乏小鼠攝取的YG-F和BG-F時(shí)，含有攝入的β-葡聚糖-F的巨噬細(xì)胞的百分比或每個(gè)細(xì)胞中β-葡聚糖-F的量沒有明顯差異。因此，通過胃腸道巨噬細(xì)胞攝取大麥和酵母β-葡聚糖不需要CR3，而可能是由Dectin-1介導(dǎo)的。(2)體外和骨髓中的巨噬細(xì)胞能夠?qū)⒋蠓肿拥拇篼溁蚪湍甫?葡聚糖降解成β-葡聚糖的較小生物活性片段，然后得到釋放。
為了測定巨噬細(xì)胞釋放的可溶性β-葡聚糖-F是否確實(shí)已經(jīng)被骨髓粒細(xì)胞吸收，對已經(jīng)給予了YG-F或BG-F10天的WT或CR3-缺乏小鼠組i.p.注射巰基乙酸鹽介質(zhì)來得出骨髓粒細(xì)胞進(jìn)入腹膜腔的有邊集合。只有WT粒細(xì)胞能夠獲得從巨噬細(xì)胞中釋放的YG-F和BG-F。這些數(shù)據(jù)表明胃腸道巨噬細(xì)胞連續(xù)攝取β-葡聚糖，并將β-葡聚糖短程運(yùn)輸至骨髓，其中釋放可溶性降解片段并通過膜CR3被粒細(xì)胞吸收。當(dāng)從已經(jīng)給予了口服β-葡聚糖的WT和CR3-缺乏小鼠中分離出腹膜粒細(xì)胞時(shí)，在體外只有WT粒細(xì)胞能夠殺滅iC3b被覆的腫瘤細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)顯示了骨髓粒細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞從胃腸道巨噬細(xì)胞獲得膜CR3-結(jié)合的可溶性β-葡聚糖，且該結(jié)合的β-葡聚糖激發(fā)了粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞兩者的CR3，以致當(dāng)它們補(bǔ)充至炎癥部位時(shí)，它們能夠殺滅iC3b被覆的腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例V的參考文獻(xiàn)1.Hong F，Yan J，Baran JT，等口服給藥的β(1，3)-葡聚糖和抗腫瘤單克隆抗體一起作用來介導(dǎo)腫瘤退化和無腫瘤存活的機(jī)理(Mechanism by which orally administered beta(1，3)-glucansfunction with anti-tumor monoclonal antibodies to mediate tumorregression and tumor-free survival).J Exp Med，20042.Herre J，Gordon S，Brown GDDectin-1及其在通過巨噬細(xì)胞識別β-葡聚糖中的作用(Dectin-1 and its role in therecognition of beta-glucans by macrophages).Mol Immunol40869-76，2004實(shí)施例VI可溶性β-葡聚糖可以用作質(zhì)粒的通道口服DNA、RNA和蛋白質(zhì)遞送的主要障礙是胃的酸性和蛋白水解的環(huán)境，以及GALT對蛋白質(zhì)有限的攝取。相信集合淋巴結(jié)和吞噬細(xì)胞中的M細(xì)胞是攝取微粒的主要載體。然而，納微顆粒還可以通過副細(xì)胞(paracellular)機(jī)理1，2和通過轉(zhuǎn)胞吞3進(jìn)入GALT。任一種情況中，使用具有粘膜粘性特性的或?qū)?xì)胞上受體的親和性的顆?？梢蕴岣哂^察到的顆粒攝取。已經(jīng)用于制造納微顆粒的許多聚合物是粘膜粘性的。其中是藻酸鹽、角叉膠和果膠。盡管這些材料通常用作納微顆粒中的核心聚合物，但沒有鑒定出這些聚合物的特異性受體，攝取效率仍然是次優(yōu)的。目前已知Dectin-1是β-葡聚糖的通用受體，并發(fā)現(xiàn)于許多人組織包括單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中。高分子量β-葡聚糖的凝膠特性使RNA、DNA和蛋白質(zhì)得到包埋。由于糖對酸條件具有高度耐受性，因此在穿過胃腸道的過程中酶、蛋白質(zhì)、RNA和DNA仍然得到了保護(hù)。通過β-葡聚糖的高親和性Dectin-1受體，可以將這些物質(zhì)引入吞噬細(xì)胞作為到達(dá)身體其它部分的潛在載體。
從BD Biosciences(Palo Alto，CA)購買pEGF-C1載體(參見圖8)并根據(jù)制造商的說明來制備。pEGF-C1編碼野生型GFP(1-3)的紅色-移位變體，為了較亮的熒光和在哺乳動物細(xì)胞中較高的表達(dá)已經(jīng)將其最佳化。(最大激發(fā)＝488nm；最大發(fā)射＝507nm)。只有當(dāng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)SV40 T-抗原時(shí)，載體主鏈還含有用于在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的SV40起點(diǎn)。該盒上游的細(xì)菌啟動子在大腸桿菌中表達(dá)卡那霉素抗藥性。pEGF-C1主鏈還提供了用于在大腸桿菌中繁殖的pUC復(fù)制起點(diǎn)，和用于單鏈DNA產(chǎn)生的f1起點(diǎn)。
用混入100μl鹽水中的400μg β-葡聚糖(～200,000道爾頓)中的50μg pEGFP-c1質(zhì)粒通過口服管飼來喂養(yǎng)小鼠，而對照小鼠僅給予質(zhì)粒?？诜桂B(yǎng)連續(xù)進(jìn)行3天(第1天、第2天和第3天)。RBC裂解后，通過FCAS分析來分析從尾靜脈取出的50μl血液，記錄單核細(xì)胞群體中表達(dá)GFP細(xì)胞的％。葡聚糖中綠細(xì)胞％對無葡聚糖組(每組n＝4-9只小鼠)的平均比率顯示于圖9中。貫穿實(shí)驗(yàn)的14天，無葡聚糖組中的綠單核細(xì)胞％在背景水平下保持穩(wěn)定。另一方面，口服管飼第1天后，存在一貫較高％的循環(huán)綠單核細(xì)胞，其在約第8天達(dá)到最高。由于通常在小鼠單核細(xì)胞中不發(fā)現(xiàn)GFP，所以在質(zhì)粒進(jìn)入血液中循環(huán)的單核細(xì)胞中之后，綠細(xì)胞的存在和GFP蛋白質(zhì)表達(dá)相一致。
使用較高分子量(～350,000道爾頓)的具有較好膠凝特性的大麥β-葡聚糖重復(fù)實(shí)驗(yàn)。圖10中，看到相似的動力學(xué)，從第8天至第11天持續(xù)的較高百分比的綠細(xì)胞(每組n＝4只小鼠)。
使用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析來測試GFP mRNA的存在。用混入100μl鹽水中的400μg高分子量(～350,000道爾頓)β-葡聚糖中的50μgpRGFP-c1通過口服管飼喂養(yǎng)小鼠，而對照小鼠只給予質(zhì)粒。使用50μl外周血來提取總RNA，使用之前所述方法的改進(jìn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的和定量的實(shí)時(shí)PCR4。保持基因小鼠GAPDH的小鼠用作內(nèi)部對照。使用已知的GFP和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平。分開計(jì)算GFP和GAPDH的轉(zhuǎn)錄單位并以GFP對GAPDH的比例作為結(jié)果。圖11中，平均RNA水平(GFP/GAPDH)表示為葡聚糖對非葡聚糖組(每組n＝4只小鼠)的比例。到第10天檢測到GFP mRNA。
實(shí)施例VI的參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種用于口服吸收物質(zhì)的組合物，該組合物包含合適量的糖類。
2.一種用于口服遞送一種或多種物質(zhì)的組合物，該組合物包含有效量的口服給藥的β-葡聚糖和一種或多種化療劑。
3.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的組合物，其中所述糖類是葡聚糖。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合鍵，或者1，3-1，6和1，3-1，4混合鍵的混合物。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述葡聚糖提高了化療劑或抗癌抗體的功效。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麥、真菌、小麥或海藻。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述葡聚糖具有高分子量。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中所述物質(zhì)是肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA或質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中所述物質(zhì)是化療劑。
10.一種組合物，該組合物包含有效量的能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)或(1→3)，(1→4)β-葡聚糖。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述抗體是對抗癌癥的抗體。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述抗體是結(jié)合腫瘤的抗體。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述抗體能夠激活補(bǔ)體。
全文摘要
本發(fā)明提供了將物質(zhì)引入細(xì)胞的方法，該方法包括使含有口服β－葡聚糖的組合物接觸所述細(xì)胞。本發(fā)明還提供了將物質(zhì)引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥于患者。可以口服遞送的物質(zhì)包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑、質(zhì)粒以及其它小分子和化合物。最后，本發(fā)明提供了含有能夠提高IgM功效的口服β－葡聚糖的組合物，以及所述組合物的不同用途。
文檔編號A61K39/395GK1823092SQ200480020356
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月16日
發(fā)明者N－K·V·陳 申請人:斯隆-凱特林癌癥研究院