專利名稱：酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葡聚糖衍生物，尤其涉及酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法，本發(fā)明進一步涉及酵母β-D-葡聚糖衍生物作為霉菌毒素吸附劑的用途，屬于酵母β-D-葡聚糖衍生物的制備及其應用領域。
背景技術：
霉菌毒素是由多種真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌等，在谷物、牧草、水果及副產(chǎn)品中均可發(fā)現(xiàn)，很多農(nóng)作物和飼料易被霉菌毒素污染，從而對人類食品、飼料工業(yè)和動物生產(chǎn)造成了嚴重的影響。這些真菌毒素能夠?qū)θ撕蛣游锂a(chǎn)生嚴重危害，如致癌、致突變、致畸、 雌激素中毒、神經(jīng)中毒或者降低免疫力等。動物飼料、農(nóng)作物和食品中霉菌毒素的污染日益引起人們的關注。CAST報道稱全球至少有25%的飼料受到霉菌毒素的污染。張丞等對全國各地具有代表性的244份飼料和原料樣品進行霉菌毒素污染情況調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)93%的樣品都受到霉菌毒素的污染，主要以玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬毒素為主，并且出現(xiàn)受多種霉菌毒素同時污染的現(xiàn)象(張丞，劉穎莉.2009年上半年中國飼料和原料中霉菌毒素污染調(diào)查報告.飼料廣角，2010，4:57-59)。王金勇等(2011)對來自全國各地199份樣品進行檢測，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)與之相似的檢測的結果，玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的污染比較常見(王金勇，劉穎莉.2011年第三季度中國飼料和原料中霉菌毒素污染調(diào)查報告[J].今日養(yǎng)豬業(yè)，2012(01))。玉米赤霉烯酮(簡稱為ZEA，又稱F-2毒素)，主要由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌所產(chǎn)生的非類固醇雌激素。這些鐮刀菌都是土壤真菌，在高溫、高濕環(huán)境條件下容易污染農(nóng)作物。最初是從受禾谷鐮刀菌污染的發(fā)霉玉米中分離得到(Stob M, BaldwinR S，Tuite J，et al.1solation of an anabolic, uterotrophic compound from corninfected with Gibberella zeae[J].Nature，1962，196:1318)。ZEA 能夠引發(fā)動物繁殖功能紊亂，還能夠引起人類的高雌激素綜合癥。有報道指出ZEA及其代謝產(chǎn)物對豬、牛和羊起著類雌激素活性的作用，而對于大鼠、小鼠口服或者腹腔注射給予ZEA則會表現(xiàn)出急性毒性。田間和倉儲期間預防和控制霉菌毒素是首要途徑，但是這種污染不能夠完全避免，所以需要應用各種脫霉措施處理霉變飼料。目前有多種脫毒處理方式，主要包括物理脫毒、化學脫毒、生物降解和吸附法等。具體可以根據(jù)不同的污染情況及實際條件，選擇合適的方式、方法降低或避免霉菌毒素的危害，減少經(jīng)濟損失。吸附劑脫毒原理是在體內(nèi)，吸附劑與霉菌毒素結合形成螯合物，這種螯合物經(jīng)過胃腸道時不被吸收而直接排出體外。目前，報道較多的吸附劑主要有無機吸附劑和有機吸附劑，如活性炭、鋁硅酸鹽類和酵母細胞壁類等。酵母或酵母細胞壁對霉菌毒素具有較好的吸附作用。通常作為霉菌毒素吸附劑使用的僅僅是利用酵母細胞壁，而不是整個酵母細胞。大量的試驗證明酵母細胞壁對霉菌毒素具有較好的吸附效果。酵母細胞壁位于酵母細胞的最外層，其厚度約0.05 0.2 μ m，約占細胞干物質(zhì)重的30%左右。酵母多糖是酵母細胞壁的主要成分，由內(nèi)到外依次為葡聚糖層、蛋白質(zhì)層、甘露聚糖層，層與層之間可部分鑲嵌，此外還有幾丁質(zhì)和脂類等。酵母葡聚糖可分為堿不溶、熱醋酸不溶性β -1, 3-D-葡聚糖，約占細胞壁的34% ；堿可溶性β_1，3-D-葡聚糖占細胞壁的20%;堿不溶性、熱醋酸可溶性β-1，6-葡聚糖約占細胞壁的6%;其中堿不溶性、熱醋酸不溶性的β-1，3-葡聚糖所占比例較大。從酵母細胞壁中分離的β_1，3-D-葡聚糖不帶電荷，呈中性，并且有少量i3-l，6-D-的支鏈結構，由于其分子內(nèi)多羥基作用，形成了致密的超螺旋結構，導致β-1，3- -葡聚糖不溶于水，另外其比表面積較小，所以使其應用受到限制。β-D-葡聚糖是一種很好的免疫增強劑，具有多種生物活性。近年來，國外許多研究者發(fā)現(xiàn)β-D-葡聚糖對霉菌毒素有很強的吸附特性，其吸附特性與其高分子結構密切相關(YiannikourisA，F(xiàn)rancois J，Poughon L，Dussap C G., Bertin G., Jeminet G., et al., Adsorptionof zearalenone by β -D-glucans in the Saccharomyces cerevisiae cell wall.Journal of Food Protection, 2004a，67，1195 - 1200 ；Yiannikouris A，F(xiàn)rancoisJjPoughon LjDussap C G.，Bertin G.，Jeminet G.，et al.Alkali extractionof β -D-glucans from Saccharomyces cerevisiae cell wall and study of theiradsorptive properties toward zearalenone.Journal of Agricultural and FoodChemistry, 2004b，52，3666 - 3673)。霉菌毒素的危害和所造成的巨大經(jīng)濟損失已是不容忽視的問題。只有保證飼料及其原料的安全，才能保持飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。如何有效控制或降低霉菌毒素對農(nóng)作物、動物和人類的危害一直是困擾人們的難題。隨著對霉菌毒素污染狀況的重視程度逐漸增加，吸附劑的研究也不斷深入，酵母多糖作為一種新型霉菌毒素吸附劑已經(jīng)也引起人們的關注。由于酵母多糖結構緊密、不溶于水，需要對其結構進行適當?shù)母男蕴幚碓黾悠渌苄浴⑻岣呱锘钚?，從而改善其吸附霉菌毒素的效果?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供酵母β-D-葡聚糖衍生物，相比于酵母β-D-葡聚糖，該酵母β-D-葡聚糖衍生物對于 霉菌毒素的吸附效果有顯著提升；本發(fā)明目的之二是提供一種制備所述酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法；本發(fā)明目的之三是將所述的酵母β-D-葡聚糖衍生物作為毒素吸附劑應用于吸
附霉菌毒素。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:本發(fā)明提供了酵母β-D-葡聚糖衍生物，所述酵母β-D-葡聚糖衍生物由硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基得到；其中，硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51 ;優(yōu)選的，所述取代度是0.29或0.49。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備所述酵母β -D-葡聚糖衍生物的方法，包括以下步驟:將酵母β -D-葡聚糖溶于有機溶劑中，加入酯化劑進行酯化反應，即得。其中，所述的有機溶劑優(yōu)選為二甲基甲酰胺。所述的酯化劑由氯磺酸與吡啶組成；優(yōu)選的，氯磺酸與吡啶的體積比例為1:2-10，更優(yōu)選為1:4-6，最優(yōu)選為1:6。
所述酯化劑可參考下述方法制備得到:在0°C以下溫度條件下，向吡啶中滴加氯磺酸，得到酯化劑。所述的酯化反應溫度優(yōu)選為30_90°C，進一步優(yōu)選為45_75°C，更優(yōu)選為45_60°C，最優(yōu)選為45 °C ；所述的酯化反應時間優(yōu)選為0.5-4小時，更優(yōu)選為1-3小時，最優(yōu)選為2小時。本發(fā)明中所述的霉菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素或伏馬毒素等霉菌毒素，優(yōu)選為玉米赤霉烯酮。影響酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度受酯化條件的影響，即酯化反應的反應條件不同，酯化產(chǎn)物的取代度也會不同。酯化反應過程中的條件有氯磺酸與吡啶的體積比、反應時間和反應溫度。本發(fā)明首先采用單因素試驗考察每個條件的具體水平對取代度的影響。單因素試驗考察發(fā)現(xiàn)，不同氯磺酸與吡啶體積比對取代度的影響，隨著氯磺酸的增力口，取代度逐漸增大，當二者體積比為1:6時取代度達到最高為0.43，然后繼續(xù)增加氯磺酸的量，取代度下降，分析原因可能是隨著氯磺酸的量逐漸增加，使反應處于酸度較高的環(huán)境下，易使多糖鏈發(fā)生斷裂，甚至發(fā)生碳化所致。酯化時間、酯化溫度也出現(xiàn)這一現(xiàn)象。通過單因素試驗條件優(yōu)化，本發(fā)明對酯化反應的單因素初步確定:氯磺酸與吡啶體積比優(yōu)選為1:2-10，更優(yōu)選為1:4-6 ;酯化反應溫度優(yōu)選為30-90°C，進一步優(yōu)選為45_75°C ;酯化反應時間為0.5-4小時，優(yōu)選為1-3小時。在單因素試驗的基礎上，本發(fā)明通過正交試驗進一步發(fā)現(xiàn)影響取代度大小的順序為:氯磺酸與吡啶的體積比 > 酯化時間 > 酯化溫度。

由于酯化劑是由氯磺酸和吡啶反應配制，氯磺酸含量的高低直接決定取代度的大小，但是含量過高會使取代度降低。不同取代度的酵母β-D-葡聚糖硫酸酯對ZEA的體外吸附效果不同。酵母β-D-葡聚糖由于其分子上羥基的氫被磺酸基取代，使得酵母β-D-葡聚糖水溶性增加、分子結構發(fā)生變化。取代度不同說明酵母β-D-葡聚糖分子上羥基的氫被取代的程度不同，所以導致產(chǎn)物的水溶性和分子結構發(fā)生變化，使得致密的三螺旋結構受到破壞，所以對ZEA的吸附效果發(fā)生變化。本發(fā)明通過大量的實驗非常意外的發(fā)現(xiàn)，當酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度是0.49時(取代度是0.49的產(chǎn)物通過以下條件制備得到:氯磺酸與吡啶的體積比為1:6，酯化溫度為45°C，酯化時間為2h，)，產(chǎn)物對ZEA的吸附量達到最高，其吸附量為18.6528ug/mg ;當酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度超過0.49后，酵母β -D-葡聚糖衍生物產(chǎn)物對ZEA的吸附量呈顯著下降的趨勢，說明并不是取代度越高，其對ZEA的吸附力就越強，其原因可能是與酵母β-D-葡聚糖的空間結構相關。此外，當糖硫酸酯的取代度是0.29 (取代度是
0.29的產(chǎn)物通過以下酯化反應條件制備得到:氯磺酸與吡啶的體積比為1:4，酯化溫度為750C，酯化時間為3h)，該取代度的酯化產(chǎn)物對ZEA的吸附量為18.356ug/mg,僅次于取代度為0.49時對ZEA的的吸附量。掃面電鏡對比分析發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾后，酵母β -D-葡聚糖酯化產(chǎn)物物理形態(tài)發(fā)生變化，酵母β-D-葡聚糖硫酸酯的圓形或橢圓形結構消失，顆粒表面結構發(fā)生改變，呈現(xiàn)網(wǎng)格狀，有明顯的溝紋，比表面積增大，吸附能力顯著增強；吸附效果試驗表明，本發(fā)明所制備的酵母β -D-葡聚糖衍生物對玉米赤霉烯酮吸附量達到18.6528 μ g/mg,非常顯著的高于酵母細胞壁以及酵母β -D-葡聚糖對玉米赤霉烯酮的吸附量。


圖1硫酸基的標準曲線。圖2氯磺酸與吡啶不同體積比對取代度的影響。圖3酯化溫度對取代度的影響。圖4酯化時間對取代度的影響。圖5酵母β -葡聚糖硫酸酯樣品的紅外光譜圖。圖6酵母β -D-葡聚糖硫酸酯化改性前后掃描電鏡圖。圖7不同取代度的酵母β -D-葡聚糖硫酸酯對ZEA吸附效果。圖8三種不同產(chǎn)品體外吸附ZEA的效果比較。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。試劑及通用的實驗方法1.主要試劑及材料:三氯乙酸、硫酸鉀、吡啶、二甲基甲酰胺、氫氧化鈉、苯酚、氯磺酸、明膠、氯化鋇、鹽酸、色譜級甲醇等均為國產(chǎn)分析純(上海國藥國藥集團化學試劑有限公司)，玉米赤霉烯酮(ZEA)標準品購`自sigma公司，玉米赤霉烯酮試劑盒購自安德珍有限責任公司。2.氯磺酸-吡啶法制備酵母β -D-葡聚糖硫酸酯酯化劑的制備:將附有冷凝管、攪拌裝置和測定溫度裝置的四頸燒瓶置于鹽水冰浴中，加入吡唆，攪拌，使之冷卻到0°c以下，然后用恒壓滴液漏斗慢慢加入氯磺酸，在30min左右滴加完畢，燒瓶出現(xiàn)大量淡黃色固體，即得到酯化劑。稱取一定量的酵母β-D-葡聚糖溶于二甲基甲酰胺中，室溫下充分攪拌懸浮，然后加入到制備好的酯化劑中。迅速將四頸燒瓶移入熱水浴中，恒溫攪拌，反應一定時間，再移置冰水浴中冷卻至室溫，將反應液傾入冰水中，用2.5%Na0H中和到pH7.5左右，加入無水乙醇1:3 (V/V)，析出淡黃色沉淀，抽濾收集沉淀。將沉淀溶于水，用透析袋流水透析48h，蒸餾水透析24h。透析液冷凍干燥，得到淡黃色粉末。3.酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的定量與定性分析方法3.1硫酸基含量的測定3.1.1硫酸鋇比濁法基本原理是:通過酸水解從糖復合物中釋放出硫酸基，生成硫酸鋇，使其在氯化鋇明膠溶液中渾濁，用紫外分光光度計測定。測定方法:稱取硫酸多糖IOmg,加入lmol/L鹽酸5ml,真空封管，100°C水解6h,按標準品的測定方法測定其吸光值。3.1.2標準曲線的繪制精確稱取干燥的硫酸鉀準確配制成0.6mg/ml的溶液。分別取上述標準硫酸鹽溶液 0.04ml、0.08ml、0.12ml、0.16ml,0.2ml，加 lmol/L HCl 補至 0.2ml，依次加入 3.8ml 三氯乙酸。Iml氯化鋇-明膠溶液，混合室溫放置15min,以lmol/L HCl作為參比,360nm測定吸光值；以硫酸基的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標建立線性回歸方程，繪制標準曲線。標準曲線見圖1 ;圖1表明，硫酸基含量與吸光度呈良好的線性關系，其相關系數(shù)為0.9995，標準曲線的回歸方程為y=0.0031x - 0.0384。3.1.3硫酸取代度計算酵母β-D-葡聚糖硫酸酯中的硫酸基含量通常用取代度(degree of sulfur,DS)來表示。DS是指酵母β-D-葡聚糖硫酸酯上每個葡萄糖殘基中含有的硫酸基團的平均個數(shù)。計算公式如下:

權利要求
1.酵母β-D-葡聚糖衍生物，其特征在于:通過硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基獲得；其中，硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51。
2.按照權利要求1所述的酵母β-D-葡聚糖衍生物，其特征在于:硫酸基的取代度是.0.29 或 0.49。
3.一種制備權利要求1或2所述酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法，其特征在于，包括以下步驟:將酵母β -D-葡聚糖溶于有機溶劑中，加入酯化劑進行酯化反應，即得。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:所述的有機溶劑為二甲基甲酰胺。
5.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:所述酯化劑按照以下方法制備得到:在(TC以下溫度條件下，向吡啶中滴加氯磺酸得到酯化劑。
6.按照權利要求3或5所述的方法，其特征在于:所述的酯化劑由氯磺酸與吡啶組成。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于:氯磺酸與吡啶的體積比例為1:2-10 ;優(yōu)選為1:4-6 ;更優(yōu)選為1:6。
8.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:所述的酯化反應溫度為30-90°C;優(yōu)選為.45-750C ;更優(yōu)選為45-60°C ;最優(yōu)選為45°C。
9.按照權利要求3所述的方法，其特征在于:所述的酯化反應時間為0.5-4小時；優(yōu)選為1-3小時；最優(yōu)選為2小時。
10.權利要求1或2所述酵母β-D-葡聚糖衍生物作為霉菌毒素吸附劑的用途；優(yōu)選的，所述霉菌毒素包括玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素或伏馬毒素。
全文摘要
本發(fā)明公開了酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法和用途。所述酵母β-D-葡聚糖衍生物由硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基得到,其中，硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51。本發(fā)明進一步提供了制備酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法，包括將酵母β-D-葡聚糖溶于有機溶劑中，加入酯化劑進行酯化反應，即得。掃面電鏡對比分析發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾后的酵母β-D-葡聚糖衍生物呈現(xiàn)網(wǎng)格狀，有明顯溝紋，比表面積明顯增大，吸附能力顯著增強。吸附效果試驗表明，本發(fā)明酵母β-D-葡聚糖衍生物對玉米赤霉烯酮吸附量達到18.6528μg/mg，顯著高于酵母細胞壁以及酵母β-D-葡聚糖對玉米赤霉烯酮的吸附量。
文檔編號C08B37/02GK103183741SQ20131009105
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權日2013年3月21日
發(fā)明者馬立保, 榮迪, 胡曉芬, 吳艷麗 申請人:馬立保