專利名稱：帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物可吸收合成非織造織物、該非織造織物的制造方法以及包含所述非織造織物的止血物，所述非織造織物的特點在于其中帶有凝血酶作為有效成分。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療領(lǐng)域，止血處理非常重要。當(dāng)活體中的血管被損壞后，各種凝血因子在該局部區(qū)域被激活并且纖維蛋白最終形成從而止血。在這個過程中，凝血酶是最重要的酶，其作用于纖維蛋白原從而將其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。纖維蛋白原本身，雖然存在于血液中，但沒有止血功能。要依靠凝血酶的作用才能發(fā)揮止血功能。也就是說，在活體的止血反應(yīng)中凝血酶起最重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
(本發(fā)明要解決的技術(shù)問題)常規(guī)凝血酶制劑是液體或粉末形式的，因而當(dāng)施用于流血區(qū)域時經(jīng)常被沖走，導(dǎo)致凝血酶的止血效果不充分。為了消除這個缺點，已有各種關(guān)于在生物可吸收材料上帶有凝血酶的片材的報道(例如WO90/13320和日本專利公告No.61/59737)。這些片材中的一種是將來自血液的凝血酶固定在由明膠制成的片材上得到的片材。但是如下面的實施例所示，該片材沒有展示出充分的止血效果，并且由于制造困難以及實際使用時的問題，該片材距離實際使用還有很遠的距離。存在其中牛明膠與牛凝血酶混在一起的凝膠形式的止血劑，但這類止血劑也是不利的，因為有感染例如BSE的危險并且使用時不便壓縮。
另一類止血劑是其中凝血酶與其它凝血因子相結(jié)合的纖維蛋白粘合劑。纖維蛋白粘合劑，主要包括凝血酶和纖維蛋白原，是生物組織粘合劑，其通過凝血酶的作用利用纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)變，并且廣泛應(yīng)用于臨床領(lǐng)域中的粘合、止血和封合用途。但是，對在例如外科手術(shù)中的用途，通過溶解制備凝血酶溶液和纖維蛋白原溶液需要時間，因而對于使用特別是緊急情況非常不方便。
考慮到這些不方便，通過使用片材直接按壓到流血區(qū)域而施用的纖維蛋白粘合劑也已經(jīng)實際應(yīng)用。但是，目前可用的片材類型的粘合劑并不理想，因為其包括作為基本材料的馬膠原蛋白和得自牛的凝血酶，也就是得自非人動物種的材料，因而有可能引出抗異種蛋白的抗體以及人畜共患性感染如朊病毒病的危險。所以，目前可用的局部止血劑在操作和安全方面并不令人滿意地方便。
為了解決上述問題，需要含有得自人并且沒有感染性試劑的凝血因子的止血物，所述止血物是由嚴格挑選并設(shè)計為具備完全的止血效果并且對活體安全的材料制成的片材形式。
(解決問題的方法)考慮到上述的各種問題，發(fā)明人進行了深入細致的研究并完成了關(guān)于局部止血物的本發(fā)明。因而，從各種生物可吸收材料中挑選以非織造織物形式加工的生物可吸收合成材料，本發(fā)明涉及帶有凝血酶作為止血有效成分的生物可吸收合成非織造織物、制造該非織造織物的方法以及含有所述非織造織物的止血物。
(比現(xiàn)有技術(shù)更加有效的效果)本發(fā)明的帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物具有如下所列的優(yōu)異性質(zhì)，因而是理想的局部止血物。
(1)具有優(yōu)異的止血效果；(2)在緊急情況下容易處理；(3)安全性高；(4)隨時間推移被吸收；(5)表現(xiàn)出優(yōu)異的彈性和柔軟性；(6)能夠?qū)掗焻^(qū)域進行止血；(7)引起輕微的或沒有發(fā)炎反應(yīng)。
因此，本發(fā)明提供了包含生物可吸收合成非織造織物的止血物，該止血物允許在各種不同領(lǐng)域手術(shù)中對需要組織封合的外科手術(shù)進行安全止血。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明所使用的生物可吸收合成非織造織物可以是由生物可吸收合成纖維制成的任意的非織造織物。本發(fā)明的非織造織物優(yōu)選具有適當(dāng)?shù)娜彳浶砸源_保其肯定能夠覆蓋任何損傷區(qū)域。例如，能夠形成這樣的非織造織物的合成纖維包括聚乙醇酸、聚乳酸或乙醇酸和乳酸的共聚物等等，這些合成纖維可在加工成非織造織物后使用。在這些非織造織物之中，由聚乙醇酸通過加工成非織造織物而制備的生物可吸收合成非織造織物是用于本發(fā)明目的最優(yōu)選的材料。
本發(fā)明的非織造織物可以是任意形狀，但考慮到對不同應(yīng)用的通用性優(yōu)選片狀形式。
對于凝血酶，得自人血液的凝血酶和通過DNA重組技術(shù)得到的重組凝血酶都可使用。除了凝血酶，也可添加可藥用的穩(wěn)定劑和添加劑。這樣的穩(wěn)定劑和添加劑的例子包括例如白蛋白、聚乙二醇、精氨酸、透明質(zhì)酸鈉、甘油、甘露醇和氯化鈣等。
本發(fā)明的帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物可用例如如下描述的方法制造。
將凝血酶溶于鹽水或緩沖液中并任選進一步向其中加入作為穩(wěn)定劑或添加劑的白蛋白、聚乙二醇、精氨酸、透明質(zhì)酸、甘油、甘露醇或氯化鈣等。然后將生物可吸收合成非織造織物浸入該溶液中，在-80℃冷凍2小時，凍干得到所需產(chǎn)品。
本發(fā)明帶有凝血酶的生物可吸收非織造織物可以被按壓到出血區(qū)域通過壓力防止血液流出，并且除此之外，該片狀止血物含有的凝血酶立刻和血液中的纖維蛋白原反應(yīng)，使得纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，由此在此局部區(qū)域達到止血效果。所形成的纖維蛋白可以附著于周圍的組織上。
由聚乙醇酸制成的生物可吸收非織造織物早已用于醫(yī)療目的，并且它的安全性已經(jīng)由其被吸收進活體并被分解為水和二氧化碳所證明。
工業(yè)實用性這樣，本發(fā)明帶有凝血酶的生物可吸收非織造織物可以容易并且迅速地施用于局部出血并且可以通過壓力和血液凝固反應(yīng)有效止血。除此之外，因為在所述生物可吸收非織造織物中使用的每一種材料對活體都是安全的，因此該生物可吸收非織造織物可不經(jīng)考慮就用于臨床情況。
通過下面的實施例更加詳細地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實施例。
實施例1重組凝血酶的制備如日本專利申請No.2001/206919所述制備重組凝血酶。簡單地說，培養(yǎng)導(dǎo)入了人前凝血酶(prethrombin)基因的動物細胞，然后從所得的培養(yǎng)基中純化前凝血酶。另一方面，從導(dǎo)入了ecarin基因的動物細胞培養(yǎng)基中純化ecarin。前凝血酶被所得到的ecarin激活從而得到可被純化的凝血酶。
實施例2帶有凝血酶的片的制備通過以下描述的方法制備本發(fā)明帶有凝血酶的片。
向含有0.001-0.01％透明質(zhì)酸鈉(nacalai tesque；18237-41)或0.5-2％甘油(nacalai tesque；17018)的溶液中加入最終濃度為0.5-1.5％的甘露醇(nacalai tesque；21303)和40mM氯化鈣，接著加入最終濃度為1000U/mL的重組凝血酶。將該溶液滴加到由聚乙醇酸制成的生物可吸收合成非織造織物(3cm×3cm；Neoveil，Gunze Limited，厚度0.15mm)中，滴加量為0.05mL/cm2。該片在-80℃冷凍2小時并凍干后，用作帶有重組凝血酶的片狀樣品。類似地，制備帶有得自血液的凝血酶的片，所用凝血酶得自人血液而不是重組凝血酶。
作為對照，使用了沒有用凝血酶處理的生物可吸收合成非織造織物、如WO 90/13320實施例描述所制備的明膠制成的止血海綿以及市場上可買到的片狀纖維蛋白粘合劑。
組1帶有得自血液的凝血酶的片使用一種片，其中在聚乙醇酸制成的非織造織物中帶有50U/cm2的得自人血液的凝血酶。
組2帶有重組凝血酶的片使用一種片，其中在聚乙醇酸制成的非織造織物中帶有50U/cm2的重組凝血酶。
組3沒有凝血酶的片使用一種片，其中聚乙醇酸制成的非織造織物除了沒有凝血酶外按組1的方法處理。
組4帶有固定凝血酶的止血海綿使用一種止血海綿，該止血海綿由含有得自人血液的凝血酶的明膠制成，并按照如WO 90/13320(Spongostan，Johnson & JohnsonK.K.)實施例的描述制備。
組5片狀纖維蛋白粘合劑使用一種其中纖維蛋白粘合劑的組分固定于膠原蛋白片(TachoComb，Torii Pharmaceutical Co.，Ltd.)上的片狀纖維蛋白粘合劑，其中組分如纖維蛋白原和凝血酶通過凍干法固定于由馬膠原蛋白制成的海綿片的一側(cè)。
實施例3在滲出性出血中檢測止血性使用兔子作為動物模型以評估止血性。將兔子剖腹并切除部分肝臟，對整個傷口區(qū)域向其流血區(qū)域施用如實施例2制備的各組止血物并按壓一分鐘。所用的評估如下所示。
(1)將用戊巴比妥麻醉的兔子實施剖腹術(shù)。
(2)靜脈給藥300U/kg肝素。
(3)將右葉、內(nèi)側(cè)左葉或外側(cè)左葉的肝臟表面切除直徑為1.5cm厚度為4mm的圓形。
(4)用紗布吸收從切除傷口流出的血液10秒鐘并稱重。形成切除傷口后流血量約為0.50g。
(5)嘗試用上述各種止血物止血。每一次治療的實施都沒有驅(qū)血但有血液流出。
(6)用紗布吸收并稱重5分鐘的流血量，包括止血治療需要的時間。5分鐘后當(dāng)觀察到傷口表面流血時，重復(fù)進行止血治療和流血的稱重。
(7)止血治療最多重復(fù)四次，通過止血所需的止血治療次數(shù)和從止血治療開始直到止血的流血的全部重量進行評估(表1)。
表1

*即使經(jīng)過第四次止血治療后，所觀察到的不能止血的病例。
如表1所示，與對照止血片的止血效果相比，帶有得自血液的凝血酶(組1)和重組凝血酶(組2)的本發(fā)明的止血片展示出了更加優(yōu)異的止血效果。只有非織造織物而未經(jīng)凝血酶處理(組3)，幾乎沒有觀察到止血效果，但也比WO 90/13320描述的由明膠制成的帶有固定凝血酶的止血海綿(組4)的止血效果高。這表明，在已知的生物可吸收材料中，用于本發(fā)明作為基質(zhì)的生物可吸收非織造織物是最適合用于止血的材料。另外，還表明在該非織造織物中帶有凝血酶可以更快速和更有效地止血。除此之外，由對比測試結(jié)果清晰可見，與本發(fā)明帶有凝血酶的止血片相比，其中膠原蛋白用作基質(zhì)的片狀纖維蛋白粘合劑(組5)表現(xiàn)出差得多的止血效果。
權(quán)利要求
1.一種生物可吸收合成非織造織物，其帶有凝血酶作為有效成分。
2.權(quán)利要求1的生物可吸收合成非織造織物，其中所述生物可吸收合成非織造織物由選自聚乙醇酸、聚乳酸以及乙醇酸和乳酸共聚物的材料制成。
3.權(quán)利要求2的生物可吸收合成非織造織物，其中所述材料是聚乙醇酸。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的生物可吸收合成非織造織物，其中凝血酶是得自人血液的凝血酶或通過DNA重組技術(shù)制備的重組人凝血酶。
5.一種止血物，其使用權(quán)利要求1-4中任一項所述的生物可吸收合成非織造織物。
6.制備帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物的方法，該方法包括將生物可吸收合成非織造織物浸入含有凝血酶的溶液以及凍干所得非織造織物的步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述生物可吸收合成非織造織物由選自聚乙醇酸、聚乳酸以及乙醇酸和乳酸共聚物的材料制成。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述材料是聚乙醇酸。
9.權(quán)利要求6-8中任一項的方法，其中凝血酶是得自人血液的凝血酶或通過DNA重組技術(shù)制備的重組人凝血酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種安全并且有效的止血物并且涉及生物可吸收合成非織造織物以及含有該非織造織物的止血物，該非織造織物的特點在于凝血酶作為有效成分固定于其上。本發(fā)明的帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物可通過將生物可吸收合成非織造織物浸入含有凝血酶的溶液的步驟以及凍干所得非織造織物的步驟制備，并且通過使用該帶有凝血酶的生物可吸收合成非織造織物可以實現(xiàn)快速且有效的止血。
文檔編號A61L15/64GK1711111SQ20038010315
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者內(nèi)田隆德, 新屋希子, 嘉悅洋, 今村隆幸, 野崎周英 申請人:財團法人化學(xué)及血清療法研究所